प्रोक नेटल अॅडॅड सायन्स यूएस अ. 2005 फेब्रुवारी 1; 102(5): 1737-1742
सार
कोकेन, गैरवर्तन औषध, अॅक्सन टर्मिनल्सवर डोपामाइन रीपटेक अवरोधित करून स्ट्रायटममध्ये सिनॅप्टिक डोपामाइनची पातळी वाढवते. सायक्लिन-आश्रित केनेज 5 (सीडीकेएक्सएनएक्स) आणि त्याच्या एक्टिव्हेटर पीएक्सएनएक्सएक्स, पोस्टमिटोटिक न्यूरॉन्समधील सबस्ट्रेट्सच्या फॉस्फोरीलायझेशनमध्ये समाविष्ट असलेल्या प्रथिने, कोकेनच्या दीर्घकालीन संपर्कानंतर अप-नियमन केले गेले आहेत. स्ट्रायटल डोपामाइन सिग्नलिंगवर सीडीकेएक्सएनएक्स आणि पीएक्सएनएक्सएक्सच्या प्रेरणांचे आणखी परीक्षण करण्यासाठी आम्ही दोन स्वतंत्र ट्रांसजेनिक माऊस लाइन तयार केली ज्यात न्यूरॉन्समध्ये सीडीकेएक्सएनएक्स किंवा पीएक्सयूएनएक्स ओव्हरक्प्रेस केले होते. आम्ही येथे अहवाल देतो की P5 नुसार सीडीकेएक्सएनएक्स क्रियाकलाप वाढविला परंतु सीडीकेएक्सएनएक्स ओव्हरएक्सप्रेसमुळे नाही, यामुळे कोकेन-मध्यस्थ डोपामाईन सिग्नलिंगचे प्रमाण कमी होते. थ्रो-एक्सएनएक्सएक्समध्ये डीओपीएएमएनएक्स आणि सीएएमपी-रेग्युलेटेड फॉस्फोप्रोटीन, आण्विक वस्तुमान 35 केडीए (डीएआरपीपी-एक्सNUMएक्स) चे सीडीकेएक्सएनएक्स-मध्यस्थ फॉस्फोरीलायशन वाढविले गेले, तसेच थ्र-एक्सएमएक्सएक्समध्ये डीएआरपीपी-एक्सNUMएक्सचे फॉस्फोरिलेशन कमी झाले. थ्र-एक्सएनएक्सएक्स वरील एक्सट्रॉक्सेलर सिग्नल-रेग्युलेटेड किनेज किनेस 5 चे वाढवलेला सीडीकेएक्सएक्सएक्स-मध्यस्थ फॉस्फोरीलायनसह एक्सट्रॉक्सेलरल सिग्नल-रेग्युलेटेड किनेज 35 / 5 चे सक्रियकरण कमी झाले. या प्रभावांनी सीएएमपी प्रतिसाद घटक-बाध्यकारी प्रथिने तसेच स्ट्रायटममधील सी-फॉसचा कमी अंतर्भाव करण्याच्या कोकेन-प्रेरित फॉस्फोरीलायझेशनची निर्मिती करण्यात योगदान दिले. या परिणामांमुळे कोडेनच्या दीर्घकालीन संपर्कात नंतर सीडीकेएक्सएनएक्स क्रिया बदललेली जीन अभिव्यक्तीमध्ये समाविष्ट आहे आणि म्हणून न्यूरोनल फंक्शन अंतर्भूत कोकेन व्यसनातील दीर्घकालीन बदलांवर प्रभाव पाडते.
कोकेन स्ट्रायटममध्ये सिनॅप्टिक डोपामाइन पातळी वाढवते आणि डोपामिनोसेप्टिव न्यूरॉन्समध्ये जीन अभिव्यक्ती बदलते जी अंतःक्रियाशील मार्गांनी सक्रिय करतात ज्या डोपामाइन डीएक्सएनएक्सएक्स रिसेप्टरपासून न्यूक्लियसमध्ये प्रारंभिक सिग्नल प्रसार करतात.1). कोकेनच्या दीर्घकालीन प्रदर्शनामुळे अनेक लिप्यंतरण घटकांचे नियमन होते, परिणामी जीन अभिव्यक्तीमध्ये दीर्घकालीन बदल होतात ज्या कोकेनच्या व्यसनामध्ये न्यूरोनल अॅप्लिकेशन्सच्या अंडरलाइज केल्या जातात.2). Δएफओएसबी, अशा लिप्यंतरण घटक म्हणून ओळखली (3), कोकेनला प्राण्यांच्या वर्तणुकीची संवेदनशीलता वाढविण्यास दर्शविले गेले आहे (4, 5). म्हणून, फॉस्फेट इंजेक्शनद्वारे नियंत्रित केलेल्या जीनचे ओळखणे कोकेन व्यसनाधीन आण्विक तंत्रज्ञानाच्या अधिक समजून घेण्यासाठी योगदान देण्याची अपेक्षा आहे. अलीकडे, कोकेन असलेल्या प्राण्यांचा दीर्घकाळचा उपचार ΔFosB च्या प्रेरणांद्वारे स्ट्रायटममध्ये सायक्लिन-अवलंबित किनेस 5 (Cdk5) आणि त्याच्या एक्टिव्हेटर P35 चे अभिव्यक्ती अप-नियमन दर्शवित आहे.6, 7).
