Első pszichiátria. 2018; 9: 81.
Megjelent online 2018 Mar 12. doi: 10.3389 / fpsyt.2018.00081
PMCID: PMC5858605
PMID: 29593587
Minho Lee,1,† Hyeyoung Cho,2,3,† Seung Hyun Jung,2,4 Seon-Hee Yim,2 Sung-Min Cho,2,3 Ji-Won Chun,5 Soo-Hyun Paik,5 Yae Eun Park,6,7 Dong Huey Cheon,7,8 Ji Eun Lee,7 Jung-Seok Choi,9 Dai-Jin Kim,5,* és a Yeun-Jun Chung1,2,3,*
Absztrakt
Háttér
Az internet és az online játékok addiktív használata potenciális pszichiátriai rendellenesség, amelyet internetes játékzavarnak (IGD) neveznek. Megváltozott mikroRNS (miRNS) expressziós profilokat jelentettek bizonyos pszichiátriai rendellenességekkel küzdő betegek vérében és agyszövetében, amelyeket biomarkerekként javasoltak. Az IGD-ben azonban nem érkezett jelentés a vér miRNS profiljáról.
Mód
Az IGD-hez kapcsolódó miRNS-ek felfedezéséhez elemeztük az 51 minták (25 IGD és 26 kontrollok) miRNS expressziós profilját a TaqMan alacsony sűrűségű miRNA tömb segítségével. Az érvényesítéshez kvantitatív reverz transzkripciós PCR-t végeztünk 36 független mintákkal (20 IGD és 16 kontrollok).
Eredmények
A felfedezés és a független validálás révén három miRNS-t (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-652-3p) azonosítottunk, amelyek szignifikánsan alulszabályoztak az IGD csoportban. Mindhárom miRNS-változással rendelkező egyének sokkal nagyobb IGD-kockázatot mutattak, mint azok, akik nem változtak [esélyarány (OR) 22, 95% CI 2.29 – 211.11], és az OR-k növelték a dózist a megváltozott miRNS-ek számától függően. A három miRNS várható célgénjeit idegi útvonalakkal asszociáltuk. Megvizsgáltuk a három downstream célgén protein expresszióját Western blot módszerrel és megerősítettük, hogy a GABRB2 és a DPYSL2 expressziója szignifikánsan magasabb volt az IGD csoportban.
Következtetés
Megfigyeltük, hogy a hsa-miR-200c-3p, a hsa-miR-26b-5p és a hsa-miR-652-3p expressziója alulszabályozott volt az IGD betegekben. Eredményeink hasznosak lesznek az IGD patofiziológiájának megértésében.
Bevezetés
Az internet és az Internet-alapú játékok addiktív használata nem csupán társadalmi jelenség azokban az országokban, ahol kiterjedt internet-hozzáférési infrastruktúra működik, hanem egy lehetséges pszichiátriai rendellenességnek is nevezik az internetes játék zavarát (IGD) (1-3). Az epidemiológiai jelentések szerint a serdülőknél az IGD prevalenciaszintje országonként változik, az 0.8-től az 26.7% -ig terjedően (4). Különösen a tanulmányok mutatják az 10% feletti prevalenciaarányt serdülőknél sok ázsiai országban, például Dél-Korea, Kína, Tajvan, Hongkong és Szingapúr (4). Az IGD a megismerés, a pszicho-társadalmi kapcsolatok és a mindennapi élet károsodásával jár; például csökken a tudományos vagy foglalkozási teljesítmény (4-7). Az IGD bekerült a mentális rendellenességek diagnosztikai és statisztikai kézikönyvének (DSM-V) ötödik változatának III. Szakaszába (További vizsgálati feltételek) (8). Klinikai-társadalmi jelentőségük ellenére azonban kevés információ áll rendelkezésre az IGD mögötti molekuláris genetikai mechanizmusról.
A közelmúltban végzett nagyszabású iker-kutatások genetikai hátteret sugalltak az IGD (9, 10). Vink et al. megvizsgálta a holland ikernyilvántartásban az 5,247 monozigótikus és dizigótikus serdülő ikrekkel való kényszeres internethasználat különbségeit, és arról számolt be, hogy a különbségek 48% -át genetikai tényezők magyarázzák (9). Li et al. megfigyelték a kínai serdülő ikrek 825 pároit, és arról számoltak be, hogy a genetikai tényezők magyarázzák a különbségek 58 – 66% -át (10). Ennek megfelelően a neurotranszmisszióban, a megismerésben és a figyelemben részt vevő gének, például a dopamin receptor D2 gén (DRD2), katecholamin-O-metil-transzferáz gén (COMT), szerotonin transzporter gén (5HTTLPR) és kolinerg receptor nikotin-alfa 4 gén (CHRNA4) beszámoltak arról, hogy jelentős mértékben társulnak az internetes függőséghez (11-13). Nemrégiben Kim et al. az 100 jelölt géneknél szkrínelt változatokat, amelyek a neurotranszmitterek termelésével, működésével és anyagcseréjével kapcsolatosak, a következő generációs szekvencia-elemzéssel, és beszámoltak arról, hogy az rs2229910 NTRK3 gén van társítva az IGD-vel (14).
