Nat Neurosci. Szerző kézirat; kapható a PMC Jan 1, 2014 nyelven.
Végleges szerkesztett formában megjelent:
Nat Neurosci. 2013 július; 16 (7): 10.1038 / nn.3420.
Közzétett online június 2, 2013. doi: 10.1038 / nn.3420
PMCID: PMC3703824
NIHMSID: NIHMS477621
Hui Wang,*,1,2,3 Florian Duclot,*,1,2 Yan Liu,2,3 Zuoxin Wang,2,3 és a Mohamed Kabbaj1,2
A kiadó ennek a cikknek a végleges szerkesztett változata elérhető a következő weboldalon: Nat Neurosci
Lásd a PMC egyéb cikkeit idéz a közzétett cikket.
Absztrakt
A társadalmilag monogám prérimócában (Microtus ochrogaster), a párosodás tartós párkötéseket indukál, amelyeket a partnerpreferencia kialakulása indít és számos neurotranszmitter szabályozza, ideértve az oxitocint, vazopressint és dopamint. Itt vizsgáltuk a pár-kötés szabályozását közvetítő lehetséges epigenetikus mechanizmusokat. Megmutatjuk, hogy a hiszton-dezacetiláz-gátlók a nátrium-butirát és a TrichoStatin A (TSA) megkönnyítik a partner preferencia kialakulását a nők prérigombáján párzás hiányában. Ezt az oxitocin (OTR) és a vazopresszin V1a receptorok (V1aR) specifikus fokozódásával társították a nucleus akumulánsokban, a hiszton acetilációjának növekedésével a megfelelő promoterükön. Ezenkívül a TSA-val elősegített partnerpreferenciát megakadályozták az OTR vagy a V1aR blokádja a nucleus activumban. Fontos szempont, hogy a párosodás által kiváltott partnerpreferencia ugyanazt az epilepsziás szabályozást váltotta ki az OTR és a V1aR génpromóterekben, mint a TSA. Ezek a megfigyelések tehát azt mutatják, hogy a TSA és a párzás megkönnyíti a partner preferenciáját az epigenetikus események révén, biztosítva az első közvetlen bizonyítékot a párkötés epigenetikus szabályozására.
Bevezetés
A társadalmi hovatartozás az emberi társadalmi magatartás alapvető jellemzője, és a társadalmi kognitív hiányok a neuropszichiátriai rendellenességek sokaságának közös jellemzői, ideértve a skizofrénia és az autizmus spektrum rendellenességeit, valamint a függőséget és a depressziót.1. A társadalmilag monogám prérimócák (Microtus ochrogaster) nagyon érdekes modellnek bizonyultak a társadalmi kötődés neurobiológiai alapjainak vizsgálatához, mivel mind a laboratóriumi, mind a szabadon élő egyének tartós páros kötéseket hoznak létre2-4, amelyeket először a partnerrel szembeni szelektív kapcsolattartási viselkedés kialakulása indít, amelyet partner preferencianak neveznek5. A partnerpreferencia kialakulása számos neurotranszmittert és hormonális rendszert érint, beleértve az oxitocint és a vazopressint (AVP) és a mezolimbikus dopamint5.
IÁltalánosságban a partner preferencia kialakulását a férfiak ventális pallidumában és az oldalsó septumban (LS) az AVP neurotranszmisszió, a nőgyógyászati próbaüregekben az oxitocin neurotranszmissziója és a nucleus akumulum (NAcc), valamint az prebicicorta közvetíti.6-8.
Általában a természetes jutalomban, például a párzásban, a dopamin a prérifarmokban való partnerpreferencia kritikus közvetítőjeként is szolgál. A dopamin D2 típusú receptorok (D2R) aktiválása a NAcc-ban megkönnyíti, míg a dopamin D1 típusú receptorok (D1R) aktiválása gátolja a partnerpreferencia kialakulását mind a férfi, mind a nő prérimérében9-11.
Fontos szempont, hogy az oxitocin és az AVP V1a receptorok, az OTR és a V1aR receptorok génexpressziójának változásai drámaian befolyásolhatják a partner preferenciát. Például a nők prériérinél az OTR túlexpressziója a NAcc-ban megkönnyíti a partner preferenciáját párzás hiányában12-14.
A páros kötés szabályozása mellett az oxitocin és az AVP számos társadalmi viselkedésben szerepet játszik, beleértve a társadalmi felismerést, az agressziót és az anyák gondozását.15, 16. Nevezetesen, a rágcsálók utóbbi viselkedésének megszakadása epigenetikus mechanizmusok révén, beleértve az ösztrogén receptor alfa DNS-metilezését, tartós neuroadapciót vált ki17 és AVP gének18, valamint a glükokortikoid receptor promóter hiszton-acetilezése19. Ezenkívül a hisztondezacetiláz (HDAC) gátlók, javítva a génexpressziót a rágcsálók agyának fokozott hiszton-acetilációja révén20, megfordíthatja ezeket a változásokat19, és közvetlenül befolyásolják a társadalmi viselkedést, például a szexuális érzékenységet21. Fontos szempont, hogy egy tüdőrák sejtvonalban a HDAC inhibitor trichostatin A (TSA) közvetlenül fokozza az OTR transzkripcióját azáltal, hogy helyileg elősegíti a hiszton acetilációt22.
Ezért javasolható epigenetikus alap a partnerpreferencia kialakulásához a prérimócákban. Ennek a hipotézisnek a tesztelésére először két HDAC-gátló, a nátrium-butirát (NaB) és a TSA hatását vizsgáltuk a partnerpreferencia kialakulására felnőtt női prérigondokban. Ezután megvizsgáltuk azokat a molekuláris mechanizmusokat, amelyek közvetítik a TSA hatásait a partner preferencia indukálására a női prérigondokban. Végül megvizsgáltuk, hogy a TSA által az együttélés során kiváltott epigenetikus változásokat párosítás is kiváltotta-e.