सीडीकेएक्सएनएक्स सीरीन / थ्रेओनिन केनेझच्या सीडीके कुटुंबाचा सदस्य आहे. सेल-सायकल प्रोग्रॅमच्या मुख्य नियामक असलेल्या इतर सीडीसीजांसारखे, सीडीकेएक्सएनएक्स प्रामुख्याने पोस्टमिटोटिक न्यूरॉन्स मधील सबस्ट्रेट्सच्या फॉस्फोरीलायशनमध्ये गुंतलेले असते. (8). सीडीकेएक्सएनएक्स क्रियाकलापाची न्यूरोनल विशिष्टता त्याच्या कार्यकर्ते, एकतर पीएक्सएनएक्सएक्स किंवा पीएक्सयूएनएक्स असोसिएशनद्वारे प्राप्त केली जाते जी प्रामुख्याने पोस्टमिटोटिक न्यूरॉन्समध्ये व्यक्त केली जाते.8). मेंदू विकास मध्ये सीडीकेएक्सएनएक्सची महत्त्वपूर्ण भूमिका याव्यतिरिक्त9, 10), मीप्रसवपूर्व मेंदूच्या डोपामिनर्जिक ट्रांसमिशनमध्ये टी देखील समाविष्ट आहे.11, 12). सीडीकेएक्सएनएक्सच्या क्रियाकलापाच्या परिणामामुळे स्ट्रायटममध्ये डोपामाइनची वाढ वाढली आहे, सीडीकेएक्सएनएक्सचे प्रिन्सिनॅप्टिक फंक्शन डोपामाइन सोडण्याच्या नकारात्मक नियामक म्हणून दर्शवते. (11). याव्यतिरिक्त, सीडीकेएक्सएनएक्स फॉस्फोरिलेटिंग डोपामाइन- आणि सीएएमपी-नियमन केलेल्या फॉस्फोप्रोटीन, आण्विक वस्तुमान 5 केडीए (डीएआरपीपी-एक्सNUMएक्स) द्वारा एक्स-एक्सएनएक्सएक्सद्वारे पोस्टिनेप्टेप्टिक डोपामाईन सिग्नलिंगची कार्यक्षमता सुधारित करते, ज्यामुळे सीएआरपी-एक्सटेन्टेड केनेस (पीकेए) च्या प्रतिबंधक मध्ये डीएआरपीपी-एक्सNUMएक्स बदलते. (12).
या निरीक्षणातून असे सूचित होते की कोडेनच्या दीर्घकालीन संपर्कात झाल्यानंतर आणि कोकेनच्या व्यसनामुळे डीडीएमएक्सएनएक्स आणि पीएक्सएनएक्सएक्स दीर्घकालीन नियामकांच्या डोपस्ट्रीम रेग्युलेटर्सचे डाउनस्ट्रीम नियामक आहेत. स्ट्रायटल डोपामाइन सिग्नलिंग वर सीडीकेएक्सएनएक्सची भूमिका पुढील संबोधित करण्यासाठी आम्ही दोन ट्रान्सजेनिक माऊस लाइन तयार केली ज्यामध्ये सीडीकेक्सएनएक्स किंवा पीएक्सयूएनएक्स विशेषत: पीएक्सNUMएक्स प्रमोटरच्या नियंत्रणाखाली न्यूरॉन्समध्ये ओव्हरक्प्रेस केले गेले होते. आमच्या निष्कर्षांवरून असे दिसून आले आहे की सीडीकेएक्सएनएक्स क्रियाकलाप पीएक्सएनएक्सएक्स प्रथिनेच्या वाढीव स्तरांसह अप-नियमनित आहे परंतु सीडीकेएक्सएनएक्स प्रोटीन नाही, असे सूचित करते की पीएक्सएनएक्सएक्स प्रोटीनचे स्तर सीडीकेएक्सएनएक्स क्रियाकलापासाठी दर-मर्यादित आहे. आम्ही येथे प्रदान करतो जीवनात पीएक्सएनएक्सएक्स ओव्हरएक्सप्रेसमुळे परिणामस्वरूप सीडीकेएक्सएनएक्स क्रियाकलाप वाढला आहे, यामुळे पीकेए आणि एक्स्ट्रॉसेल्युलर सिग्नल-रेग्युलेटेड किनेज (ईआरके) कॅस्केडच्या प्रतिबंधाने न्यूक्लियसमध्ये कोकेन-मध्यस्थ डोपामाइन सिग्नलिंगचे प्रमाण कमी होते.
सामुग्री आणि पद्धती
अँटीबॉडीज सांता क्रूझ बायोटेक्नॉलॉजीकडून सीडीकेएक्सएनएक्स (सी-एक्सNUMएक्स) आणि पीएक्सNUMएक्स (सी-एक्सNUMएक्स) चे पॉलीक्लोनल अँटीबॉडीज खरेदी करण्यात आले. सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी (बेव्हरली, एमए) कडून फॉस्फोरलायझेशन-आश्रित आणि परस्पर प्रतिरक्षी एआरके किनेस (एमईके) 5 / 8, ERK35 / 19, आणि सीएएमपी-प्रतिसाद घटक-बाईंडिंग प्रोटीन (सीआरबी) प्राप्त झाले. फॉस्फो-थ्रू-एक्सएमएक्सएक्स एक्सपीएक्स एक्सटीएक्स (एंटीबॉडीज)13), फॉस्फो-थ्रू-एक्सNUMएक्स डीएआरपीपी-एक्सNUMएक्स (12), एकूण DARPP-32 (12), आणि सी-फॉस (14) वर्णन केल्याप्रमाणे वापरले होते. सिग्माकडून अॅक्टिनची अँटीबॉडी खरेदी केली गेली.
प्रायोगिक प्राणी आम्ही पूर्वी माउस P35 जीन क्लोन केले होते सीडीकेक्सएनएक्सआरएक्सएनएक्स, जे पीएक्सएनएक्सएक्स प्रथिने एन्कोड करते आणि त्याच्या जीनोमिक संरचनेचे वैशिष्ट्य (15). पीएक्सNUMएक्स (टीजीपीएक्सएनएक्स) च्या न्यूरोनल ओव्हरएक्सप्रेससह ट्रान्सजेनिक माउस तयार करण्यासाठी, 35-केबी इकोआरआय-इकोएक्सएमएक्स-केबी प्रमोटर क्षेत्र असलेल्या आरआय फ्रॅगमेंटमध्ये पीजीईएक्सएक्सएक्सएक्स (-) प्लाज्मिडमध्ये घसरले होते आणि एसव्हीएक्सएनएक्सएक्स पासून व्युत्पन्न केलेला 1.2-बीपी टॅग समाविष्ट करण्यात आला होता. केपीएनमी पॉली (ए+) सिग्नल (चित्र 1A). टॅगमध्ये एक आहे बोलमी जनावरांच्या जीनोटाइपिंगसाठी साइट आहे. एक्सएमएक्स-केबी फ्रॅगमेंट प्लास्मिड आणि शुक्लिफाइडमधून उत्क्रांत होते, त्यानंतर ट्रांसजेनिक चूहू तयार करण्यासाठी ट्रान्सजेनचे प्रवाही इंजेक्शन. एक्सएनएक्सएक्स-केबी पीएक्सएनएक्सएक्स प्रमोटरच्या नियामक नियंत्रणाखाली ट्रान्झिनच्या अभिव्यक्ती प्रोफाइलचे परीक्षण करणे जीवनात, द्वि ट्रान्सजेनिक माऊस (टीजीपीएक्सएनएक्स; पीएक्सयूएनएक्स - / -) पुढील दोन-प्रजनन प्रजनन तंत्रज्ञानाद्वारे तयार करण्यात आली ज्यामुळे Tgp35 माउस एंडोजोजेस पीएक्सNUMएक्स-नल बॅकग्राउंडमध्ये पुनर्जन्मित झाला. या अभ्यासात वापरल्या जाणार्या इतर माऊस मॉडेलमध्ये पीएक्सNUMएक्स +/-, पीएक्सएनएक्स - / -, सीडीकेएक्सएनएक्स +/- आणि सीडीकेएक्सएनएक्स (टीजीसीडीकेएक्सएनएक्सएक्स) च्या न्यूरोनल ओव्हरएक्सप्रेससह ट्रांसजेनिक माउस समाविष्ट आहे.9, 16, 17). या मासची जीनोटाइप शेरल बायोप्सीजपासून विभक्त जीनोमिक डीएनएवर दक्षिणी ब्लॉट विश्लेषण किंवा पीसीआर केल्याने निर्धारित केली गेली. चकत्या एका 12-H लाइट / 12-H गडद सायकल अंतर्गत ठेवण्यात आले होते. प्रयोगशाळा आणि प्रायोगिक प्राण्यांच्या काळजी आणि वापराविषयी राष्ट्रीय आरोग्य संस्थांच्या मार्गदर्शक तत्त्वांचे पालन करून सर्व काळजी देण्यात आली.