A genetikai tényezőkön túl az is ismert, hogy a neuro-viselkedésbeli fenotípusokat epigenetikusan nem kódoló RNS-ek, ideértve a mikroRNS-eket (miRNS-eket) (15, 16). A miRNS-k kicsi nem kódoló egyszálú RNS-molekulák (körülbelül 20 – 23 nukleotidok hosszúak), amelyek negatív módon szabályozzák a fehérjekódoló gének expresszióját az mRNS lebontásával, és kritikus szerepet játszanak a különféle betegségek patofiziológiai folyamatában (17). A bizonyítékok sora rámutatott, hogy a miRNS-ek bőségesen vannak az emberi központi idegrendszerben (CNS), és a célgének expressziós szintjének finomhangolására szolgálnak, amelyek részt vesznek a központi idegrendszer kialakításában és érésében (15). A közelmúltbeli tanulmányok valóban azt mutatták, hogy a miRNS expressziós profilja megváltozott a pszichiátriai rendellenességekkel rendelkező betegek agyszövetében, ami arra utal, hogy expressziós profiljuk biomarkerek lehetnek a pszichiátriai rendellenességekhez (15, 16, 18). Például, postmortem elemzéssel Lopez és mtsai. számolt be arról, hogy a miR-1202 expresszióját, amely szabályozza a metabotróp glutamát receptor-4 gén expresszióját és előrejelzi az antidepresszánsra adott választ, alulszabályozták a depresszió súlyos betegségben szenvedő betegek prefrontális kéregszöveteiben (19). A biomarker szűrés szempontjából ennek a megközelítésnek egyértelmű korlátja van, mivel a szűréshez a központi idegrendszeri szövet biopszia elvégzése lehetetlen. Mivel a miRNS-ek kimutathatók a vérben (plazma vagy szérum), a keringő miRNS-eknek határozott előnye van, mivel nem invazív biomarkerek a neuropszichiátriai rendellenességekben. Mindeddig azonban nem történt tanulmány az IGD keringő miRNS profiljairól. A keringő miRNS expressziós profilok jobb megértése elősegítheti az IGD fejlődésének mechanizmusát és megkönnyítheti a klinikai transzlációt.
Ebben a tanulmányban arra törekedtünk, hogy az IGD-hez kapcsolódó miRNS markereket azonosítsuk az IGD és a kontrollcsoportok között eltérően expresszált plazma miRNS-ek megfigyelésével, és feltárjuk azok biológiai következményeit.
Anyagok és módszerek
Tanulmányi tárgyak
Megkérdeztük az 3,166 tinédzsereket (12 – 18 éves) a DSM-V IGD pontozással. Ezek közül az 251-et (168 hímek és 83 nők) IGD-ként diagnosztizálták a DSM-V kritériumok alapján (8). Összesen 91 egyén (49 IGD és 42 kontroll) adta meg a tájékozott beleegyezését e vizsgálathoz. Közülük négy egyént kizártak a kizárási kritériumok alapján. Végül 87 egyedeket (45 IGD alanyok és 42 egészséges kontroll egyének) vettünk fel ebbe a vizsgálatba. Közülük az 51 résztvevőit (25 IGD betegek és 26 kontrollok) toborozták a felfedező készletként 2014-ről 2016-ra. A többi 36 résztvevőt (20 IGD betegek és 16 kontrollok) az 2016-től független validációs készletként toborozták. Az összes résztvevő koreai egyének volt, bekerültek a Szöuli Szent Mária Kórházba (Szöul, Dél-Korea) és a Szöuli Nemzeti Egyetem Boramae Kórházába (Szöul, Dél-Korea). Minden résztvevő strukturált interjún ment keresztül egy pszichiáter által, az aktív rendellenességek és a szkizofrénia koreai Kiddie ütemterve alapján (K-SADS-PL) (20). Minden résztvevő elkészítette a Koreai-Wechsler intelligencia skála gyerekeknek, 4th kiadás (K-WISC-IV) (Block Design and Vocabulary) résztesteit (21). Az impulzivitást a Barratt Impulsiveness Scale (BIS) (22). A viselkedésgátló rendszer (BInS) és a viselkedés-aktiválási rendszer (BAS) skálait megmértük a személyiség dimenziójának értékeléséhez (23). A kizárási kritériumok között szerepeltek a múltbeli vagy jelenlegi súlyos orvosi rendellenességek (pl. Diabetes mellitus), idegrendszeri rendellenességek (pl. Rohamok, fejsérülések), pszichiátriai rendellenességek (pl. Súlyos depressziós rendellenességek, szorongásos rendellenességek), mentális retardáció vagy bármilyen anyaggal való visszaélés (pl. , dohány, kannabisz, alkohol). A vizsgálati alanyok általános jellemzőit a 4. táblázat foglalja össze Table1.1. Ezt a tanulmányt a koreai katolikus egyetemi orvosi főiskola intézményi felülvizsgálati testülete hagyta jóvá (MC16SISI0120). Minden résztvevő és szüleik írásbeli tájékozott hozzájárulást adtak.
