Jonathan P. Fadok, 1,2 Tavis MK Dickerson, 2 és Richard D. Palmiter2 *
J Neurosci. Szerzői kézirat; elérhető a PMC 2010 március 9.
Végleges szerkesztett formában megjelent:
J Neurosci. 2009 szeptember 9; 29 (36): 11089 – 11097.
doi: 10.1523 / JNEUROSCI.1616-09.2009.
1 diplomás program neurobiológiában és viselkedésben, University of Washington, Seattle, WA 98195
2 Biokémiai Tanszék és Howard Hughes Orvostudományi Intézet, Washington Egyetem, Seattle, WA, 98195
* A levelezést Richard D. Palmiternek, a HHMI-nek és a Biokémiai Tanszéknek, a Box 357370-nek, a Washington University of Seattle-nek, WA 98195-nak kell címezni. Email: [e-mail védett]
A cikk kiadójának utolsó szerkesztett változata ingyenesen elérhető a J Neurosci oldalon
Lásd a PMC egyéb cikkeit, amelyek idézik a közzétett cikket.
Absztrakt
A dopamin (DA) számos viselkedéshez kapcsolódik, beleértve a motorfunkciót, a megismerést és a jutalom feldolgozást; a DA-nak a félelem feldolgozásában betöltött szerepe azonban kétségtelen. A DA-nak a félelemhez kötődő tanulásban betöltött szerepének vizsgálatához a dopamin-hiányos (DD) egereket félelem-potenciált meglepő paradigmában tesztelték. A DA-szintézis helyreállítható a DD egerekben 3, 4-dihidroxi-L-fenilalanin (L-Dopa) alkalmazásával, ezáltal lehetővé téve a félelem feldolgozásának értékelését DA-kimerült vagy újrakezdő állapotban. A DD egerekben a félelem-potencírozott meglepetés hiányzott, de az L-Dopa beadásával azonnal vissza lehetett állítani a félelem kondicionálása után. A DA szintézis szelektív vírus által közvetített helyreállítása a ventrális tegmentális területen belül teljesen helyreállította a félelem tanulását a DD egerekben, és a DA szintézis helyreállítását a DA neuronok felé, amelyek a basolaterális amygdala felé mutatnak, helyreállítva a rövid távú memóriát, de nem a hosszú távú memóriát vagy a sokkérzékenységet. Azt is bemutatjuk, hogy a DA D1 receptor (D1R) és a D2-szerű receptorok szükségesek a cue-függő félelem tanuláshoz.
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a több célzónán belüli több receptor altípusra ható DA elősegíti a félelem memória stabilizálását.
Kulcsszavak: Dopamin, félelem, félelem-fokozott meglepetés, amygdala, dopamin D1 receptor, dopamin D2 receptor
Bevezetés
A DA neuromodulátor fontos a jutalomhoz kapcsolódó tanulás és a kábítószer-kereső viselkedés szempontjából (Schultz, 2002; Wise, 2004), és a felhalmozódó bizonyítékok arra utalnak, hogy a DA szintén fontos lehet a félelemhez kapcsolódó tanulás szempontjából (Lamont és Kokkinidis, 1998; Guarraci et al. Grey és Kokkinidis, 1999, Guarraci és munkatársai, 2000, Greba és munkatársai, 2000, Pezze és Feldon, 2001, de Oliveira és munkatársai, 2004). A ventrális középső agyi DA idegsejtjei a félelem tanulásához fontos limbikus agyterületekhez, és ezeknek az agyi területeknek a DA szintjei növekednek az averzív események során (Abercrombie et al., 2006; Kalivas és Duffy, 1989; Doherty és Gratton, 1995; Inglis és Moghaddam; , 1997). Ezen túlmenően, egyes középső agyi neuronok növelik az égési sebességüket az averzív ingerekre és a prediktív jelekre (Guarraci és Kapp, 1999; Horvitz, 1999; Joshua et al., 2000). Továbbá, a DA bizonyította, hogy megkönnyíti a hosszú távú potencírozást, a memória kulcsfontosságú neurális korrelációját a félelem tanulásában kritikus területeken, mint például a hippocampus és az amygdala (Bissiere et al., 2008; Lemon és Manahan-Vaughan, 2003; Swant és Wagner, 2006).
Annak ellenére, hogy a DA neuronok fiziológiájával kapcsolatos félelem miatt elért előrehaladás történt, a DA és a rokon receptorok pontos szerepe a félelemhez kapcsolódó tanulásban továbbra is megoldatlan. Kimutatták, hogy a D1R-szerű antagonisták szisztémás vagy az amygdala-ba történő beadása blokkolja a félelemhez kapcsolódó tanulás megszerzését vagy kifejeződését; mások azonban kimutatták, hogy ezeknek a gyógyszereknek nincs hatása (Guarraci és munkatársai, 1999; Greba és Kokkinidis, 2000; de Oliveira és munkatársai, 2006). Emellett kimutatták, hogy a D1R-szerű agonisták fokozzák vagy nem befolyásolják a félelem kondicionálását (Guarraci és munkatársai, 1999; Greba és munkatársai, 2000; Inoue és munkatársai, 2000; de Oliveira és munkatársai, 2006). Analóg eltéréseket találtunk a D2R-szerű receptorok agonistáit vagy antagonistáit alkalmazó vizsgálatokban (Guarraci és munkatársai, 2000; Greba és munkatársai, 2001; Ponnusamy és munkatársai, 2005; de Oliveira és munkatársai, 2006). Ezek az eltérések a viselkedési módszertan, az injektált gyógyszerek dózisfüggő hatásai vagy a farmakológiai szerek kiválasztásának különbségei lehetnek. Például a DA receptor antagonisták szelektivitása igen eltérő, míg egyes tanulmányok szelektívebben antagonizálhatják a D2 receptorokat, míg mások szélesebb körben antagonizálhatják a D2, D3 és D4 receptorokat (Missale és mtsai, 1998).
A DA-nak a félelemgel kapcsolatos tanulásában betöltött szerepének tisztázása érdekében olyan egereket használtunk, amelyek nem rendelkeztek DA (DD egerek), valamint egerekkel, amelyeknek nincsenek D1R vagy DA D2 receptorai (D2R), és azokat félelem-potenciált meglepő paradigmában teszteltük. A félelem-potencírozott meglepetés egy Pavlovian-félelem kondicionáló paradigma, amelyben a neutrális inger az akusztikus megdöbbentő válasz növekedését okozza, miután párosodott a lábszárral (Koch, 1999). Ezeknek a vizsgálatoknak ideális a paradigma a félelem-potencírozott meglepetés, mivel ez nem függ a fagyasztási viselkedés értékelésétől, amelyet nehéz mérni a hipoaktív DD egerekben (Zhou és Palmiter, 1995). Mivel a DD-egerek DA-kimerült vagy DA-teljes állapotban tanulmányozhatók, ideális lehetőséget biztosítanak a DA szerepének tanulmányozására a tanulásban és a memória kialakulásában. Továbbá, a vírus által közvetített Cre-rekombináz-leadás alkalmazásával a DA-jelátvitel szelektíven helyreállítható a specifikus célterületekre a DD egerek Th-alléljének reaktiválásával (Hnasko és munkatársai, 2006). A DA specifikus célterületekre történő szelektív helyreállítása lehetővé teszi a DA jelzéssel szabályozott agyterületek értékelését a félelem kondicionálása során.
Anyagok és módszerek
Állatok és kezelések
A DD egereket a leírtak szerint állítottuk elő (Hnasko és munkatársai, 2006). Röviden, a DD (Thfs / fs; DbhTh / +) egerek két nem funkcionális tirozin-hidroxiláz (Th) allélt hordoznak, amelyek inaktiváltak egy neomicin rezisztencia (NeoR) gén beillesztésével, amelyet a lox P helyek határolnak a Th gén első intronjába. . Ezek az egerek egy intakt dopamin β-hidroxiláz (Dbh) allélt és egy Dbh allélt hordoznak a Th gén célzott beillesztésével. A kontroll állatok legalább egy intakt Th-allélt és egy intakt Dbh-allélt hordoznak. A nem-dopaminerg katekolaminok szintje normális a DD állatokban, és az összes katekolamin szintje a kontroll állatokban normális (Zhou és Palmiter, 1995; Szczypka et al., 1999). Az egereket egy vegyes C57BL / 6 X 129 / Sv genetikai háttéren tartottuk. A súlyos hypophagia miatt a DD egereket naponta (ip) injektáltuk L-Dopa-val 50 mg / kg-nál 33 μl / g térfogatban (Zhou és Palmiter, 1995), kezdve az 10 kb. Ezek az injekciók helyreállítják a DA-funkciót az 8-re 10 órára (Szczypka et al., 1999). Leírták a D1R knockout (KO) és a D2R KO egereket (Drago és munkatársai, 1994; Kelly és munkatársai, 1997). Mindkét törzset C57BL / 6 háttéren tartottuk. A D1R KO egerek növekedési retardációja miatt négy héten át elválasztottuk, majd nedvesített chow-t tápláltak a növekedés elősegítése érdekében. Valamennyi állatot PCR-analízissel genotípusosítottunk. A hím és nőstény egereket viselkedési tesztnek vetettük alá 2 – 5 hónapok között. Minden egeret 12: 12 (fény: sötét) ciklus alatt tartottunk hőmérséklet-szabályozott környezetben, élelmiszerrel (5LJ5; PMI Feeds, St. Louis, MO) és ad libitum vízzel. Minden viselkedési kísérletet a fényciklus alatt végeztek. Minden egeret az Országos Egészségügyi Intézetek és a Washington Egyetem Intézményi Állatgondozási és Használati Bizottsága által kidolgozott iránymutatások szerint kezeltünk
Annak megítéléséhez, hogy más D2-szerű receptorok fontosak-e a félelem tanulásához, a D2R KO egereknek DNNXX-szerű antagonista etiklopridet (Sigma, St. Louis, MO) adtunk be 2 mg / kg (ip) értéken. Az etiklopridot 0.5% sóoldatban oldottuk, és 0.9 μl / g végső térfogatban adtuk be. A D10R vad típusú (WT) egereket hordozóanyaggal injektáltuk.