दक्षिणी ब्लॉट विश्लेषण शेप बायोप्सीजपासून काढलेले जीनोमिक डीएनए पचन होते इकोआरआय आणि बोलमी, 0.9% अग्रोझ जेलवर इलेक्ट्रोफोरेरेस केले आणि नायलॉन झिल्लीवर हस्तांतरित केले. झेंडे एक यादृच्छिक-प्रामुख्याने hybridized होते 32रात्रीच्या 42 डिग्री सेल्सियसवरील पी-लेबल केलेले प्रोब. खालील प्राइमर्स वापरून XRX-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-485 'आणि 35'-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-35' वापरून पीएक्सएनएक्सएक्स नॉकआउट (पीएक्सNUMएक्स - / -) आणि टीजीपीएक्सएनएक्स चूहूची जीनोटाइपिंगसाठी 35-बीपी प्रोब तयार करण्यात आली. 5 मिनिटसाठी 3 × एसएससी / एक्सNUMएक्स% एसडीमध्ये XBRX × एसएससी / एक्सNUMएक्स% एसडीएसमध्ये दोन वेळा धुतले जाणारे झिंबणे, 5 मि साठी 3 × एसएससी / 2% एसडीएसमध्ये दोन वेळा आणि 0.1 मि साठी 42 डिग्री सेल्सियसमध्ये दोनदा धुलाई, आणि एक्स-रे फिल्ममध्ये उघडले गेले.
औषधोपचार कोकेन (सिग्मा) निर्जंतुक खारटपणात विरघळली गेली. 15 महिन्यांवरील प्राणी कोकेन (3 मिलीग्राम / किग्रा) किंवा बराच प्रमाणात खारट आयपी-इंजेक्शन होते आणि इंजेक्शननंतर भिन्न वेळेच्या (15, 30, 60, आणि 120 मिनिट) डीकॅपिटेशनने ठार मारले. बर्फ-थंड पीबीएसमध्ये ब्रेन वेगाने काढून टाकण्यात आले. स्ट्रायटा नंतर डिस्क्लेक्ट केले गेले आणि उत्तर किंवा वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण अधीन झाले. इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषणांसाठी, इंजेक्शननंतर चूहू 2 एच पासून प्रारंभिक विभाग प्राप्त केले गेले.
नॉर्दर्न ब्लॉट विश्लेषण ट्रायझोल रीएजेन्ट (इंव्हिट्रोजन लाइफ टेक्नोलॉजीज, कार्ल्सबाड, सीए) सह स्ट्रायटातून एकूण आरएनए काढण्यात आला आणि वर्णन केल्यानुसार नॉर्दर्न ब्लॉट विश्लेषणाच्या अधीन (18). सी-फॉस एमआरएनए शोधण्यासाठी, माऊस सी-फॉस सीडीएनएचा एक 189-बीपी खंड खंडित केल्याप्रमाणे तपासणी म्हणून वापरला गेला (19). सी-फॉस एमआरएनएचे स्तर निह प्रतिमा सॉफ्टवेअर, आवृत्ती 1.62 सह प्रतिमा विश्लेषण प्रणाली वापरून विशिष्ट बँडची ऑप्टिकल घनता मोजून प्रमाणित केले गेले.
वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण स्ट्रिटाटल ऊतकांना 1% एसडीएसमध्ये सॉकेट केले गेले आणि 10 मिनिटांसाठी उकडले. प्रत्येक नमुना मध्ये प्रथिने एकाग्रता बीसीए प्रोटीन परिक्षण (पिअर्स) यांनी निश्चित केली. नायट्रोसेल्यूलोस झिल्लीवर हस्तांतरित करण्यापूर्वी एसडीएस / पृष्ठाद्वारे समान प्रमाणात प्रथिने विभक्त केली गेली. 1 × पीबीएसमध्ये झिंबके अवरोधित करण्यात आली होती ज्यात 5% स्किम दूध आणि 0.05% ट्विन 20 आणि 4 ° सेल्सिअस रात्रभर प्राथमिक अँटीबॉडीजसह उकळलेले होते. पेरोक्साइडेज-कन्जुएटेड अँट-माऊस किंवा ससा आयजीजी (सिग्मा) सह ऊष्मायन 60 मिनिट खोलीच्या तपमानावर केले गेले. वाढीव केमिलीमिनेन्स (पिअर्स) द्वारे सिग्नल आढळला आणि वर वर्णन केल्याप्रमाणे बँडची ऑप्टिकल घनता मोजली गेली.