Táblázat 1
A vizsgálati alanyok általános jellemzői.
| Felfedezés | Érvényesítés | Kombinált | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Ellenőrzés | IGD | P-érték | Ellenőrzés | IGD | P-érték | Ellenőrzés | IGD | P-érték | |
| N | 26 | 25 | 16 | 20 | 42 | 45 | |||
| Életkor (év) | |||||||||
| Medián (min – max) | 13 (12 - 17) | 13 (12 - 15) | 0.759 | 15 (13 - 18) | 14.5 (12 - 18) | 0.628 | 14 (12 - 18) | 14 (12 - 18) | 0.509 |
| Heti internetes játék órák (h) | |||||||||
| Medián (min – max) | 5.25 (2 - 17) | 18 (6 - 46) | 1.27E-6a | 5.5 (2 - 23) | 8 (1 - 112) | 0.374 | 5.5 (2 - 23) | 14 (1 - 112) | 1.63E-5a |
| Havi háztartási jövedelem (millió KRW) | |||||||||
| Medián (min – max) | 5 (1 - 9) | 3 (1 - 9) | 0.588 | 4 (4 - 4) | 2 (2 - 2) | 1.000 | 5 (1 - 9) | 3 (1 - 9) | 0.460 |
| Oktatás (év) | |||||||||
| Medián (min – max) | 8 (7 - 9) | 8 (7 - 9) | 0.584 | 12 (12 - 12) | 6 (6 - 13) | 0.305 | 8 (7 - 12) | 8 (6 - 13) | 0.269 |
| K-WISC: blokk kialakítás | |||||||||
| Medián (min – max) | 10.5 (4 - 17) | 10 (4 - 16) | 0.544 | 10 (3 - 16) | 12.5 (4 - 15) | 0.125 | 10 (3 - 17) | 11 (4 - 16) | 0.598 |
| K-WISC: szókincs | |||||||||
| Medián (min – max) | 9 (5 - 17) | 7 (5 - 13) | 0.174 | 9.5 (8 - 15) | 11.5 (5 - 15) | 0.595 | 9 (5 - 17) | 9 (5 - 15) | 0.527 |
| KS | |||||||||
| Medián (min – max) | 24 (17 - 36) | 37 (22 - 51) | 3.81E-6a | 29 (17 - 34) | 59 (22 - 108) | 1.2E-5a | 25 (17 - 36) | 40 (22 - 108) | 2.05E-10a |
| BIS | |||||||||
| Medián (min – max) | 63 (35 - 75) | 67.5 (45 - 81) | 0.080 | 61 (45 - 79) | 63 (32 - 82) | 0.835 | 62 (35 - 79) | 65 (32 - 82) | 0.240 |
| BAS | |||||||||
| Medián (min – max) | 31 (15 - 40) | 31 (13 - 51) | 0.558 | 36.5 (22 - 48) | 34 (27 - 52) | 1.000 | 32 (15 - 48) | 34 (13 - 52) | 0.637 |
| Tartályok | |||||||||
| Medián (min – max) | 18 (10 - 26) | 17.5 (13 - 27) | 0.642 | 18.5 (12 - 25) | 20 (13 - 21) | 0.138 | 18 (10 - 26) | 19 (13 - 27) | 0.302 |
IGD, internetes játékbetegségben szenvedő betegek; KS, koreai internetes függőségi érzékenységi skála; BIS, Barratt impulzivitási skála; BAS, viselkedési aktiváló rendszer; BInS, viselkedésgátló rendszer; KRW, koreai győzelem.
aP <0.05 (Mann – Whitney – Wilcoxon teszt).
TaqMan alacsony sűrűségű miRNA Array (TLDA) kísérletek
Az egyes résztvevőktől perifériás vért vettünk és az 4 h-en belül a laboratóriumba vittük a vérsejt-lízis minimalizálása érdekében. A mintát szobahőmérsékleten 3,000 fordulatszám mellett 10 percig centrifugáltuk. Ezután a felülúszót (plazmaréteg) összegyűjtöttük a vérsejtek szennyeződése nélkül. A keringő miRNS-eket a gyártó utasításainak megfelelően TaqMan miRNA ABC tisztítókészlettel (Human Panel A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) extraháltuk. Röviden: 50 µL plazma mintát és 100 µL ABC puffert összekevertünk. A cél-specifikus anti-miRNS mágneses gyöngyökkel történő hibridizációt követően a körülhatárolt keringő miRNS-eket a gyöngyökből 100 / ul eluálópufferrel eluáltuk. A felfedezés fázisában az 381 miRNS-eket megvizsgáltuk 51 plazmamintákból (25 IGD és 26 kontrollok) a TaqMan miRNA ABC tisztítókészlettel (Humán Panel; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) a gyártó utasításai szerint. Megaplex reverz transzkripciót és pre-amplifikációs reakciókat hajtottunk végre a cDNS mennyiségének növelése érdekében a miRNS expressziós elemzéséhez a MegaplexPreAmp Primers Human Pool A és TaqManPreAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific) felhasználásával. A TLDA panel A v2.0-et (Thermo Fisher Scientific) futtattuk a ViiA7 valós idejű PCR-rendszeren (Thermo Fisher Scientific) a miRNS-ek expressziójának értékelésére. A nyers adatokat az ExpressionSuite Software v1.0.4 (Thermo Fisher Scientific) alkalmazásával dolgoztuk fel, hogy meghatározzuk az egyes miRNS-ek Ct-értékeit.