Készülék
A prepulzus gátlásának, a rettegéses válaszok és a félelem-potenciált meglepetés mérésére hangcsillapító ellenséges kamrákat (SR-Lab, San Diego Instruments, San Diego, CA) használtunk. Elsősegélyes válaszok esetén 65 1-msec értékeket vettünk, az impulzus kezdetétől kezdve. A lábfejre adott válasz méréséhez 500 1-msec értékeket vettünk, kezdve a sokk kezdetétől. A válasz csúcs amplitúdóját használtuk a prepulzus-gátlás, a rettegés-válaszok, a félelem-potenciált meglepetés és a sokk-reaktivitás kiszámításához. A hangmagasságot a kamra mennyezetében található nagyfrekvenciás hangszóró készítette. A háttérhangot állandó 65 dB szinten tartottuk. A hangszintet decibelben (A skála) mértük egy hangszint-olvasóval (RadioShack, Fort Worth, TX). Egy kalibráló egységet használtunk a meglepetésre adott válaszok integritásának biztosítására (San Diego Instruments, San Diego, CA). 8-wattos fényt szereltek fel a dobogató hátsó falára, hogy felhasználhassák.
Kezdeti válasz görbék
Egy 5-perc szokásos időtartamot követően az állatokat hét kísérletsorozattal mutattuk be, amelyek növekvő hangszintekkel rendelkeztek: 80-től 120 dB-ig, 30 szekció ITI-vel. Ez a sorozat 10 időket mutatott be az összes 70 vizsgálathoz. Minden kísérletben, kivéve a null próbákat, amelyekben nem volt hang, a hangimpulzus 40 msec volt.
Az impulzus előtti gátlás
Az állatokat 10-min-szokási periódusra adtuk, majd az alanyokat 5 40-msec, 120-dB, pulzus-egyedüli kísérletekkel mutattuk be. Az egereket ezután 50-próbákkal mutatták be, akár egy indító impulzusos vizsgálat, mind a három prepulzus vizsgálat egyikének (5, 10 és 15-dB a háttér felett), vagy egy null próba, amelyben nem volt akusztikus inger. Az intertrial intervallum (ITI) átlagosan 15 sec (5 – 25 sec). A megpróbáltatás egy fehér zaj 40-msec, 120-dB impulzusából állt. A prepulse-vizsgálatok 20, 70 vagy 75-dB intenzitás 80-msec időtartamú prepulzusából álltak, amely az 40 msec 120-msec 100-dB impulzusát megelőzte. A prepulse-gátlást minden egyes prepulzusszintre kiszámítottuk a következő képlet alkalmazásával:% -os gátlás = [(átlag ellenséges válasz a prepulzus próbán / átlagos gyulladásos válasz pulzus-önálló próbán) × 100]. A DD egereket DA-kimerült állapotban, 18 – 24 órában teszteltük az L-Dopa injekció után.
Félelem-fokozott meglepetés (7-napi paradigma)
Az 1-nál (alapvonal) az 5-perc szokásos idő után az egereknek pszeudo-véletlenszerű sorrendű 20-kísérletsorozatot kaptak, amelyek egyenletesen oszlanak meg a cue és no-cue körülmények között. A nem-cue kísérletekhez az állatokat 40-msec, 105-dB akusztikus impulzussal mutattuk be. A cue kísérletekhez az állatokat egy 10-sec fénysugárral mutattuk be, amely egy 40-msec, 105-dB impulzussal együtt végződött. Az ITI átlagosan 120 sec (60 tartomány 180 sec).
A képzés az 2, az 4 és az 6 napokon történt. Egy 10-perc szokásos idő után az egereknek 10-prezentációkat kaptak a cue-fényről, amelyek egy 0.2-mA, 0.5-sec footshock-val együtt végződtek. Az ITI átlagosan 120 sec (60 tartomány 180 sec). A tesztfolyamatok az 3, az 5 és az 7 napokon voltak, és megegyeztek a fent leírt alapfolyamatokkal. A DD egerek DA-kimerült állapotban voltak, 18-től 24 óráig az utolsó L-Dopa injekció után, az alapvonal, a képzés és a tesztelés során. Az L-Dopa-t az edzések után injekciózták, ahogy az a legendákban látható. A következő képletet használtuk a félelem-potenciált meglepetés kiszámításához:% potencialitás = [(válaszok átlaga a cue-próbákon / válaszok átlaga a cue-próbákon - 1) × 100].
Félelem-fokozott meglepetés (3-napi paradigma)
A paradigma 1 és 3 napjai (alapvonal és teszt) megegyeztek az 7-napi félelem-potenciált meglepő paradigmával. Az 2-nál (edzés) az egerek 30-sec fénysugár 10 párosításait 0.2-mA, 0.5-sec lábkockával kapták. Az ITI átlag 120 sec (60 tartomány 180 sec). A DD egerek DA-kimerültek az alapvonal, a képzés és a tesztelés során.
Rövidtávú memória
Az alapvonal és a tesztszakaszok megegyeztek az 7-nap paradigmájában leírtakkal. Az 2-nál az 5-perc szokásos időtartamot követően az egereknek 30-párosítást kaptak egy 10-sec cue fényből, amely egy 0.5-sec, 0.2-mA footshock-tal együtt végződött. Az ITI átlagosan 120 sec (60 és 180 között). Az edzést követően az egereket a tesztelés előtt percenként 10-be helyeztük a ketrecbe. A rövid távú memóriát ugyanazzal a képlettel értékeltük, amelyet a félelem-potencírozott meglepetésnél használtunk.
Sokkérzékenység
A rövid távú memória alapvonala és a vizsgálati szekciók során a nem-cue állapotra adott válaszokat minden állatra átlagoltuk, és a következő képletet használtuk a sokkérzékenység kiszámításához:% szenzitizáció = [(átlagos gyulladásos válasz a vizsgálat során / az átlagos kezdeti válasz a kiindulási értéken) 1) × 100].
A Th génfunkció Cre rekombináz által közvetített helyreállítása
Az izoflurán (1.5 – 5%) érzéstelenített egereket sztereotaxikus eszközbe helyeztük (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). A Th génfunkció helyreállításához a ventrális tegmentális területen a rekombináns AAV1-Cre-GFP vírust (titerezve 1.2 × 1012 részecskék / ml) kétoldalúan injekcióztuk a ventrális középső agyba (koordináták mm-ben: 3.5 a Bregma előtt, 0.5 oldalirányban a középvonalig) , 4.5 ventrális Bregma-ra, 0.5 μl / félteke). A BLA DA specifikus helyreállítása céljából a rekombináns CAV2-Cre vírust (2.1 × 1012 részecskék / ml) tenyésztettük kétoldalúan (mm koordináták: Bregma 1.5, 3.25 oldalirányban középre, 5 ventrális Bregma; 0.5 μl / félteke) . Mindkét vírus vektor részletes leírását közzétették (Hnasko és munkatársai, 2006; Zweifel és munkatársai, 2008). A vírusokat 10-periódus alatt injektáltuk egy 32-mérő fecskendő tűvel (Hamilton, Reno, NV), amely egy mikro-infúziós szivattyúhoz van csatlakoztatva (WPI, Sarasota, FL).
Immunohisztokémia
Az 50 mg / ml nátrium-pentobarbitallal (0.2 – 0.3 ml / állat) végzett érzéstelenítés után az egereket foszfáttal pufferolt sóoldattal transzkardiálisan perfundáltuk, majd 4% paraformaldehidet foszfáttal pufferolt sóoldatban. A leválasztott agyakat egy éjszakán át rögzítettük 4% paraformaldehidben, a foszfát-pufferolt sóoldatban 30% -os szacharózzal védettük, majd izopentánban gyorsan lefagyasztottuk. A szabadon úszó koronális szakaszokat (30 μm) immunhiányosítottuk egér anti-TH (1: 1000, Chemicon) vagy nyúl anti-TH (1: 2000, Chemicon) antitestekkel. Az immunfertőzést Cy2- vagy Cy3-konjugált IgG szekunder antitestek alkalmazásával érjük el (1: 200, Jackson ImmunoResearch). A festett metszeteket csúszdákra szereltük, lefedtük, és egy függőleges fénymező mikroszkóppal (Nikon) fényképeztük.
