Hypocretin (orexin) e nolofalletsa moputso ka ho hlokomelisa liphello tse se nang lehlakoreng tsa eona ea li-cotransmitter dynorphin sebakeng sa ventral tegmental (2014)

John W. Muschamp,^a,1 Jonathan A. Hollander,^b Jennifer L. Thompson,^c George Voren,^b Linda C. Hassinger,^a Sara Onvani,^a Theodore M. Kamenecka,^b Stephanie L. Borgland,^c Paul J. Kenny,^b 'me William A. Carlezon, Jr.^a

Boitsebiso ba Mongoli ► Tlhahisoleseding ea Copyright le License ►

Hypocretin (orexin) le dynorphin ke li-neuromodulators tse phethang karolo ea bohlokoa ho taolong e amang le ts'usumetso. Orexin e bohlokoa bakeng sa moputso mme ea ameha ho batleng lithethefatsi, athe dynorphin e nka maikutlo a fosahetseng mme e kenella mefuteng e joalo ea khatello ea maikutlo. Ha ho nahanoa ka litlamorao tsena tse hanyetsanang, litlaleho tsa hore li-peptide ka bobeli li hlahisitsoe ka li-neuron tse tšoanang mme li-msingi li kentse letsoho. Mona, re bonts'a hore orexin le dynorphin li kopantsoe kahare ho li-vesicles tse tšoanang le hore colocalization ena e na le tšusumetso e kholo meputsong, ho sebeliseng lithethefatsi le liketsong tse sa ts'oaneng. Taba ea hore orexin e kenyelletsa litlamorao tse kang khatello ea maikutlo ea dynorphin e fetoha haholo kamoo re talimang karolo e sebetsang ea orexin bokong.

Hypocretin (orexin) le dynorphin ke li-neuropeptide tse nang le liketso tse hanyetsang ho boits'oaro bo susumetsang. Orexin e kenelletse literekeng tse khahlisang le moputso, athe dynorphin e kenella mefuteng e tepelletsang joaloka maikutlo. Re bontša hore, ho sa natse liketso tsa bona tse hanyetsanang, li-peptide tsena li kentsoe ka li-vesicles tse tšoanang tsa synaptic ka har'a hypothalamus. Ho sitisoa ha tšebetso ea orexin ho etsa hore ho be le litlamorao tse matlafatsang tsa ho tsitsisa ha pelo (lateral hypothalamic (LH)), ho tlosa tšusumetso e bakoang ke koae, hape ho fokotsa ho itlhokomela ha koae. Tšitiso e ts'oanang ea mosebetsi oa dynorphin e khutlisa liphetoho tsena tsa boitšoaro. Re boetse re bonts'a hore orexin le dynorphin li na le liketso tse hanyetsanang mabapi le thabo ea sebaka se kopaneng (VTA) dopamine neurons, sepheo se totobetseng sa li-neurons tse nang le orexin, le hore mabaka a intra-VTA orexin a baka ho theoha ha ts'ebetso ea boikoetliso ba koae le ho ts'oaroa ha LH. tse khutliselitsoeng morao ke dynorphin antagonism. Seo re se fumaneng se supa ts'ebetso e ikhethang ea sele eo ka eona orexin e ka hlahisang meputso e nyolisang meputso ea dynorphin ea mantlha mme ka tsela eo e sebetsa ka mokhoa o lumellang ho fana ka moputso.

Orexin le Dynorphin ke Cotransmitters.

Re netefalitse coexpression ea orexin le dynorphin ka har'a li-neurons tse tšoanang tsa toeba ea morao, phello le dorsomedial hypothalamus re sebelisa fluorescence microscopy (18) (Feie. 1A). Ho ba teng ha li-neuron tse hlalosang li-transmitter tse ngata ho hlalositsoe lits'ebetsong tse ling tsa boko mme ho ka emela motheo oa neural bakeng sa ts'ebetso ea ho sefa - litokollo tsa li-neurotransmitters tse kopaneng li etsahala ka litekanyetso tse fapaneng tsa ho thunya (19). Ka ho sebelisa EM, re fumane leha ho le joalo hore orexin le dynorphin li ngotsoe kahare kahare. Maemo a mangata a ho kopitsa a ile a bonoa maemong a sa tsitsang, a varicose axonal, moo immunolabeling e fumanoeng kapa haufi le li-vesicles. Ka har'a 'mele ea lisele tsa methapo ea kutlo, ho ngola ho bohlokoa ho ne ho amahanngoa le mofuta oa Golgi, athe ha ho e' ngoe e fumanoeng ho maqhubu a haufi (Feie. 1 B 'me C). Dendrites e ne e boetse e na le mongolo o amanang le vesicle bakeng sa li-peptide ka bobeli, o fana ka maikutlo a ho ba teng ha dendritic ho lokolloe ha li-transmit. Palo e nyane ea liprofinete tsa "micostructural" e nkile li-terminals tsa axon tse nang le mangolo bakeng sa li-peptide ka bobeli tse fumanehang ka har'a li-vesicles tse kholo tsa ∼100 nmFeie. 1 B 'me C), e fana ka tšehetso ea sephetho sa hore orexin le dynorphin li sebetsa e le mekotla ea thepa le hore, tlasa maemo a tloaelehileng, ba lokolloa mmoho eseng ho fapana joalo ka ts'ebetso ea maqhubu a fono a sele.