A TLDA adatelemzése
Először megmértük az egyes miRNS-ek küszöbciklusait (Ct érték). a> 35-nél magasabb Ct-értékű miRNS-eket kimutathatatlannak tekintették, és kizárták a későbbi elemzésből. Valamennyi Ct értéket normalizáltuk a miR-374b Ct értékére (ΔCt érték), amely az egyik legstabilabban expresszált miRNS az emberi plazmában24). A kifejezés log2 hajtásváltási arányát (ΔΔCt érték) kiszámoltuk a kontroll minták kalibráló eszközének átlagértékei segítségével a Bioconductor HTqPCR csomagjában (25). Az egyes miRNS-célok relatív mennyiségi meghatározását (RQ) 2-ként határoztuk meg-ΔΔCt. A két csoport közötti expressziós különbség hipotetikus tesztelésére helyettesítő variábilis analízist (SVA) alkalmaztunk a heterogenitások, például a szakaszos hatások rögzítésére a kísérletekben SVA csomag Bioconductorban (26). miRNS-ek a P-A <0.05 értéket két csoport között szignifikánsan eltérőnek tekintettük.
Génkészlet-gazdagítási elemzés
A génkészlet-gazdagodás elemzéséhez a ToppFun-t használtuk a ToppGene Suite programban (27) a jelentős mértékben gazdagodott gén ontológia (GO) (28) kifejezések, útvonal és betegség fogalmak. Ennek a megközelítésnek a bemeneteként a miRNS jelölt 1,230 előrejelzett célgénjeit használtuk. A KEPG, a BioCarta, a Reactome, a GeneMAPP és az MSigDB szerint a ToppGene útvonalakban útvonal-elemzést használtunk a várható célgének jelentős útvonalainak megtalálására. A funkcionális gazdagodás fontosságát a Bonferroni-korrekcióval határoztuk meg P-érték.
Kvantitatív fordított transzkripciós PCR (qRT-PCR) validálás és replikáció
A felfedezés szakaszában differenciálisan expresszált 10 miRNS-ek validálására a qRT-PCR-t a TaqMan MicroRNS esszé segítségével végeztük (miR-15b-5p, #000390; miR-26b-5p, #000407; miR-29b-3b-000413-X) 125; miR-5b-000449p, #200; miR-3c-002300p, #337; miR-5-002156p, #411; miR-5-001610p, #423; miR-5; -002340p, #483 és miR-5-002338p, #652) és a ViiA3 rendszer (Life Technologies) a gyártó protokollja szerint. Tíz nanogramm teljes RNS-t konvertáltunk első szálú cDNS-ként miRNS-specifikus primerekkel a TaqMan MicroRNS reverz transzkripciós készlet (#002352, Life Technologies) felhasználásával, majd valós idejű PCR-rel a TaqMan Probes segítségével. Az egyes miRNS-ek RQ-ját 7-ként definiáltuk-ΔCt, ahol ΔCt a kérdéses minta küszöbciklusainak különbsége, normalizálva az endogén miRNS-sel (miR-374b-5p, #001319). Az összes PCR reakciót három példányban hajtottuk végre, és Ct értéküket átlagoltuk. Kiszámoltuk az egyes miRNS log2 hajtásváltási arányát (ΔΔCt) ugyanúgy, mint a tömb alapú elemzésnél. Nem parametrikus Mann – Whitney – Wilcoxon tesztet hajtottunk végre a miRNS-ek expressziós szintjeinek különbségeinek két küszöbértékkel történő vizsgálatára P- az 0.05 értéke.
Western blot elemzés
Mindegyik szérummintából előbb leürítették a felső 14 nagy mennyiségű fehérjét (albumin, immunoglobulin G, immunoglobulin A, szerotranszferrin, haptoglobin, alfa-1 antitripszin, fibrinogén, alfa-2 makroglobulin, alfa-1 sav-glikoprotein, immunoglobulin, immunoglobulin, immunoglobulin , apolipoprotein A-II, komplement C3 és transztiretin) a MARS-14 oszlopon (4.6 × 50 mm, Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA) a Western blot elemzés előtt. A MARS-14 oszlopból nyert kötetlen frakciót Amicon Ultracel-3 centrifugális szűrőn (3 kDa cutoff) koncentráljuk, majd a fehérje koncentrációját bicinchoninsav módszerrel meghatározzuk. Ugyanazon mennyiségű (10-ről 30 ug-ra) kontroll és IGD szérummintákat szétválasztunk egy 4 – 20% Mini-PROTEAN TGX előgyártó gélen (Bio-Rad, CA, USA) és átvisszük egy polivinilidén difluorid membránra. Ezután a membránt TBS-T-ben (190 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5 és 0.05% Tween 20) blokkoltuk 5% zsírmentes száraz tejjel szobahőmérsékleten 30 percig. A membránokat ezután a DPYSL2 (1: 500, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), GABRB2 (1: 1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) elleni primer antitestekkel és CNR1 (1: 100, , Inc., Santa Cruz, Kalifornia, USA), DUSP4 (1: 500, MybioSource, San Diego, Kalifornia, USA) és PI15 (1: 500, MybioSource, San Diego, Kalifornia, USA) a TBS-T-ben és az 5 % zsírmentes száraz tej 4 ° C hőmérsékleten egy éjszakán át, majd megfelelő szekunder antitestekkel, vagy szarvasmarha anti-egérrel (1: 1,000, Santa Cruz Biotechnology) vagy kecske anti-nyúllal (1: 1,000, Cell Signaling, Beverly, MA, USA) ) tormaperoxidázzal konjugálva szobahőmérsékleten 1 órán át. A jel detektálását kemilumineszcenciával végeztük, ECL reagenssel (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). A Western blot eredményeit a TotalLab 1D elemző szoftverrel (nemlineáris dinamika, Newcastle upon Tyne, Egyesült Királyság) számszerűsítettük. Ezután kiszámítottuk a denzitometriás hányados értékét az egyes minták denzitometria értékének elosztásával, ahol máshol leírtuk (29). A normalizálás kontrolljaként az 46 IGD-ből összegyűjtött szérum mintát és a kontroll mintákat használták minden kísérlethez. A statisztikai szignifikanciát egy nem-parametrikus Mann – Whitney – Wilcoxon teszt alkalmazásával határozzuk meg egy küszöbértékkel P- az 0.05 értéke.