सीडीकेएक्सएनएक्स किनास अॅसे. 50 एमएम ट्राइस एचसीएल, पीएच 7.4 / 50 एमएम NaCl / 5 एमएम EDTA / 1% ट्रायटन X-100 / 1mMDTT / 1 एमएम फेनिलमेथाइलसल्फोनिफ्लो फ्लोराइड / 1 μg / मिली ऍप्राटिनिन / 1 μg / एमएल ल्युपॅप्टीन / फॉस्फेटेस इनहिबिटर (फॉस्फेटेस इनहिबिटर मिश्रण I आणि II, सिग्मा). एलआयडी-सीडीएक्सएक्सएक्स (सी-एक्सएमएक्सएक्स) किंवा एन्टी-पीएक्सएनएक्स (सी-एक्सएमएक्सएक्स) अँटीबॉडीजसह एकतर ल्युटेट्सची निर्जलीकरण झाली. सीडीकेएक्सएनएक्स इम्यूनोप्रिसीटेट्स लिटसेटच्या 5 μl (प्रथिनाच्या 8 μg च्या सेन्टींग) च्या उष्माद्वारे तयार करण्यात आले होते जे सीएनटीएक्सएनएक्सएक्स एंटीबॉडी (35 μg) XnightX डिग्री सेल्सिअस रात्रभर राहात होते आणि त्यानंतर प्रथिने ए-एग्रोसोज मोत्यांच्या 19 μl च्या अधिक उष्मायन (5) एलआयसीएक्स बफरमध्ये% स्लरी; सान्ता क्रूझ बायोटेक्नॉलॉजी) 300 ° X साठी 300 ° C. पीएक्सएनएक्सएक्स इम्युनोप्रेसिटिट्स तयार करण्यासाठी, लिसेटच्या 5 μl (प्रोटीनच्या 3 मिलीग्रामशी संबंधित) उपरोक्त वर्णित अँटी-पीएक्सएनएक्सएक्स एंटीबॉडी (4 μg) सह उकळलेले होते. इम्यूनोप्रिसीटेट्सस दोनदा लसीस बफरसह दोनदा धुवायचे आणि दोनदा केनेझ बफरसह 25 एमएम ट्राइस एचसीएल, पीएच 50 / 3 एमएम एमजीसी2/ 1 एमएम EDTA / 1 एमएम ईजीटीए / 1 एमएम डीटीटी, किनेस बफरच्या 60 μl मध्ये पुनरुत्थित. किनेस क्रियाकलाप हिस्टोन H1 वापरून सबस्ट्रेट म्हणून मोजला गेला (18).
इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री अॅव्हर्टिन (250 मिलीग्राम / किग्रा, फ्लुका) च्या आयपी इंजेक्शन्सने आणि चक्राकारपणे एक्सएमएक्स एम सोडियम फॉस्फेट बफर, पीएच 0.1, स्ट्रॅक टिश्यू फिक्सेटिव्ह (स्ट्रॅक लेबोरेटरीज, ला व्हिस्टा, एनई), नॉन-क्रॉसलिंकिंग फिक्सेटिव्हसह आयपी इंजेक्शन्सने मिसला अँजेस्टिझाईड केले. विच्छेदित मेंदू पुढील राक्षस मध्ये 7.4 डिग्री सेल्सियसच्या वेळी पुन्हा निश्चित करण्यात आले. मग, पॅराफिनमध्ये मेंदू अंतर्भूत केले गेले, 37-μm-thick coronal भागांमध्ये कट केले गेले आणि एमिडिन-बायोटिन-पेरोक्साइडस कॉम्प्लेक्स तंत्र (वेक्टर लॅबोरेटरीज) एक सबस्ट्रेट म्हणून हिरिनोबेंजेडाइन सह वापरुन इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्रीच्या अधीन केले. सी-एफओएसच्या विरूद्ध एक्सएनएक्स डिग्री सेल्सियसच्या तुलनेत हे भाग एन्टीनिटी-पुर्वाइफाइड पॉलीक्लोनल अँटीबॉडीसह उकळले गेले. प्राथमिक अँटीबॉडी वगळता दागिन्यांची विशिष्टता तपासली गेली.
परिणाम
पीएक्सNUMएक्सच्या न्यूरोनल ओव्हरएक्सप्रेससह ट्रान्सजेनिक मूसची निर्मिती. पीएक्सएनएक्सएक्सच्या वाढलेल्या न्युरोनल अभिव्यक्तीस प्राप्त करण्यासाठी वापरलेली ट्रान्सजेनमध्ये 35-केबी प्रमोटर आणि पीएक्सNUMएक्सचे संपूर्ण कोडिंग अनुक्रम असलेले क्लोन केलेल्या माउस पीएक्सएनएक्सएक्स जीनचे 6-Kb खंड समाविष्ट आहे.चित्र 1 A). माइसची जीनोटाइप दक्षिणी ब्लॉट विश्लेषणाद्वारे निर्धारीत केली गेली जी प्रोबचा वापर करून पिक्स्युएक्स - / - आणि टीजीपीएक्सएनएक्स चूहूला वन्य-प्रकार चूहूपासून वेगळे करण्यास तयार करण्यात आली होती.चित्र 1 A आणि B). एक्सएनएक्सएक्स-केबी पीएक्सएनएक्सएक्स प्रमोटरच्या नियंत्रणाखाली ट्रान्सजीन अभिव्यक्तीचे परीक्षण करण्यासाठी, आम्ही दुहेरी ट्रान्सजेनिक चूहू (टीजीपीएक्सएनएक्स; पीएक्सएनएक्स - / -) तयार केले ज्यामध्ये पीएक्सएनएक्सएक्स एक्सप्रेशन ट्रांजिनेमधूनच चालवले गेले. टीजीपीएक्सएनएक्स एक्सएक्स पीएक्सएनएक्सएक्स एक्सप्रेशन; पीएक्सयूएनएक्स - / - माइस केवळ मेंदूमध्ये आढळून आले (चित्र 1C), जेथे स्थानिक अभिव्यक्ती नमुना वन्य-प्रकार चूहूच्या समान होते (चित्र 1D). पीएक्सयूएनएक्सची कमतरता सेरेब्रल कॉर्टेक्स आणि चूहूच्या हिप्पोकैम्पस मधील असामान्य लेयरिंग स्ट्रक्चरमध्ये दर्शविली गेली आहे (10). तथापि, टीजीपीएक्सएनएक्स; पीएक्सएनएक्सएक्स - / - माइसने पीएक्सएनएक्सएक्स - / - मेंदू फनोटाइपचे संपूर्ण बचाव दर्शविले (चित्र 1E). या डेटाने सूचित केले की 1.2-kb p35 प्रमोटरने ट्रान्सजेनची अभिव्यक्ती एका समान अभिव्यक्ती प्रोफाइलसह एंडोजोजेस पीएक्सएनएक्सएक्स जीनपासून P35 पर्यंत नियंत्रित केली आहे.