Statisztikai elemzések
Az elvégzett analízisek közé tartoznak az ismételt mérések és az egyirányú ANOVA, a Fisher-post-hoc és a Student-féle t-tesztek, amint az az eredményekben szerepel. A statisztikai elemzést Statistica szoftverrel (Statsoft, Tulsa, Oklahoma) végeztük.
Eredmények
A DD egerek érintetlen akusztikus elakadással és normális prepulzus gátlással rendelkeznek
A félelem-potenzált meglepetés intakt akusztikus rémületi válaszokat és érzékelőérzékelőt igényel. Annak megállapításához, hogy az akusztikus megdöbbentő válasz megváltozik-e a DA hiányában, a DA-lecsökkent DD egerek válaszát (18-től 24 óráig L-Dopa után) több decibel hangszintre mértük és összehasonlítottuk a kontrollokkal (1A ábra). Az ANOVA ismételt intézkedések nem mutatták a genotípus fő hatását és nem mutattak szignifikáns kölcsönhatást a genotípus és a hangszint között.
ábra 1
A DA kritikus fontosságú a félelem által erősített riadalom megtanulásához. A, Kontroll (n=10, fekete négyzetek) és DD egerek (n=10, nyitott négyzetek) akusztikus megdöbbenése különböző hangintenzitásokra. A válaszok tetszőleges egységekben vannak megadva. B, A prepulzus gátlást 3 különböző előpulzus intenzitással teszteltük kontroll (n=10, fekete sávok) és DD egerekben (n=10, nyitott oszlopok). A csillagok p<0.05, ismételt mérések ANOVA. C, A 7 napos félelem-potenciált megdöbbentő paradigmát illusztráló séma. A kiindulási és a tesztnapokon az egerek 10 jelzés nélküli prezentációt (40 dB-es riasztó impulzus 105 msec időtartamú bemutatása) és 10 jelzéspróbát (10 másodperces fényjelzés a riasztó impulzussal egyidejűleg) kaptak pszeudovéletlen módon. rendelés. A képzési napokon az egerek 10 párosítást kaptak a 10 másodperces fényjelzésből, amely egyidejűleg 0.5 másodperces időtartamú, 0.2 mA lábrázással végződött. A tanulást a tesztnapokon a jelzés nélküli kísérletekkel összehasonlítva a potencírozás százalékában értékelték. D, DD egerek (n=10, nyitott oszlopok), amelyeknek L-Dopa-t kaptak 3 órával az edzés után (2. és 4. nap), nem tudtak tanulni (1. és 2. teszt). Ha azonban a DD egereket közvetlenül a tréning után (6. nap) injekciózták, jelentős félelemkeltő ijedtséget mutattak (3. teszt). A csillagok p<0.05, ismételt mérések ANOVA. E, lökésreaktivitás mérése edzés közben (kontroll n=10, fekete sávok; DD n=10, nyitott sávok). A válaszok tetszőleges egységekben vannak megadva. F, A 3 napos félelem-potenciált megdöbbentő paradigmát illusztráló séma, amelyet annak a kritikus időszaknak a meghatározására használnak, amelyben a DA fontos. Mind a 30 cue-shock párosítást egy edzésnapon adtuk be, és a DD egereket azonnal, 1 vagy 3 órával a tréning után L-Dopával kezeltük. G, Csak a kontroll (n = 8, szilárd fekete sávok, C) és a DD egerek, amelyeket közvetlenül az edzés után injektáltak (n = 7, függőleges csíkok, 0 óra) mutattak félelmet fokozó megdöbbenést a teszt napon. A félelem által fokozott megdöbbenésnek ez a szintje szignifikánsan magasabb volt, mint azoknál a DD egereknél, amelyek L-Dopa-t kaptak 1 órával (n=6, átlós csíkok) vagy 3 órával (n=6, nyitott oszlopok) az edzés után. A csillagok p<0.05-öt jelölnek az alapvonalhoz képest, Fisher post-hoc. Minden közölt érték átlag ± SEMDA-kimerült DD és kontroll egereket is teszteltünk egy prepulzusgátlási paradigmában, amelyet általában a szenzomotoros kapuzás hiányának kimutatására használnak. A prepulzus gátlás fokozódott DD egerekben (1B. ábra; ismételt mérések ANOVA, genotípus: F1, 18=5.37; p<0.05; nem mutattunk ki szignifikáns genotípust prepulzus szintű kölcsönhatás alapján). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a DD egerekben nincs hiány a megdöbbentő reakciókban vagy nem csökken a szenzomotoros kapuzási mechanizmus, miközben DA-kimerült állapotban vannak, és igazolják, hogy a félelem által felerősített riasztási kísérletekben használják őket.
A dopamin kritikus időben szükséges a félelem-potenciált meglepetés tanulásához
Annak meghatározására, hogy a DA szükséges-e a jelzett félelem kondicionálási feladat megtanulásához, a DD-t és a kontroll egereket 7 napos félelem-potenciált riadalom paradigmának vetettük alá (1C. ábra). A DD egereket DA-kimerült állapotban képeztük ki és teszteltük. Amikor 24 órával a tréning után tesztelték, a kontroll egerek félelmet fokozó megdöbbenést mutattak egyetlen edzés után, ami nem volt megfigyelhető DD egereknél (1D. ábra; ismételt mérések ANOVA, genotípus, F1, 18=7.4590, p<0.05). A DD egerek még egy további edzés után sem fejezték ki a félelem által felerősített megdöbbenést, míg a kontroll egerek továbbra is robusztus tanulást fejeztek ki. Érdekes módon, amikor a 6. napon közvetlenül a tréning után L-Dopát kaptak, a DD egerek félelmet fokozó megdöbbenést mutattak, ami szignifikánsan magasabb volt, mint az alapvonal (egyirányú ANOVA F1, 18=9.1999, p<0.01), és nem különbözött a kontrollszintektől ( 1D ábra). A DD egerek és a kontroll egerek edzési napjaiban tapasztalható sokk-reaktivitás egyetlen edzési napon sem különbözött szignifikánsan a genotípusok között, ami azt jelzi, hogy a DD egerek tanulási hiánya nem a lábsokk érzékelésének képtelenségéből fakad (1E. ábra). A kritikus időablak jellemzése érdekében a DA-hatás esetében egy további vizsgálat változtatta az L-Dopa beadásának idejét. A DD és a kontroll egereket 30 fénysokk párosításból álló tréningen (1F. ábra), majd közvetlenül, 1 órával vagy 3 órával a tréning után L-Dopával fecskendezték be, és 24 órával később tesztelték őket. A közvetlenül a tréning után beinjektált DD egerek erőteljes félelmet fokozó megdöbbenést fejeztek ki a tesztnapon, hasonlóan a kontrollokhoz, míg az L-Dopával injekciózott DD egerek 1 órával vagy 3 órával a tréning után nem tanultak (1G. ábra; ismételt mérések ANOVA; kezelés × ülés F3, 23=5.1032, p<0.01). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a DA véges időn belül szükséges a tanuláshoz a félelem által potencírozott megdöbbentő paradigmában. A DA azonban nem szükséges a jelzett félelem memória kifejezéséhez, mivel a DD állatokat mindig DA hiányában tesztelték. Ezenkívül a DA hiánya nem rontja a sokk-reaktivitást.
A D1R szükséges ahhoz, hogy a félelem erősödjön
Annak felderítésére, hogy mely DA-receptorokra van szükség a félelem által erősített megdöbbenéshez, először D1R KO egereket elemeztünk. A D1R KO-t és a kontroll, vad típusú (WT) egereket a megdöbbentő pulzusintenzitás több szintjén teszteltük, a DD egereknél leírtak szerint (2A. ábra). Nem volt szignifikáns különbség a D1R KO és a WT egerek között egyetlen tesztelt hangszinten sem, ami azt jelzi, hogy a D1R KO egerek sértetlen akusztikus riasztási reakcióval rendelkeznek. Korábbi tanulmányokkal összhangban sértetlen prepulzusgátlást figyeltünk meg D1R KO egerekben (Ralph-Williams és mtsai, 2002). A 7 napos félelem-potenciált megdöbbentő paradigmában tesztelve a D1R KO egerek egyik tesztnapon sem fejezték ki a tanulást (2B ábra; ismételt mérések ANOVA genotípus × F3 tesztnap, 48=6.28; p<0.01), míg a WT egerek Az egerek szignifikáns, félelmet fokozó megdöbbenést mutattak a 2. és 3. tesztnapon (p<0.05 és p<0.01, kontroll alapvonal versus 2. és 3. teszt, Fisher post-hoc). A D1R KO egerek sokk-reaktivitása nagyobb volt, mint a WT mindhárom edzési napon (2C. ábra; ismételt mérések ANOVA, F1 genotípus, 16=10.18; p<0.01; nem figyeltek meg szignifikáns genotípus × edzésnapot). Így, bár a D1R KO egerek a WT egerekhez képest fokozottabb válaszreakciókat mutatnak a lábrázkódásra, még 3 napos edzés után is jelentősen gyengítették a félelemkeltést. Ezek az adatok tanulási zavart jeleznek a D1R KO állatokban, és a D1R szerepet játszik abban, hogy a DA hatását közvetíti a jelzéstől függő félelemkondicionálásban. 2. ábra A D1R KO egerek tanulási képessége jelentősen csökkent. A, D1R WT (n=9, fekete négyzetek) és KO (n=9, nyitott négyzetek) egerek akusztikus ijedt válasza. B, A 7 napos félelem-potenciált megdöbbentő paradigma eredményei D1R egerekkel. A D1R WT egerek (n = 9, egyöntetű fekete sávok), de nem a D1R KO egerek (n = 9, nyitott sávok) félelemkeltő ijedtséget mutattak a teszt 3. napjára. A csillagok p<0.01-et jelölnek, összehasonlítva a KO-t a WT-vel, Fisher a vizsgálat után. hoc. C, Lökésreaktivitás mérése. A D1R KO egerek (n=9, nyitott oszlopok) jobban reagálnak a láblökésre, mint a WT (n=9, tömör oszlopok). A csillagok p<0.05, ismételt mérések ANOVA. Az összes jelentett érték átlag ± SEM A megdöbbentő reakciók és a sokk-reaktivitás esetén tetszőleges egységekben közölt számok.