Eredmények
A tantárgyak jellemzői
A vizsgálati alanyok demográfiai és klinikai jellemzőit a 2. táblázat mutatja Table1.1. Amikor összehasonlítottuk az IGD és a kontrollcsoportokat a koreai internetes függőség mértéke skála szerint (K-Mérete) másutt leírtak szerint (20, 30), az IGD csoport szignifikánsan magasabb medián K-skálát mutatott, mint a kontroll csoport (37 vs. 24, P = 3.81 × 10-6) (Asztal (Table1) .1). Az IGD-csoportban az internetes játékra fordított átlagos heti idő szignifikánsan hosszabb volt, mint a kontrolloknál (18 vs. 5.25 h, P = 1.27 × 10-6). Míg a K-WISC, BIS, BInS és BAS életkor, havi háztartási jövedelem, oktatás időtartama, blokk-tervezés és szókincs-subtest eredményei között nem volt szignifikáns különbség két csoport között.
Különbözősen kifejezett miRNS-ek az IGD és a kontrollok között
Az IGD-hez kapcsolódó miRNS-ek felfedezéséhez kétlépéses (felfedezés és független validálás) megközelítést alkalmaztunk. A tanulmány megtervezését és az általános stratégiát a kiegészítő anyag S1. Ábrája szemlélteti. A felfedezés szakaszában az 51 minták (25 IGD és 26 kontrollok) miRNS expressziós profilját elemeztük az 384 miRNS-eket tartalmazó miRNS tömb segítségével. Az 10 miRNS expressziós szintjei szignifikánsan különböznek az IGD és a kontrollcsoportok között (5. Táblázat) (Table2) .2). Ezen 10 miRNS-ek relatív expressziós szintjét az 1. ábra mutatja Figure1.1. Közülük kettőt (hsa-miR-423-5p és hsa-miR-483-5p) felülszabályoztak, és nyolcot (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-29b-3b, XA A hsa-miR-125b-5p, a hsa-miR-200c-3p, a hsa-miR-337c-5p, a hsa-miR-411-5p és a hsa-miR-652-3p) alcsoportban volt.
Táblázat 2
Diferenciálisan kifejezett mikroRNS-ek (miRNS-ek) és a hajtás változásai.
| miRNS | Felfedezés | Érvényesítés | Kombinált | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| P-érték | Hajtsa át a változást | P-érték | Hajtsa át a változást | P-érték | Hajtsa át a változást | |
| hsa-miR-15b-5p | 0.033 | 0.829 | 0.694 | 1.119 | 0.381 | 0.947 |
| hsa-miR-26b-5pa | 0.008 | 0.871 | 0.049 | 0.841 | 0.013 | 0.857 |
| hsa-miR-29b-3p | 0.005 | 0.400 | 0.560 | 1.187 | 0.089 | 0.647 |
| hsa-miR-125b-5p | 0.021 | 0.582 | 0.290 | 0.950 | 0.069 | 0.723 |
| hsa-miR-200c-3pa | 0.011 | 0.336 | 0.003 | 0.542 | 2.93 × 10-5 | 0.415 |
| hsa-miR-337c-5p | 0.009 | 0.385 | 0.582 | 0.872 | 0.020 | 0.553 |
| hsa-miR-411-5p | 0.004 | 0.322 | 0.336 | 1.282 | 0.158 | 0.595 |
| hsa-miR-423-5p | 0.026 | 1.387 | 0.189 | 0.955 | 0.518 | 1.175 |
| hsa-miR-483-5p | 0.018 | 1.861 | 0.765 | 1.413 | 0.211 | 1.647 |
| hsa-miR-652-3pa | 0.019 | 0.715 | 0.049 | 0.877 | 0.011 | 0.782 |
aA miRNS-ek következetesen jelentősen megváltoztak mind a felfedezés, mind az érvényesítés halmazában.