Eredmények
A TSA-kezelés megkönnyíti a partner preferenciáját
A szexuálisan naiv nők prériérét intracerebroventrikulárisan (icv.) az 0.08, 0.4 vagy 4 tartalmú CSF-sel vagy CSF-fel nGt TSA-t közvetlenül az 6-órás férfival párosodás nélküli együttélés előtt, majd partnerük preferenciáját teszteltük. A férfival való pár órás párosulás nélküli hat órás együttélés nem idézi elő a partner preferencia kialakulását a nők prérigombáin4 így ezt a viselkedési paradigmát széles körben használják a különféle gyógyszereknek a partnerpreferencia kialakulásának megkönnyítésére gyakorolt hatásainak felmérésére.5.
A CSF-fel kezelt állatok nem szelektív egymás mellett történő érintkezést mutattak a partnerrel vagy az idegennel, az 6 órányi együttélés után párzás nélkül (t15= 0.76, P = 0.46; 1a). Azonban az állatok, amelyeket TSA-val kezeltek minden vizsgált dózissal, előnyösebben több időt töltöttek a partnerrel, mint az idegennel (t8= 4.35, P = 0.002 a TSA 0.08 esetén ng csoport; t15= 3.63, P = 0.002 a TSA 0.4 esetén ng csoport; és t8= 2.58, P = 0.03 a TSA 4 esetén ng csoport). Fontos szempont, hogy a mozgásszervi aktivitásban nem találtak különbséget csoportban (F3,46 = 1.25, P= 0.30, 1b), valamint a vizsgált nők agresszív viselkedését sem az idegen, sem a partner felé nem figyelték meg, amely azt bizonyította, hogy a TSA hatásai inkább társadalmi preferenciákra vonatkoznak, nem pedig másodlagos jelentőségűek a mozgás megváltoztatására vagy az idegen társadalmi vonzódására.
Annak megvizsgálására, hogy a TSA fokozza-e a hiszton-acetilációt az agyi struktúrákban, amelyek részt vesznek a partnerpreferencia kialakulásában, különálló nőstény tételt injektáltunk a TSA közepes dózisával (0.4 ng) és férfival párosulva párzás hiányában 30 perc, 2 vagy 9 óra alatt. Nevezetesen, hogy a NAC és a caudate putamen semmilyen időpontban sem észlelhető a globális hiszton H3 acetilációs (Lys14) szintek jelentős változása (P > 0.05 minden csoportnál, 1c és d). Ez azt mutatja, hogy a TSA megkönnyíti a partner preferencia kialakulását párzás nélkül, annak ellenére, hogy nem befolyásolja a globális hiszton H3 acetilációt a NAcc-ben vagy a caudate putamenben.
Fontos szempont, hogy a nátrium-butirát megkönnyítette a partner preferenciát a nők prérimérében is, miután férjgel 6 óráig párosodás nélkül együtt folytak, és amely a NAcc globális hiszton H3 acetilációjának (Lys14) növekedésével jár (Kiegészítő ábra 1). A TSA hatása a partnerpreferencia kialakulására tehát egy másik HDAC-gátlóval reprodukálható, utalva a HDAC-gátlás bevonására, nem pedig a TSA nem-specifikus hatására a partnerpreferencia megkönnyítésében. Tekintettel arra, hogy a TSA egy specifikusabb és affin I / II osztályú HDAC inhibitor23, 24, és mivel a TSA viselkedésbeli hatásai kifejezettebbek, mint a NaB-nál, úgy döntöttünk, hogy a TSA-t NaB fölött használjuk a specifikus molekuláris korrelációk vizsgálatához a vizsgálat következő részeiben.
A TSA által elősegített partnerpreferencia molekuláris korrelációja
Mivel a gén expressziós szintjének ingadozása a NAcc-ban társult a különböző párzási stratégiákkal a monogám és a nem monogám erek között, és különösen a partner preferencia kialakulásának megváltozásával a prérimócákban12, 13, 25, 26, megvizsgáltuk, hogy a TSA által elősegített partnerpreferencia-képződés összefügg-e a NAcc gén expressziójának variációival.
TSA kezelés (0.4 ng, icv.) az OTR mRNS szint növekedését váltotta ki a NAcc-ben az 2 együttélési órákat követően, a CSF-vel kezelt kontrollokhoz képest (t10 = 2.38, P = 0.038, 2a), amelyet általában 9 együttélési órák (t9 = 2.17, P = 0.058, 2b). Noha a TSA-injekció beadását követő NAcc 1 órákban a V2aR mRNS enyhe, de nem szignifikáns növekedését lehetett megfigyelni, a többi mért mRNS, beleértve a D1R vagy a D2R (a másik időpontban), egyik időpontban sem észleltek más csoportbeli különbséget (P > 0.05, 2a, b). Fontos szempont, hogy a caudate putamenben egyetlen időpontban sem a csoportos különbségeket, sem a mért mRNS (P > 0.05 minden csoportnál, 2c, d), ami arra utal, hogy a TSA-val kezelt állatokban megfigyelt OTR mRNS növekedése specifikus a NAcc-ra. Ezen túlmenően, az ilyen fokozott szabályozás csak a férfival való együttélés után volt megfigyelhető, mivel az NATR OTR és V1aR mRNS szintje változatlan maradt 2 órákban a TSA injektálás után együttélés nélkül (OTR: 100.0% ± 11.70 CSF csoportnál, 86.7% ± 12.11 TSA esetén) csoport, t12 = 0.79, P = 0.444; V1aR: 100.0% ± 26.24 a CSF csoportnál, 92.3% ± 13.75 a TSA csoportnál, t9 = 0.27, P = 0.791).