 

Setšoantšo sa 1.

Orexin le dynorphin ke li-cotransmitters ka li-neuron tsa hypothalamus. (A, Left hole) Photomicrograph ea sefahleho se khanyang e bonts'a sebaka sa hypothalamus se hlahlojoang bakeng sa orexin (bofubelu) le dynorphin (botala). (A, Ho lokile) Setšoantšo se kopaneng sa liteishene tse peli ...

Liphetho tsa Moputso tse Phahamisang tsa Thibelo ea Orexin blockade li khutlisoa ke Dynorphin Blockade.

Ho hlahloba bohlokoa ba ts'ebetso ea mokhoa ona o ikhethang oa polelo ea transmitter, re ile ra hlahloba hore na ho hloka taolo ho pontšo ea orexin le dynorphin ho ka ama boits'oaro bo rarahaneng bo bonts'ang maikutlo a tloaelehileng le a sitisang. Ka C57BL / 6 litoeba tse koetliselitsoeng ho etsa intracranial ho intlafatsa (ICSS) e matlafalitsoeng ka ho hlohlelletsoa hoa hypothalamic (LH) hamorao (20), blockade ea OX₁Rs ka N- (2-methyl-6-benzoxazolyl) -N ″ -1,5-naphthyridin-4-yl urea (SB334867) nakong ea leseli le bakile keketseho ea tekanyetso ea litekanyetso tsa meputso (Feie. 2A; mehato e 'ngoe e pheta-phetoang ea ANOVA bakeng sa Tekanyetso: F_3,12 = 4.44, P <0.02). Keketseho ea lithibelo tsa ICSS e bonts'a liphokotso tse bakoang ke kalafo ho litlamorao tse ntle tsa ts'usumetso, lets'oao le ts'oanang le khatello ea maikutlo le bontšang ho fokotseha hoa kutlo ho putsa (20). Phello ena e ne e se ka lebaka la sedation kapa ho sitisoa hoa boitšoaro bo bong bo sa hlonepheng, hobane litekanyetso tsa karabelo tsa ICSS li ne li sa angoe (Feie. 2B; mehato e 'ngoe e pheta-phetoang ea ANOVA bakeng sa Tekanyetso: F_3,24 = 0.33, P > 0.80).

 

Setšoantšo sa 2.

Liphetho tse phahamisang meputso tse tlisoang ke orexin blockade li khutlisoa ke dynorphin blockade. (A) Blockade ea orexin signing ho OX₁R ka SB334867 (0-30 mg / kg, ip) e phahamisa menyetla ea moputso litekong tsa ICSS, e bonts'a moputso o fokotsehileng. Matla ana ...

Liphetoho maemong a meputso tse bakoang ke SB334867 li ile tsa thibeloa ke ho reroa ha ho sa na letho ka binaltorphimine (norBNI) [mekhoa e 'meli e phetoang habeli ANOVA bakeng sa Lithethefatsi (pakeng tsa lintlha tsa thuto) × Dose SB (ka har'a mabaka a tšebelisano): F_3,24 = 3.98, P <0.01], e hlahisang thibelo ea nako e telele ea liketso tsa dynorphin ho li-KOR (10). Lintlha tsena li fana ka maikutlo a hore tahlehelo ea matšoao a orexin e senola litlamorao tsa morao-rao tsa dynorphin ea methapo. Tsamaiso ea NorBNI feela ha ea ka ea fokotsa menyetla ea meputso. Le ha phello ena e kanna ea amana le pharmacodynamics e ikhethang ea NorBNI le bahanyetsi ba bang ba protorypical KOR (10), e kanna ea supa hore ho na le bofokoli ba mekhoa e fetolang tšebetso ea lipotoloho tsa moputso oa boko kapa hore keketseho ea phasic molumo oa orexin o le mong (e sa amaneng le dynorphin ea methapo) ha e lekane ho fana ka letšoao la moputso ho tsoa sebakeng sa ts'usumetso ho hypothalamus ea morao. Liphumano tsena li ka shebahala li sa tsamaisane le mosebetsi oa ba bang ba ileng ba hlahloba SB334867 molemong oa ICSS nakong ea lefifi.21). Leha ho le joalo, ho na le bopaki bo bongata bo fokotsehang ts'ebetsong ea orexin bo ka ba le litlamorao ho latela hore na liphoofolo li hlahlojoa nakong ea leseli kapa lefifi la tsona. Mohlala, lijo le metsi li boloka litlamorao tsa tsona ho litoeba tsa orexin KO ha ho etsoa liteko nakong ea lefifi empa eseng nakong ea leseli.22), nako eo ka eona re ileng ra etsa liteko tsa boitšoaro ba rona kaofela.

