DeltaFosB kwa moja kwa moja inasimamia shughuli ya mchezaji wa Cck (2010)

Ubongo Res. 2010 Mei 6; 1329: 10-20.

Iliyochapishwa mtandaoni 2010 Machi 11. Doi:  10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

John F. Enwight, III,1 Megan Wald,1 Madison Paddock,1 Elizabeth Hoffman,1 Rachel Arey,2 Scott Edwards,2 Sade Spencer,2 Eric J. Nestler,3 na Colleen A. McClung2, *

Maelezo ya Mwandishi ► Taarifa ya Hakimiliki na Leseni ►

Toleo la mwisho la chapisho la mchapishaji linapatikana katika Ubongo Res

Angalia makala nyingine katika PMC kuwa Anatoa makala iliyochapishwa.

Nenda:

abstract

Baadhi ya mabadiliko muhimu ya biochemical, kimuundo, na tabia yanayosababishwa na udhihirisho sugu wa dawa za dhuluma huonekana kupatanishwa na stableFosB iliyo thabiti sana ya uandishi. Kazi ya hapo awali imeonyesha kuwa ΔFosB overexpression katika panya kwa wiki 2 husababisha kuongezeka kwa usemi wa jeni nyingi kwenye striatum, ambayo mingi baadaye inadhibitiwa kufuatia wiki za 8 za kujieleza kwa ΔFosB. Kwa kufurahisha, idadi kubwa ya jeni hizi ziliorodheshwa pia katika kupindua panya kwa sababu ya maandishi ya CREB. Haijulikani wazi kutoka kwa utafiti huu, hata hivyo, ikiwa ΔFosB ya muda mfupi inasimamia jeni hizi kupitia CREB. Hapa tunaona kuwa wiki za 2 za ΔFosB overexpression huongeza kujionyesha kwa CREB katika hali ya striatum, athari ambayo hutengana na wiki za 8. Induction ya mapema inahusishwa na kuongezeka kwa CREB kwa watengenezaji wa jeni fulani wa lengo kwenye mkoa huu wa ubongo. Kwa kushangaza, jeni moja ambalo lilikuwa watuhumiwa wa CREB kulingana na ripoti za zamani, cholecystokinin (Cck), haikudhibitiwa na CREB katika hali ya siri. Kuchunguza zaidi kanuni za Cck Kufuatia ΔFosB overexpression, tulithibitisha kwamba ufupi wa ΔFosB overexpression huongeza zote mbili Cck shughuli ya kukuza na kujieleza kwa jeni. Pia inaongeza shughuli za kumfunga katika tovuti ya kumfunga CREB (CRE) katika Cck mtangazaji. Walakini, wakati tovuti ya CRE inahitajika kwa kujieleza kwa kawaida kwa Cck, haihitajiki kwa ΔFosB induction ya Cck. Ikizingatiwa, matokeo haya yanaonyesha kuwa wakati uingizwaji wa ΔFosB wa muda mfupi huongeza kujielezea na shughuli za CREB kwa watangazaji wa jeni fulani, hii sio utaratibu tu ambao jeni huandikishwa chini ya masharti haya.

Keywords: mkusanyiko wa nuksi, maandishi, ulevi

Nenda:

UTANGULIZI

Mfiduo wa muda mrefu wa dawa za dhuluma husababisha mabadiliko ya biochemical na ya kimuundo katika mikoa kadhaa ya ubongo. Mabadiliko haya hufikiriwa kuhusisha mabadiliko katika maelezo mafupi ya jeni katika mfumo wa mesolimbic. Mfumo huu unaundwa na neuropu ya dopaminergic ambayo mradi huo kutoka eneo la tezi ndogo ya hewa (VTA) katika eneo la katikati hadi ya katikati ya spiny kwenye nukta za nucleus (NAc) (ventral striatum) na idadi ya maeneo mengine ya ubongo. Mabadiliko katika shughuli ya sababu mbili za uandishi, protini inayoweza kujibu majibu ya CAMP (CREB) na ΔFosB (proteni ya familia ya Fos), imependekezwa kugeuza mabadiliko mengi ya biochemical, muundo, na tabia inayoonekana na mfiduo sugu wa dawa za kulevya ( kukaguliwa na Nestler, 2005).

CREB ni jambo lililoonyeshwa kwa maandishi lililo wazi kwamba ni mwanachama wa familia ya CREB / ATF. Codb Homodimers huunganisha kwa tofauti za mlolongo wa CRE (makubaliano: TGACGTCA) inayopatikana katika watangazaji wa jeni nyingi. Phosphorylation ya CREB (haswa huko serine 133, ingawa tovuti zingine zimetambuliwa) zinaweza kuchochewa na kasino kadhaa za kuashiria ikijumuisha ile iliyo chini ya dopamine receptors (Cole et al., 1995). Juu ya phosphorylation katika serine 133, CREB inaajiri mwanzilishi wa protini ya kumfunga CREB (CBP) au protini zinazohusiana zinazoongoza kwa usemi ulioongezeka wa jeni (uliyopitiwa na Johannessen et al., 2004). Mfiduo wa mara kwa mara kwa madawa ya opiate au psychostimulant ya unyanyasaji huchochea kuongezeka kwa shughuli za CREB kwenye mkusanyiko wa kiini (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), marekebisho ya wazo la kupungua mali yenye thawabu ya dawa hizi na kuchangia hali mbaya ya kihemko ya kujiondoa kwa dawa za kulevya (Nestler, 2005).

Lmarekebisho ya kudumu juu ya madawa ya unyanyasaji hufikiriwa kuwa na upatanishwaji kwa sehemu na ΔFosB, lahaja yenye nguvu sana ya FosB (Nestler et al., 1999; McClung et al., 2004; Nestler, 2008). Wanafamilia wa Fos wanajitenga na wanafamilia wa Jun kuunda tata ya proteni 1 (AP-1). Nakala ya uandishi wa AP-1 huunganika kwa tofauti za vifaa vya kukabiliana na AP-1 (makubaliano: TGACTCA) kudhibiti uandishi (uliokitiwa na Chinenov na Kerppola, 2001). Wakati mfiduo mkubwa wa madawa ya kulevya unasababisha induction ya muda mfupi (hrs) ya wanafamilia wa Fos (pamoja na shughuli inayoongezeka ya CREB), udhihirisho wa madawa ya kulevya unaorudiwa husababisha mkusanyiko wa ΔFosB thabiti sana (Hope na al., 1994; Perrotti et al., 2008), usemi wa ambao unaendelea kwa wiki.

Panya za bi-transgenic zisizidisha kupita kiasi ΔFosB au CREB kwenye striatum ya watu wazima zinaonyesha phenotypes nyingi za biochemical na tabia zinazoonekana katika wanyama wazi mara kwa mara kwa psychostimulants au dawa zingine za unyanyasaji. Amabadiliko ya kujieleza kwa jeni katika wanyama hawa wa kuzaliwa waligundua jeni nyingi zilizosajiliwa na muda mfupi (wiki za 2) utaftaji wa ΔFosB, mabadiliko yanayohusiana na kupungua kwa ujumuishaji wa tuzo ya dawa. Mabadiliko katika kujieleza kwa jeni na tabia ya kukabiliana na ΔFosB kwa muda mfupi walikuwa sawa na ile iliyoonekana kwenye wanyama kupita kiasi kwa CREB ya wiki ya 2 au 8 (McClung na Nestler, 2003). Kwa kulinganisha kushangaza, overexpression ya muda mrefu (wiki ya 8) ya ΔFosB ilipungua kujieleza kwa aina nyingi hizi na kusababisha kuongezeka kwa tuzo ya dawa (Kelz et al., 1999; McClung na Nestler, 2003).

Jini moja linalotambuliwa katika masomo haya ni cholecystokinin (Cck), neuropeptide inayozalishwa katika maeneo kadhaa ya ubongo, pamoja na striatum (Hoktima et al., 1980). CCK inaweza kurekebisha maambukizi ya dopaminergic (Vaccarino, 1992), inahusika katika ujira wa dawa na kuimarisha (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton, et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002), na huchochewa katika densi na cocaine sugu (Ding na Mocchetti, 1992). Kwa kuongeza Cck mtangazaji ameonyeshwa kuwa msikivu kwa hali zote za CREB na AP-1 (Haun na Dixon, 1990; Deavall, et al., 2000; Hansen, 2001). Kwa kuwa jeni nyingi (pamoja na Cck) ambayo ilionesha kujieleza kuongezeka kufuatia CREB na usemi wa ΔFosB wa muda mfupi walijulikana au wanaoshukiwa aina ya lengo la CREB (McClung na Nestler, 2003), tulitaka kuamua ikiwa maelezo mafupi ya ΔFosB husababisha udhibiti wa aina hizi (kwa kuzingatia Cck) kupitia kanuni ya CREB au kupitia mifumo ngumu zaidi ya kanuni ya jeni.