P35 प्रोटीन लेव्हल सीडीकेएक्सएनएक्स क्रियाकलापाच्या उप-नियमनसाठी दर-मर्यादा आहे. आम्ही 35 महिन्यांपर्यंत पीएक्सNUMएक्स - / -, पीएक्सएनएक्सएक्स +/-, जंगली-प्रकार, टीजीपीएक्सएनएक्स, सीडीकेएक्सएक्स +/, आणि टीजीसीडीकेएक्सएनएक्सएक्स चूहू पासून प्रथिनांच्या अभिव्यक्तीमध्ये प्रथिन अभिव्यक्तीवर जीन्स एन्कोडिंग पीएक्सएनएक्सएक्स आणि सीडीकेएक्सएनएक्सचे जीन-डोस प्रभावांचे परीक्षण केले. पीएक्सएनएक्सएक्स आणि सीडीकेएक्सएनएक्स प्रोटीनचे स्तर अनुक्रमे अनुवांशिक जीन्स डोससह चांगले संबंध आहेत.चित्र 2 A आणि B). टीजीपीएक्सएनएक्स चोळीने जंगली-प्रकारचे चूहू तुलनेत पीएक्सएनएक्सएक्स प्रथिने पातळीमध्ये ≈35-fold वाढ दर्शविली, तर सीडीकेएक्सएनएक्स प्रोटीनचे स्तर पीएक्सएनएक्सएक्स प्रथिनेच्या भिन्न पातळ्यांमुळे अप्रभावित झाले. टीजीसीडीकेएक्सएनएक्सएक्स चोळीने वन्य-प्रकार चूहूच्या तुलनेत सीडीकेएक्सएनएक्स प्रोटीन स्तरावर ≈1.6-fold वाढ दर्शविली, तर पीडीएमयूएनएक्स प्रोटीन स्तर सीडीकेएक्सएनएक्स प्रोटीनच्या विविध स्तरांमुळे अप्रभावित झाले. सीडीकेएक्सएनएक्सएक्स क्रियाकलापावर विविध प्रमाणात पीएक्सएनएक्सएक्स प्रथिनेच्या प्रभावांचे परीक्षण करण्यासाठी, सीडीकेएक्सएनएक्स सीडीएक्सएक्सएनएक्स एंटीबॉडी आणि किनेज क्रियाकलाप मापन केलेल्या स्ट्रायटल अर्कपासून इम्यूनोप्रिसीटिटेड करण्यात आले. त्याचप्रमाणे, किनेझ क्रियाकलापावरील सीडीकेएक्सएनएक्स प्रोटीनच्या विविध प्रमाणात प्रभावांचे परीक्षण करण्यासाठी, पीएक्सएनएक्सएक्स एंटी-पीएक्सएनएक्सएक्स एंटीबॉडीसह स्ट्रायटल अर्कपासून इम्यूनोप्रिसीटिड करण्यात आले आणि किनेस क्रियाकलाप मोजला गेला. सीडीकेएक्सएनएक्स क्रियाकलाप पीएक्सएनएक्सएक्स प्रथिनेच्या पातळीशी चांगले संबंध आहे परंतु सीडीकेएक्सएनएक्स प्रोटीनच्या पातळीसह नाही.चित्र 2 C आणि D). हे परिणाम दर्शवितात की P35 प्रोटीनची संख्या Cdk5 क्रियाकलापासाठी दर-मर्यादित घटक आहे. आम्ही ट्रायटल डोपामाईन सिग्नलिंग वर वाढलेल्या सीडीकेएक्सएनएक्स क्रियाकलापाच्या प्रभावांची तपासणी करण्यासाठी टीजीपीएक्सएनएक्स चूहोचा वापर केला.
टीआर-एक्सएनएक्सएक्स वर डीएआरपीपी-एक्सएमएक्सएक्सचे कोकेन-प्रेरित फॉस्फोरलायझेशन टीजीपीएक्सएनएक्स मिसमध्ये ऍट्युनेटेड आहे. DARPP-32 चे कार्य एकाधिक साइट्सवरील त्याच्या फॉस्फोरिलेशन स्थितीवर अवलंबून असते (20). पीकेए थ्र-एक्सएमएक्सएक्सवर डीएआरपीपी-एक्सNUMएक्स फॉस्फोरिलेट करते, तर सीडीकेएक्सएनएक्स थ्र-एक्सएमएक्सएक्स वर डीएआरपीपी-एक्सNUMएक्स फॉस्फोरिलेट करते. अशा प्रकारे, आम्ही जंगली-प्रकार आणि टीजीपीएक्सएनएक्स चूहूच्या स्ट्रायटल अर्कमध्ये DARPP-32 च्या फॉस्फोरलायझेशन स्थितीची तपासणी केली. टीजीपीएक्सएनएक्स चूहूमध्ये फॉस्फो-थ्र-एक्सएमएक्स डार्प-एक्सNUMएक्सची पातळी जास्त होती (चित्र 3A; वन्य-प्रकार चोथाच्या मूल्यापेक्षा 1.6 ± 0.2-fold). आम्ही पुढे स्ट्रायटल डोपामाइन सिग्नलिंग वर वाढलेल्या सीडीकेएक्सएनएक्स क्रियाकलापांच्या प्रभावांचे मूल्यांकन केले. आम्ही थ्र-एक्सएमएक्सएक्स वर DARPP-5 च्या फॉस्फोरलायझेशन स्टेटसचे विश्लेषण करून टीजीपीएक्सएनएक्स चूहूमध्ये कोकेन-प्रेरित पीकेए सक्रियतेची तपासणी केली. कोकेन इंजेक्शननंतर 35 मिनिट वन्य-प्रकार चूहूमध्ये फॉस्फो-थ्र-एक्सएमएक्स डार्प-एक्सएनएक्सएक्सची पातळी वाढविण्यात आली (चित्र 3B; बेसल स्तरावर 1.8 ± 0.2-fold). तथापि, DARPP-34 च्या थ्र-एक्सएनएक्सएक्स फॉस्फोरीलायझेशन वर कोकेनचा प्रभाव टीजीपीएक्सएनएक्स चोथा (बेसल पातळीपेक्षा 32 ± 35-fold) मध्ये क्षीणित केला गेला. या निष्कर्षांनी सूचित केले की सीडीकेएक्सएनएक्सच्या वाढीमुळे कोकेन-प्रेरित पीकेए सक्रीयता संभाव्यतेने थ्र-एक्सएमएक्सएक्स वर DARPP-1.2 फॉस्फोरायलेक्शनद्वारे (6, 12). हे देखील शक्य आहे की प्रिन्सिपॅप्टिक सीडीकेएक्सएनएक्स क्रियाकलाप वाढल्याने डोपामाइनच्या प्रमाणात कमी होण्यास मदत होते आणि यामुळे कोकेनच्या कमी परिणामात योगदान होते. विशेषतः, कोकेनच्या एका इंजेक्शनमुळे पीएक्सएनएक्सएक्स आणि सीडीकेएक्सएनएक्स प्रोटीनच्या पातळी तसेच किनेस क्रियाकलापांवर परिणाम होत नाही (चित्र 3 C आणि D). हे मागील अभ्यासाच्या विरोधात आहे ज्यामध्ये कोकेनचे दीर्घकालीन संपर्क P35 आणि Cdk5 चे अभिव्यक्ती अप-नियमन दर्शविण्यात आले आहे (6).