Ho tsebisa litla-morao tsa tsamaiso ea SB334867 le norBNI ho ICSS, sehlopha sa litoeba se arohaneng se ile sa kenngoa ka li-electrode tsa LH tse susumetsang le li-cannulae tsa VTA tsa tsamaiso. Microinfusion ea SB334867 ho VTA e bakile keketseho e tšoaeang menyako ea meputso, e bonts'ang ho fokotseha ha kutloisiso ea moputso. Le ha intra-VTA norBNI feela e ne e sena phello mathuleng a ICSS, e ile ea thibela lits'itiso tsa ho phahamisa litšeho tsa ts'ebetso e ileng ea latela ea SB334867 (Feie. 2C; mekhoa e pheta-phetoang ea ANOVA bakeng sa Lithethefatsi: F_3,9 = 10.98, P <0.01). Leha ts'oaetso ea lithethefatsi e sa sebetseng e ne e tloaetse ho hlahisa phokotso e nyane ka sekhahla se phahameng sa karabelo ha e bapisoa le liente tsa sistimi ea lithethefatsi, litlamorao tsena ha lia fihlela boleng ba lipalo (Feie. 2D; mekhoa e pheta-phetoang ea ANOVA bakeng sa Lithethefatsi: F_3,9 = 1.03, P = 0.112).

Impulsivity E laoloa ke Orexin le Dynorphin Transfer.

Ho susumetsa ho bontšoa ke bofokoli ho hatelletseng ha boits'oaro ba ho batla moputso, ka maemo a phahameng a ho itlhahisa e le tšobotsi e tloaelehileng ea mafu a mangata a kelello (23). Lithethefatsi tsa tlhekefetso, ho kenyelletsa le koae, li ka baka le ho eketseha ha maikutlo, tse khothalletsoang ho khanna tsoelo-pele ea bokhoba ba tahi (24). Ha re nka karolo ea bohlokoa ea li-orexin le li-dynorphin tse laolang taolo ea kutlo mabapi le phello e khotsofatsang ea ho susumetsoa ke LH tlhahlobo ea ICSS, re ile ra nahana hore tšebelisano lipakeng tsa li-neuropeptide tsena tse peli e ka ba le tšusumetso ea bofokoli ba mantlha le bofokoli bo hlahisitsoeng ke koae ka ts'ebetso ena. Impulsivity e ka aroloa ka litoeba ka ho lekanya likarabo tsa pele ho nako ea 5-khetho ea serial reaction time task (5-CSRTT) (25), mohlala oa phoofolo e ananang le teko ea ts'ebetso e tsoelang pele e sebelisetsoang ho ithuta tlhokomelo ho batho. Ho arabela pele ho tlhahlobo ena ho batla ho le tlase maemong a tloaelehileng mme ho eketsoa ke lithethefatsi tse phahamisang phetiso ea DA (26). Re sebelisitse 5-CSRTT ho hlahloba monehelo oa sistimi ea orexin-dynorphin ho boits'oaro bo potlakileng le bo kopantseng koae. Ha e tsamaisoa e le 'ngoe, SB334867 e boetse e fokotsa palo ea likarabo tse tlang pele ho nako (Feie. 3A; F_3,21 = 4.89, P <0.01). Phokotso ena e etsahetse ka lebaka la ho ba sieo ha litlamorao ho ho nepahala ha karabelo (F_3,21 = 1.45, P = 0.25), latency e khutlisetsang morao (F_3,21 = 0.91, P = 0.44), kapa palo ea liteko tsa ts'usumetso e felisitsoeng (F_3,21 = 1.46, P = 0.25), ho bonts'a hore li ne li se ka lebaka la ho falimeha ho hlokofetse kapa bokhoni ba koloi. Tsamaiso ea NorBNI, leha ho le joalo, e khutlisitse litlamorao tsa SB334867 mabapi le ho arabela pele ho nako (Feie. 3B; F_3,18 = 0.45, P = 0.71), ho fana ka maikutlo a hore phetisetso ea dynorphin e sa thibeloang e bohlokoa bohareng ba litlamorao tsa litlamorao. Fuoa o le mong kapa o kopantsoe le SB334867, NorBNI ha ea hlahisa litlamorao ho mehato ea ho nepahala ha karabelo (F_3,18 = 0.66, P > 0.58), latency (F_3,18 = 3.09, P > 0.06), kapa palo ea liteko tse khothatsang li phethetsoe (F_3,18 = 2.38, P > 0.10). Ho itšireletsa pele ka SB334867 ho boetse ho thibetse keketseho e habeli ea karabelo ea pele ho nako e hlohlellelitsoeng ke cocaine (Feie. 3C; F_6,24 = 5.84, P <0.01). Lintlha tsena li fana ka bopaki ba hore orexin neurotransuction e ka laola boits'oaro bo sa tsitsang tlasa maemo a mabeli a mantlha le a khothaletsoang ke cocaine ka tsela e mamelang dynorphin.

 

Setšoantšo sa 3.

Boitšoaro ba ho susumetsa bo laoloang ke ho leka-lekana ha orexin le dynorphin. (A) SB334867 e fumana likarabo tsa pele ho nako mohlaleng oa likhakanyo tsa 5-CSRTT. Mehato ea ho nepahala, latency ea ho khutlisa pellet ea lijo, le palo ea liteko tse setseng e ne e se ...

Dynorphin Mediates Fokotsa Ts'ebetso ea Cocaine ho OX₁R-Null lithunya.