Nenda:

MATOKEO

OFosB overexpression polepole huongeza viwango vya CREB

Tulitumia blotting Western kuchunguza kama ΔFosB overexpression inazidisha viwango vya proteni ya CREB kwenye striatum ya panya. Kwa utafiti huu, tulitumia panya za bi-transgenic (mstari wa 11A) ambao hubeba transbeti ya NSE-tTA na transbe ya TetOp-ΔFosB. Kwa kukosekana kwa doxycycline, panya hizi zinaonyesha kuongezeka kwa nguvu kwa usemi wa ΔFosB katika neuroni nzuri ya dynorphin katika striatum (Kelz et al., 1999). Njia hii ya xpFosB ya kupita kiasi imeorodheshwa sana na inaruhusu utaftaji maalum wa mkoa, ambao unafanana na uingizwaji wa ΔFosB unaonekana katika wanyama walio wazi kwa cocaine sugu (Hope na al., 1994; Kelz et al., 1999). Tuligundua kuwa katika NFosB ya panya wa 11A, viwango vya protini ya CREB vilirekebishwa sana baada ya wiki ya 2 ya kujieleza na viwango hivi vilirudi kwa msingi baada ya wiki ya 8 ya kuelezea (Kielelezo 1A, n = 8). Kuamua ikiwa mabadiliko katika viwango vya CREB na overexpression ya muda mfupi osBFosB inaweza kuigwa katika mfumo mwingine, tulielezea kwa muda mfupi ΔFosB katika seli za PC12 na tukagundua kuwa viwango vya CREB vimeongezeka sana (p <0.05) ikilinganishwa na udhibiti (Kielelezo 1B, n = 4). Matokeo haya yanaonyesha kuwa maelezo mafupi ya expressionFosB yanaongeza viwango vya protini ya CREB.

Kielelezo 1

Kielelezo 1

Viwango vya CREB huongezeka na ΔFosB overexpression. Mchanganuo wa blot wa Magharibi kutoka (A) panya striata kutoka 11A panya mbali dox kwa 2 au wiki 8 au (B) Seli za PC12 zinazoongeza ΔFosB. Takwimu ndani A zinaonyeshwa kama mabadiliko ya asilimia katika dox ya kulinganisha ...

Wote wa ΔFosB na CREB hufunga kwa watangazaji wa jeni maalum wa kusudi kwa kufuata utaftaji wa muda mfupi wa ΔFosB

Tulitumia ChIP (chromatin immunoprecipitation) tishu za striatal kuamua ikiwa ΔFosB au kumfunga CREB kulitokea kwa watangazaji fulani wa jeni na ikiwa kufunga hii iliongezeka kufuatia vereFosB overexpression ya muda mfupi. Tulichambua kumfunga huko BDNF na Cck watangazaji, kwa kuwa jeni zote mbili zinarekebishwa sana kufuatia utaftaji wa ΔFosB wa muda mfupi, utaftaji mwingi wa CREB, au matibabu sugu ya cocaine (McClung na Nestler, 2003). Sisi pia kuchambuliwa kisheria katika CDK5 kukuza, kwani ni lengo la moja kwa moja la ΔFosB (Chen et al., 2000; Bibb et al., 2001; Kumar na al., 2005). Mwishowe, tulipima kumfunga prodynorphin kukuza, kwani tafiti zilizopita zimegundua kuwa inaweza kufungwa na ΔFosB na CREB chini ya hali tofauti (Andersson et al., 2001; Zachariou et al., 2006).

Mchanganuo wa ChIP ulifanywa kwa striata kutoka 11A panya oxpxpressing ΔFosB kwa wiki 2 kutumia antibodies zinazotambua CREB au ΔFosB. Katika hali ya kawaida, tuligundua kuwa ΔFosB inafungamana na CDK5 na prodynorphin watangazaji, wakati hakuna kisheria BDNF or Cck watangazaji (Meza 1). Kwa kuongezea, ΔFosB overexpression iliongeza kisheria kwa ΔFosB CDK5 kukuza, lakini sio kwa prodynorphin mtangazaji. Tulipima CREB inayofuata kwa watangazaji hawa na tukagundua kuwa CREB inafungamana na CDK5, BDNF na prodynorphin watangazaji, lakini sio kwa Cck mpandishaji, katika hali ya kawaida, na kwamba ΔFosB overexpression ya wiki ya 2 inakuza CREB kumfunga BDNF na prodynorphin watangazaji, lakini sio CDK5 mtangazaji. Ikizingatiwa pamoja, matokeo haya yanaonyesha kuwa ΔFosB na CREB wanaweza kuungana na watangazaji wa jeni kama vile prodynorphin na CDK5, hata hivyo, kumfunga CREB ni maalum kwa watangazaji wengine kama vile BDNF. Kwa kuongezea, ΔFosB overexpression husababisha kuongezeka kwa ΔFosB kumfunga kwa watangazaji fulani, kama inavyotarajiwa, lakini pia kwa CREB inayowafunga kwa watangazaji maalum, sanjari na induction ya ΔFosB-mediated CREB inayzingatiwa wakati huu.

Meza 1

Meza 1

Kufunga kwa protini za kisheria za kuweka kwa watangazaji mbalimbali katika mFosB panya kwa wiki mbili.

Kazi ya hapo awali imeonyesha kuwa mabadiliko katika usemi wa jeni uliyosababishwa na uboreshaji wa ΔFosB wa muda mrefu unahusishwa na marekebisho ya chromatin, haswa, acetylation ya histone H3, kwa watangazaji maalum wa jeni (Kumar na al., 2005). Ili kubaini ikiwa hii inaweza kuandikia mabadiliko katika usemi wa jeni kwa muda mfupi wa ΔFosB, tulipima bindande ya histone H3 (muundo wa histone unaohusishwa na chromatin inayofanya kazi), au methylated histone H3 (Lys9, muundo wa histone unaohusishwa na transcriptally chromatin isiyofanya kazi). Tuligundua kuwa overexpression ya ΔFosB kwa wiki za 2 ilisababisha mabadiliko yoyote ya kumfunga acetylated H3 wakati wowote wa watangazaji wa jeni waliosoma (Meza 1). Tulipata kupungua kwa maana kwa kufungwa kwa histone ya histone H3 huko prodynorphin kukuza, lakini hakuna kumfunga kwa Cck kukuza na hakuna mabadiliko katika kumfunga CDK5 na BDNF watangazaji, kupendekeza kuwa hii sio utaratibu wa jumla ambao ΔFosB, kwa muda mfupi, inasimamia usemi wa jeni. Tulishangaa na kufurahishwa na ukweli kwamba hatukuona tofauti katika maonyesho yetu ya ChIP ambayo inaweza kusababisha kuongezeka kwa Cck usemi wa mRNA kwenye panya wa 11A kufuatia wiki ya 2 ya kujieleza kwa ΔFosB na kuamua kuuchunguza utaratibu huu zaidi.

Muda mfupi -FosB huongezeka Cck kujieleza katika mifumo mingi

Tabia ndogo ya Microarray ya bi-transgenic 11A panya inayoangazia ΔFosB kwenye striatum iligundua kuwa Cck Viwango vya usemi huongezeka kufuatia wiki ya 2 ya overexpression na kisha kupungua polepole na vipindi virefu vya kujieleza kwa ΔFosB (Kielelezo 2A, n = 3). Tulihakikisha athari hii kwa Cck kutumia wakati halisi wa PCR kwenye kikundi tofauti cha wanyama katika wiki za 2 na 8 na kupatikana matokeo katika sehemu mbili za muda kuwa sawa na uchambuzi wa microarray (data haijaonyeshwa).

Kielelezo 2

Kielelezo 2

Utaftaji wa muda mfupi wa ΔFosB huongezeka Cck kujieleza kwa jeni. (A) Cck kujieleza kwa mRNA katika hali ya kufuatia ΔFosB overexpression katika panya za 11A kwa 1, 2, 4, au wiki ya 8. Uchambuzi wa Microarray ulifanywa kwa sampuli za striatal na Cck ngazi ...

Kuchunguza zaidi uwezo wa ΔFosB kudhibiti Cck kujieleza, tulitumia seli za PC12 kuhamishwa kwa muda mfupi na CckMwandishi wa habari -luciferase plasmid na ama ΔFosB kujieleza au kiwango sawa cha pCDNA. Zote mbili (n = 5-9) na siku tatu (n = 11-13) za xpFosB overexpression zilisababisha ongezeko kubwa la Cck-Usemaji wa sauti. Kwa kuongeza, siku tatu za ofFosB overexpression ilisababisha zaidi CckUingizaji wa -luciferase ikilinganishwa na siku mbili za utaftaji mwingi (Kielelezo 2B). Utaftaji zaidi wa ΔFosB haukuchochea kujielezea kwa ujenzi wa faida kubwa (data iliyoonyeshwa). Katika hali yoyote ya matibabu kulikuwa kupunguzwa CckShughuli -luciferase inaonekana. Matokeo haya yanaonyesha kuwa maelezo mafupi ya ΔFosB yanaongeza shughuli ya Cck mtangazaji, na anaacha bila kujibu utaratibu ambao ressesFosB oudexpression inasisitiza Cck kujieleza.