A magasabb OTR mRNS-szintekkel összhangban a TSA-val kezelt állatok szintén magasabb OTR-proteinszintet mutattak mindkét időpontban a NAcc-ben (2 órák: t10 = 2.34, P = 0.041; 9 óra: t10 = 3.16, P = 0.01, 2e ábra, f), de nem caudate putamen (t10 = 0.41, P = 0.69, 2g ábra, h). Érdekes, hogy míg a NAcc-ben a TSA injekció beadása után nem mutattak szignifikáns változást a V1aR mRNS-szintekben az 2 vagy az 9 órákban (2a, b), a V1aR fehérje szintje szignifikánsan megemelkedett az 9 órákban, összehasonlítva a CSF-kezelt állatokkal, a NAcc-ban (t9 = 3.46, P = 0.007, 2f), de nem caudate putamen (t10 = 0.98, P = 0.35, 2h). Bár bizonyos eltérésekkel, a NAX és a caudate putamen D1R és D2R fehérje szintjét a TSA beadása nem befolyásolta szignifikánsan (P > 0.05, 2e-h ábra).
A TSA megkönnyíti az oxtr és az avpr1a hiszton-acetilezését
A TSA-kezelés utáni együttélés után mind az mRNS, mind az OTR proteinszintjének növekedése arra utalt, hogy a TSA valószínűleg növeli a oxtr, az OTR-t kódoló gén, ahelyett, hogy megváltoztatná a fehérje transzlációját vagy forgalmát. Ezenkívül a V1aR fehérje szintje magasabb volt a NAcc-ben, ami az MRNS-szinteknek a TSA-kezelést követő enyhe, de nem szignifikáns növekedésével volt összefüggésben (Ábra 2). Tekintettel arra, hogy a TSA erőteljes I. és II. Osztályú HDAC inhibitor23, 24, 27, feltételeztük, hogy a TSA fokozta a hiszton-acetilációt a oxtr és a avpr1a promóterek a NAcc-ben, ezután fokozva transzkripciójukat. Új tétel az állatokból icv. TSA injekció (0.4 ng), és azonnal egy férfivel együtt párosodnak, anélkül, hogy párosulnának 30 percig, mielőtt feláldozták volna. Az 30-perc időablakot a korábbi munka alapján választottuk meg, hiszen patkányokban és egerekben a helyi TSA-injekció beadása után a hiszton-acetiláció maximális növekedése jelent meg28, 29. H3K14 acetilezés a oxtr és a avpr1a A promótereket kromatin immunprecipitációval elemeztük.
Az OTR mRNS és a protein szintje korábban megfigyelt növekedésével összhangban a TSA-val kezelt állatok nagyon magas (+ 460%) növekedést mutattak a hiszton H3 acetilációban a oxtr a génpromoter, összehasonlítva a CSF-rel kezelt kontrollokkal, a NAcc-ban (t10 = 5.88, P = 0.0002), de nem caudate putamen (t9= 0.31, P = 0.76, 3a). Ezenkívül a hiszton H3 acetilezése a avpr1a a promoter szignifikánsan megemelkedett 30 percben a TSA beadását követően (+ 196%) a NAcc-ban (t10 = 3.12, P = 0.01), de nem caudate putamen (t9= 0.38, P = 0.71), összehasonlítva a CSF-fel kezelt kontrollokkal (3b). Ezért a TSA már a férfival való együttélés megkezdése után 30 perccel megnöveli a hiszton-acetilációs helyet a NAcc-ben.
A TSA megkönnyíti a partner preferenciáját az OTR és a V1aR segítségével
Az előző kísérleti csoportból kiderül egy molekuláris hatásmodell, amelyben az együttélés során a TSA fokozza a hiszton acetilezését a oxtr és a avpr1a Ezután fokozza a transzkripciót, és magasabb OTR és V1aR fehérje szintet eredményez az 9 óráig az együttélési időszak kezdete után. Fontos szempont, hogy ez a TSA hatás helyspecifikus, mivel a caudate putamen változatlan marad. Itt teszteltük, hogy a TSA-indukált OTR és V1aR növekedése összefügg-e a partnerpreferencia kialakulásának megkönnyítésével. A nőstény prériérintek NASA-n belüli TSA-injekciót (0.04ng / oldal) előzetes injekcióval vagy anélkül (30 perc a TSA injekció előtt, 0.5ng / oldal) CSF vagy CSF, amely két különféle OTR antagonista, OTA (B) és OTA (T), vagy egy V1aR antagonista (V1aRA) egyikét tartalmazza. Közvetlenül a TSA-injekció után a nőstényeket párosodás nélkül 6 órákon át egy férfival együtt éltek, majd egy partnerpreferencia-tesztet követtünk.
A CSF-vel kezelt állatok nem mutattak ki partneri preferenciát (t5 = 0.17, P = 0.87, 4a). A TSA-val kezelt állatok ugyanakkor szignifikánsan több időt töltöttek egymással a „partnerrel”, mint az „idegennel”, így arra utalnak, hogy egy közvetlen TSA-injekció közvetlenül a NAcc-be elegendő a partnerpreferencia kialakulásának elősegítéséhez párzás nélkül (t5 = 7.04, P = 0.0009). Érdekes módon az OTR vagy a V1aR blokkolása OTA (B), OTA (T) vagy V1aRA előkezeléssel megelőzte a TSA (P > 0.05 minden csoportnál). Mivel a mozgásszervi aktivitásban nem találtunk csoportkülönbséget (F4,32 = 1.89, P = 0.14, 4b), ezek az adatok azt sugallják, hogy a NASA-ban lévő TSA megkönnyíti a partnerpreferencia kialakulását OTR- és V1aR-közvetített mechanizmusok révén viselkedés-specifikus módon.