Ho ba tlokotsing ea ho lemalla ho ho lemalla ho eketsa tšenyo e kholo ho batho ba sa tsubeng, 'me ho eketsoa ha koae ho eketsang maikutlo ho tlatsetsa ho eketseng ts'ebetsong ea lithethefatsi (23, 27). Ho feta moo, phetisetso ea orexin le phetisetso ea dynorphin li entsoe ka mokhoa o ikemetseng bakeng sa ho laola litlamorao tsa phello e ntle ea koae le lithethefatsi tse ling tsa tlhekefetso (28-32). Re ile ra nahana hore tšebelisano lipakeng tsa orexin le phetisetso ea dynorphin e ka laola ka kotloloho ts'ebeliso ea lithethefatsi. Ho hlahloba monyetla ona, re ile ra hlahloba boiketsi ba iv cocaine ho litoeba tse fetotsoeng liphatsa tsa lefutso₁Rs (OX₁R^{- / -}). Lits'oants'o tsa mofuta ona oa genocype li bonts'a ho itaola ka mokhoa o pharaletseng oa litekanyetso tse ngata (0.1-1 mg / kg ka infusion) empa li bonts'a karabelo e sa ntlafatsoang ea meputso ea lijo tlasa manane a ntlafatso a tšoanang (33), ho fana ka tlhahiso ea hore phokotso ea ho sethethefatsi sa koae ha e kopane le bofokoli ba ts'ebetso ea boits'oaro. Ho feta moo, OX₁R^{- / -} litoeba li bonts'a litekanyetso tse tloaelehileng tsa ho itlhokofatsa ka koae nakong ea linako tse tharo tse qalang tsa phihlello ea koae empa ka nako eo e bonts'a ka potlako ho theoha ha cocaine (33). Re netefalitse phenotype ena ka tekanyo ea 0.3 mg / kg ka infusion, re bonts'a ho supa ka OX₁Rs e bapala karolo ea bohlokoahali ho theheng le ho boloka boits'oaro ba koae [Feie. 4; mehato e 'meli e pheta-phetoang ANOVA, Genotype (lipakeng tsa lintlha) x D kalafo ea lithethefatsi (ka har'a lintlha) F_1,12 = 12.91, P <0.01]. Joalo ka ho iketelletsa pele ka NorBNI ho khutlisetsa ICSS e tloaelehileng le boits'oaro bo ts'oanang le maikutlo ho litoeba tse fuoeng SB334867, e boetse e buselitse boitaolo ba cocaine ho OX₁R^{- / -} litoeba, e fana ka mohlala o ikhethang oo ho oona ho pholohileng boits'oaro bo hlahisoang ke liphatsa tsa lefutso tšebetsong ea tšebetso e 'ngoe ea methapo ea methapo. Liphumano tsena li fana ka maikutlo a hore, ho OX₁R^{- / -} litoeba, liketso tse sa bonoeng tsa dynorphin li hlahisa thepa e ruisang ea koae, ebe ka tsela eo, e fokotsa lithethefatsi. Ho khahlisang ke hore ho OX₁R^{+ / +} (taolo) litoeba, NorBNI ka tšohanyetso e ile ea fokotsa ts'ebetso ea cocaine. Tlhaloso e 'ngoe e ka bang teng ka phello ena ke hore dynorphin e ntšoang ke li-neurore tsa "nonorexin" tse bitsoang "Direct" striatonigral medium spiny neurons, e na le litlamorao tse amanang le ho ja koae' me e hlile e ka tsamaisa litlamorao tse khahlisang tsa koae. Ho ba teng ha palo ea batho ba babeli ba KORs ba nang le likarolo tse fapaneng moputsong oa koae ho tla boela ho hlalose hore na ke ka lebaka lefe renoceto e ileng ea khutlisetsa bofokoli boitsholong ba ho sebelisa koae ho fumanoe ho OX₁R KO litoeba. Ntle le moo, ho nkeha maikutlo ha KOR ho fokotsa ho hobe kapa ho sithabetsang ha ho khaotsa koae (34), tse bakang mekhoa ea ho ja lithethefatsi (17). Ho sa tsotelehe, datha tsena li fana ka maikutlo a hore litlamorao tse nyahamisang joalo ka dynorphin lia ata ho sa sebetseng ha orexin ho saena, ho hlahisa phokotso ho litlamorao tse khahlisang tsa koae, athe litlamorao tsa orexin li tsamaisa litlamorao tse khahlisang tsa koae, li eketsa nako ea tsona ka ho se be teng dynorphin e bonts'a.

 

Setšoantšo sa 4.

Ts'ebetso ea ts'ebetso ea cocaine e fokotsehile₁Litoeba tsa R KO li khutlisoa ke KOR blockade. Ho senyeha ha matšoao a orexin ho OX₁R ka ho tlosoa hoa liphatsa tsa lefutso tsa receptor ena ho fokotsa ho ikarola ha koae (0.3 mg / kg ka ho kenella). Phokotso ena ke e 'ngoe ...

Orexin le Dynorphin ba ka hlahisa litlamorao tse hanyetsanang tsa VTA DA Neurons.