OFosB overexpression inaongeza bindande katika tovuti ya kuweka CREB ya kufunga katika Cck mtetezi

Uchambuzi wetu uligundua hiyo Cck usemi unaongezeka kufuatia usemi wa ΔFosB wa muda mfupi, hata hivyo, mpango wetu wa CHIP uligundua kuwa hakuna CREB wala ΔFosB inayoshikilia Cck mtangazaji. Kuamua ikiwa kuna mabadiliko yoyote katika kumfunga proteni hapo Cck mpandishaji kufuatia ΔFosB overexpression, tulitumia uhamaji wa uhamishaji wa elektroni (EMSA) na uchunguzi ulio na tovuti ya uwekafi kama CRE iliyopo ndani ya Cck mtangazaji. Kutumia dondoo za nyuklia kutoka kwa mpigo wa panya wa 11A oxpxpressing ΔFosB kwa wiki za 2, tulipata ongezeko la kufungwa kwa tovuti ya matibabu ya CRE kwenye Cck kukuza (Kielelezo 3 A, C, n = 4). Inafurahisha, panya za 11A ouffxpressing ΔFosB kwa wiki za 8, ambazo zinaonyesha kupungua kwa Cck kujieleza, pia ilionyesha kuongezeka kwa dhamana kwenye tovuti hii (Kielelezo 3B, C, n = 4). Kama kulinganisha, tulikagua kufungwa kwa tovuti ya makubaliano ya CRE katika iceFosB ya panya kupita kiasi kwa wiki 2 na tukapata nguvu CRE ikifunga katika dondoo za striatal, lakini hakuna ongezeko la kumfuata ΔFosB kwa kufuata.Kielelezo 3F, n = 4). Kwa hivyo, licha ya ongezeko la ΔFosB lililosababishwa na viwango vyote vya CREB kuonekana wakati huu, matokeo haya yanaambatana na madai yetu ya ChIP ambayo yanaona kuwa kuongezeka kwa CREB kwa watangazaji kufuatia oFosB overexpression ni maalum kwa aina fulani tu na sio jambo la ulimwengu. . Kuamua ikiwa CREB inafungwa na Cck kukuza katika uchanganuzi wetu wa EMSA, tulifanya mazoezi ya kushuka kwa kasi na mgeni maalum wa CREB. Kwa makubaliano na assows zetu za ChIP, hatukupata kifungu chochote cha CREB kwa Cck uchunguzi uliokuwa na tovuti ya kuweka CRE katika uozo wa EMSA, wakati CREB ilifunga kwa kiwango kikubwa na kuchukua nafasi ya makubaliano ya CRE ya makubaliano (Kielelezo 3D, E, n = 4). Shughuli ya kumfunga ya DNA huko Cck mtangazaji pia hakuathiriwa na antibody kwa ΔFosB (data haijaonyeshwa), chini ya masharti yaliyoonyeshwa katika tafiti kadhaa za awali kuzuia ΔFosB kumfunga tovuti za Fide X -UMNXX (Tumaini et al., 1a, 1994b; Chen et al., 1995, Hiroi et al., 1998). Tulifanya pia safari za ChIP kwenye striata ya wanyama wa 11A kufuatia wiki za 8 za kujieleza kwa ΔFosB na bado hatujapata kiunga cha CREB au ΔFosB Cck mtangazaji (data haijaonyeshwa). Kwa hivyo, usemi wa ΔFosB husababisha kuongezeka kwa proteni kumfunga Cck kukuza baada ya wiki zote za 2 na 8 ya kujieleza; Walakini, utambulisho wa sababu hizi bado haujajulikana.

Kielelezo 3

Kielelezo 3

Protini inayofunga Cck mtangazaji. (A, B) Electrophoretic uhamaji kuhama kutumia Cck Wavuti kama tovuti ya tishu za kuharisha kutoka kwa wanyama kupita kiasi ΔFosB kwa wiki 2 (A) au wiki ya 8 (B). Katika (A), ushindani na mshindani zaidi ambaye hajasaliwa ...

Wavuti ya kuweka CRE katika Cck mtangazaji sio kuwajibika kwa shughuli ya kukuza mpandishaji

Kwa kuwa hatukupata ongezeko la proteni inayofaa kwa kutumia kipande cha Cck mtangazaji, ambayo ina tovuti ya CRE ya kueneza, kufuatia ΔFosB oxpxpression, tulitaka kuamua ikiwa tovuti hii ni muhimu kwa kuongezeka Cck usemi unaofuata ΔFosB overexpression. Ili kujaribu uwezekano huu, tulibadilisha seli za PC12 na Cck-luciferase plasmid iliyo na tovuti yake isiyo ya kawaida ya CRE au moja iliyo na mabadiliko kwenye wavuti ambayo inaweza kumaliza mwingiliano wowote na CREB. Kwa kupendeza, mabadiliko ya tovuti kama ya CRE ilipungua basal Cck shughuli ya kukuza na 32% (Kielelezo 4A, n = 9), lakini hakuathiri Cck kuingizwa kwa mtangazaji na byFosB overexpression (Kielelezo 4B, n = 11-13). Hii inaonyesha kuwa, ingawa Cck Matangazo yanahitaji tovuti isiyo sawa ya CRE ya shughuli kamili ya basal, shughuli ya kukuza kukuza inayosababishwa na ΔFosB oxpxpression haitaji mlolongo kama wa CRE.

Kielelezo 4

Kielelezo 4

The Cck-kama CRE tovuti sio lazima kwa Cck induction na ΔFosB. (A) CckShughuli ya -luciferase ilipimwa siku za 2 baada ya kuhamishwa na kawaida Cck-luciferase au moja ambayo tovuti kama-CRE ilibadilishwa. * p <0.05 (B) Cck-luciferase ...

cFos inafunga kwa Cck mtetezi

Uchunguzi wa awali umegundua kuwa cFos mRNA inakua na usemi wa ΔFosB wa muda mfupi, hata hivyo, baada ya kujieleza kwa muda mrefu wa ΔFosB, uwezo wa matibabu ya cocaine kushawishi cFos katika striatum umepunguzwa (McClung na Nestler, 2003; Renthal et al., 2008). Kwa hivyo, inawezekana kwamba cFos inachangia kuongezeka kwa Cck kujieleza kufuatia usemi wa ΔFosB wa muda mfupi. Tulifanya assays za ChIP na antibody maalum kwa cFos na kipimo cha cFos kinachofunga Cck kukuza na bila ya muda mfupi ΔFosB kujieleza. Wakati tuligundua kuwa cFos haina uhusiano na Cck mtangazaji, kumfunga hakukuongeza sana kufuatia ΔFosB overexpression (Kielelezo 5, n = 5). Hii inaonyesha kuwa kwa kuwa cFos inafunga Cck kukuza, inaweza kuchangia udhibiti wa jumla wa Cck kujieleza, lakini uwezekano hauhusiki katika kanuni ya Cck mtangazaji na osFosB.

Kielelezo 5

Kielelezo 5

cFos inafunga kwa Cck mtangazaji. Mageuzi ya kinga ya chromatin yalifanywa na antibody maalum ya cFos kwa kutumia tishu za kuhariri kutoka kwa panya wa ΔFosB oreatxpressing ama kwenye Dox, au baada ya wiki ya 2 ya kuondolewa kwa dox. Uchambuzi wa wakati halisi wa PCR ulikuwa ...

Nenda:

FUNGA

Utafiti huu unathibitisha na kupanua juu ya matokeo ya zamani kuonyesha kuwa ΔFosB inasimamia kujieleza kwa jeni kwenye striatum na tunaona kuwa hufanya hivyo kupitia njia nyingi baada ya kujieleza kwa muda mfupi. Tunaonyesha kuwa, baada ya majuma ya 2 ya overexpression, ΔFosB inamfunga moja kwa moja kwa watangazaji kwenye jeni fulani na kusababisha mabadiliko katika usemi (i.e. CDK5). Kwa kuongezea, huongeza viwango vya protini ya CREB, athari inayotazamwa katika seli zilizotiwa chiti na striatum, na kusababisha kuongezeka kwa CREB kwa watangazaji wengine wa jeni (i.e. dynorphin na BDNF). Katika utafiti uliopita, tuligundua kuwa overexpression ya muda mfupi ya ΔFosB inasababisha mabadiliko mengi ya aina ya jini ambayo hupatikana wakati CREB inavyosisitizwa, na kusababisha majibu sawa ya tabia katika hatua za upendeleo wa cocaine (McClung na Nestler, 2003). Kwa hivyo, ugunduzi wa sasa kwamba ΔFosB inaongoza kwa ujasusi wa CREB, pamoja na kumfunga CREB kwa watangazaji wa jeni fulani, husaidia kuelezea ni kwanini mabadiliko mengi ya kujielezea kwa jeni yalishirikiwa na sababu hizi mbili za uandishi.