A D2R KO egerekben a félelem-potenciált meglepetés sérült, de más D2-szerű receptorokat igényel.
Annak megvizsgálására, hogy a D2-szerű receptorok szükségesek-e a félelem-potenciált meglepetéshez, a D2R KO és a WT egereknek meglepő válasz és félelem-potenciált meglepő tesztek voltak. A WT és a D2R KO egerek minden vizsgált dB-szintnél egyenértékű ellenséges válaszokat mutatnak, ami azt jelzi, hogy a D2R KO egerek sértetlenül reagálnak az akusztikára (3A ábra). Hasonlóan a D1R KO egerekhez, megfigyeltük, hogy a D2R KO egereknek ép prepulzus gátlása van (Ralph-Williams et al., 2002). Az 7-napos félelem-potenciált meglepő paradigmában tesztelve mind a WT, mind a D2R KO egerek az összes 3 tesztnapon (3B. Ábra) ugyanolyan szintű félelem-potenzált győzelmet mutattak, és a sokk-reaktivitás nem különbözött a csoportok között (3C ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a D2R nem szükséges a félelem-potenciált meglepetés tanulásához.
ábra 3
A D2R KO egerek sértetlen félelemkeltő ijedtséggel rendelkeznek. A, D2R WT (n = 8, fekete négyzetek) és KO egerek (n = 8, nyitott négyzetek) akusztikus riasztási reakciója. B, A 7 napos félelem-potenciált megdöbbentő paradigma eredményei D2R egerekkel. Mind a WT (n=8, szilárd oszlopok), mind a KO (n=8, nyitott oszlopok) egerek szignifikáns szintjeit mutatták a félelem által fokozott megdöbbenésnek. C, Lökésreaktivitás mérése edzés közben (WT, n=8, tömör oszlopok; KO, n=8, nyitott rudak). A D, WT és D2R KO egereket (n=11 egyenként) a 3 napos félelem-potenciált riadalom paradigmának vetettük alá. A D2R KO egereknek etiklopridot (0.5 mg/kg) adtunk be edzés előtt, és a tesztelés során nem fejezték ki a félelem által erősített megdöbbenést. A csillagok p<0.01, KO versus WT, Fisher post-hoc. Az összes közölt érték átlag ± SEM A megdöbbentő válaszok és a sokkreaktivitás esetén a válaszokat tetszőleges egységekben adták meg. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a D2-szerű antagonisták szisztémásán vagy közvetlenül az amygdalába történő beadása csökkenti a kondicionált félelmet (Guarraci et al., 2000; Greba és mtsai, 2001; Ponnusamy és mtsai, 2005). Az eredményeik és a miénk közötti eltérések feltárása érdekében a D2R KO egereknek D2R-szerű antagonista etiklopridot (0.5 mg/kg; intravénás beadva) adtunk be, mielőtt a 3 napos félelem-potenciált megdöbbentő paradigmát követték volna. Az edzés után 24 órával végzett tesztelés során a hordozóanyaggal injekciózott WT egerek erős félelmet fokozó megdöbbenést mutattak, míg az etiklopriddal injekciózott D2R KO egerek nem mutattak tanulást (3D. ábra; ismételt mérések ANOVA genotípus × F1 nap, 20=7.5698, p<0.05) . Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a D1R mellett a DA receptorok D2-szerű családjának egy tagja, de a D2R nem, elengedhetetlen a félelem által erősített megdöbbenéshez.
A DD és D1R KO egerekben a rövid távú memória csökken
A DA-nak az edzés után egy órán belül meg kell tanulnia a félelemtől potenciált megdöbbentést. Ezekben a kísérletekben 24 órával az edzés után megvizsgálták a félelem által potenciált megdöbbentés hosszú távú memóriáját. Elkezdtük tesztelni, hogy a DA rövid távú memóriához is szükséges-e. A DD állatokat és a kontrollokat 2 napos paradigmának vetettük alá, amely 10 perccel az edzés után tesztelte a rövid távú memóriát (4A. Ábra). A teszt napján értékelték a sokkérzékenységet és a rövid távú memóriát. A rövid távú memóriát a megdöbbentő válaszok cue-függő növekedéseként határozták meg, míg a sokk-szenzibilizáció az akusztikus megindulási válasz kontextustól függő potenciatartalma a lábrázkódást követően, amely független a jelzéstől (McNish et al., 1997; Richardson, 2000; Risbrough et al., 2008). A DD egereknél szignifikánsan kevesebb volt a sokk szenzibilizációja, mint a kontrolloknál (4B. Ábra, p <0.05; Student's t-teszt). Hasonlóképpen, a kontroll egerek robusztus rövid távú memóriát mutattak, amely hiányzott a DD egerekből (4B. Ábra, p <0.05, DD versus kontroll, Student's t-teszt). Ezek az adatok arra utalnak, hogy DA szükséges a félelemtől potenciált megdöbbenés rövid és hosszú távú memóriájához. Ezenkívül a DA szükséges a kontextustól függő félelem tanulásához, amelyet a sokk szenzibilizációja vizsgál. Ezek az adatok is megerősítik azt a korábbi következtetést, hogy a DA-ra egy kritikus időszakban van szükség a félelemkondicionáló memórianyom stabilizálásához. 4. ábra A rövid távú memória és a sokkérzékenység a DA-tól függ. A, A viselkedési paradigma kialakítása. Az 1. napon a kiindulási megdöbbentő válaszokat kaptuk. A 2. napon az egerek megkapták mind a 30 cue-shock párosítást, majd a tesztelés előtt 10 percre visszatették a házukba. A B, a kontroll egereknek (n = 10, fekete oszlopok) a DD-hez képest szignifikánsan nagyobb a sokkérzékenység és a félelem által potenciált megdöbbentés (n = 10, nyitott sávok). A csillagok p <0.05; Hallgatói t-teszt. A C, WT (n = 7, fekete sávok) és D1R KO (n = 7, nyitott sávok) egerek sértetlenek. A rövid távú memória teszt során csak a WT-nél jelentkezik a félelem által potenciált megdöbbenés. A csillagok p <0.05, KO a WT-vel szemben; Hallgatói t-teszt. A D, WT (n = 8, fekete oszlopok) egereknél lényegesen nagyobb a sokkérzékenység, mint a D2R KO-nál (n = 8, nyitott sávok). A félelem-potenciált szintek hasonlóak a WT és a D2R KO egerek között. A csillagok p <0.05, KO a WT-vel szemben; Hallgatói t-teszt. Az összes közölt érték átlag ± SEMT Annak feltárására, hogy mely receptor altípusok közvetítik a DA szerepét a rövid távú memóriában és a sokkérzékenységben, a D1R és D2R KO egereket ugyanabban a paradigmában teszteltük, mint a DD egereket. A D1R KO egereknél szignifikánsan alacsonyabb volt a rövid távú memória szintje, mint a WT egereknél (4C. Ábra, p <0.05; Student's t-teszt); azonban a D1R KO és a kontroll egereknél nem volt szignifikáns különbség a sokk szenzibilizáció szintje között, jelezve, hogy a kontextustól függő tanulás sértetlen volt. A D2R KO egereknél szignifikánsan alacsonyabb volt a sokk szenzibilizáció szintje, mint a WT-nél (4D. Ábra, p <0.05; Student t-próbája), mégsem volt szignifikáns különbség a WT és a KO egerek rövid távú memóriája között.