Libopeho tsa methapo tse fumanang karohano ho tsoa ho hypothalamic orexin le dynorphin neuron li ka pepesetsoa li-peptide ka bobeli, ka hona li tlangoa ke litlamorao tsa tsona tse hanyetsanang ho thabo ea neuronal (35, 36). Hore na litlamorao tsa peptide e le 'ngoe li laola eng kapa tse ling ho ka etsahala ho latela lintlha tse ngata, ho kenyelletsa bongata ba peptide e' ngoe le e 'ngoe, ho phela nako e telele sebakeng sa extracellular, le polelo ea li-receptor ka bongata bo fapaneng ba li-neurons tse lebisitsoeng, hammoho le tšebelisano lipakeng tsa lipakeng li-receptors le mekhoa ea bona e ikhethang ea ho supa liseleng tsa postynaptic. Moputso oa ho potlaka le oa cocaine o laoloa, bonyane ka karolo, ke li-neurons tsa DA ho VTA (26), sepheo se hlahelletseng sa lisele tse nang le orexin tse nang le hypothalamic (37). Ho feta moo, ho kenella ha orexin ho VTA ho ntlafatsa ho batlana le lithethefatsi (6). Ho hlahloba menehelo ea peptide e 'ngoe le e' ngoe ka ts'ebetso ea li-neurons tsa VTA, re ile ra etsa lirekoto tsa elektroniki ho tsoa liseleng tsa DA ho C57BL / 6 likotoana tsa boko tsa panya tse hlahisitsoeng ka orexin le dynorphin li sebelisoa ka bonngoe kapa li le hammoho. Joalo ka ha ho ne ho lebelletsoe, ha e sebelisoa ka thoko, orexin e ne e thabisa ka mokhoa o tšoanang, athe dynorphin e hlahisitse litlamorao feela (Feie. 5 A 'me B; F_2,50 = 18.95, P ≤ 0.01). Bathong ba li-neuron tsa DA tse rekotiloeng, boholo ba bona bo ile ba arabela ka botebo bo tebileng ba li-peptide tsena ka bobeli, le ha e le hore sehlotšoana se fokolang se ne se ikarabela feela ho orexin kapa dynorphin (Feie. 5B). Hoa makatsa hore ebe li-peptide tsena ka bobeli li ne li sebelisoa ho li-neurons tse arabelang habeli (n = 10), ho ne ho se na phello ea chelete palong ea ho thunngoa (Feie. 5A), Ho fana ka maikutlo a hore litlamorao tse hananang tsa peptide e ngoe le e ngoe maemong a khotsofatsang li ka hlakola tharollo ea mantlha. Li-neurone tse 'ne ho tse 10 li bontšitse thibelo e khethiloeng ke dynorphin leha e ne e le teng ea orexin, athe sele e le' ngoe e ne e thabile ka ho khetheha (> 1.5-fold change) ke orexin leha e ne e le teng ka dynorphin (Feie. 5 A 'me C). Ka kakaretso, leha lisele tse ngata li ne li arabela ho orexin ho feta dynorphin, lisele tseo tse neng li ikarabela ho li-peptide ka bobeli li ne li se na phetoho ea thekiso ha orexin le dynorphin li ne li kopantsoe, ho fana ka maikutlo a hore litšusumetso tse hanyetsanang tsa peptide e 'ngoe le e' ngoe li ne li lekane ka har'a sete sa VTA DA li-neurons li ithutile.

 

Setšoantšo sa 5.

Orexin le dynorphin ba hlahisa litekanyetso tse leka-lekaneng empa tse hanyetsanang ho li-neuron tsa VTA DA. (A, Leqeleng) Orexin e kopantsoeng le dynorphin ha li felle ka phetoho e felletseng ea sekhahla sa ho thunngoa ha li-neuron tsa VTA DA (n = 10). Ha e sebelisoa ka bonngoe, dynorphin e ne e thibile ebile orexin e ne e thabisa. ...

Ho hlakisa le ho feta litšebelisano tse ka 'nang tsa orexin-dynorphin ka har'a li-neuron tsa VTA tse neng li amehile ka orexin le dynorphin, re lekile, ka mokhoa o mong, ho eketsa lithibelo tsa thibelo ea dynorphin e sebelisitsoeng ka ho hlapa ka kalafo le SB334867 (Setšoantšo sa S2A; F_5,25 = 2.13, P <0.01) kapa ho ntlafatsa litlamorao tsa orexin ea ho hlapa ka kalafo ea norBNI (Setšoantšo sa S2B; F_3,27 = 5.48, P <0.01). Litekong ka bobeli, OX₁R le block ea ROR ea KOR e sitiloe ho hlahisa litlamorao, ho fana ka maikutlo a hore SB334867 le norBNI ha li hlahise litholoana ka liketso tse sa hlonepheng. Habohlokoa le ho feta, lintlha tsena li fana ka maikutlo a hore molumo oa peptide e 'ngoe le e' ngoe ka vitro ha oa lekana ho susumetsoa ke ts'ebeliso ea bahanyetsi ba limolek'hule tse nyane joalo ka SB334867 le NorBNI. Ho fumana hona ho tsamaisana le mosebetsi oa nakong e fetileng o bonts'ang hore li-exocytosis tsa li-vesicles tse kholo, tse nang le peptide hangata li etsahala feela maemong a mangata a thunya a sa tsitsitseng ao ka tloaelo a leng sieo litokisetsong tsa methapo (38).