Kuingizwa kwa CREB na ΔFosB ni ya kufurahisha, kwani imeonyeshwa kuwa dawa za unyanyasaji huleta mabadiliko katika kiwango cha serine 133-phosphorylated CREB (Mattson et al., 2005) na ongeza maandishi ya CRE-mediated (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), bila kubadilisha viwango vya jumla vya CREB. Inawezekana kwamba mabadiliko katika viwango vya CREB yanaweza kuwa ya muda mfupi, na, kwa hivyo, yanakosa kwa urahisi katika masomo mengine. Katika mikono yetu, tumeona ongezeko la uchukuzi wa cocaine katika CREB mRNA katika majaribio fulani, lakini athari hii inatofautiana sana (uchunguzi uliochapishwa). Kwa kuwa panya wote wa 11A transgenic na seli za PC-12 zinaonyesha uingiliaji wa CREB kufuatia utaftaji wa ΔFosB wa muda mfupi, hii inaonyesha kwamba kweli CREB inasababishwa na ΔFosB (au lengo la ΔFosB), ikitoa utaratibu mwingine wa kuelezea mabadiliko yaliyosababishwa na dawa kwenye gene kujieleza.

Kwa kushangaza, tuligundua kuwa hakuna CREB au ΔFosB inayoshikilia Cck kukuza hata hivyo Cck usemi wazi umeorodheshwa kufuatia usemi wa ΔFosB wa muda mfupi. Cck ni neuropeptide nyingi iliyoonyeshwa katika VTA na NAc (Hoktima et al., 1980) na inahusika katika majibu ya kitabia kwa dawa za unyanyasaji (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton, et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002). Katika utamaduni wa seli, Cck mtangazaji amekuwa na sifa nyingi na ameonyeshwa kuwa msikivu kwa wanafamilia wa CREB na AP-1 (imepitiwa na Hansen, 2001). Haun na Dixon (1990) ilionyesha kuwa AP-1 complexes inaweza kuifunga kwa Cck Wavuti kama tovuti vitro, na ilionyeshwa baadaye, kwa kutumia seli za neuroklastoma za SK-N-MC, kwamba mabadiliko ya tovuti kama ya CRE yalipunguza mwitikio wa mtangazaji kwa cFos / cJun (Rourke et al., 1999). Kwa kweli, tunaona pia kuongezeka Cck shughuli ya kukuza (Kielelezo 2) na kumfunga au kuzunguka kipengee kama CRE (Kielelezo 3) juu ya overexpression ya ΔFosB, mtu mwingine wa familia wa AP-1, lakini hatupati dhamana ya moja kwa moja ya ΔFosB kwa Cck mtetezi katika vivo or vitro, hata juu ya overexpression yake.

Kazi nyingi imeonyesha jukumu la CREB katika udhibiti wa Cck shughuli ya kukuza. The Cck Wavuti kama ya CRE imehifadhiwa kote kwa watabiri wa vertebrates (Hansen, 2001) na, katika utamaduni fulani wa kiini, seli za CREB na AP-1 zote zinafungwa kwenye wavuti hii na zinahitajika kwa Cck shughuli ya kukuza (Haun na Dixon, 1990; Deavall, et al., 2000; Hansen, 2001). Kwa kuongeza, wanaharakati kadhaa wanaojulikana wa Cck kujieleza (pamoja na bFGF, PACAP, peptoni, na ufidhili) imeonyeshwa kutenda kwa njia ya CREB (Hansen, et al., 1999; Deavall, et al, 2000; Bernard, et al., 2001; Gevrey, et al., 2002; Hansen, et al., 2004). Yetu CckTakwimu-mwandishi wa habari ya jeni huonyesha jukumu muhimu kwa tovuti kama ya CRE katika udhibiti wa Cck shughuli ya kukuza, kwani mabadiliko ya tovuti hii hupunguza basal Cck shughuli ya kukuza na CckUsemi wa -luciferase unaosababishwa na VP16-CREB, fomu ya kazi ya CREB, inapotea wakati tovuti hii inarekebishwa (uchunguzi uliochapishwa). Kwa hivyo, tulishangaa kugundua kuwa CREB haionekani kuwa sawa Cck kipandishaji katika dondoo za laini ama kwa msingi wa msingi au juu ya muda mfupi wa ΔFosB overexpression wakati viwango vya CREB vinaongezeka. Hii inasema kwamba viwango vya CREB per se sio sababu pekee ya kuamua kiasi cha kumfunga kwenye wavuti hii, na hii inasaidiwa na kazi ya wengine (Cha-Molstad, et al., 2004). Tangu watangazaji wa jeni zingine zilizotambuliwa za CREB, kama vile BDNF na prodynorphin, wakati wa kumfunga CREB, tuna uhakika katika kupata kuwa CREB haifanyi kazi kwa Cck kukuza katika dondoo za nyuklia za densi. Kwa kuongezea, CckShughuli -luciferase ya ΔFosB haikutegemea tovuti isiyo sawa ya CRE, kupendekeza kwamba ΔFosB haidhibiti Cck kujieleza kwa kudhibiti kufungwa kwa moja kwa moja kwa CREB kwa Cck mtangazaji.

Uwezo wetu wa kugundua CREB inayoingiliana na Cck kukuza ni mkono na Renthal et al. (2009), ambaye alitumia mbinu ya ChIP-chip kuangalia mabadiliko ya kidunia katika phosphorylated CREB (pCREB) na ΔFosB ikiwa ni ngumu baada ya kufichua ugonjwa wa cocaine. Katika majaribio haya, protini za proteni za DNA zilikuwa hazina chanjo ya ΔFosB au pCREB na DNA iliyotangulizwa, baada ya kuweka alama, ilibadilishwa kwa kipandishaji kipya. Wakati aina nyingi za walengwa wa CREB hapo awali ziligundulika na mbinu hii (kwa mfano, BDNF, prodynorphin), Cck haikutambuliwa. Kwa kuongezea, imeonyeshwa kuwa kufungwa kwa CREB kwa tovuti ya makubaliano ya CRE kunatofautiana sana kati ya mistari ya seli iliyoabuniwa (Cha-Molstad, et al., 2004). Masomo yote ya awali ambayo yalipata mwingiliano wa CREB na Cck ukuzaji ulifanywa katika tamaduni ya seli (sio ubongo ambayo sampuli zetu za EMSA na ChIP zilitokana) na kutumia uhamaji wa mabadiliko ya gel ili kuchunguza uchunguzi wa mwingiliano wa protini na DNA. Wakati EMSA inaweza kutathmini uwezekano wa sababu ya kuambatana na mlolongo wa DNA, ChIP assows inatoa mtazamo wa riwaya juu ya mwingiliano huu katika vivo. Kwa kuongezea, data nyingi zinazoonyesha induction ya Cck shughuli ya kukuza au CREB inayofunga kwa Cck mtangazaji alipatikana kutoka kwa seli ambazo zilichochewa na vitu kama peptoni (Bernard et al., 2001), depolarization (Hansen, et al., 2004), au anuwai ya waanzishaji wa alama za ndani zinazojumuisha cAMP na ERK (Hansen et al., 1999). Katika majaribio yetu, "kichocheo" pekee kilichotumiwa ilikuwa utaftaji wa ΔFosB, ambao unatosha kushawishi Cck kujieleza. Ikizingatiwa, hii inaonyesha kuwa uwezo wa CREB kumfunga (na uwezekano wa kudhibiti) Cck mpandishaji hutegemea sana aina ya seli na uanzishaji wa njia fulani za kuashiria. Kwa kuongeza, Cck Sehemu ya kukuza kama CRE (angalau katika seli za PC12 ambazo hazikufunguliwa na kwenye panya) sio lengo la moja kwa moja la CREB au orFosB. Kwa kupendeza, kanuni ya FosB kujieleza kwa CREB pia ni maalum kwa aina ya seli na aina ya kuchochea. Utafiti uliofanywa na Andersson et al. iligundua kuwa sindano ya CERB ya oligonucleotides ya CREB ndani ya panya imeeneza kwa sehemu uvumbuzi wa FosB kufuata utawala wa kokaini (Andersson et al., 2001). Walakini, pia waligundua kuwa uwezo wa L-Dopa kushawishi FosB kujieleza katika starehe ya 6-OHDA-haikuchochewa na uwepo wa oligonucleotides ya CREB.