qRT-PCR validáció a jelölt miRNS-ekkel
Az 10 jelölt miRNS-ek validálásához elvégeztük a qRT-PCR-t független validációs készlettel (20 IGD és 16 kontrollok) (S1 táblázat a kiegészítő anyagban). Ezek közül a miRNS-ek közül három (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p és hsa-miR-652-3p) szignifikánsan alulszabályozódott az érvényesítési készlet IGD csoportjában (táblázat) (Table2) .2). Három másik miRNS-t (hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-125b és hsa-miR-423-5p) szintén alulszabályoztak az IGD csoportban, de nem szignifikánsan. A fennmaradó négy miRNS-t (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-411-5p és hsa-miR-423-5p) ellentétesen fejeztük ki az érvényesítési készletben. Amikor a felfedezési és validálási halmazokat (összesen 45 IGD alanyok és 42 kontrollok) kombináltuk, a három validált miRNS szignifikánsan szignifikáns volt (táblázat (Table2) .2). E három miRNS részletes információ, a kromoszómális helyek, az érett szekvenciák és az expressziós szintek a központi idegrendszerben megtalálhatók a kiegészítő anyag S2 táblázatában.
A három miRNS egyidejű változásának szinergetikus hatása az IGD kockázatára
A három miRNS együttes hatásának kiértékeléséhez megfigyeltük a négy alcsoport oddsarányát (OR) (0, 1, 2 vagy 3 miRNS változásokkal). A miRNS megváltozását az RQ érték határozta meg, a „Anyagok és módszerekMivel mind a három miRNS-markert az IGD-csoportban alulszabályozták, egy olyan miRNS-t, amelynek RQ értéke egynél alacsonyabb volt, megváltoztatottnak nevezték el. Az egyes vizsgálati alanyok három miRNS-re vonatkozó RQ-értékével kapcsolatos részletes információk a kiegészítő anyag S3. Táblázatában találhatók. Az egyes alcsoportokhoz az esélyeket kiszámítottuk a kontrollok és az IGD-k arányának arányában, majd az egyes OR-ket úgy számoltuk, hogy az egyes alcsoportok esélyeit elosztottuk az alcsoport oddsaival, miRNS-változtatások nélkül. Három miRNS-változással rendelkező egyének 22-kockázatát mutatták nagyobbszor, mint azoknál, akiknél miRNS-változtatás nem történt (OR 22, 95% CI 2.29 – 211.11). Az OR-k növekvő tendenciát mutattak az 0-ről 3-re változott miRNS-ek számával (r2 = 0.996) (ábra (Figure22).
A jelölt miRNA-k GO és útjának elemzése
Ahhoz, hogy betekintést nyerjünk az IGD csoportban szignifikánsan alárendelt három miRNS marker funkcióba, célgénjeiket a miRWalk 2.0 adatbázis segítségével megjósoltuk (31). Összesen 1,230 géneket következetesen előre jeleztek downstream célokként négy algoritmus (miRWalk, miRanda, RNA22 és Targetscan) segítségével a miRWalk adatbázist (32-34) (S4 táblázat kiegészítő anyagban). A ToppFene alkalmazásával végzett génkészlet-gazdagodás-elemzés a ToppGene Suite alkalmazásban azt mutatta, hogy ezen miRNS-ek célgének szignifikánsan kapcsolódtak az idegfejlődési útvonalakhoz, mint például az „Axon-irányítás” és a GO-kifejezésekhez, mint például „neurogenezis” (S5 táblázat a kiegészítő anyagban).
A várható célgének kifejezése
A három miRNS downstream célgénje között az 140-et egyidejűleg előre jelezték két vagy több miRNS esetében (S4 táblázat a kiegészítő anyagban). Annak feltárására, hogy a downstream célgének fehérje expressziós szintje eltér-e az IGD és a kontroll csoportok között, kiválasztottuk az 2 géneket (DUSP4 és a PI15), amelyek előrejelzése szerint az összes 3 miRNS és további 3 gén downstream célpontjai (GABRB2, DPYSL2és CNR1) azokból, amelyek előre jelezték az 2 miRNS-eket, és elvégezték a Western blot analízist a kísérlethez rendelkezésre álló 28 IGD-k plazmamintáival és 28 kontrollokkal. Összehasonlítottuk az öt cél kifejeződését az IGD és a kontrollcsoportok között úgy, hogy meghatározzuk a sáv intenzitását és területét, ahogyan másutt leírtuk (29). Ezek közül a DPYSL2 expressziós szintje (28 IGD és 28 kontrollok, P = 0.0037) és GABBR2 (27 IGD és 28 kontroll, P = 0.0052) szignifikánsan magasabbak voltak az IGD csoportban (XNUMX. ábra) (Figure3) .3). A CNR1 differenciális kifejezéseit azonban nem tudtuk megfigyelni (P = 0.0853), DUSP4 (P = 0.5443) és PI15 (P = 0.6346).