Ho netefatsa hore norBNI ha e a ka ea susumetsa boitšoaro ka liketso tsa "off-target" ho OX₁Rs, re tla hlahloba litlamorao tsa mohanyetsi enoa ho OX₁R ho saena. Ka ho khetheha, re sebelisitse mofuta oa fluorometric imaging plate Read (FLIPR) ho tseba bokhoni ba orexin A, SB334867, kapa norBNI ho kenya litšitšireletso tsa khalsiamo tse kahare liseleng tse cultured tsa CHO tse hlahisang OX ea motho₁Rits. Le ha orexin A e hlahisitse keketseho e lebelletsoeng ea calcium ea intracellular (EC₅₀ = 0.01 μM) le lethal dose la SB334867 li fumane phello ena ka botlalo (EC₅₀ = 0.035 μM), NorBNI e ile ea hloleha ho hlahisa liphetho leha e le life ho basele kapa ho marang-rang a orexin A-evoke ea calcium calcium e intracellular. Sena se fana ka maikutlo a hore litlamorao tsa NorBNI ho VTA DA neuronal physiology li feela ka mekhoa e boletsoeng ea KOR ea ho fana ka litlhare mme sethethefatsi ha se na phello e tobileng ho OX₁R (39) (Setšoantšo sa S3 A-C).

Litumellano tsa Orexin-Dynorphin ho VTA Laola Ts'ebetso ea Cocaine.

Lithuto tsa rona tsa electrophysiology li bonts'a ts'ebelisano e matla lipakeng tsa orexin le dynorphin e laola ts'ebetso ea VTA DA, le hore li-neurons tsa VTA mohlomong li sebetsa e le senotlolo sa mantlha bakeng sa litlamorao tsa tsamaiso ea orexin-dynorphin ka boitšoaro bo susumetsang. Ho leka hypothesis ena ka kotloloho, re ile ra hlahloba litlamorao tsa ho kenella kahare ho VTA ea SB334867 ho iv-cocaine ea ho itaola literekeng. Ha e bapisoa le infusion ea koloi ea intra-VTA, intra-VTA SB334867 e bakile phokotso e tšoaileng ea tšebeliso ea koae e neng e thibetsoe ke NKBI (Feie. 6; tsela e le 'ngoe ANOVA: F_3,24 = 11.56, P <0.01), ho fana ka maikutlo a hore liketso tsa dynorphin tse sa hanyetsoeng kahare ho sebaka sena sa boko li fokotsa moputso oa cocaine. Liphetho tsena li bonahala li fapane le tse bonts'itseng ho ba sieo ha intra-VTA SB334867 mabapi le boits'oaro ba k'hok'heine litulong tse tlase tsa boiteko bo matla ba 1 (FR1) tsa matlafatso (40). Leha ho le joalo, litlaleho tse 'maloa li bontšitse hore ha litlhoko tsa mesebetsi li ntse li eketseha, SB334867 e sebetsa hantle haholo ho fokotsa tšebeliso ea lithethefatsi (2, 33). Hobane likhoto tsa teko ena li ne li etsa moralo oa boikhathatso ba FR5, liphetho tsa hona joale li lumellana le lingoliloeng tsena. Lintlha tsena li fana ka bopaki bo tobileng ba hore mofuta o hanyetsanang oa orexin le dynorphin ho VTA DA neuronal physiology li ka hlahisa litholoana tsa bohlokoa boits'oarong bo khannoang ke moputso.

 

Setšoantšo sa 6.

Ho sebelisana ha lithethefatsi tsa Orexin-dynorphin ho VTA ho nka lithethefatsi. Ts'ebetso ea cocoaine e fokotsehile ke intra-VTA SB334867 (3 μg ka lehlakoreng le leng), athe ts'usumetso ena e khutlisoa ka ho tloaela ho sebetsa le NorBNI (10 mg / kg, ip) (n = 9). ***P < ...

Liphoofolo.

Tona e kholo ea C57BL / 6J (8 wk ea lilemo; Jackson Laborator) e sebelisitsoeng litekong tsa EM e ne e e-na le ntlo (e meraro ho isa ho e mehlano ka khareji); tse sebelisoang bakeng sa ICSS li ne li lula ka bolona kamora ho buuoa. Male banna ba baholo (350 g) Sprague-Dawley rats (Charles River Laboratories) ba sebelisitsoe ho liteko tsa 5-CSRTT le tsa cocaine tsa taolo ea koae 'me ba ne ba behiloe ka lihlopha tsa ba bane. Tona e kholo ea C57BL / 6J (matsatsi a morao-rao a 19-21) e sebelisitsoeng liteko tsa elektroniki e ne e le sehlopha (tse tharo ho isa ho tse hlano ka koleche). The OX1^{- / -} litoeba le bona OX1^{+ / +} litterlings (6 wk ea lilemo) tse sebelisoang lithutong tsa boits'oaro li fumanoe ho Laboraro la Laboraro mme li ile tsa khutlisoa morao ho feta meloko e supileng ho isa litoeba tsa C57BL / 6. Linta tsena li ne li bolokiloe ka lihlopha (tse peli ka kofing). Liphoofolo tsohle li ne li behiloe ka tlasa maemo a laoloang ke mocheso mochesong oa khanya oa 12-h, mme tlhahlobo ea boitšoaro e etsahetse 4-5 h ka har'a potoloho ea leseli; lijo le metsi li ne li fumaneha ka lipapatso ntle le ha ho bontšitsoe ka hosele. Tsamaiso e ile ea etsoa ho latela Setsi sa Naha sa Bophelo Tataiso bakeng sa tlhokomelo le tšebeliso ea liphoofolo tsa liphoofolo (50) mme tsa amoheloa ke Komiti ea Tlhokomelo ea Liphoofolo le Ts'ebeliso ea Setheo sa Sepetlele sa McLean, Univesithi ea British Columbia, le scripps Florida.