Kwa kuwa CREB na ΔFosB wanaonekana kudhibiti kwa moja kwa moja Cck kukuza, na mabadiliko katika muundo wa chromatin yameandikwa kwa kujibu aina ya kuchochea ambayo inasababisha ΔFosB (Tsankova et al., 2004; Kumar na al., 2005; Renthal et al., 2008), tulidhani kwamba ΔFosB inaweza kurekebisha shughuli za kukuza bila kubadilisha muundo wa chromatin. Walakini, katika iceFosB ya panya kupita kiasi kwa wiki za 2, hakukuwa na mabadiliko katika eksirei ya histone H3 huko Cck kukuza (Meza 1). Hii inasaidiwa na data ya ChIP-chip ya Renthal et al. (2009), ambaye aliripoti mabadiliko yoyote ya kisheria ya H3 ya asetilini Cck kukuza katika panya wazi kwa cocaine sugu. Tangu Cck kukuza ni kazi katika harakati, hakuna kukandamiza methylated histone H3 binding ilitarajiwa au kuzingatiwa. Inafurahisha, pia hatukuona mabadiliko kwa sababu ya ΔFosB overexpression katika H3 ya acetylated katika BDNF kukuza (ambayo ilionyesha kuongezeka kwa CREB kumfunga) au kwa CDK5 na prodynorphin watangazaji (ambayo ilionyesha kuongezeka kwa bindFosB kumfunga). Kwa kuwa kuna idadi kubwa ya marekebisho ya histone yanayohusiana na mabadiliko katika shughuli za uhamasishaji (imekitiwa na Rando na Chang, 2009), kunawezekana kuna marekebisho mengine ya chromatin ambayo inahusishwa na ujanibishaji wa jeni hizi. Urekebishaji wowote wa chromatin, ingawa mara nyingi ni utabiri wa kiwango cha shughuli za kukuza, hauwezi kubadilika wakati wa uanzishaji wa jeni fulani. Katika kazi ya siku za usoni, itakuwa ya kuvutia kuangalia mabadiliko mengine yanayoweza kuwa katika muundo wa chromatin karibu Cck mpandishaji kufuatia ΔFosB overexpression. Kwa kupendeza, cocaine sugu (uwezekano kupitia Induction ya ΔFosB imeonyeshwa kuleta msukumo wa Sirtuin 1 na 2, deacetylases za darasa la tatu ambazo zinaonekana kubadilisha fizikia ya neuronal, kuashiria kwa ERK, na majibu ya tabia kwa cocaine (Renthal et al., 2009). Uingilishaji wa deacetylase ya histone ungekuwa na uwezo wa kudhibiti wakati huo huo matamshi ya idadi kubwa ya jeni kupitia mabadiliko ya ulimwengu katika muundo wa chromatin.

Mgombeaji mmoja anayeweza kushiriki Cck kanuni ifuatayo ΔFosB ooverxpression ilikuwa AP-1 familia cFos. Uonyeshaji wa cFos umewekwa na CREB (Sheng et al., 1990; Impey et al., 2004), na cFos overexpression (concordant na overexpression ya binding mwenzake cJun) inaongezeka Cck shughuli ya kukuza (Rourke et al., 1999). Kwa hivyo, kuongezeka kwa viwango vya CREB kwa sababu ya uhuishaji wa ΔFosB wa muda mfupi kunaweza kuongeza viwango vya cF na kusababisha kuongezeka kwa kufungwa kwa Cck Wavuti kama tovuti. cfos mRNA imewekwa katika panya kufuatia wiki mbili za xpFosB oxpxpression (McClung na Nestler, 2003) na kupungua kwa panya kufunuliwa na cocaine sugu au ΔFosB oxpxpression ya muda mrefu (Renthal et al., 2008). Hapa tunaona kwamba cFos hufanya moja kwa moja kwa Cck kukuza katika tishu za mshikamano, hata hivyo, ΔFosB oxpxpression haionyeshi kwa kiasi kikubwa kumfunga. Hii inaonyesha kuwa wakati cFos zinaweza kuhusika kudhibiti Cck kujieleza kwa ujumla, mabadiliko ya kufungwa kwa cFos pekee sio uwezekano wa utaratibu ambao ΔFosB inasimamia Cck kujieleza. Inawezekana, hata hivyo, kwamba ΔFosB inaweza kushawishi ama, mabadiliko ya baada ya tafsiri katika cFos (mfano phosphorylation) au kushawishi kujieleza kwa mwenzi anayefunga (kama cJun) au proteni ya mwanzishaji. Walakini, kwa kuwa wavuti isiyo sawa ya CRE (ambayo imeonyeshwa hapo awali kuwa tovuti ya kumfunga maunzi ya AP-1, ona Haun na Dixon, 1990) haihitajiki kwa walioongezeka Cck shughuli ya kukuza inayoonekana na ΔFosB overexpression (kama inavyotathminiwa katika majaribio ya jeni la mwandishi), inasimama kwa sababu sababu zingine za kupitisha pia zinasimamiwa na ΔFosB.

The Cck kipande cha kipandishaji kinachotumiwa katika majaribio ya mwandishi wetu wa luciferase kina tovuti ya kumfunga ya Sp1 na sanduku la E-sanduku (lililopitiwa na Hansen, 2002). Hasa, mlolongo wa E-sanduku umeonyeshwa kumfunga mambo mengi ya uandishi (uliyopitiwa na Forrest na McNamara, 2004). Kutumia seli za PC12, tumeona kwamba mabadiliko ya sanduku la E hupungua Cck shughuli ya kukuza, lakini haibadilishi majibu ya mtangazaji kuwa ΔFosB (data haijaonyeshwa). Kwa kupendeza, a CckMwandishi wa habari -luciferase aliye na mabadiliko katika wavuti ya CRE na sanduku la E-hana shughuli ya basal inayoweza kughafilika na hajibiki kwa oFosB overexpression (uchunguzi ulioachwa) Mpatanishi mwingine anayeweza wa ΔFosB hatua kwenye Cck kukuza ni ATFs, aina zingine ambazo zinajulikana kuwa zinazoongoza kwa udhihirisho sugu wa psychostimulant (Green na al., 2008). Walakini, hatujapata ushahidi wa kuingizwa kwa ΔFosB ya ATF hizi (data haijaonyeshwa), na ATF isingetegemewa kushikamana na tovuti iliyobadilishwa kama CRE kwenye Cck mtangazaji.

Mojawapo ya utafiti huu ni kwamba tunatumia mfumo wa bi-transgenic kujiongezea ΔFosB na kwa hivyo mtu lazima awe mwhafidhina katika kuchora kufanana kati ya dhana hii na usimamizi wa cocaine sugu. Walakini, panya za 11A transgenic hazina nafasi ya kipekee ya kuangalia athari maalum za ΔFosB kwenye striatum, kwa kuwa utaftaji mwingi ni mdogo kwa mkoa huu wa ubongo (Chen et al., 1998), wakati usimamizi wa cocaine huchochea mabadiliko katika anuwai ya maeneo mengine ya ubongo ambayo yanaweza kuathiri vibaya moja kwa moja. Kwa kuongezea, tafiti kadhaa zimeandika phenotypes sawa za tabia na Masi katika panya za 11A ikilinganishwa na wanyama wasio wa transgenic waliotibiwa na cocaine sugu (Kelz et al., 1999; McClung na Nestler, 2003; Renthal et al., 2009). Zaidi ya hayo, Bibb et al. (2001) kuripoti viwango sawa vya striatal Cdk5 mRNA na kuletwa kwa proteni katika aina hii hiyo ya 11A ikilinganishwa na kahawa iliyotibiwa, isiyo na transgenic, na mabadiliko sawa katika malengo ya CDK5, p35 na DARPP-32.

Kwa kumalizia, tunaona kuwa usemi wa ΔFosB wa muda mfupi husababisha kupeana kwa jeni kwenye striatum kupitia njia nyingi. Hii ni pamoja na mkuzaji wa moja kwa moja wa uhamasishaji, uhamishaji wa protini ya CREB na shughuli, muundo wa chromatin, pamoja na njia ambazo bado haziwezi kuamuliwa.

Nenda:

UTANGULIZI WA MAJIBU

Wanyama

Wanyama wa bi-transgenic 11A wa wanyama wa kiume (NSE-tTA x TetOP-ΔFosB) walitumiwa katika utafiti huu na huonyeshwa katika Kelz et al., 1999. Kwa overexpress ΔFosB, panya ziliondolewa kutoka doxycycline kati ya 3 na wiki za 6, wakati panya za kudhibiti zilitunzwa kwenye doxycycline. Panya zote ziliwekwa kwenye kikundi na kutunzwa kwenye 12: Mzunguko wa taa ya 12 / giza, taa saa 7 asubuhi na taa zimewaka saa 7 jioni, na ad lib upatikanaji wa chakula na maji. Majaribio yote ya panya yalikuwa yakifuatana na itifaki zilizopitishwa na kamati ya utunzaji wa wanyama na matumizi ya Chuo Kikuu cha Texas Kusini Magharibi mwa Kituo cha Matibabu huko Dallas.

Mwandishi na plasmids ya kujieleza

Mbwa mwitu (WT) Cck Mwandishi wa matangazo ya kukuza matangazo yalitayarishwa na kuingiza kipengee takriban cha 200 bp PCR kwenye vek ya pGL3-luc (Promega). Sehemu hii ilipatikana kutoka kwa panya genomic DNA (primers: 5 'TATCCTCATTCACTGGGACGC 3' hadi mteremko, na 5 'TACCTTTGGATGGGAAATCG 3') na hapo awali iliingizwa kwenye vekt ya PGEM-T Easy (PromeUMX, #AXN. Kifurushi cha utangazaji kiliwekwa kisha kwenye tovuti za kizuizi cha kizuizi cha Kpn1360 / Xho1 za pGL1-luc.