Megbeszélés
Úgy tűnik, hogy a miRNS-ek részt vesznek az idegsejtek fejlődésében (35, 36), és az agy miRNS-ek differenciált expresszióját megfigyelték olyan pszichiátriai betegségekben, mint például a skizofrénia (37). Ezért valószínű, hogy a keringő miRNS profilok hasznos biomarkerek lehetnek az IGD számára. A keringő miRNS-eket biomarkerekként javasolták a különféle neuropszichiátriai rendellenességek (38-40); az IGD fejlődésének molekuláris mechanizmusai azonban klinikai és társadalmi jelentőségük ellenére még mindig nagyrészt ismeretlenek. Pontosabban, nem végeztek vizsgálatokat az IGD-hez kapcsolódó miRNS-ekkel. A tanulmány célja kettős volt. Először megkíséreltük felfedezni az IGD-vel társított plazma miRNS-eket. Másodszor, a miRNS-jelöltek biológiai következményeit kiértékeljük a downstream célgének protein expressziójának és GO-jának feltárásával. A miRNS expressziós profiljainak genomszintű szűrésén és a jelöltek downstream validálásán keresztül felfedeztük, hogy három miRNS expressziója (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p és hsa-miR-652-3p) szignifikánsan alacsonyabb az IGD-s betegekben, mint a kontrollokban. Bár a többi hét miRNS-jelölt expressziós mintázatát nem replikálták a validálás során, ez hamis negatív lehet, mivel ebben a vizsgálatban a minta alacsony. Tudomásunk szerint ez az első jelentés arról a lehetőségről, hogy a vér miRNS expressziós profiljai hasznos biomarkerek lehetnek az IGD-ben. A három miRNA marker kombinációja minimálisan invazív eszköz lehet az IGD-vel veszélyeztetett emberek korai azonosításához.
A tanulmányban azonosított miRNS-ekről számoltak be, hogy különféle neuropszichiátriai rendellenességekben vesznek részt. A hsa-miR-200c vérben történő expressziójáról számos pszichiátriai rendellenesség, például skizofrénia (41) és súlyos depressziós epizódok (42). A miR-200c szinaptikus frakciókban kifejezettebben expresszálódtak, mint a teljes elülső agyban (43), valamint az idegsejtek halálához (44). Ezen előző jelentések alapján a miR-200c részt vesz a neurodevelopmentben és neuropszichiátriai rendellenességekkel társulhat, ha az expressziója zavarban van. Számos tanulmány javasolta a miR-652 és a neuropszichiátriai rendellenességek kockázata közötti összefüggést. A skizofrénia vérbiomarkereinek azonosítására alkalmazott megközelítésünkhöz hasonlóan, Lai et al. TLDA-elemzést végzett skizofrénia betegekkel és normál kontrollokkal, és megállapította, hogy hét miRNS-t, beleértve a hsa-miR-652-et, differenciálisan expresszálják skizofrénia betegekben (45). A későbbi tanulmányban megjósolták a miRNS expressziós adatait felhasználva egy predikciós modellt, és sikeresen megkülönböztették a skizofrénia és a normál kontroll (46). Az alkoholistákban megfigyelték a hsa-miR-652 megváltozott expresszióját is (47). Úgy találtuk, hogy a Hsa-miR-26b az idegsejtek differenciálódása során aktiválódik (48). Perkins et al. számolt be arról, hogy a hsa-miR-26b szabályozása a skizofrénia betegek prefrontalis cortexében csökkent (49).
Noha ezeknek a miRNS-eknek a zavart expressziója és az IGD patofiziológiája közötti kapcsolat alátámasztására nincs közvetlen bizonyíték, arra következtethetünk, hogy ezeknek a miRNS-eknek a diszregulációja összefüggésben lehet az IGD patofiziológiájával, a korábbi, a downstream génekre vonatkozó korábbi jelentések alapján. . A három miRNS néhány downstream génje, például a GABRB2, CNR1, NRXN1és DPYSL2 A jelentések szerint neuropszichiátriai rendellenességekkel járnak. A gamma-amino-vajsav (GABA) a központi idegrendszer egyik fő gátló neurotranszmittere. A GABA-receptor deregulációja szerepet játszik a neuropszichiátriai rendellenességekben, beleértve a függőséget, a szorongást és a depressziót (50), amelyek szintén az IGD fő jellemzői (8). A GABA receptor gének genetikai polimorfizmusainak beszámolása szerint alkoholfüggőséggel és skizofréniával (51, 52). A dihidropirimidináz-szerű 2 (DPYSL2) a kollaszin válasz mediátor fehérjecsalád tagja, amely szerepet játszik a mikrotubulusok összeállításában, a szinaptikus jelátvitelben és az axonális növekedés szabályozásában. Következésképpen ezt a molekulát biomarkerként javasolták a pszichiátriai rendellenességekhez (53, 54). Polimorfizmus a DPYSL2 a génről azt is beszámoltak, hogy alkoholfogyasztási rendellenességgel (55). A korábbi jelentések és adataink azt sugallják, hogy a GABRB2 és a DPYSL2 - a lefelé szabályozott miRNS-ek downstream célpontjai - túlexpressziója kihatással van a neuropszichiátriai rendellenességek patogenezisére, ideértve az IGD-t is. Az 1 típusú kannabinoid receptor (CNR1) egy presinaptikus heteroreceptor, amely modulálja a neurotranszmitter felszabadulását, és a kannabinoid jelátviteli zavarok különböző neuropszichiátriai rendellenességekkel (56). A genetikai polimorfizmus CNR1 A génről ismert, hogy a kaukázusi férfiaknál az anyagfüggőséggel kapcsolatos (57). Patkánymodellekben a CNR1 ventális hippokampusz aktiválása megzavarja a normális társadalmi viselkedést és a megismerést (58). Az NRXN családban bekövetkező genetikai változásokról ismert, hogy különféle neuropszichiátriai rendellenességekben, köztük függőségben (59).