Immunohistochemistry le Microscopy.

Fluorescence le khauta e ntlafalitsoeng ka silevera e ntlafalitsoeng bakeng sa orexin A kapa prodynorphin e ile ea etsoa ka mefuta e meng ea boko ea panya ho latela lits'ebetso tse tlalehiloeng pele (51), mme e sebetse ho latela protocol ea EM e tloaelehileng. Libaka tsa Nonoverliling tsa lisele tsa immunolabeled li ile tsa khethoa ka mokhoa o sa reroang le ho nkuoa setšoantšo bakeng sa tlhaiso ea dikarolwana tse sebelisang software ea ImageJ (Institutes of Health) (Lisebelisoa tsa SI le Mekhoa, Immunohistochemistry le Microscopy).

Elektroniki.

Lipeipi tsa Patch (3-5 MΩ) li ne li tlatsitsoe ka 143 mM potasium gluconate, 10 mM Hepes, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgATP, 0.3 mM NaGTP (e nang le pH ea 7.2), le 270-XmMMMMMXMMXMMXMMXMX Lintlha li fumanoe ho 280 kHz mme e tlhotliloe ho 20 kHz e sebelisa software ea pClamp 2 (Li-Molecular Devices). Kamora ho fumana sebopeho sa sele e felletseng, lisele li ne li tsamaisoa ka matla ho −10.0 mV le letoto la methapo ea motlakase (70 ms, ho tloha −250 ho −60 mV ka mehato ea 130-mV) e sebelisitsoe ho fumana hyperpolarizing (I_h) maqhubu. I_h e ne e nkuoe e le phetoho ea hajoale lipakeng tsa ∼30 ms le 248 ms kamora hore mohato oa motlakase o sebelisoe. Ts'ebetso ea maqhubu ea li-neurons tsa VTA DA e lekantsoe ka mokhoa oa hona joale oa clamp. Liteko li qalile ha sekhahla se tsitsitseng sa ho thunya hoa basement se fihlile; Maqephe a ka tlase a ile a kenngoa bakeng sa 5 min mme ka mor'a moo a hlatsuoa ka mokelikeli oa mokokotlo oa maiketsetso. Metsotso ea ho qetela ea 3 ea sekhechana se seng le se seng sa 5-min se sebelisitsoe bakeng sa tlhahlobo ea data. Dynorphin A (1-17; 200 nM) le orexin A (100 nM) li fumanoe ho American Peptide mme tsa qhibiliha ka metsing a hlatsoitsoeng. Likeletso tsena li kile tsa fumanoa li fana ka litlamorao tse matla mabapi le ts'ebetso ea sele ea VTA (5, 52). Thiorphan (1 μM) le boraatin (10 μM) li fumanoe ho Sigma-Aldrich, tsa qhibiliha ka metsing a belisitsoeng, 'me tsa sebelisoa hammoho le dynorphin A (Lisebelisoa tsa SI le Mekhoa, Electrophysiology).

FLIPR Assay.

OX₁Ts'ebetso ea R e ile ea hlahlojoa ka ho lekanya litekanyo tsa calcium ea intracellular ke mofuta oa FLIPR joalo ka ha ho hlalositsoe pele (53) (Lisebelisoa tsa SI le Mekhoa, Fluorometric Imaging Plate Reader Assay).

ICSS.

Lice li ne li kentsoe li-electrodes kapa cannulae (PlasticsOne) ka tlas'a ketamine / xylazine (80 le 10 mg / kg, ka ho latellana, ip; Sigma) li ile tsa lebisoa ho li-LH (18) le / kapa VTA ea mokonteraka [ho tsoa bregma: anteroposterior (AP), −3.2 mm; Mediolateral (ML), −0.5 mm; dorsoventral (DV), −4.7 mm ho tloha dura]. Kamora nako ea ho hlaphoheloa ea 7-d, litoeba li ile tsa koetlisetsoa ho arabela bakeng sa ho susumetsa ha boko joalo ka ha ho hlalositsoe pele (18). Khafetsa e tlase haholo e neng e tšehetsa karabelo (monyako) e ne e kopitsoa ho sebelisoa tlhahlobo e tlase ea mabatooa a molemo ka ho fetisisa. Ha litoeba li phethahatsa mekhoa ea botsitso bakeng sa likotlo tsa ICSS (± 10% ho feta matsatsi a 5 a latellanang), litlamorao tsa kalafo ea lithethefatsi li ile tsa lekanngoa. SB334867 (Scripps Florida) kapa koloi ea DMSO e fanoe ka matsatsi a mang a sebelisa mochini oa Hamilton (0.1 mL / kg ip), mme menyako e ile ea hlakoloa hang-hang lithutong tsa liteko tsa 15-min. NorBNI (10 mg / kg ip; Sigma) e fanoe ka saline (10 mL / kg) 48 h pele ho qalo ea tlhahlobo ea ICSS.