Ili kuunda mabadiliko ya uhakika ya CRE Cck promoter, primer ya mutagenic iliyoelekezwa dhidi ya tovuti kama ya CRE iliyoripotiwa hapo awali (sense primer: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGTAAACA 3 ', antisense primer: 5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACACG 3') ilitumika pamoja na muundo wa Strata . Hii hubadilisha wavuti inayoripotiwa kama CRE (ACTGCGTCAGC) kuwa ACTGAGCTCC. Plasmidi zote za mwandishi zilithibitishwa na upangaji wa DNA. Plasmid ya kujieleza ya osBFosB ina mlolongo wa urefu kamili wa osBFosB ulioingizwa kwenye wavuti nyingi za uundaji wa pCDNA 3.1 na imeelezewa hapo awali (Ulery na Nestler, 2007).

Utamaduni wa seli na uhamishaji wa DNA

Chembe za pheochromocytoma (PC12) zilihifadhiwa katika sehemu ya kati ya F-12 ya Eagle iliyobadilishwa, ikiongezewa na seramu ya farasi 10%, seramu ya nguruwe ya fetusi 5%, na 1% penicillin / streptomycin ifikapo 37 ° C na 5% CO2. Seli zilihamishwa na umeme wa umeme kwa kutumia electroporator ya BTX 360 (350V, 0 ohms, na 850 μF) katika 800 μL ya phosphate ya Dulbecco iliyosababisha saline katika mikato ya 4 mm na 10 μg ya mwandishi na 5 μg ya ujenzi wa usemi. Plasmid ya vector tupu (pCDNA) ilitumika kurekebisha jumla ya DNA. Baada ya kuambukizwa, seli zilipandwa kwenye sahani zilizofunikwa na collagen 35 mm kwa muda ulioonyeshwa.

Ushuru wa Lusifa

Siku mbili au tatu baada ya kuambukizwa, seli zilioshwa mara 3 katika saline ya Dulbecco iliyotiwa chumvi, iliyotiwa lys (kwa kutumia 25 mM glycylglycine, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 mM DTT), imekusanywa, na kusafishwa kupitia centrifugation. 30 μL ya lysate ilijumuishwa na 140 μL lucifase assay buffer (25 mM glycylglycine, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM potasiamu phosphate, 1 mM coenzyme A, pH 7.8). Shughuli ya luminescence ilipimwa kwa kutumia msomaji wa taa ya fluxc XXUMUM ya microplate baada ya sindano moja kwa moja ya 800 μL 40 mM luciferin kwa kila kisima. Shughuli ya Lusifa ilirekebishwa kwa kiwango cha jumla cha protini kama ilivyoamuliwa na assay ya protini ya BioRad.

Uhamaji wa mabadiliko ya uhamaji wa electrophoretic

Vipunguzi vya nyuklia kutoka kwa vipande vya nchi mbili vya striatum kutoka kwa panya za bi-transgenic 11A (ambazo zinatunzwa au kutolewa kwa doxycycline kwa wiki ya 2 au 8) (McClung na Nestler, 2003) zilitayarishwa kulingana na Huang na Walters (1996). 32Vipimo vya bandia vya oligonucleotide vilivyo na alama-viliandaliwa kwa kutumia itifaki ya mfumo wa Promega Gel Shift Assay (#E3300) na uchunguzi ulitakaswa kwa kutumia safu ya Roche Quick Spin. Makubaliano ya uchunguzi wa makubaliano ya CRE na AP-1 yalitokana na Promega (#E328A na E320B, mtawaliwa) na Cck Utaratibu wa CRE ulikuwa (Ufahamu wa Cck-CRE: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGGG; Cck-CRE antisense: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT).

Athari za kufunga na electrophoresis zilifanywa kwa kutumia marekebisho ya utaratibu wa mfumo wa Promega Gel Shift Assay (#E3300). 50,000 CPM ya probe iliyoandaliwa ilikuwa pamoja na 10 μg dondoo ya nyuklia ya nyuklia. DNA ya mshindani wa baridi au antibodies iliongezwa kabla ya kuanzishwa kwa uchunguzi wa radiolabeled. Kwa majaribio ya supershift, 2 REg ya anti-CREB (Upendeleo wa Baiolojia # 06-083) ilitumiwa. Marekebisho yalitolewa kwa umeme kwenye gia za 4% polacrylamide, kavu, na kufunuliwa kwa filamu (kwa kutumia skrini za kuongeza saa ya 1 hadi siku za 2).

Kinga

Kwa seli za PC12, sahani 35 mm za seli zilizohamishwa zilioshwa katika saline baridi ya Dulbecco iliyosababishwa na salini na lysates ziliandaliwa katika bafu ya RIPA lysis bafa (50 mM Tris pH 7.4, 5 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% deoxycholate, 1 % Triton X-100, 0.1% sodiamu dodecyl sulfate) iliyo na vizuizi vya protease. Baada ya uchunguzi wa sonication, kusafisha, na Bradford, lysates zilibadilishwa kikamilifu na 50 μg ya kila sampuli ilipunguzwa kwa umeme kwa 10% SDS polyacrylamide gel. Protini zilihamishiwa kwenye utando wa PVDF, zilizuiwa kwa saa 1 katika 3% ya maziwa kavu yasiyo na mafuta kwenye chumvi iliyosababishwa na Tris iliyo na 0.1% Tween-20 (maziwa ya TBS-T), na ilichunguzwa mara moja saa 4 ° C na kingamwili za msingi (CREB Bioteknolojia ya Kaskazini # 06-083, iliyotumiwa kwa 1: 1,000; GAPDH- Sigma # G8795, iliyotumiwa kwa 1: 80,000) iliyochemshwa katika maziwa ya TBS-T. Baada ya kuosha nyingi katika TBS-T, blots zilichunguzwa kwa saa moja kwenye joto la kawaida kwa kutumia kingamwili za sekondari za phosphatase-conjugated sekondari (Sigma) iliyochanganywa 1: 5,000 katika maziwa ya TBS-T. Baada ya kuosha mara nyingi kwenye chumvi iliyotiwa na Tris, athari ya rangi ilifanywa kulingana na maagizo ya BioRad (# 170-6432). Utando ulikaushwa usiku kucha, ukachanganuliwa kwenye skana ya flatbed na densitometri inayotekelezwa kwa kutumia ImageJ (tazama hapa chini).

Kwa dondoo za densi, uozo wa Magharibi ulifanyika kama ilivyotangazwa hapo awali (Hope na al., 1994). Vipuli viliondolewa kutoka kwa panya zilizowekwa, kuwekwa kwenye barafu na kuwekwa kwenye matrix ya ubongo kwa unene wa mm wa 1. Punch za tishu zilichukuliwa kisha zikahifadhiwa kwa -80 ° C hadi kutumika. Tissue iliangaziwa kwenye barafu katika kiboreshaji cha sabuni kilichobadilishwa kilicho na phosphatase na inhibitors za proteni (Roche, Sigma). Baada ya sonication, sampuli ziligawanywa katika maji ya kuchemsha na ikatikiswa kwa 15,000xg kwa dakika 15; supernatant baadaye ilikusanywa na kusindika; viwango vya mkusanyiko wa protini vilikamilishwa kwa kutumia assay ya Bradford (Bio-Rad). Sampuli ziliendeshwa kwenye gel ya 10% acrylamide / bisacrylamide, kuhamishiwa membrane ya PVDF, iliyofunikwa katika maziwa ya 5% na ikashikwa na antibodies za msingi (Anti-CREB, Upstate, Ziwa Placid, NY). Blots walionekana baadaye kutumia mfumo wa chemiluminescence (Pierce). Sampuli zote zilirekebishwa kwa GAPDH (Fitzgerald, Concord, MA). Curves za kawaida ziliendeshwa ili kuhakikisha kuwa tuko kwenye safu ya safu ya umiliki.