A DA-nak a bazolaterális amygdala helyreállítása elegendő a rövid távú memória megengedéséhez
A basolaterális amygdala kritikus a cue-függő félelem memória megszerzéséhez (Maren, 2003; Maren és Quirk, 2004; Sigurdsson et al., 2007). Továbbá bizonyíték van arra, hogy a DA fontos szerepet játszik a basolaterális amygdala funkció elősegítésében (Rosenkranz és Grace, 2002; Bissiere és munkatársai, 2003; Marowsky és munkatársai, 2005). Annak feltárása, hogy a basolaterális amygdala-ban DA-t kell-e a félelem-potenciált meglepetéshez, a DD és a kontroll egereket kétoldalúan injektáltuk egy CAV2-Cre vektorral a bazolaterális amygdala-ba (5A ábra). Ezt a vektort retrogradiálisan szállítjuk az injekció helyéről DA neuronokba, ahol helyreállítja a Th génaktivitást (Hnasko és munkatársai, 2006). Az immunhisztokémia kimutatta, hogy a TH a CAV2-Cre-vel beadott DD egerek (5J) bazolaterális amygdala-jában volt jelen, de a dorsalis striatumban és a nucleus accumbensben (5G ábra) nem volt jelen. A TH-t elsődlegesen kis számú neuronra állítottuk vissza a ventrális tegmentális terület caudalis részében (5D ábra). Az injektált DD egerekben 10-μm-es szakaszonként jellemzően kevesebb 30-TH-pozitív sejt volt, ami összhangban van az irodalomban jelentett kis számú amygdala-projekciós DA-neuronnal (Ford és mtsai, 2006; Lammel és mtsai. , 2008, Margolis és munkatársai, 2008).
ábra 5
Az endogén TH-expresszió régióspecifikus helyreállítása DD egerekben. A, A vázlatos ábrázolás a basolaterális amygdala (BLA) mentési kísérletek injekciós koordinátáit mutatja be. A DD (n = 7) és a kontroll (n = 7) egereket kétoldalúan injektáltuk a BLA-ba CAV2-Cre vektorokkal (0.5 uL / félteke). B, A ventrális tegmentális terület (VTA) mentési kísérleteinek injekciós koordinátáinak vázlatos ábrázolása. Az AAV1-Cre-GFP-t kétoldalúan (0.5 uL / félgömb) injektáltuk a DD (n = 7) VTA-ba és a kontroll egerekbe (n = 10). A Paxinos és a Franklin, az 2001. C-E, TH-festés összehasonlítása a koronális szeletben (4 × nagyítás), amely a VT-vel befecskendezett VT-vel, a VLA-val befecskendezett DD-t és a VTA-val injektált DD ventrális közepét mutatja. C, TH immunhisztokémia a kontroll középső agyában a DA neuronok jelenlétét mutatja a VTA és a materia nigra pars compacta (SNpc; nyíl jelzésével). D, a BLA-mentett DD egereknek kis számú TH-pozitív neuronja volt a VTA-ban. A bemenet 40 × nagyítás a dobozos régióban, amely TH kifejeződését mutatja a szomában és a folyamatokban. E, VTA-mentett DD egerek TH expresszióját főleg a VTA-ban mutatták ki. Ne feledje, hogy nincs-e TH-festés az SNpc-ben (nyíllal jelezve). F – H, Coronális szakasz (4 × nagyítás) a WT vírus-befecskendezett kontrollból, BLA-mentett és VTA-mentett DD egerekből, amely TH expresszióját mutatja a dorsalis striatumban és a nucleus accumbensben. Az F, WT vírussal befecskendezett kontrollok TH expresszióval rendelkeznek a teljes hátsó (nyíllal jelzett) és a ventrális striatumban. G, A BLA-mentett DD-egerek striatumában nincs TH-expresszió. H, a VTA-mentett DD egerek TH-expresszióját mutatják a nukleáris accumbensben, csak kis mértékben festik a dorzális striatumban (jelezve nyíl). I – K, koronális szakasz (10 × nagyítás), amely TH-expressziót mutat a vírus által injektált WT-kontroll, BLA-mentett és VTA-mentett DD egerek BLA-ban.
A bazolaterális amygdalával injekciózott egereket 3 napos félelem-potenciált riadalom paradigmának vetettük alá. A rövid távú memóriát és a sokkérzékenységet 10 perccel az edzés után, a hosszú távú memóriát pedig a félelem által erősített megdöbbenés szempontjából 24 órával az edzés után értékelték (6A. ábra). Érdekes módon a bazolaterális amygdalával injekciózott DD egerekben csak a rövid távú memória állt helyre. A rövid távú memória szintje megegyezett a kontrollokéval, de a hosszú távú memória (p<0.05; Student-féle t-teszt) és a sokkérzékenység (p<0.05; Student-féle t-teszt) szintje szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a kontrolloké. Az edzés során a sokk-reaktivitás szintje azonos volt a csoportok között (kontroll: 1613±333 versus BLA-val megmentett DD: 1758±260). Ezek az adatok azt sugallják, hogy a bazolaterális amygdalára irányuló DA-projekciók, amelyek főként a ventrális tegmentális terület caudalis aspektusából származnak, elegendőek a figyelmeztetett félelem memória rövid távú elsajátításához, ugyanakkor a DA-projekciók más kérgi vagy limbikus agyterületekre valószínűleg elengedhetetlenek kontextuális tanulás és a félelem emléknyomának hosszú távú stabilizálása. 6. ábra A basolaterális amygdalával (BLA) megmentett DD egerek a rövid távú memóriát, míg a ventrális tegmentális terület (VTA) által megmentett DD egerek teljesen helyreállították a tanulást. A, Vírussal injektált WT kontroll (n=7) és BLA-val megmentett DD egerek (n=7) 3 napos félelem-potenciált megdöbbentő paradigmának vetettük alá. Balra a sokkérzékenység szignifikánsan alacsonyabb a BLA-val megmentett egerekben. A BLA-val megmentett egerekben a középső, rövid távú memória (STM) visszaállt a kontroll szintre. Jobb, a hosszú távú memória (LTM), amelyet 24 órával az edzés után értékeltek, hiányzik a BLA-val megmentett egereknél. B, A WT-kontroll (n=10) és a VTA-val megmentett DD egerek (n=7) eredményei a 3 napos félelem-potenciált megdöbbentő paradigmában. Balra, a sokkérzékenység a VTA-val megmentett DD egerekben nem különbözött szignifikánsan a kontrolltól. Középen és jobb oldalon az STM és LTM memória szintje megegyezett a VTA-rescue egerek kontrolljával. A csillagok p<0.05-öt jelölnek, mentés versus kontroll, Student-féle t-teszt. Minden jelentett érték átlag ± SEM
A TH-nek a ventrális tegmentális terület DA neuronjainak helyreállítása elegendő a tanuláshoz
A ventrális középső agyból két nagy DA áramkör van; a mezostriatális áramkör, amely főként a ventrális tegmentális területből származik, és elsősorban a natia nigra pars compacta, és a mezokortikolimbikus áramkörből származik. A mezokortikolimbikus áramkör széles körben elterjedt az agyi magokra, amelyekről ismert, hogy fontosak a cue-függő félelem kondicionálásához, beleértve a bazolaterális amygdalát (Bjorklund és Dunnett, 2007; Lammel és mtsai, 2008). Annak vizsgálata, hogy a mezokortikolimbikus DA teljesebb helyreállítása szükséges-e a hosszú távú memóriához és a sokkérzékenységhez; A DD-t és a kontroll egereket egy AAV1-Cre-GFP vektorral kétoldalúan injektáltuk a ventrális tegmentális területbe, hogy specifikusan aktiváljuk az endogén Th gént (5B. Ábra).
Immunohisztokémiát alkalmaztunk azon DA neuronok kimutatására, amelyek célpontjai helyreállították a TH expressziót. A nem mentett DD egerekben a TH festés hiányzik (Hnasko et al., 2006). Az immunhisztokémia kimutatta, hogy a TH-ek helyreállítása a ventrális tegmentális területre injektált DD egerekben nagyon specifikus volt a ventrális tegmentális területre és annak célpontjaira (5E, H, K). Kevés a TH-festés a dorzális striatumban, ami a DA neuronok fő célpontja volt, amely a materiális nigra pars compacta-ból származik (5H. Ábra), míg a nukleáris accumbens és a basolaterális amygdala erős TH expresszióval rendelkezett (5H, K ábra).
A ventrális tegmentális területre injektált egereket ugyanazzal az 3-napos félelem-potenciált meglepő paradigmával kezeltük, mint a bazolaterális amygdala-injektált egereket (6B. Ábra). Az ingerérzékenységet, a rövid távú memóriát és a hosszú távú memóriát visszaállították a ventrális tegmentális területre injektált DD egerek kontroll szintjére. Az ütés-reaktivitás a képzés során ugyanaz volt a csoportok között (Control: 1653 ± 268 vs. VTA-mentett DD: 1602 ± 198). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a ventrális tegmentális területről származó DA-projekciók elegendőek a rövid távú és hosszú távú cued-félelmű memória kialakulására, valamint a kontextusfüggő sokkérzékenységre.