सीडीकेएक्सएनएक्स एक्टिव्हिटीची उप-नियमन ERK5 / 1 च्या कोकेन-प्रेरित केलेल्या एक्टिव्हिटीस एटिन्युएट्स. अलीकडील पुरावे दर्शवितात की स्ट्रायटममधील डोपामाइन रिसेप्टर ऍक्टिवेशन देखील इतर सिग्नलिंग कॅस्कडे सक्रिय करते, इआरके पथवेसह (21, 22), कोकेनच्या वर्तनाच्या प्रतिसादात महत्त्वपूर्ण भूमिका आहे (23). म्हणून आम्ही सीडीकेएक्सएनएक्स क्रियाकलाप ERK मार्गमार्गाच्या कोकेन-प्रेरित सक्रियतेस प्रभावित करू शकतो की नाही याचा तपास केला. सेर-एक्सएनएक्सएक्स आणि सेर-एक्सएनएक्सएक्स (बेसल लेव्हलपेक्षा 5 ± 1-fold) आणि ERK2 मधील मेक्क्सNUMएक्स / एक्सएनएक्सएक्सच्या वाढीच्या फॉस्फोरलायझेशनने दर्शविल्याप्रमाणे जंगली-प्रकारचे चूहू पासून स्ट्रायटल अर्क मधील कोकेन इंजेक्शननंतर ईआरके मार्गमार्गचे सक्रियकरण केले गेले. / 217 थ्रू-221 आणि टायर-एक्सNUMएक्स (ERK1.5 फॉस्फोरीलायशन: मूळ पातळीपेक्षा 0.2 ± 1-fold) (चित्र 4 A आणि B). तथापि, एमएक्सएक्सएनएक्सएक्स / एक्सएमएक्सएक्स (बेसल लेव्हलपेक्षा 1 ± 2-fold) आणि ERK1.2 / 0.2 (ERK1 फॉस्फोरीलायन: बेसल लेव्हलपेक्षा 2 ± 2-fold) चे कोकेन-प्रेरित सक्रियकरण टीजीपीएक्सएनएक्स चोइसमध्ये (एसीएनएक्सएनएक्स)चित्र 4 A आणि B). शिवाय, फॉस्फो-ईआरएक्सएक्सएक्स / एक्सएनएक्सएक्सचे मूलभूत स्तर टीजीपीएक्सएनएक्स चूहू (वन्य-प्रकार चोथाच्या मूल्यापेक्षा 1 ± 2-fold) मध्ये कमी होते, परंतु ही प्रवृत्ती सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण नव्हती. हे नंतरचे परिणाम थ्र-एक्सएमएक्सएक्सवरील एमकेएक्सएनएक्सएक्सचे सीडीकेएक्सएक्सएक्स-आश्रित फॉस्फोरीलायझेशनला श्रेय दिले जाऊ शकते, परिणामी उत्प्रेरक क्रियाकलाप कमी होतो (24). या संभाव्यतेचे मूल्यांकन करण्यासाठी, आम्ही थ्र-एक्सएमएक्सएक्सवरील मेक्क्समॅक्सच्या फॉस्फोरलायझेशन स्टेटसची तपासणी केली आणि आढळली की टीजीपीएक्सएनएक्स चूहूच्या स्ट्रायटल अर्कमध्ये फॉस्फो-थ्र-एक्सयूएनएक्स एमईएक्सएक्सएक्सचे उच्च स्तर उपस्थित होते (चित्र 4C; वन्य-प्रकार चोथाच्या मूल्यापेक्षा 1.3 ± 0.1-fold). शिवाय, थ्र-एक्सएनएक्सएक्सवरील एमईएक्सएक्सएएनएक्सची फॉस्फोरिशन स्थिती कोकेनच्या एका इंजेक्शनने बदलली नाही, सीडीकेएक्सएनएक्स क्रियाकलाप उपचाराने प्रभावित झाला नाही हे शोधण्याशी सुसंगत आहे (चित्र 3D).
न्युक्लियसमध्ये सिग्नलिंग दोपमाइनचा प्रसार वाढीव सीडीकेएक्सएनएक्स क्रियाकलापाने वाढला आहे. पीकेए आणि ईआरके यांचा समावेश असलेल्या एकाधिक सिग्नलिंग कॅस्केडच्या कोकेन-प्रेरित सक्रियतेमुळे सेक्र-एक्सNUMएक्सच्या फॉस्फोरिलायझेशनद्वारे न्यूक्लियसमधील लिप्यंतरण घटक सीआरबीचे पुढील सक्रियीकरण होते.22, 25). पीकेए आणि ईआरके एक्टिवेशन कॅस्केडवरील सीडीकेएक्सएनएक्स-मध्यस्थ अवरोधक प्रभाव न्यूक्लियसमधील सीआरबी फॉस्फोरीलायझेशनवर एकत्र येऊ शकतात की नाही हे तपासण्यासाठी आम्ही जंगली-प्रकार आणि टीजीपीएक्सएनएक्स चूहूच्या स्ट्रायटल अर्कमध्ये सेर-एक्सएनएक्सएक्सवरील सीआरबीच्या फॉस्फोरलायझेशन स्टेटसची तपासणी केली. फॉस्फो-सीआरबीचा मूलभूत स्तर Tgp5 चोथामध्ये (वन्य-प्रकार चोथाच्या मूल्याच्या 133 ± 35-fold) ()चित्र 5). कोकेनच्या इंजेक्शनच्या प्रतिक्रियेने वन्य प्रकारचे चूहू (बेसल पातळीपेक्षा 1.5 ± 0.1-fold) च्या स्ट्रायटममध्ये फॉस्फो-सीआरबीचे प्रमाण वाढविण्यात आले होते, परंतु कोकेनला हा प्रतिसाद टीजीपीएक्सएनएक्स चक्रात (35 ± 1.2- बेसल स्तरावर गुंडाळा) (चित्र 5).