A három miRNS-jelölt biológiai vonatkozásának közvetlen megvizsgálása céljából felfedeztük a downstream célgének fehérje expresszióját. A plazmaminták korlátozott elérhetősége miatt, az 140 általános jelöltjeinek (az 2 vagy annál több miRNS-től lejjebb becsülve) a Western blot alkalmazásával megvizsgáltuk az 5 célokat (GABRB2, DPYSL2, CNR1, DUSP4 és PI15), és megerősítettük a GABRBUM expresszióját. és a DPYSL2 szignifikánsan magasabb volt az IGD csoportban. A korábbi jelentések és adataink azt sugallják, hogy a GABRB2 és a DPYSL2 - a lefelé szabályozott miRNS-ek downstream célpontjai - túlexpressziója kihatással lehet a neuropszichiátriai rendellenességek patogenezisére, ideértve az IGD-t. A GO és az idegi fejlõdési útvonalak elemzésének eredményei szintén alátámasztják a miRNS markerek neurobiológiai következményeit. Egy másik érdekes megállapítás a miRNS-ek egyidejű megváltoztatásának szinergetikus hatása volt. Azok az egyének, akikben az összes 2 miRNS-t alulszabályozták, 3 kockázatot mutattak, mint azok, akiknél nem volt alulszabályozás, és az OR-k dózisfüggő módon növekedtek. Habár a CI e három változtatás esetében széles volt a korlátozott mintaméret miatt, a világos pozitív korreláció (r2 = 0.996) támogatja a három miRNS szinergetikus hatását.
Bár felfedeztük az IGD-hez kapcsolódó miRNS markereket, és mindhárom miRNS-változással rendelkező egyének 22 kockázata meghaladta a kockázatot, mint azoknak, akik nem tartalmaznak miRNS-változtatást, ebben a tanulmányban számos korlátozás van. Először, a kis minta mérete növeli annak valószínűségét, hogy hiányoznak más jelentős miRNS markerek. Másodszor, mivel adataink nem voltak elegendőek annak tisztázásához, hogy a plazma miRNS profilok okokat vagy következményeket mutatnak -, ezen klinikai körülmények között nem tudjuk megerősíteni ezen nem invazív markerek biológiai szerepét. További miRNS-profilozás és downstream génanalízisük az agyszövet-bankból származó emberi agyszövet felhasználásával közvetlenebb választ adhat. Hasznos lenne az agyszövet elemzése a játék zavarával járó állatmodell segítségével. Harmadsorban, a plazmaminták korlátozott elérhetősége miatt, csak öt, későbbi jelölt molekulát vizsgáltunk. További későbbi célpontok feltárása nagyobb mintasorral segít az IGD molekuláris mechanizmusának további megértésében.
Összefoglalva: a miRNS expressziós profiljainak genomszintű szűrésén és független validáláson keresztül három IGD-vel társított miRNS-t fedeztünk fel (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p és hsa-miR-652-3p). Úgy tűnik, hogy sok downstream génjük különféle neuropszichiátriai rendellenességekben vesz részt, és ezen downstream gének megváltozott expressziójának kísérleti validálása alátámasztja a tanulmányban azonosított miRNS-ek következményeit. Megállapítottuk, hogy azok a személyek, akik mind a három miRNS alulszabályozódtak, nagymértékben ki vannak téve az IGD kockázatának. Az ismert klinikai vagy környezeti kockázati tényezőkkel és diagnosztikai kritériumokkal megállapításaink megkönnyíthetik a korai beavatkozást, hogy segítsék az IGD nagyobb kockázatának kitett embereket.
Etikai nyilatkozat
Ezt a tanulmányt a koreai katolikus egyetemi orvosi főiskola intézményi felülvizsgálati testülete hagyta jóvá (MC16SISI0120). Minden résztvevő és szüleik írásbeli tájékozott hozzájárulást adtak.
Szerzői hozzájárulások
Az ML és a HC egyaránt hozzájárultak ehhez a cikkhez. Az ML, D-JK és Y-JC megtervezte a tanulmányt. SJ, S-MC, YP, DC és JL kísérleteket és adatgenerálást hajtott végre. A J-WC, S-HP, J-SC és D-JK vérmintákat és klinikai információkat gyűjtött. ML, HC, S-HY és Y-JC elemezte az adatokat. ML, HC, S-HY és Y-JC írta le a kéziratot. Az Y-JC felügyelte a projektet.
Érdekütközési nyilatkozat
A szerzők kijelentik, hogy a kutatást olyan kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolatok hiányában hajtották végre, amelyek potenciális összeférhetetlenségnek tekinthetők.
Lábjegyzetek
Finanszírozás. Ezt a munkát az Agykutatási Program támogatása támogatta a Korea Nemzeti Kutatási Alapítványán keresztül (NRF), amelyet a Tudományos és IKT és a jövőbeli tervezési minisztérium finanszírozott (NRF-2015M3C7A1064778).
Kiegészítő anyag
Az ehhez a cikkhez tartozó kiegészítő anyag az interneten található http://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpsyt.2018.00081/full#supplementary-material.
Referenciák
;