Megbeszélés
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a DA a félelem-potenciált meglepetés által mért cued-félelem kondicionáláshoz szükséges. A DD egerek nem mutattak félelem-potenciált meglepődést, kivéve, ha a DA-t a képzés után azonnal helyreállították. A DD egereknek is károsodtak a rövid távú memória és a sokkérzékenység. Fontos, hogy a DA-depletált DD egerekben a prepulzus-gátlás nem volt alacsonyabb, ami azt jelzi, hogy a szenzoros kapu nem csökken DA nélkül. Korábbi kutatások kimutatták, hogy a DA transzmissziót fokozó pszichostimulánsok csökkenthetik a prepulzus gátlást (Schwarzkopf és munkatársai, 1992; Bubser és Koch, 1994; Ralph és munkatársai, 1999; Swerdlow és munkatársai, 2006; Doherty és munkatársai, 2007; mások kimutatták, hogy a dopamin receptorok farmakológiai gátlása fokozza a prepulzus gátlását (Schwarzkopf és mtsai., 1993; Depoortere et al., 1997). Ezekkel a megállapításokkal összhangban a DD egerek kis, de szignifikáns növekedést mutattak a prepulzió gátlásában a kontroll egereknél. A korábbi vizsgálatok azt is kimutatták, hogy a DA receptorok farmakológiai gátlása csökkentheti az akusztikus meglepetés válaszát (Davis és Aghajanian, 1976; Schwarzkopf et al., 1993). A dopamin-kimerült DD egerek nem változtattak szignifikánsan megváltozott akusztikus meglepetéssel; ugyanakkor a kontrollokhoz viszonyított csökkent válaszok alakultak ki, különösen nagy ingerlési intenzitásokkal, összhangban a korábbi jelentésekkel (Schwarzkopf et al., 1993).
Az itt bemutatott adatok világosan mutatják, hogy a DA nem fontos a cue-függő félelemmemória kinyeréséhez vagy kifejezéséhez, mivel a DD egerek nem követelik meg a DA-t a tesztfolyamat során, hogy kifejezzék a félelem-potenciált megdöbbentést, amelyet korábban az L-Dopa injektálása után szereztek azonnal kiképzés. Kísérleteink azt is állítják, hogy a képzés során a kezdeti ingerfeldolgozáshoz szükséges DA-t szükségesnek tartjuk, mivel a DD egerek dopamin-kimerültek voltak minden edzés alatt. Ehelyett adataink arra utalnak, hogy a DA a memóriakövetés korai stabilizálásához szükséges, mivel a DD egerek nem fejeznek ki rövid távú memóriát, és a hosszú távú memória csak akkor jelenik meg, ha az L-Dopa azonnal, de nem az 1 hr. kiképzés. Feltételezhető, hogy a DD egerek L-Dopával történő injektálása közvetlenül az edzés után stabilizálja a memóriát, lehetővé téve, hogy egy hosszú távú formába lépjen. A félelem-kondicionálás szempontjából döntő fontosságú agyi régiókban a félelem-ingerlés szempontjából kulcsfontosságú, hosszantartó emelkedés a DA-szintekben, ami lehetővé teszi a félelem-memória ilyen stabilizálását (Abercrombie et al., 1989; Kalivas és Duffy, 1995; Doherty és Gratton, 1997; Inglis és Moghaddam, 1999). Adatainkkal összhangban mások azt mutatták, hogy a DA-funkció utáni manipulációk megváltoztatják a félelemhez kapcsolódó memóriát (Bernaerts és Tirelli, 2003; Lalumiere és mtsai, 2004; LaLumiere és mtsai, 2005).
Eredményeink azt mutatják, hogy a többszörös DA receptor altípusok szükségesek a félelem-potenciált meglepetéshez. A D1R KO egereknek nincsenek rövid és hosszú távú memóriái a félelem-potenciált meglepetéshez, ami arra utal, hogy ez a receptor altípus döntő szerepet játszik a DA hatásának közvetítésében a cue-függő félelem tanulásban. Érdekes, hogy a D1R KO egerekben a kontextusfüggő félelem tanulás ép volt. Ezek az adatok alátámasztják azokat a vizsgálatokat, amelyek azt mutatják, hogy a D1R-szerű antagonisták gyengítik a cue-kondicionált félelem tanulást anélkül, hogy befolyásolnák a sokkérzékenységet, és bizonyítják, hogy ezekben a kísérletekben a farmakológiai manipulációk specifikusak a D1R-re (Lamont és Kokkinidis, 1998; Guarraci et al., 1999) . Ezek az adatok összhangban vannak a D1R kritikus szerepét bemutató tanulmányokkal más cue-függő tanulási paradigmákban (Smith et al., 1998; Eyny és Horvitz, 2003).
A D2R KO sértetlen volt a félelemtől, de nem volt sokkérzékenység. Greba és mtsai. (2001) kimutatták, hogy a D2R intra-amygdaláris antagonizmusa megrongálta a sokk szenzitizálódását, és a félelem-potenzált megdöbbentés anélkül, hogy befolyásolná az alapvonalat, és nem reagált a lábfejre. A D2R aktiválása a BLA-ban a hosszú távú potenciál indukciójához vezet, ami feltehetően létfontosságú a félelem-potenciált meglepő memória (Bissiere et al., 2003) számára. Adataink azt mutatják, hogy a D2R nem szükséges a cue-függő félelem tanuláshoz, hanem, hogy ez a DA receptor altípus fontos a kontextusfüggő sokkérzékelésre. D2R KO egerek injektálása szisztémásan a D2-szerű antagonista etiklopriddal a képzés megelőzése előtt megakadályozta a félelem-potenciált meglepődést; ezért valószínű, hogy más D2R-szerű receptorok, amelyeket szintén gátolnak az etikloprid, kritikusak a félelem-potenciált meglepetésben (Sigala és munkatársai, 1997; Bernaerts és Tirelli, 2003; Laviolette és munkatársai, 2005; Swant és Wagner , 2006). Így a korábbi vizsgálatokban a D2-szerű antagonisták által okozott cue-függő tanulás károsodása a D2R család többi tagját gátló gyógyszereknek tulajdonítható.
Az endogén TH specifikusan a ventrális tegmentális területre történő szelektív helyreállítása a DD egerekben a tanulás helyreállításához vezetett. Az immunhisztokémia azt jelezte, hogy a TH-t helyreállították a fontos limbikus magokba, például a magvakba és a bazolaterális amygdala-ba, de nem a dorsalis striatumba. Ezen túlmenően nagyon kevés neuron volt pozitív a TH-nek a materia nigra pars compacta-ban. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a ventrális tegmentális terület neuronokból származó DA a cued és contextual-félelem kondicionálás szempontjából fontos.
Azok a egerek, amelyek szelektíven helyreállították a DA-t a bazolaterális amygdala-ra, rövid távú memóriát fejeztek ki, de nem a hosszú távú memóriát vagy a sokkérzékenységet. Korábbi vizsgálatok azt mutatták, hogy a DA elősegíti az amygdala funkciót a GABAerg gátló tónus megváltoztatásával, és ezt a hatást a D1R vagy a D2R közvetíti (Bissiere és munkatársai, 2003; Kroner és munkatársai, 2005; Marowsky és munkatársai, 2005). Az itt bemutatott adatok azt mutatják, hogy a DA a bazolaterális amygdala-ban kritikus fontosságú a rövid távú memória megszerzéséhez a félelem-potenciált meglepetésért, mégis nem elegendő a memória hosszú távú stabilitásához. A rövid távú memória helyreállítását a ventrális tegmentális területből származó kis számú bazolaterális amygdala-vetítő DA neuron közvetíti. Az endogén TH-ek szélesebb körű helyreállítása a ventrális tegmentális terület mentett DD egerekben ép, rövid távú és hosszú távú memóriát eredményezett; ezért a TH-nek más mezokortikolimbikus áramkörökre való helyreállítása valószínűleg szükséges ahhoz, hogy hosszú távú memóriát alakítson ki a félelem-potenciált meglepetés miatt. Korábbi vizsgálatok arra utalnak, hogy a nukleáris accumbens és a prefrontális kéreg szintén fontos célpontok lehetnek a DA-nak a félelem kondicionálásakor (Kalivas és Duffy, 1995; Murphy és mtsai, 2000; Pezze és mtsai, 2003; LaLumiere és munkatársai, 2005; al., 2005, Floresco és Tse, 2007). Ezért lehetséges, hogy a hosszú távú memória kialakulásához DA jelzés a nukleáris accumbensben vagy a prefrontális kéregben szükséges.