सेर-एक्सएनएक्सएक्सवरील सीआरबीचे फॉस्फोर्लायझेशन त्याच्या जीवाणूंच्या क्रियाकलापांना सीएएमपी प्रतिसाद घटकाच्या सहाय्याने निश्चित जीन्सच्या प्रमोटर क्षेत्रामध्ये सी-फॉस जीन समेत वाढवते.26). म्हणून आम्ही कोकेन इंजेक्शननंतर जंगली-प्रकार आणि टीजीपीएक्सएनएक्स चूहूच्या स्ट्रायटममध्ये सी-फॉसची तपासणी केली. जंगली-प्रकारच्या चोथामध्ये, को-फॉन्स एमआरएनएचे पातळी कोकिनच्या इंजेक्शननंतर 35 मिनिट (बेसल लेव्हलपेक्षा 1.8 ± 0.2-fold) वाढले आणि इंजेक्शननंतर 30 मिनिट नंतर बेसल स्तरावर परत आले (चित्र 6 A आणि B). तथापि, सी-फॉस एमआरएनए इंजेक्शननंतर 30 मिनिटापर्यंत जंगली-प्रकारचे चूहू पेक्षा टीजीपीएक्सएनएक्स चोथामध्ये ≈35% कमी होते.चित्र 6 A आणि B). टीजीपीएक्सएनएक्स चोईसमध्ये सी-फॉसचे कमी प्रेरण इम्यूनोहिस्टोकेमॅस्टी द्वारे पुढे सिद्ध केले गेले.चित्र 6 C-F). कोकेन प्रशासनाने सी-फॉस इम्युनोरिएक्टिव्हिटी वाढविली, जो स्ट्रायटमच्या डोर्सोमेडियल-डोरोसेंट्रल भागांमध्ये आणि दुर्बलपणे पार्श्वभूमीत जंगली-प्रकार आणि टीजीपीएक्सएमएक्स चोथा दोन्हीमध्ये वाढली. तथापि, सी-फॉस-इम्यूनोस्पोजिटिव्ह पेशींच्या संख्येत कोकेन-प्रेरित वाढ विशेषतः टीजीएपीएक्सएनएक्स चूहूच्या स्ट्रायटममध्ये क्षीणित करण्यात आली (चित्र 6G). एकत्रितपणे, या निष्कर्षांनी सूचित केले की टीजीपीएक्सएनएक्स चूहूतील स्ट्रायटल डोपामाईन सिग्नलिंगच्या कोकेन-मध्यस्थ वाढीस सीडीकेएक्सएनएक्सच्या वाढीचा संभाव्य परिणाम होतो.
चर्चा
सीडीकेएक्सएनएक्स आणि त्याच्या एक्टिव्हेटर पीएक्सएनएक्सएक्सला लक्ष्य जीन म्हणून ओळखले गेले आहे जे कोकेनच्या दीर्घकालीन प्रदर्शनाद्वारे नियंत्रित केले जातात. (6). सीडीकेएक्सएनएक्स अप-रेग्युलेशनऐवजी पॅक्युएनएक्स अप-रेग्युलेशनच्या परिणामी सीडीकेएक्सएनएक्स क्रियाकलाप वाढविण्याबद्दल आम्ही येथे पुरावा सादर करतो, ज्यामुळे प्रघातक न्यूरॉन्समध्ये कोकेन-मध्यस्थ डोपामाईन सिग्नलिंगचे प्रमाण कमी होते. स्ट्रायटल डोपामाईन सिग्नलिंग वर सीडीकेएक्सएनएक्स किंवा पीएक्सयूएनएक्सच्या अपर-नियमन केलेल्या परीणामांच्या परीणामांचे परीक्षण करण्यासाठी, दोन ट्रान्सजेनिक माऊस लाईन्स, टीजीसीडीकेएक्सएनएक्स आणि टीजीपीएक्सएमएक्स चूहोचे विश्लेषण केले गेले. आम्हाला आढळून आले की सीडीकेएक्सएनएक्स क्रियाकलाप वाढीच्या पॅकएक्सएक्स प्रोटीनच्या प्रमाणानुसार अप-नियमनित होते परंतु सीडीकेएक्सएनएक्स प्रोटीनच्या वाढीव पातळीमुळे प्रभावित झाले नाही. आमच्या मागील अहवालात असेही दिसून आले आहे की जेव्हा सीडीकेएक्सएनएक्स इम्युनोप्रेसिटिट्स वापरुन क्रियाकलाप मोजला गेला तेव्हा TgCdk5 माउस मेंदूमधील सीडीकेएक्सएनएक्स क्रियाकलाप जंगली-प्रकारच्या माउस मेंदूपेक्षा कमी होती.17), असे दर्शवितो की सीडीकेएक्सएक्सएक्स ओव्हरएक्सप्रेसमुळे पॉक्समॅक्स पातळी वाढल्यास मोनोमेरिक सीडीकेएक्सएक्सचा वाढीव स्तर वाढला नाही. या परिणामांनी सूचित केले आहे की पीडीएनयूएनएक्स प्रोटीनचे स्तर सीडीकेएक्सएनएक्स क्रियाकलापांसाठी दर-मर्यादित घटक आहे.
कोडेनच्या तीव्र इंजेक्शननंतर ट्रायटॅममध्ये सीआरबीएक्सएनएक्स चोईने सीआरबी फॉस्फोरेलायझेशन आणि सी-फॉस या दोन्हीपैकी कमी प्रेरणांचे प्रदर्शन केले, असा निर्देश दिला की सीकेकेक्सएनएक्सएक्स क्रियाकलाप वाढवून कोकेनला प्रघातक प्रतिसाद अडथळा आला. टीजीपीएक्सएनएक्स चोईसमध्ये कोकेन-मध्यस्थ डोपामाईन सिग्नलिंगचे क्षीण होणे डीएआरपीपी-एक्सNUMएक्स, पीकेए आणि ईआरके समेत एकाधिक सिग्नलिंग कॅस्केडच्या सीडीकेएक्सएनएक्स-मध्यस्थ प्रतिबंधांद्वारे शक्य झाले. कोकेन प्रशासनाने जंगली-प्रकारातील चहाच्या थ्र-एक्सएनएक्सएक्समध्ये डीएआरपीपी-एक्सएमएक्सएक्सचे पीकेए फॉस्फोरीलायशन वाढविले, तर ही प्रतिक्रिया टीजीपीएक्सएनएक्स चूहूमध्ये क्षीणित केली गेली. थ्र-एक्सएनएक्सएक्स वर डीएआरपीपी-एक्सएनएक्सएक्सचे पीकेए फॉस्फोरिलेशन प्रोटीन फॉस्फेटेस 35 (PP5) चे क्रियाकलाप रोखण्यासाठी दर्शविले गेले आहे, सीआरबीच्या सेर-एक्सएनएक्सएक्सच्या डिफॉस्फोरिलायझेशनसाठी जबाबदार एनजाइम (27). अशा प्रकारे, PP1 क्रियाकलाप Tgp32 माइसमध्ये DARPP-1 / PP35 मार्ग मार्गे विरोध करणार नाही.