A párzás hasonló neuroadapciókat vált ki, mint a TSA
Korábbi megfigyeléseinket megállapítottuk, hogy az oxitocin és a vazopresszin neurotranszmisszió epigenetikus potencírozása a női NAcc-ben elegendő volt a partner preferencia kialakulásának elősegítéséhez párzás nélkül. Annak megvizsgálására, hogy ezek a neuroadapciók is előfordulnak-e a partnerpreferencia természetes kialakulása során, a nőstény préri hangokat 24 órákban párosítva jelen voltak egy férfival, ami párkapcsolat jelenlétét idézi elő.4, és feláldozták. Megfigyeltük mind az OTR, mind a V1aR mRNS és a protein szint emelkedését a NAcc-ben, szemben a szexuálisan naiv nőstényekkel (OTR: + 38%, t10 = 2.68, P = 0.02 az mRNS-hez és + 58%, t8 = 3.05, P = 0.01 fehérjére; V1aR: + 89%, t14= 2.53, P = 0.02 az mRNS-hez és + 26%, t20 = 2.23, P = 0.037 fehérjére, 5a, b).
Mivel mind az OTR, mind a V1aR mRNS és fehérje szintje megemelkedett a párosodással való együttélés eredményeként, azt követõen megvizsgáltuk, hogy ez a fel-szabályozás társult-e a oxtr és a avpr1a gének transzkripciója. Így egy új nőstény tételt 6 órákon keresztül együtt párosítottak egy hímmel párosítással és H3K14 acetilálással a oxtr és a avpr1a a promóterek kromatin immunprecipitációval mérve. Az OTR és a V1aR mRNS és fehérje szintjével összhangban a női prérigének nagyobb H3K14 acetilációt mutatnak a oxtr és a avpr1a promóterek a NAcc-ben, szemben a szexuálisan naiv nőkkel (oxtr: t9 = 2.64, P = 0.02; avpr1a: t9 = 2.91, P = 0.017 5c, d). Ezek az adatok arra utalnak, hogy az olyan együttélési paradigmák, amelyek megbízhatóan indukálják a partner preferenciát a női prérimérben, az OTR és a V1aR expresszió fokozódását idézik elő a NAcc-ben epigenetikus mechanizmusok révén, amint azt a TSA kezelés után megfigyelték.
Megbeszélés
Ebben a tanulmányban először számolunk be a partnerpreferencia kialakulásának epigenetikus szabályozásáról. Először bebizonyítottuk, hogy a NAAC-ban a HDAC-gátló beadásával történő növekvő hiszton-acetilezés megkönnyíti a partner preferencia kialakulását felnőtt női prérimérben párzás hiányában. Ttyúk, közvetlen bizonyítékokat fedtek fel arra, hogy a nőkben a partnerpreferencia kialakulása epigenetikusan vezérelt, mivel nőtt a férfival folytatott együttélés és párosodás oxtr és a avpr1a a gének expressziója a NAcc fokozott hiszton-acetilezésén keresztül. A TSA beadása a NAcc-ben a partner preferenciát váltotta ki, és az OTR mRNS és fehérjék magasabb szintjéhez vezetett a NAcc-ben. Sőt, bár a globális hiszton H3 acetilációt a TSA-val kezelt nőstények nem befolyásolták, a hiszton acetiláció jelentős dúsulása a oxtr A NAcc-ben lévő promoter megfigyelése már a TSA beadását követő 30 percben megfigyelhető volt. Végül az OTR blokkolása a NAcc-ben elegendő volt a TSA által elősegített partner preferencia megakadályozásához. Mivel a párosítás és az együttélés után hasonló epigenetikusan vezérelt módosításokat fedeztünk fel, olyan eljárások során, amelyekről ismert, hogy a partner preferenciát idézik elő, adataink egy modellt mutattak be a társadalmi viselkedés epigenetikus szabályozására. Dha hímivarú együttélést folytatunk, vagy TSA-val vagy párosulunk, egy specifikus hiszton H3 acetiláció gyorsan indukálódik a oxtr A NAcc-ben lévő olyan promóter, amely fokozza a transzkripcióját, magasabb OTR mRNS- és proteinszintet eredményezve, ami ezután megkönnyíti a partnerpreferencia kialakulását.
Női prérigörcsék esetén az 6 órákkal folytatott párosodás nélküli férfival folytatott együttélés nem idézi elő a partner preferencia kialakulását4, és ezt a viselkedési paradigmát arra használják, hogy megvizsgálják a farmakológiai manipulációk hatását a partnerpreferencia kialakulására.5. Tanulmányunkban, míg a sóoldattal vagy CSF-fel kezelt kontrollok nem fejlesztették ki a partner preferenciát, a NaB-val vagy TSA-val kezelt nők prérigondjai ezt mutatták. Mivel sem a NaB, sem a TSA nem befolyásolta az általános mozgást, a partnerpreferenciára gyakorolt hatásaik inkább viselkedés-specifikusak, mint másodlagos hatások voltak a mozgásra. A TSA ezen specifikus hatását tovább erősítették molekuláris megfigyeléseink. Valóban, bár alkalmazva icv., képesek voltunk kimutatni a gén expressziójának specifikus változását a NAcc-ben, de nem egy szomszédos struktúrában, a caudate putamenben. Ezen túlmenően, még a NAcc-en belül is, a D1R és a D2R mRNS és protein szint nem változott. Ez a specifitás meglepőnek tűnik egy olyan széles HDAC-gátló esetében, mint a TSA, amely mind az I., mind a II. Osztályú HDAC-kat érinti. Ennek ellenére a TSA-ról arról számoltak be, hogy csak egy kis génrész expresszióját befolyásolja az emlős genomjában30-32, beleértve az egereket is20.