Összefoglalva, tanulmányunk a genetikai egérmodellek, a farmakológia és a régióspecifikus mentési funkció kombinációját használja fel annak bizonyítására, hogy a DA szükséges a félelem-potenciált meglepetéshez, a cue-függő félelem kondicionáló feladathoz. Ezek az eredmények hangsúlyozzák e neurotranszmitter fontos szerepét a jutalom feldolgozásán kívül. Vizsgálataink azt is jelzik, hogy a DA-nak több DA-receptorra kell reagálnia több agyi régióban a cue-függő félelem kondicionálására. A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy a ventrális tegmentális terület DA neuronjai molekuláris és fiziológiai tulajdonságaikban jelentősen eltérnek a célhelytől függően (Ford és mtsai, 2006; Margolis és munkatársai, 2006; Bjorklund és Dunnett, 2007; Lammel és munkatársai, 2008; Margolis és munkatársai, 2008). Az általunk elvégzett kísérletek, amelyekben a Th gént szelektíven aktiválták a basolaterális amygdala felé mutató DA neuronokban, azt mutatják, hogy ezek a ventrális tegmentális területek neuronjainak egy kis, kiválasztott populációja, nem pedig a más agyrégiókra vetítő DA neuronok közbeiktatása. Adataink a DA neuron populációk heterogenitását igazoló tanulmányokkal kombinálva hangsúlyozzák, hogy meg kell érteniük az egyes diszkrét DA áramkörök szerepét. A DA számos viselkedési és fiziológiai funkciójával kapcsolatos ismeretek kiterjesztése a félelemhez kapcsolódó tanuláshoz, az elterjedt félelemgel kapcsolatos rendellenességek jobb megértéséhez vezethet, mint pl. A traumatikus stressz-rendellenesség, rögeszmés-kényszeres betegség és generalizált szorongásos zavar.
Köszönetnyilvánítás
Ezt a vizsgálatot részben a Közegészségügyi Szolgálat, a Nemzeti Kutatási Szolgálat díja, a T32 GM07270, az Országos Általános Orvostudományi Intézet és az NIH Nemzeti Általános Orvostudományi Intézetek Grant 4 R25 GM 058501-05. Köszönjük Ilene Bernstein-nek, Lisa Beutler-nek, Charles Chavkin-nak és Larry Zweifel-nek, hogy hasznos megjegyzéseket tettek a kéziratra, Albert Quintanára a szövettani segítségért, és Valerie Wall-et az egér kolónia fenntartásához. Köszönet illeti Dr. Miguel Chillont (a CBATEG vektorgyártó egységét a Barcelonában az Universitat Autonoma-nál) a CAV2 és a Matthew AAV1 vírusért.
Referenciák
1. Abercrombie ED, Keefe KA, DiFrischia DS, MJ Zigmond. A stressz differenciális hatása az in vivo dopamin felszabadulásra a striatumban, a nucleus accumbensben és a mediális frontális kéregben. J Neurochem. 1989; 52: 1655-1658. [PubMed]
2. Bernaerts P, Tirelli E. A PD4 dopamin D168,077-receptor agonista facilitáló hatása a C57BL/6J egerekben a gátló elkerülés tanult válaszának memória-konszolidációjára. Behav Brain Res. 2003;142:41–52. [PubMed]
3. Bissiere S, Humeau Y, Luthi A. Dopamin kapja az LTP indukcióját az oldalsó amygdala-ban az előremenő gátlás elnyomásával. Nat Neurosci. 2003; 6: 587-592. [PubMed]
4. Bjorklund A, Dunnett SB. Dopamin neuron rendszerek az agyban: frissítés. Trendek Neurosci. 2007; 30: 194-202. [PubMed]
5. Bubser M, Koch M. Patkányok akusztikus riadozási válaszának prepulzus-gátlását csökkentik a mediális prefrontális kéreg 6-hidroxidopamin léziói. Psychopharmacology (Berl) 1994;113:487–492. [PubMed]
6. Davis M, Aghajanian GK. Az apomorfin és a haloperidol hatása a patkányok akusztikus megdöbbenésére. Psychopharmacology (Berl) 1976;47:217–223. [PubMed]
7. de Oliveira AR, Reimer AE, Brandao ML. Dopamin D2 receptor mechanizmusok a kondicionált félelem kifejeződésében. Pharmacol Biochem Behav. 2006; 84: 102-111. [PubMed]
8. Depoortere R, Perrault G, Sanger DJ. A megdöbbentő reflex prepulzus-gátlásának fokozása patkányokban: az eljárás farmakológiai értékelése, mint modell az antipszichotikus aktivitás kimutatására. Psychopharmacology (Berl) 1997;132:366–374. [PubMed]
9. Doherty JM, Masten VL, Powell SB, Ralph RJ, Klamer D, Low MJ, Geyer MA. A D1, D2 és D3 dopamin receptor altípusok hozzájárulása a kokain zavaró hatásaihoz az egerek prepulzusgátlására. Neuropszichofarmakológia. 2007;12:12.
10. Doherty MD, Gratton A. A nucleus accumbens NMDA receptorai modulálják a stressz által kiváltott dopamin felszabadulását a nucleus accumbensben és a ventrális tegmentalis területen. Szinapszis. 1997;26:225–234. [PubMed]
11. Drago J, Gerfen CR, Lachowicz JE, Steiner H, Hollon TR, Love PE, Ooi GT, Grinberg A, Lee EJ, Huang SP és mások. Megváltozott striatális funkció D1A dopaminreceptorokat nem tartalmazó mutáns egérben. Proc Natl Acad Sci US A. 1994;91:12564–12568. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
12. Eyny YS, Horvitz JC. A D1 és D2 receptorok ellentétes szerepe az étvágygerjesztő kondicionálásban. J Neurosci. 2003;23:1584–1587. [PubMed]
13. Floresco SB, Tse MT. A gátló és serkentő transzmisszió dopaminerg szabályozása a bazolaterális amygdala-prefrontális kortikális útvonalon. J Neurosci. 2007;27:2045–2057. [PubMed]
14. Ford CP, Mark GP, Williams JT. A mesolimbikus dopamin neuronok tulajdonságai és opioidgátlása a célhelytől függően változik. J Neurosci. 2006; 26: 2788-2797. [PubMed]
15. Greba Q, Kokkinidis L. Az SCH 1 dopamin D23390-receptor antagonista perifériás és intraamygdaláris beadása blokkolja a félelem által felerősített megdöbbenést, de nem a sokk-reaktivitást vagy az akusztikus megdöbbenés sokkérzékenységét nem. Behav Neurosci. 2000;114:262–272. [PubMed]
16. Greba Q, Munro LJ, Kokkinidis L. A ventrális tegmentális terület kolinerg muszkarin receptorainak részvétele a klasszikusan kondicionált félelemkifejezésben, félelem-potenciált riadalommal mérve. Brain Res. 2000;870:135–141. [PubMed]
17. Greba Q, Gifkins A, Kokkinidis L. Az amygdaloid dopamin D2 receptorok gátlása rontja az érzelmi tanulást, félelem-potenciált megdöbbenéssel mérve. Brain Res. 2001;899:218–226. [PubMed]
18. Guarraci FA, Kapp BS. A ventrális tegmentális terület dopaminerg neuronok elektrofiziológiai jellemzése differenciált pavlovi félelemben, az ébren lévő nyúlban kondicionálva. Behav Brain Res. 1999; 99: 169-179. [PubMed]
19. Guarraci FA, Frohardt RJ, Kapp BS. Az amygdaloid D1 dopamin receptor részvétele a pavlovi félelem kondicionálásában. Brain Res. 1999;827:28–40. [PubMed]
20. Guarraci FA, Frohardt RJ, Falls WA, Kapp BS. A D2 dopamin receptor antagonista intra-amigdaloid infúziójának hatása a pavlovi félelem kondicionálására. Behav Neurosci. 2000;114:647–651. [PubMed]
21. Hnasko TS, Perez FA, Scouras AD, Stoll EA, Gale SD, Luquet S, Phillips PE, Kremer EJ, Palmiter RD. A nigrostriatális dopamin Cre rekombináz által közvetített helyreállítása dopaminhiányos egerekben visszafordítja a hipofágiát és a bradykinesiát. Proc Natl Acad Sci US A. 2006;103:8858–8863. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
22. Horvitz JC. Mezolimbokortikális és nigrostriatális dopaminreakciók kiemelkedő, nem jutalommal járó eseményekre. Idegtudomány. 2000;96:651–656. [PubMed]
23. Inglis FM, Moghaddam B. Az amygdala dopaminerg innervációja erősen reagál a stresszre. J Neurochem. 1999; 72: 1088-1094. [PubMed]
24. Inoue T, Izumi T, Maki Y, Muraki I, Koyama T. A dopamin D(1/5) antagonista SCH 23390 hatása a kondicionált félelem megszerzésére. Pharmacol Biochem Behav. 2000;66:573–578. [PubMed]
25. Joshua M, Adler A, Mitelman R, Vaadia E, Bergman H. Midbrain dopaminerg neuronok és striatális kolinerg interneuronok kódolják a különbséget a jutalom és az averzív események között a valószínűségi klasszikus klinikai kísérletek különböző korszakaiban. J Neurosci. 2008; 28: 11673-11684. [PubMed]