टीजीपीएक्सएनएक्स चूहूमध्ये ERK1 / 2 चे कोकेन-प्रेरित सक्रियकरण देखील क्षीणित केले गेले. सीडीकेएक्सएनएक्स द्वारा ERK35 / 5 च्या कोकेन-प्रेरित सक्रियतेस प्रतिबंध करणारी अनेक वेगळी तंत्रे आहेत. प्रथम, थ्र-एक्सएनएक्सएक्स वर डीएआरपीपी-एक्सNUMएक्सचे सीडीकेक्सएमएक्स-अवलंबित फॉस्फोरलायझेशन पीकेएला बाधित करू शकते, यामुळे ERK1 / 2 सक्रियतेसाठी आवश्यक असलेल्या कोणत्याही पीकेए-मध्यस्थ MEK5 / 32 सक्रियनची पुढील प्रतिबंध होऊ शकते. अलीकडील अभ्यासात असे आढळले आहे की एमईके सक्रीयतेच्या अप्रत्यक्ष नियमनसह अनेक मार्गांनी ERK75 / 1 च्या कोकेन-मध्यस्थ केलेल्या सक्रियतेसाठी थ्र-एक्सएमएक्सएक्स वर डीएआरपीपी-एक्सएनएक्सएक्सचे फॉस्फोरिलेशन आवश्यक आहे तसेच स्ट्रॉटल-समृद्ध फॉस्फेटेस, टायरोसिन फॉस्फेटस जी थेट ERK2 / 1 वर कार्य करते (28). या संभाव्यतेसाठी समर्थन हे शोधून सूचित केले आहे की Ser-1 आणि Ser-2 वर मेकेक्सNUMX / 217 चे कोकेन-प्रेरित फॉस्फोरलायझेशन Tgp221 चूहूमध्ये समाप्त झाले. आणखी संभाव्य मार्ग थ्र-एक्सएमएक्सएक्सवरील एमकेएक्सएनएक्सएक्सचे सीडीकेएक्सएक्सएक्स-आश्रित फॉस्फोरीलायझेशनद्वारे आहे, ज्यामुळे त्याचा उत्प्रेरक क्रिया कमी होईल आणि ERK35 / 5 क्रियाकलापाचा प्रतिबंध होईल (24).
स्ट्रॅटममधील सीडीकेएक्सएनएक्स क्रियाकलापाचा प्रतिबंध प्राण्यांमध्ये क्रॉनिक कोकेन उपचारांच्या पर्सेंटिएट वर्तनासंबंधी प्रभाव दर्शवित आहे.6). सीडीकेएक्सएनएक्सच्या क्रियाकलापाचे वर-नियमन केल्याने पूर्ववत असलेल्या कोकेन व्यवस्थापनाच्या प्रभावांना प्रतिकार करण्यासाठी न्यूरोनल अनुकूलीत योगदान देऊ शकते अशी पूर्वस्थितीशी सुसंगतता (6), आम्हाला आढळले की DARPP-5 आणि MEK32 चे सीडीकेएक्सएनएक्स-मध्यस्थ फॉस्फोरलायझेशन ERK1 / 1 च्या कोकेन-प्रेरित सक्रियतेच्या क्षीणतेसाठी योगदान देत आहे, परिणामी स्ट्रायटममध्ये सीआरबी फॉस्फोरेलायझेशन आणि सी-फॉसचे कमी प्रेरण. आमच्या निष्कर्षांनी सीडीकेएक्सएनएक्स क्रियाकलाप वाढविला आहे, जे पिक्सनएक्स अप-रेग्युलेशनमुळे झाले आहे, कोकेनच्या दीर्घकालीन संपर्काच्या नंतर स्ट्रायटममध्ये जीन अभिव्यक्ती बदलू शकते. हे सीआरबी आणि सी-फॉस्सारख्या प्रतिलेखन घटकांच्या क्रियाकलापांमधील बदलांद्वारे येऊ शकते. म्हणूनच, सीडीकेएक्सएनएक्सएक्स एक्टिव्हेटर पीएक्सएनएक्सएक्स सीडीकेएक्सएनएक्सच्या क्रियाकलापांवर दर-मर्यादा घालण्याच्या परिणामामुळे, न्यूरॉनल फंक्शन अंतर्निहित कोकेन व्यसन मध्ये दीर्घकालीन बदल होऊ शकते..
Acknowledgments
आम्ही डॉ. आभार मानतो. पांडुलिपिचे महत्त्वपूर्ण वाचन करण्यासाठी मेरी जो डॅनटन, फिलिप ग्रांट आणि सशी केसापाण्या. हे काम नॅशनल इन्स्टिटयूट ऑफ हेल्थ ग्रांट जेएक्सएनएक्सएक्सटीएनएक्सएक्स-एक्सएमएक्सएक्स (एबीके), यूएस पब्लिक हेल्थ सर्व्हिस ग्रांट डीएक्सईएनएक्स आणि सिमन्स फाऊंडेशन, पीटर जे. शार्प फाऊंडेशन आणि पिकावर फाऊंडेशन (पीजी) कडून अनुदान देण्यात आले होते.
टिपा
संक्षेप: सीडीकेएक्सएनएक्स, सायकलीन-अवलंबित किनेस 5; ERK, अतिरिक्त सेल्यूलर सिग्नल-रेग्युलेटेड किनेस; DARPP-5, डोपामाइन आणि सीएएमपी-नियंत्रित फॉस्फोप्रोटीन, आण्विक वस्तुमान 32 केडीए; पीकेए, सीएएमपी-आश्रित केनेस; एमके, इर्क केनेस; सीआरबी, सीएएमपी-प्रतिसाद घटक-बाध्यकारी प्रोटीन.
संदर्भ
;