Itt bemutattuk, hogy a H3 hiszton acetilálása a Lys14-en a oxtr promóter, a fokozott génátírással járó módosítás, beleértve az agyi plaszticitás során is33, 34, aláhúzza a magasabb OTR mRNS és fehérje szintet. A TSA-ra adott válaszként a hiszton acetilezése a oxtr A promoter növeli és megkönnyíti transzkripciójának aktiválását az emberi sejtvonalban22, alátámasztva azt a megállapítást oxtr epigenetikusan szabályozható. Mivel az OTR helyi blokkolása a NAcc-ben elegendő volt a TSA viselkedésbeli hatásának megakadályozásához, adataink arra utalnak, hogy a TSA által indukált OTR expressziója a NAcc-ben az együttélés során a partnerpreferencia kialakulásának megkönnyítését közvetítette. Sőt, a párosulással járó 24 órákban folytatott együttélés - amely eljárás ismert módon megbízhatóan indukálja a partner preferenciát a női prérimérben - hasonló növekedést váltott ki a női NAcc-ben az OTR expressziójában. Ez teljes mértékben összhangban van az oxitocin és receptorának ismert részvételével a nőstény állatok partner preferenciájának kialakulásának neurobiológiájában. A párzás növeli az extracelluláris oxitocin szintet a NAcc-ban25, és az oxitocin helyi infúziója a NAcc-be megkönnyíti a partner preferencia kialakulását párzás nélkül8. Ezenkívül az OTR antagonisták blokkolják a partner preferencia kialakulását, amelyet az oxitocin adagolása vagy a párzás okoz8, 35. Fontos szempont, hogy a női NAcc vírus által közvetített túlzott expressziója elegendő a partner preferencia kialakulásának megkönnyítéséhez12, 13.
Az OTR szerepének erősítésén kívül eredményeink bizonyítékot szolgáltatnak az OTR gén expressziójának aktiválására is, epigenetikus mechanizmusok révén a férfival való párosodás hiányában történő együttélés során. Valóban, bár ez nem elegendő a partner preferencia indukálásához, az ilyen együttélés rövid időn keresztül párosodás nélkül aktiválja a partner preferencia kialakulásának alapjául szolgáló neurobiológiai folyamatokat.. Például egy két órás szabad férfinak történő expozíció enyhén, de nem szignifikánsan növeli az oxitocin felszabadulását a nő NAcc-ban25. Ezért javasolható, hogy a TSA vagy a NaB fokozza a hímrel való együttélés által kiváltott neuroadapciókat, megkönnyítve a partnerpreferencia kialakulását. Érdekes, hogy az ilyen potencírozásról rágcsálókban már számoltak be, ahol az I. és II. Osztályú HDAC-gátlók, beleértve a NaB-t és a TSA-t, megkönnyítik egy olyan tanulási esemény konszolidációját, amely nem eredményezi a kontrollállatokban hosszú távú memória kialakulását36, 37. E fogalom alátámasztása érdekében a hosszabb együttélési időszakok (például., 48hours) még párzás hiányában is kiválthatja a partnerpreferenciát4. Fontos megjegyezni, hogy a párosodással való együttélés a női NAcc-ben az OTR és a V1aR expressziójának fokozott szabályozását váltotta ki ugyanazon epigenetikus mechanizmusokon keresztül, mint amelyeket a TSA-kezeléssel folytatott együttélés után figyeltünk meg. partner preferencia kialakulása. Fontos szempont, hogy a TSA a férfival való együttélés hiányában nem indukálja az OTR és a V1aR szabályozását a női NAcc-ben. Összességében ez alátámasztja azt a hipotézist, miszerint a TSA elősegíti a partnerpreferencia kialakulását az endogén neuroadaptációk potencírozásával, amelyet természetesen a férfival való együttélés vált ki, ahelyett, hogy önmagában aktiválná ezeket vagy a különböző neuroadapciókat.
OAz ur tanulmány rávilágít a NAcc V1aR kritikus szerepére a nő partner preferencia kialakulásában, mivel a TSA-val kezelt állatok magasabb V1aR szintet mutatnak, amelyek blokádja megakadályozta a TSA által elősegített partner preferencia kialakulását. Ezen túlmenően ezeket a hatásokat a magasabb hiszton-acetilezés okozta avpr1a annak ellenére, hogy a V1aR mRNS szignifikáns emelkedése valószínűleg nem egy optimális időpont miatt. Bár nem zárhatjuk ki a fehérje stabilitásának a TSA általi szabályozását a nem hiszton fehérjék acetilezésével38, ez a megállapítás azt sugallja, hogy hasonlóan a oxtr promóter, a TSA előmozdíthatja avpr1a transzkripció helyi hiszton-acetilációval. Míg az AVP hozzájárulását a férfi párok kötéséhez ismertették5, a nő viselkedésében játszott szerepe továbbra is ellentmondásos. Egyrészt egy icv. Az AVP injekció megkönnyíti a partner preferencia kialakulását mind a férfi, mind a nőstény vonalakban, ezt megakadályozza a V1aR vagy az OTR blokkolása39. Másrészt, egy icv. a V1aR antagonista injekciója blokkolja a párosodás által kiváltott partner preferenciát a férfiakban, de a nőkben nem.40. Mindezen vizsgálatokat azonban felhasználták icv. injekciók, megakadályozva az esetleges struktúrák további betekintését. Itt adjuk meg az első bizonyítékokat arra, hogy az NAP-n belüli AVP neurotranszmisszió részt vehet a nőstények partnerpreferenciájának kialakulásában, míg az irodalom nagy része leírja annak részvételét különböző területeken, például a ventrális pallidumban, az oldalsó septumban és a hímekben a stria terminalis és az amygdala5. Ezért érdekesnek tűnik megjegyezni, hogy az OTR vagy a V1aR blokkolása a női NAcc-ben elegendő volt a partner preferencia kialakulásának megakadályozására a TSA-kezelést követően, ami arra utal, hogy a partner preferencia kialakulásához mind a V1aR, mind az OTR aktiválása szükséges.. Tmegállapításai összhangban állnak és alátámasztják a korábbi megfigyeléseket a férfiak prérijeiben, miszerint az LS-ben az OTR-hez és a V1aR-hez egyidejű hozzáférés elengedhetetlen az AVP által kiváltott partnerpreferencia szempontjából6. Ezenkívül a TSA-val kezelt állatokban mind az OTR, mind a V1aR szintek specifikus növekedésének megfigyelése alátámasztja az AVP és az oxitocin neurotranszmissziók egyidejű aktiválásának szükségességét a párkötéshez.