26. Kalivas PW, Duffy P. A dopamin transzmisszió szelektív aktiválása a mag magjába a stressz hatására. Brain Res. 1995; 675: 325-328. [PubMed]
27. Kelly MA, Rubinstein M, Asa SL, Zhang G, Saez C, Bunzow JR, Allen RG, Hnasko R, Ben-Jonathan N, Grandy DK, Low MJ. Hipofízis lactotroph hiperplázia és krónikus hiperprolaktinémia dopamin D2 receptor hiányos egerekben. Idegsejt. 1997;19:103–113. [PubMed]
28. Koch M. A meglepetés neurobiológiája. Prog Neurobiol. 1999; 59: 107-128. [PubMed]
29. Kroner S, Rosenkranz JA, Grace AA, Barrionuevo G. A dopamin modulálja a bazolaterális amygdala neuronok ingerlékenységét in vitro. J Neurophysiol. 2005; 93: 1598-1610. [PubMed]
30. Lalumiere RT, Nguyen LT, McGaugh JL. A dopamin edzés utáni intrabazolaterális amygdala infúziói modulálják a gátló elkerülő memória konszolidációját: noradrenerg és kolinerg rendszerek bevonása. Eur J Neurosci. 2004;20:2804–2810. [PubMed]
31. LaLumiere RT, Nawar EM, McGaugh JL. A basolaterális amygdala vagy a nucleus accumbens héj által a memóriakonszolidáció modulálása egyidejű dopamin receptor aktiválást igényel mindkét agyi régióban. Ismerje meg a Mem. 2005; 12: 296-301. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
32. Lammel S, Hetzel A, Hackel O, Jones I, Liss B, Roeper J. Unique properties of mesoprefrontal neurons within a dual mesocorticolimbic dopamine system. Idegsejt. 2008;57:760–773. [PubMed]
33. Lamont EW, Kokkinidis L. Az SCH 1 dopamin D23390 receptor antagonista infúziója az amygdalába blokkolja a félelem kifejezését egy megerősített megdöbbentő paradigmában. Brain Res. 1998;795:128–136. [PubMed]
34. Laviolette SR, Lipski WJ, Grace AA. A mediális prefrontális kéreg neuronjainak egy szubpopulációja az érzelmi tanulást kódolja burst és frekvencia kódokkal egy dopamin D4 receptor-függő bazolaterális amygdala bemeneten keresztül. J Neurosci. 2005;25:6066–6075. [PubMed]
35. Lemon N, Manahan-Vaughan D. A dopamin D1/D5 receptorok új információk megszerzését biztosítják a hippocampális hosszú távú potencírozáson és a hosszú távú depresszión keresztül. J Neurosci. 2006;26:7723–7729. [PubMed]
36. Maren S. Az amygdala, a szinaptikus plaszticitás és a félelememlékezet. Ann NY Acad Sci. 2003;985:106–113. [PubMed]
37. Maren S, Quirk GJ. A félelem memória neuronális jelzése. Nat Rev Neurosci. 2004;5:844–852. [PubMed]
38. Margolis EB, Mitchell JM, Ishikawa J, Hjelmstad GO, Fields HL. Midbrain dopamin neuronok: a vetítési cél meghatározza az akciós potenciál időtartamát és a dopamin D (2) receptor gátlását. J Neurosci. 2008; 28: 8908-8913. [PubMed]
39. Margolis EB, Lock H, Chefer VI, Shippenberg TS, Hjelmstad GO, Fields HL. A kappa opioidok szelektíven szabályozzák a prefrontális kéregbe kinyúló dopaminerg neuronokat. Proc Natl Acad Sci US A. 2006;103:2938–2942. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
40. Marowsky A, Yanagawa Y, Obata K, Vogt KE. Az interneuronok speciális alosztálya közvetíti az amygdala funkció dopaminerg elősegítését. Idegsejt. 2005; 48: 1025-1037. [PubMed]
41. McNish KA, Gewirtz JC, Davis M. A kontextuális félelem bizonyítéka a hippocampus elváltozásai után: a fagyás megzavarása, de nem a félelem által erősített megdöbbenés. J Neurosci. 1997;17:9353–9360. [PubMed]
42. Missale C, Nash SR, Robinson SW, Jaber M, Caron MG. Dopamin receptorok: a szerkezettől a működésig. Physiol Rev. 1998;78:189–225. [PubMed]
43. Murphy CA, Pezze M, Feldon J, Heidbreder C. A dopamin differenciális részvétele a nucleus accumbens héjában és magjában egy averzíven kondicionált inger látens gátlásának kifejezésében. Idegtudomány. 2000;97:469–477. [PubMed]
44. Pezze MA, Feldon J. Mesolimbikus dopaminerg útvonalak a félelem kondicionálásában. Prog Neurobiol. 2004; 74: 301-320. [PubMed]
45. Pezze MA, Bast T, Feldon J. A dopamin transzmisszió jelentősége a patkány mediális prefrontális kéregében a kondicionált félelem miatt. Cereb Cortex. 2003;13:371–380. [PubMed]
46. Ponnusamy R, Nissim HA, Barad M. A D2-szerű dopamin receptorok szisztémás blokádja elősegíti a kondicionált félelem kihalását egerekben. Ismerje meg a Mem. 2005; 12: 399-406. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
47. Ralph RJ, Varty GB, Kelly MA, Wang YM, Caron MG, Rubinstein M, Grandy DK, Low MJ, Geyer MA. A dopamin D2, de nem D3 vagy D4 receptor altípusa nélkülözhetetlen az amfetamin által termelt prepulzusgátlás megzavarásához egerekben. J Neurosci. 1999;19:4627–4633. [PubMed]
48. Ralph-Williams RJ, Lehmann-Masten V, Otero-Corchon V, Low MJ, Geyer MA. A közvetlen és közvetett dopamin agonisták eltérő hatásai a prepulzus gátlására: egy vizsgálat D1 és D2 receptor knock-out egereken. J Neurosci. 2002;22:9604–9611. [PubMed]
49. Richardson R. Megdöbbenés sokkérzékenysége: tanult vagy nem tanult félelem? Behav Brain Res. 2000; 110:109–117. [PubMed]
50. Risbrough VB, Geyer MA, Hauger RL, Coste S, Stenzel-Poore M, Wurst W, Holsboer F. A CRF(1) és CRF(2) receptorok szükségesek a megdöbbentő és a kontextuális jelzésekhez, de nem. Neuropszichofarmakológia. 2008;19:19.
51. Rosenkranz JA, Grace AA. A szag által kiváltott amygdala potenciálok dopamin által közvetített modulációja a pavloviai kondicionálás során. Természet. 2002; 417: 282-287. [PubMed]
52. Schultz W. A dopamin és jutalom formális megszerzése. Idegsejt. 2002;36:241–263. [PubMed]
53. Schwarzkopf SB, Mitra T, Bruno JP. Érzékszervi kapuzás újszülöttként dopaminhiányos patkányokban: potenciális jelentősége a skizofrén betegeknél. Biol Psychiatry. 1992;31:759–773. [PubMed]
54. Schwarzkopf SB, Bruno JP, Mitra T. A haloperidol és az SCH 23390 hatásai az akusztikus megdöbbenésre és az előpulzus gátlására alap- és stimulált körülmények között. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 1993;17:1023–1036. [PubMed]
55. Sigala S, Missale C, Spano P. A dopamin D2 és D3 receptorok ellentétes hatásai a tanulásra és a memóriára patkányban. Eur J Pharmacol. 1997;336:107–112. [PubMed]
56. Sigurdsson T, Doyere V, Cain CK, LeDoux JE. Hosszú távú potencírozás az amygdalában: a félelemtanulás és a memória sejtmechanizmusa. Neurofarmakológia. 2007;52:215–227. [PubMed]
57. Smith DR, Striplin CD, Geller AM, Mailman RB, Drago J, Lawler CP, Gallagher M. D1A dopaminreceptorokat hiányzó egerek viselkedési értékelése. Idegtudomány. 1998;86:135–146. [PubMed]
58. Swant J, Wagner JJ. A dopamin transzporter blokád növeli az LTP-t a patkány hippocampus CA1 régiójában a D3 dopamin receptor aktiválásával. Tanuld meg Mem. 2006;13:161–167. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
59. Swerdlow NR, Shoemaker JM, Kuczenski R, Bongiovanni MJ, Neary AC, Tochen LS, Saint Marie RL. Az előagy D1 funkciója és a szenzomotoros kapuzás patkányokban: a D1 blokád hatása, a frontális elváltozások és a dopamin denervációja. Neurosci Lett. 2006;402:40–45. [PubMed]
60. Szczypka MS, Rainey MA, Kim DS, Alaynick WA, Marck BT, Matsumoto AM, Palmiter RD. Táplálkozási viselkedés dopaminhiányos egerekben. Proc Natl Acad Sci US A. 1999;96:12138–12143. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
61. Bölcs RA. Dopamin, tanulás és motiváció. Nat Rev Neurosci. 2004; 5:483–494. [PubMed]
62. Zhou QY, Palmiter RD. A dopaminhiányos egerek súlyosan hipoaktívak, csípősek és aphagikusak. Sejt. 1995; 83: 1197-1209. [PubMed]
63. Zweifel LS, Argilli E, Bonci A, Palmiter RD. Az NMDA receptorok szerepe a dopamin neuronokban a plaszticitás és az addiktív viselkedés szempontjából. Idegsejt. 2008;59:486–496. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
;