5-CSRTT.

Likhoto li ne li thibetsoe lijo (ho 85% ea boima ba phepo e sa lefelloeng) mme li koetliselitsoe likamoreng tse sebetsang tse laoloang ke likhomphutha tse kentsoeng kahare, likhabinete tse nang le molumo (Metsoalle ea Med), le mekhoa ea 5-CSRTT e entsoeng joalo ka ha ho hlalositsoe (25). SB334867 (ho DMSO, 0.1 mL / kg) le / kapa cocaine (ka saline, 1 mL / kg; Sigma) e fanoe ke injin ea ipN XXUMX pele ho liteko, joalo ka liteko tse ling, 'me NorBNI e ile ea fuoa bonyane 10 h pele ho qalo ea liteko (Lisebelisoa tsa SI le Mekhoa, The 5-Khetho ea Nako ea Boikarabello ea Khetho).

IV Cocaine Boitšoaro.

Likhoto le litoeba li ne li entsoe ka anoflurane (1-3% vol / vol) motsoako oa mosi oa oksijene 'me o hlophisitsoe hantle ka li-catheter tsa Silastic (VWR Science) tse kahare ea methapo ho latela litsamaiso tse hlophisitsoeng (54). Hang hang kamora ho kenngwa ha catheter likhoto, li-cannulae tsa tšepe tse sa keneleng letho (23 gauge, 17 mm bolelele) li kentsoe VTA (ho tloha bregma: AP, 5.3 mm; ML, ± 0.7 mm; DV, -7.5 mm ho tloha ka nako e telele ). Ho lekoa ka SB334867 kapa norBNI nakong ea likopano tsa letsatsi le letsatsi tsa 60-min ho ile ha etsoa kamora ho fihlella ts'ebetso e tsitsitseng ea k'hok'heine (<20% ho arabela matsatsi a 3 a latellanang; Lisebelisoa tsa SI le Mekhoa ea Ts'ebeliso ea Ts'ebetso ea IV Cocaine).

Lipalopalo.

Lintlha li hlahisitsoe joalo ka S mean SEM. Bakeng sa liteko tsa ICSS, mehato e pheta-phetoang ea ANOVA e sebelisitsoeng habeli ho sebelisoa ho bapisa mekhoa pakeng tsa maemo a tšoaroang ke SB334867 le norBNI + SB334867. Mehato e pheta-phetoang ea ANOVA e le 'ngoe le liteko tsa Newman-Keuls post hoc e sebelisitsoe ho bapisa mekhoa ka har'a SB334867 le norBNI + SB334867. Mehato e pheta-phetoang ea ANOVA le Newman-Keuls le tsona li ile tsa sebelisoa ho bapisa mekhoa litekong tsohle tsa 5CSRTT. Mehato e pheta-phetoang habeli ANOVA e sebelisitsoe ho bapisa mekhoa lipakeng tsa lihlopha tsa kalafo litekong tsa ho itaola tsa koae le OX₁R KO litoeba. Mehato e 'ngoe e phetoang e le' ngoe ea ANOVA le liteko tsa Newman-Keuls li ile tsa sebelisoa ho bapisa likarabo tse hlakileng ho orexin le dynorphin ke li-neurons tsa VTA DA. Mehato e 'ngoe e pheta-phetoang ea ANOVA le Newman-Keuls le tsona li ile tsa sebelisoa ho bapisa mokhoa oa ho ja koae ka likhoto tse tšoaroang ke SB334867 le norBNI. Phapang e ne e nkuoa e le ea bohlokoa haeba P <0.05.

Re leboha Dr. Garrett Fitzmaurice bakeng sa litlhaloso tse molemo mabapi le buka e ngotsoeng ka letsoho le Miranda S. Gallo le Melissa Chen ka thuso ea ho bokella lintlha. Mosebetsi ona o ne o tšehelitsoe ke National Institutes of Health Grants F32-DA026250 le K99-DA031767 (ho JWM), F32-DA024932 le K99-DA031222 (ho JAH), R01-DA023915 (ho. PJK), le R01 (TOX PUMK), le R063266. ) le ka lengolo la tumello ea ho sibolla likokoana-hloko tsa Natural Science and Engineering Research Council (ho SLB).

Pherekano ea polelo ea thahasello: WAC e tšoere patent (US Patent 6,528,518; Assignee: McLean Hospital) e amanang le ts'ebeliso ea bahanyetsi ba kappa-opioid bakeng sa kalafo ea mafu a sithabetsang. Bangoli ba bang kaofela ba phatlalatsa hore ha ba na tlholisano ea lichelete.

Sengoliloeng sena ke Tlhahiso ea Direct ea PNAS.

Bona Maikutlo a maqepheng 5765.

Sengoliloeng sena se na le tlhahisoleseling e tšehetsang marang-rang ho www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1315542111/-/DCSupplemental.