Az oxitocinnel és AVP-vel kombinálva a NAcc dopamin neurotranszmissziója modulálja a partner preferencia kialakulását a nőstény állatokban9. Bár a párzás indukálja a dopamin felszabadulását a NAcc-ben9, a receptor szintekben bekövetkező változások csak a párosodással való együttmûködés hosszabb idõtartama alatt - hosszabb, mint az 24h-nál - fontosak a páros kötés fenntartása szempontjából10. E megfigyelésekkel összhangban a TSA-val kezelt női prérigondok partner preferenciát mutattak anélkül, hogy a Doppum D1R és a D2R receptorok szignifikánsan változtak volna. Ezért a dopamin receptor szabályozás hiánya újabb bizonyítékot jelent a TSA specifitására.
Adataink először epigenetikus összetevőt jelentenek a páros kötés neurobiológiájában, és arra utalnak, hogy a TSA „permisszív állapotot” indukál a női préri hangokban, elősegítve a természetes molekuláris reakciót az együttélésre, és elősegítve az erősebb társadalmi interakciók kialakulását. ami partner preferenciához vezet. Ezért csábító annak feltételezése, hogy a TSA által elősegített partnerpreferencia tovább erősíthető, és tartós kötelékhez vezethet. Noha az érintett HDAC-k meghatározása még nem történt meg, érdekes lenne tovább vizsgálni a TSA más monopóliumú életstratégiával kapcsolatos viselkedésére gyakorolt hatásait a prériálmokban, például a szelektív agresszió és a szülők gondozása során. Figyelembe véve a préri hangok fontosságát az emberek párosodásának neurobiológiai mechanizmusainak modellezésében5, és az ígéretes HDAC-gátlók már a klinikai vizsgálatok során24, 41, 42, adataink új farmakológiai lehetőségeket nyitnak meg a társadalmi magatartás befolyásolására.
Mód
Tantárgyak
Szexuálisan naiv női prérifarmok (Microtus ochrogaster) laboratóriumi tenyésztelepből 21 napos korban elválasztottuk, és azonos nemű testvérek párjaiban műanyag ketrecekben (12 × 28 × 16 cm) tartottuk, vízzel és élelemmel ad libitum. Az összes ketrecet 14: 10 h világos-sötét ciklus alatt tartottuk, és a hőmérséklet körülbelül 20 ° C volt. Az állatokat véletlenszerűen osztottuk be a kísérleti csoportokba, amikor elérték az 70 – 90 napos kort. A felhasznált állatok számát a csoportunk és mások által korábban végzett, ezen a területen végzett vizsgálatok alapján egy erõelemzéssel kombináltuk. A kísérleti eljárásokat a Floridai Állami Egyetemen működő Állatgondozási és Használási Bizottság jóváhagyta.
Kábítószer
A sóoldatban oldott nátrium-butirátot (NaB) és a mesterséges cerebrospinális folyadék hordozóban (CSF, BioFluids, Rockville, MD) feloldott trichosztatin A-t (TSA) egyaránt a Sigma-Aldrich-tól (St Louis, MO) vásároltuk. A NaB-t intraperitoneálisan injektálták (ip) 600 mg / kg dózisban, amelyről ismert, hogy egerekben több agyszerkezetben indukálja a hiszton-acetilációt43, 44. Hasonlóképpen, a TSA-hoz alkalmazott dózistartomány korábbi munkán alapult, meghatározva annak hatékonyságát lokális hiszton-acetilációs események indukálásában és a rágcsálók gén expressziójának változásain19, 20. A szelektív V1aR receptor antagonista V1aRA, d(CH2)5[Tyr (Me)] AVP és az OTR antagonista OTA (B), [d(CH2)5, Tyr (én)2, Thr4, Tyr-NH29] -OVT), a Bachem-től (Torrance, CA) szereztük be. Egy második, szelektívebb OTR antagonista, OTA (T), dGly-NH2-d(CH2)5 [Tyr (Me)2Thr4] OVT45, kedvesen Dr. Maurice Manning (Toledói Egyetem, OH). Ezeket az antagonistákat és az alkalmazott adagokat korábbi vizsgálatok alapján választottuk meg, amelyek bizonyították szelektivitásukat a V1aR vagy az OTR vonatkozásában.35, 39, 46-49.