Mchanganuo wa densitometry

Kwa immunoblots ya PC12, uchambuzi wa densitometry ulifanywa kwa kutumia ImageJ na urekebishaji wa viboko. Ishara ya wastani ya maandishi ilitolewa kutoka kwa kila kipimo na uwiano wa CREB hadi ishara ya GAPDH ulihesabiwa kwa kila sampuli. Kwa immunoblots za striatal na uchambuzi wa EMSA, Scion Image 1.62c ilitumiwa na uondoaji wa mandharinyuma.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP)

Maombi ya ChIP yalifanywa kulingana na mbinu za Tsankova et al. (2004) na Kumar et al. (2005). Kwa kifupi, sampuli za kuzaa za nchi mbili kutoka kwa panya 11A zilizohifadhiwa au kuzimwa kwa doxycycline ziliunganishwa na 1% formaldehyde na msalaba ulizimwa na glycine (mkusanyiko wa mwisho wa 0.125 M). Sampuli hizi zilitoka kwa vipande vya ubongo vilivyochukuliwa kwa kiwango cha mkusanyiko wa kiini na korte iliyoondolewa. Chromatin ilikatwa kwa vipande takriban 0.2 hadi 1 kb kupitia sonication, iliyosafishwa na shanga za Protein G (Thermo Scientific # 22852), na sampuli za pembejeo zilizohifadhiwa -80 ° C. Kati ya 60 na 100 μg ya chromatin ilitumika kwa kila mvua. 5-10 μg ya kila kingamwili ya kimsingi ilitumika (CREB: Teknolojia ya Juu # 06-863, ,FosB: Santa Cruz Biotechnology # SC-48x, acetylated H3: Bioteknolojia ya Juu # 06-599, methylated H3 (LYS9): Teknolojia ya Kuashiria Seli, cFos: Teknolojia ya Santa Cruz # SC-7202x). Viunga vya antibody-chromatin vilikomeshwa na Protein G pamoja na shanga kulingana na maagizo ya utengenezaji (Thermo Scientific # 22852). Kufuatia kuingiliana kwa nyuma kwa sampuli za kuingiza na zilizosababishwa, kila sampuli ilifanyiwa PCR ya upimaji (qPCR). Matumizi ya kingamwili hizi zote kwa ChIP imethibitishwa sana (Tsankova et al., 2004; Kumar na al., 2005; Renthal et al., 2009).

Viwango vya proteni ambavyo vimetungwa kwa kila jenasi la kukuza riba ziliamuliwa kwa kupima kiwango cha DNA inayohusishwa na qPCR (Programu ya Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, CA). Uingizaji au jumla ya DNA (nonimmunopreciplect) na DNA ya kutengwa iliboreshwa mara tatu kwa uwepo wa SYBR Green (Imetumika Biosystems, CA). Thamani za Ct kutoka kila sampuli zilipatikana kwa kutumia Sequence Detector 1.1 programu. Thamani ya jamaa ya template ya DNA ilifanywa kwa kutumia njia ya ΔΔCt (Tsankova et al., 2004). Primers kutumika: BDNF kukuza 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; Mlezaji wa kipindi cha CDTCCACGAGAGGGCTCCA CDK5: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; Mtangazaji wa GTGCCCCGCTCTTGTTATta Cck: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; Mtangazaji wa Prodnorphin wa TTAAATAGCTCCGTTGG: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

Uchambuzi wa takwimu

Takwimu zote zinawasilishwa kama njia ± makosa ya kawaida ya maana. Tofauti ya kitakwimu iliamuliwa na t-mtihani wa Tailed mbili (p <0.05). Wakati kulinganisha nyingi kulifanywa, maadili ya p yalibadilishwa kwa kutumia marekebisho ya Bonferroni.

Nenda:

Shukrani

Tunapenda kumshukuru Will Renthal na Arvind Kumar kwa majadiliano mazuri. Tunapenda pia kuwashukuru NIDA kwa kufadhili majaribio haya.

Nenda:

Maelezo ya chini

Kanusho la Mchapishaji: Huu ndio faili ya PDF ya maandishi yasiyotarajiwa ambayo yamekubaliwa kwa kuchapishwa. Kama huduma kwa wateja wetu tunawasilisha toleo hili la awali la maandishi. Kitabu hiki kitashirikiwa kuchapishwa, kuchapisha, na kuchunguza uthibitisho uliofuata kabla ya kuchapishwa kwa fomu yake ya mwisho inayofaa. Tafadhali kumbuka kuwa wakati wa makosa ya mchakato wa uzalishaji yanaweza kugunduliwa ambayo yanaweza kuathiri maudhui, na kukataa kisheria kwa kila kisheria inayohusu.

Masharti ya uainishaji:

Sehemu: #1 Baolojia ya seli na Masi ya mifumo ya neva

Nenda:

Marejeo

  1. Andersson M, Konradi C, Cenci MA. protini ya kujibu ya kujumlisha kwa cAMP inahitajika kwa usemi wa tegemezi wa dopamine kwenye intact lakini sio striatum iliyo dopamine. J Neurosci. 2001; 21: 9930-43. [PubMed]
  2. Barrot M, Olivier JD, Perrotti LI, DiLeone RJ, Berton O, Eisch AJ, Impey S, Storm DR, Neve RL, Yin JC, Zachariou V, Nestler EJ. Shughuli ya CREB kwenye kiini hujumuisha udhibiti wa gati ya majibu ya tabia kwa kuchochea kihemko. Proc Natl Acad Sci US A. 2002; 99: 11435-40. [Makala ya bure ya PMC] [PubMed]
  3. Beinfeld MC, Connolly KJ, Pierce RC. Matibabu ya Cocaine huongeza cholecystokinin ya seli ya nje (CCK) kwenye mkusanyiko wa mkusanyiko wa panya, macho ya kusonga kwa uhuru, athari ambayo inakuzwa katika panya ambazo zinaleweshwa tabia ya cocaine. J Neurochem. 2002; 81: 1021-7. [PubMed]
  4. Bernard C, Sutter A, Vinson C, Ratineau C, Chayvialle J, Cordier-Bussat M. Peptones huchochea nakala ya cholecystokinin ya jeni kupitia cyclic adenosine monophosphate majibu ya mambo ya kumfunga. Endocrinology. 2001; 142: 721-9. [PubMed]
  5. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Athari za kudumu kwa cocaine hutekelezwa na protini ya neuronal Cdk5. Hali. 2001; 410: 376-80. [PubMed]
  6. Cha-Molstad H, Keller DM, Yochum GS, Impey S, Goodman RH. Aina maalum ya kiini ya kiini cha maandishi ya CREB kwa sehemu ya majibu ya cAMP. Proc Natl Acad Sci US A. 2004; 101: 13572-7. [Makala ya bure ya PMC] [PubMed]
  7. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Tumaini BT, Nestler EJ. Udhibiti wa Delta FosB na protini za FosB-kama na mshtuko wa elektronivulsive na matibabu ya cocaine. Mol Pharmacol. 1995; 48: 880-9. [PubMed]
  8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Wanyama wa Transgenic na wasiofanikiwa, na walengwa wa jeni kwenye ubongo. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
  9. Chen J, Zhang Y, Kelz MB, Steffen C, Ang ES, Zeng L, Nestler EJ. Uingiliaji wa cyclin-tegemezi la kinase 5 kwenye hippocampus na mshtuko sugu wa nguvu ya elektroni: jukumu la ΔFosB. J Neurosci. 2000; 20: 8965-71. [PubMed]
  10. Chinenov Y, Kerppola TK. Karibu kukutana kwa aina nyingi: Mwingiliano wa Fos-Jun ambao upatanishi hali maalum ya udhibiti. Oncogene. 2001; 20: 2438-52. [PubMed]
  11. Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman SE. Marekebisho ya Neuronal ya amphetamine na dopamine: mifumo ya Masi ya kanuni ya jeni ya prodynorphin katika striatum ya panya. Neuron. 1995; 14: 813-23. [PubMed]
  12. Deavall DG, Raychowdhury R, ​​Dockray GJ, Dimaline R. Udhibiti wa nakala ya jeni ya CCK na PACAP katika seli za STC-1. Am J Jumuia ya mwili ya Gastrointest ini. 2000; 279: G605-12. [PubMed]
  13. Ding XZ, Mocchetti I. Dopaminergic kanuni ya cholecystokinin mRNA yaliyomo katika striatum ya panya. Brain Res Mol Uongo wa Bongo. 1992; 12: 77-83. [PubMed]
  14. Forrest S, McNamara C. Id familia ya sababu za maandishi na malezi ya mishipa. Arteriosmith Thromb Vasc Biol. 2004; 24: 2014-20. [PubMed]
  15. Gevrey JC, Cordier-Bussat M, Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. Mahitaji ya cyclic AMP- na protini zinazotegemea kalsiamu kwa uanzishaji wa geni la cholecystokinin na hydrolysates ya proteni. J Biol Chem. 2002; 277: 22407-13. [PubMed]
  16. Green TA, Alibhai IN, Unterberg S, Neve RL, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ. Uingiliaji wa sababu za uanzishaji wa maandishi (ATFs) ATF2, ATF3, na ATF4 katika mkusanyiko wa kiini na kanuni yao ya tabia ya kihemko. J Neurosci. 2008; 28: 2025-32. [PubMed]
  17. Hamilton ME, Redondo JL, Freeman AS. Kufurika kwa dopamine na cholecystokinin katika kiini cha panya katika kukabiliana na utawala wa madawa ya kulevya. Shinikiza. 2000; 38: 238-42. [PubMed]
  18. Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. Protini kinase iliyoamilishwa na Mitogen na protini kinase Njia za kuashiria huchochea unukuzi wa cholecystokinin kupitia uanzishaji wa mzunguko wa adenosine 3 ", 5'-monophosphate majibu-proteni inayofunga. Mol Endocrinol. 1999; 13: 466-75. [PubMed]
  19. Hansen TV, Nielsen FC. Udhibiti wa uondoaji wa jeni la cholecystokinin ya jeni. Scand J Clin Lab Kuwekeza Suppl. 2001; 234: 61-7. [PubMed]
  20. Hansen TV. Uandishi wa jeni la Cholecystokinin: vitu vya kukuza, sababu za ununuzi na njia za kuashiria. Peptides. 2001; 22: 1201-11. [PubMed]
  21. Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. KCl na forskolin synergistically up -asimamia kujieleza kwa jeni la cholecystokinin kupitia kuratibu uanzishaji wa CREB na mwanzishaji wa CBP. J Neurochem. 2004; 89: 15-23. [PubMed]
  22. Haun RS, Dixon JE. Kiwandani cha kuchapa muhimu kwa usemi wa jeni la cholecystokinin ya panya ina mlolongo sawa na sehemu ya -296 ya jini la binadamu la c-fos. J Biol Chem. 1990; 265: 15455-63. [PubMed]
  23. Hiroi N, Marek GJ, Brown JR, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, Duman RS, Greenberg ME, Nestler EJ. Jukumu muhimu la jenasi ya fosB katika vitendo vya Masi, simu za rununu, na tabia ya kushonwa sugu kwa elektroni. J Neurosci 1998. 1998; 18: 6952-62. [PubMed]
  24. Hoktima T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldstein M, Markey K. Ushuhuda wa usawa wa dopamini na CCK katika neurones kubwa. Asili. 1980; 285: 476-8. [PubMed]
  25. Matumaini BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ. Matibabu ya mshtuko wa mara kwa mara wa elektroniki (ECS) husababisha kuelezea kwa tata ya AP-1 ya muda mrefu katika ubongo iliyo na muundo na sifa zilizobadilishwa. J Neurosci. 1994; 14: 4318-28. [PubMed]
  26. Tumaini BT, NYE HE, MB Kelz, Mweke DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ. Uingizaji wa tata ya AP-1 ya muda mrefu iliyojumuisha protini zilizobadilika kama Fos katika ubongo na matibabu ya muda mrefu ya kocaine na matibabu mengine ya muda mrefu. Neuron. 1994; 13: 1235-44. [PubMed]
  27. Huang KX, Walters JR. Udhibiti wa dopaminergic ya shughuli ya uandishi wa AP-1 ya sababu ya kufunga ya DNA katika striatum ya panya. Neuroscience. 1996; 75: 757-75. [PubMed]
  28. Impey S, McCorkle SR, Cha-Molstad H, Dwyer JM, Yochum GS, bosi JM, McWeeney S, Dunn JJ, Mandel G, Goodman RH. Kufafanua kanuni ya CREB: uchanganuzi mpana wa mkoa wa udhibiti wa sababu za uandishi. Kiini. 2004; 119: 1041-54. [PubMed]
  29. Johannessen M, mbunge wa Delghandi, Moens U. Ni nini kinachobadilisha CREB? Ishara ya Kiini. 2004; 16: 1211-27. [PubMed]
  30. Josselyn SA, Vaccarino FJ. Madhara yanayopingana na wapinzani wa CCK (A) na CCK (B) juu ya maendeleo ya shughuli zenye masharti katika panya. Behav Pharmacol. 1996; 7: 505-512. [PubMed]
  31. Josselyn SA, De Cristofaro A, Vaccarino FJ. Ushahidi wa CCK (A) ushiriki wa receptor katika upatikanaji wa shughuli zenye hali zinazozalishwa na cocaine katika panya. Ubongo Res. 1997; 763: 93-102. [PubMed]
  32. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr., Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR , Nestler EJ. Uonyeshaji wa deltaFosB ya uandishi katika maandishi inadhibiti usikivu wa cocaine. Asili. 1999; 401: 272-6. [PubMed]
  33. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, Self DW, Nestler EJ. Kurudisha kwa Chromatin ni njia muhimu inayosababisha uboreshaji wa cocaine katika striatum. Neuron. 2005; 48: 303-14. [PubMed]
  34. Mattson BJ, Bossert JM, Simmons DE, Nozaki N, Nagarkar D, Kreuter JD, Tumaini BT. Phosphorylation ya cocaine iliyosababishwa na Cocaine iliyosababishwa na mkusanyiko wa panya iliyosisitishwa ya kokeini inawezeshwa na uanzishaji ulioimarishwa wa kinase inayohusiana na ishara ya nje, lakini sio protini kinase A. J Neurochem. 2005; 95: 1481-94. [PubMed]
  35. McClung CA, Nestler EJ. Udhibiti wa kujieleza kwa jeni na malipo ya cocaine na CREB na DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-15. [PubMed]
  36. McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: kubadilisha molekuli kwa kukabiliana na muda mrefu katika ubongo. Ubongo Res Mol Brain Res. 2004; 132: 146-54. [PubMed]
  37. Nestler EJ, Kelz MB, Chen JS. ΔFosB: mpatanishi wa Masi ya uso wa muda mrefu wa neural na tabia. Ubongo Res. 1999; 835: 10-17. [PubMed]
  38. Nestler EJ. Je! Kuna njia ya kawaida ya Masi kwa ajili ya kulevya? Nat Neurosci. 2005; 8: 1445-9. [PubMed]
  39. Nestler EJ. Mbinu za uandishi wa ulevi: jukumu la DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245-55. [Makala ya bure ya PMC] [PubMed]
  40. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, DJ Knapp, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Mwelekeo tofauti wa DeltaFosB induction katika ubongo na madawa ya kulevya. Sambamba. 2008; 62: 358-69. [Makala ya bure ya PMC] [PubMed]
  41. Rando OJ, Chang HY. Maoni mapana ya muundo wa chromatin. Annu Rev Biochem. 2009; 78: 245-71. [Makala ya bure ya PMC] [PubMed]
  42. Renthal W, Carle TL, Maze I, Covington HE, 3rd., Truong HT, Alibhai I, Kumar A, Montgomery RL, Olson EN, Nestler EJ. Delta FosB hupatanisha kukata tamaa kwa jini ya c-fos baada ya mfiduo sugu wa amphetamine. J Neurosci. 2008; 28: 7344-9. [Makala ya bure ya PMC] [PubMed]
  43. Waliofariki W, Kumar A, Xiao G, Wilkinson M, Covington HE, 3rd, Maze I, Sikder D, Robison AJ, LaPlant Q, Dietz DM, Russo SJ, Vialou V, Chakravarty S, Kodadek TJ, Stack A, Kabbaj M, Nestler EJ. Uchunguzi wa jumla wa uharibifu wa kromatin na cocaine unaonyesha jukumu kwa maiti. Neuron. 2009; 62: 335-48. [Makala ya bure ya PMC] [PubMed]
  44. Rotzinger S, Bush DE, Vaccarino FJ. Cholecystokinin modulation ya mesolimbic dopamine kazi: kanuni ya tabia ya motisha. Dawa ya sumu. 2002; 91: 404-13. [PubMed]
  45. Rourke IJ, Hansen TV, Nerlov C, Rehfeld JF, Nielsen FC. Ushirikiano mbaya kati ya sanduku lenye maandishi ya E-sanduku na cAMP / TPA msikivu katika kukuza gene la cholecystokinin. FEBS Lett. 1999; 448: 15-8. [PubMed]
  46. Shaw-Lutchman TZ, Barrot M, Wallace T, Gilden L, Zachariou V, Impey S, Duman RS, Storm D, Nestler EJ. Ramani za kikanda na za rununu za uandishi wa maandishi ya CRE-mediated wakati wa uondoaji wa morphine uliotumiwa na -trexone. J Neurosci. 2002; 22: 3663-3672. [PubMed]
  47. Shaw-Lutchman TZ, Impey S, Dhoruba D, Nestler EJ. Udhibiti wa uandishi wa maandishi ya CRE-mediated katika ubongo wa panya na amphetamine. Shinikiza. 2003; 48: 10-7. [PubMed]
  48. Sheng M, McFadden G, Greenberg ME. Uchakachuaji wa Membrane na uondoaji wa kalsiamu ya c-fos kupitia njia ya fosforasi ya maandishi ya CREB. Neuron. 1990; 4: 571-82. [PubMed]
  49. Tsankova NM, Kumar A, Nestler EJ. Marekebisho ya kihistoria katika mikoa ya kukuza gene katika hippocampus ya pigo baada ya kukamata kwa papo hapo na sugu ya umeme. J Neurosci. 2004; 24: 5603-10. [PubMed]
  50. Ulery PG, Nestler EJ. Udhibiti wa shughuli za uandishi wa DeltaFosB na fosforasi ya Ser27. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224-30. [PubMed]
  51. Vaccarino FJ. Nucleus inakusanya mwingiliano wa dopamine-CCK katika malipo ya psychostimulant na tabia zinazohusiana. Neurosci Biobehav Rev. 1992; 18: 207-14. [PubMed]
  52. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, mbunge wa Cassidy, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ. ΔFosB: Jukumu muhimu kwa ΔFosB kwenye kiini hujilimbikizia hatua ya morphine. Asili Neurosci. 2006; 9: 205-11. [PubMed]