Sztereotaxiás kannuláció és mikroinjekció
A nőstényeket nátrium-pentobarbitállal (1mg / 10g testtömeg) érzéstelenítettük, és az 26 méretű rozsdamentes acél vezető kanülöket (Plastics One, Roanoke, VA) sztereotaxikusan implantáltuk, az oldalkamra felé irányítva (egyoldalúan; orrrúd –2.5 mm-nél, 0.6 mm-nél) rostral, 1.0 mm oldalirányban és 2.6 mm ventrálisan a bregma-hoz) vagy helyspecifikusan a NAcc-hez (kétoldalúan; orrrúd −2.5 mm-nél, 1.7 mm rostral, ± 1.0 mm kétoldali, és 4.5 mm ventrális a bregma-hoz). Az 3 napos gyógyulás után az alanyok CSF vagy CSF mikroinjekciókat kaptak, amelyek különböző TSA koncentrációkat tartalmaztak. Az OTR vagy a V1aR szelektív antagonistáinak használatakor 30 injekciót adtak be a TSA előtt. Az injekciókat olyan 33 mérőtűvel végeztük, amely az 1 mm-rel a vezetőkanül alatt a célterületre terjedt, az 500 nL injekciós térfogatával az oldalkamrába (icv.) vagy 200 nL oldalanként a NAcc-be. A tűt egy Hamilton fecskendőhöz (Hamilton, Reno, NV) csatlakoztattuk polietilén-20 csöveken keresztül, és a dugattyút lassan lefékeztük, 1 percet igényelve injekciónként. A kísérlet végén az összes alanyt gyors dekapitációval feláldozták, és az agyokat extrahálták annak érdekében, hogy a kanülök elhelyezését a vak kísérleti körülmények között vak szemlélő ellenőrizze. A rosszul elhelyezett kanülű alanyokat kizártuk az adatelemzésből.
Együttműködési és partnerpreferencia-teszt
Közvetlenül a következő ip., icvvagy gyógyszerek intra-NAcc injekcióival, a nőstényeket 6 órákon keresztül párosítottuk egy férfival párzás nélkül. A párosodás hiányát a videolejátszó viselkedésének vizsgálata igazolta. A párosodó, ösztrogénnel kezelt nőstényekkel való együttélés kiváltott neuroadaptációk vizsgálatára (2μg / nap, ip., 3 napokig) együtt éltek egy férfival 6 vagy 24 órák alatt, és a párzás jelenlétét igazoltuk utólagos a kazettán (az 6-től az 11-es rohanásokig az első 6 együttélési órákban).
A partner preferencia tesztet közvetlenül az 6 órás együttélés után hajtottuk végre, a korábban leírtak szerint11. Röviden: a háromkamrás tesztberendezés egy semleges ketrecből állt, amely két párhuzamos, azonos ketrechez volt csatlakoztatva, mindegyikben ingerállatot - egy ismeretlen hím „idegent” vagy egy ismerős hím „társat” használtak az együttélési időszakban. A női alanyok a 3 órás tesztelés során szabadon mozoghattak a készülékben, és az inger hímeket ketrecükbe kötötték, és nem engedtek közvetlen kapcsolatot egymással. Az egész foglalkozást videofelvételen rögzítették, és később a képzett kísérletező számszerűsítette az alanynak a partnerrel vagy az idegenrel való érintkezésének időtartamát, nem tudva a biológiai csoportokról. A partnerpreferenciát úgy határozták meg, hogy az alanyok lényegesen több időt töltenek testkontaktusban a partnerrel szemben az idegenekkel, amit egy páros, kétfarkú t-teszt. Ezenkívül a háromkamrás készüléket fotogerendás érzékelőkkel láttuk el, amelyek lehetővé tették a mozgásaktivitás meghatározását, amelyet a nőstények stimulációs kamrába történő belépésének száma mutatott. Ez a mozgásszervi pontszám tehát lehetővé teszi számunkra, hogy ellenőrizzük a gyógyszerek feltételezett másodlagos hatásait a nők viselkedésére, például általános aktivitást, szorongást vagy új környezet megváltozott felfedezését, ahogyan azt a csoportunk és mások általában használják12.
RNS és fehérje extrakció
A nőstényeket gyors lebontással feláldozták, és az agyokat azonnal extrahálták és száraz jégen fagyasztották. A koronális metszeteket (200 μm) egy kriosztáttal elvágtuk és a mikroszkóp lemezeire fagyra szereltük. A teljes NAcc-ből és a caudate putamenből, az utóbbi egy kontroll terület volt, 1 mm átmérőjű kétoldalú szövetlyukasztásokat vettünk, és –80 ° C-on tároltuk a feldolgozásukig. Az összes RNS-t és fehérjéket extraháltuk a TRI-reagens protokoll alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint (Molecular Research Center, Cincinnati, OH).
A fehérje expressziós elemzése Western-blot módszerrel
Az 10% -os poliakrilamid gélen végzett szétválasztást követően (a hisztonok esetében 15%) a fehérjéket nitrocellulóz membránokba helyeztük és a következő primer antitestekkel inkubáltuk: anti-OTR (sc-8102, 1: 1000), -V1aR (sc-18096, 1: 500), -D1R (sc-33660, 1: 1000), -D2R (sc-9113, 1: 1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornia), -aktin (A2066, 1: 1000; St Louis, MO) vagy anti-acetil-hiszton H3 (Lys14, # 06 – 911, 1: 1000) és az összes H3 (# 05 – 928, 1: 1000, Millipore, Temecula, CA). Valamennyi antitestet emberi, patkányokban és egerekben való felhasználásukra validálunk, amelyekkel a prérimér nagy arányú homológiát mutat (az 81-től az 96% -ig terjedően). A HRP-vel konjugált szekunder antitesttel történő hibridizáció után a membránokat felvittük az ECL-rel (ECL SuperSignal West Dura szubsztrát, Pierce Biotechnologies, Rockford, IL), és a Fuji XAR filmmel (Fuji Film, Tokió, Japán) tettük ki. A mennyiségi meghatározást AIS 6.0 Image szoftver alkalmazásával végeztük (Imaging Research, St. Catharines, Ontario, Kanada), és az összes jelet ugyanazon a membránon belül aktinná normalizáltuk, kivéve az acetil-H3 jelet, amelyet a teljes hiszton H3 jelre normalizáltunk. A normalizált adatokat ezután a CSF-vel kezelt állatok százalékában fejezzük ki.
Félkvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció (RT-PCR)
A teljes RNS 0.5 ug-ját feldolgozzuk a komplementer DNS szintézishez, majd az előzőekben leírtak szerint elemezzük50 a nikotinamid adenin-dinukleotid dehidrogenáz (NADH) génre történő normalizálásával. Az összes reakciót három példányban hajtottuk végre, specifikusságukat olvadási görbe elemzéssel és szétválasztással 2% agaróz gélen igazoltuk. A primerek szekvenciái a következők voltak: 5'-TCCAAGGCCAAAATCCGCACGG-3 '(FWD) és 5'-GGCAGAAGCTTCCTTGGGCGC-3' (Rev) OTR, 5'-GAGGTGAACAATGGCACTAAAACC-3 '(For) és 5'-CCAGATGTGGTAGCAGATGAAGC-3' (Rev.) Az AVP1aR, 5'-TTAACAACAATGGGGCTGTG-3 '(mert) és 5'-GGCATGAGGGATCAGGTAAA-3' (Rev) esetén a D1R, 5XTG ' ) a D3R, az 5'-CTATTAATCCCCCCTGACC-3 '(a) és az 2'-GGAGCTCGATTTGTTTCTGC-5' (Rev) esetében a NADH esetében. A normalizált adatokat a CSF-vel kezelt állatok százalékában fejezzük ki.
Kromatin immunprecipitáció
A histon H3 acetilációját (Lys14) NAcc és caudate putamen szövetekben a Magna ChIP protein G szöveti készlet (Millipore, Temecula, CA) alkalmazásával elemeztük a gyártó utasításai szerint. Röviden, miután az 1% formaldehiddel keresztkötöttük, a kromatint Misonix XL-2000 alkalmazásával oltottuk az 200 – 600 bp fragmenseire. Az acetilezett H3 (Lys14) hiszton immunprecipitációját azután 10 ug anti-acetil-H3 (Lys14) antitesttel (Millipore) végeztük egy éjszakán át 4 ° C-on. Mosás után, a gyöngyökből történő elúcióval és a keresztkötések megfordításával az immunprecipitált DNS-t tisztítottuk és három példányban elemeztük RT-PCR-rel egy iCycler platformon (lásd fent) az összevont INPUT mintákból készített belső standard görbével. Az primereket úgy tervezték, hogy az 236 bp hosszúságú régiót amplifikálják, amely az 128 bp hosszúságban helyezkedik el az OTR préri vole első kódoló első exonjától (oxtr, A Genbank csatlakozási számaAF079980), vagy az 192 bp hosszú régió, amely a V141aR prérimóta első exonját kódoló első exonból 1 bp felfelé helyezkedik el (avpr1a, A Genbank csatlakozási számaAF069304). A szekvenciák a következők voltak: 5'-CTCCGGAGCCGGGGCTAAGT-3 '(Fwd) és 5'-ACCGCTTCCCCGAGAGTAGGG-3' (Rev) a oxtr, valamint az 5'-GGTGGACCAGCCAGACCCCA-3 '(Fwd) és 5'-TGCAGAGCCAGGCGCTTTCC-3' (Rev) avpr1a. Mindegyik mintát a megfelelő INPUT értékkel normalizáltuk, majd az adatokat a CSF-vel kezelt állatok százalékában fejezzük ki.
Statisztikai elemzések és adatfeldolgozás
A partnerpreferencia elemzéséhez az állatokat, amelyek párosodási viselkedést mutattak az együttélési periódusban, vagy amelyek rosszul elhelyezett kanülökkel rendelkeztek. Az összes többi molekuláris elemzésnél biológiai csoportonként legfeljebb egy adatpontot kizártunk, ha kívül esőként azonosítottuk. A kísérletek nagy részét megismételték, kivéve, ha az eredmények nagyon világosak voltak. A partnerpreferencia-teszt során bármelyik stimulusállattal való kapcsolatban eltöltött időt kétfarkú párral elemezték t-teszt. A mozgási pontszámokat két farok segítségével elemeztük t-teszt (két csoportra) vagy egyirányú ANOVA (több mint két csoportra), és adott esetben a Fischer PLSD post-hoc A vizsgálatokat 10% - os küszöbértékkel végeztük P <0.05. A normalitás ellenőrzése után az összes többi adatot kétfarkúan elemeztük t-teszt, feltételezve, hogy egyenlő vagy egyenlőtlen eltéréseket mutatnak előre. Az összes statisztikai elemzést a StatView szoftver (SAS Institute) alkalmazásával végeztük. Amikor az adatokat a megfelelő kontrollokhoz egységesítik (a CSF, sóoldat vagy párzási csoport% -a), a statisztikai elemzéseket a nyers adatok alapján végeztük.
Köszönetnyilvánítás
Ezt a munkát az Országos Mentális Egészségügyi Intézet (NIMH) támogatta az MHR21-083128-et az MK-nak és a ZW-nek, és az MHR01-058616-ot az ZW-nek. Köszönjük Dr. Maurice Manningnek az OTR antagonista OTA (T) nagylelkû ajándékát is.
Lábjegyzetek
Összeférhetetlenség: A szerzők nem jeleznek összeférhetetlenséget.
Szerzői hozzájárulások
HW, FD és YL végezte el a kísérleteket. A HW és az FD elemezte az adatokat. A vizsgálatot HW, FD, ZW és MK készítette. FD, ZW és MK írta a papírt. Az összes szerző megvitatta az eredményeket és kommentálta a kéziratot.
Referenciák
;
