Cdk5 Phosphorylates Dopamine D2 Receptor na Dhamana Signal Downstream (2013)

Citation: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) Cdk5 Phosphorylates Dopamine D2 Receptor na Atttenuates Signal Downstream. PLoS ONE 8 (12): e84482. toa: 10.1371 / journal.pone.0084482

Mhariri: James Porter, Chuo Kikuu cha North Dakota, Marekani

Imepokea: Mei 20, 2013; Imekubaliwa: Novemba 14, 2013; Published: Desemba 31, 2013

Copyright: © 2013 Jeong et al. Hii ni makala ya kufikia wazi iliyosambazwa chini ya masharti ya License ya Attribution Attribution, ambayo inaruhusu matumizi yasiyozuiliwa, usambazaji, na uzazi kwa kila aina, ikitoa mwandishi na chanzo cha awali ni sifa.

Fedha: Kazi hii iliungwa mkono na misaada (NRF-2012R1A2A2A01012923 na NRF-2012R1A4A1028200) kutoka kwa serikali ya Korea (MSIP) na pia inasaidiwa chini ya mfumo wa ushirikiano wa kimataifa uliofanywa na NRF ya Korea (2012K2A1A2033117) na Taasisi ya Utafiti wa Brain Korea (KBRI) Programu ya Msingi ya Utafiti wa MSIP (2031-415). SKP alikuwa mpokeaji wa 2004 na 2006 Taifa ya Muungano wa Utafiti juu ya Ujasirivu na Unyogovu (NARSAD) Young Apelelezi Tuzo. Wafadhili hawakuwa na jukumu katika kubuni utafiti, kukusanya data na uchambuzi, uamuzi wa kuchapisha, au maandalizi ya maandishi.

Maslahi ya kushindana: Waandishi wametangaza kwamba hakuna maslahi ya mashindano yanayopo.

kuanzishwa

Dopamine ishara inahusika katika kazi mbalimbali za ubongo ikiwa ni pamoja na uratibu wa magari, udhibiti wa mood na utaratibu wa malipo [1]. Sehemu kubwa ya dopamini ishara katika vidonda ni kazi na spurred spin neurons kati (MSNs) ambayo kuchagua kikamilifu subset ya receptors dopamine na kupokea pembejeo dopaminergic hasa kutoka eneo ventral teknolojia (VTA) na substantia nigra (SN) [2]. Vipokezi vya Dopamine ni G receptors ya protini-pamoja (GPCR) yenye nyanja saba za transmembrane na zinajumuisha aina mbili, Vipokezi vya D1-na kama D2, ambavyo vinapatanisha hatua za usahihi katika ishara ya dopamini [1]. Kwa mfano, receptors ya D1 kama D1, D5) kuamsha adenylyl cyclase kupitia G_αs na kuongeza kiwango cha intracellular ya CAMP, lakini dopamine D2 kama receptors (D2, D3, D4) inhibitisha adenylyl cyclase kupitia G_αi na kupungua kiwango cha intracellular ya cAMP [1], [3].

Miongoni mwa receptors ya dopamine, receptor ya D2 (DRD2) inahusishwa na pathophysiolojia ya matatizo makubwa ya akili ya akili ikiwa ni pamoja na schizophrenia na madawa ya kulevya [4], kama vile madawa mengi ya dawa ya kupambana na madawa ya kulevya angalau sehemu ya DRD2. Inajulikana pia kuwa shughuli za DRD2 zinahusiana vizuri na matokeo ya tabia ya madawa ya kulevya katika mifano ya wanyama [5]. Vikwazo vya kupambana na uchochezi na ufanisi wa udhibiti wa kihisia pia wamehusishwa na mabadiliko katika kujieleza uso wa seli ya DRD2 au ishara ya chini ya intracellular iliyoidhinishwa na PKA, ERK na GSK3 [1], [4], [6]. Licha ya majukumu muhimu ya DRD2 katika ubongo, utaratibu wa kina wa udhibiti unaoonyesha urithi na utata kwa mali DRD2 hauelewi kabisa.

Kubadili mistari ya ushahidi huonyesha kwamba marekebisho mengi ya posttranslational yanashiriki katika utaratibu mzuri wa shughuli za DRD2. Glycosylation ya kina ya DRD2 ilifunuliwa katika masomo mapema ya ushirikiano wa picha [7], na malezi ya dhamana ya disulfide ndani ya DRD2 pia ilitambuliwa kama mabadiliko muhimu ya kufungwa kwa ligand [8]. Aidha, maeneo ya phosphorylation ya DRD2 yalianza kutambuliwa na vitro kupima na radioisotopes, kutoa njia kwa njia mbalimbali za udhibiti zilizoingizwa na kinases mbalimbali [9]. Kwa kweli, protini Kinase C (PKC) inasimamia uhamisho wa DRD2-mediated wa calcium ya kioevu na huimarisha uingiliano wa DRD2 na protini za cytoskeletal [10]. Phosphorylation na GPCR kinase 2 (GRK2) inasimamia mifumo ya upungufu wa agonist ya DRD2 [11].

XIUMX (Cdk5) kinachotumiwa na Cyclin (Cdk5) ni serine inayoongozwa na proteine ​​/ threonine kinase iliyo na shughuli za upendeleo kutokana na kujieleza kwa ubongo wa watoaji wake muhimu, p35 na p39 [12]. Cdk5 inashiriki katika michakato mbalimbali ya neuronal ikiwa ni pamoja na uhamiaji wa neuronal na uongozi wa axon, na Cdk5 na p35 null panya kuonyesha kasoro katika layering cortical [13]. Hivi karibuni, ilionyeshwa kuwa phosphorylation ya WAVE1 na ephexin na Cdk5 inasimamia dendritic mgongo morphogenesis [14]. Zaidi ya hayo, Cdk5 pia inasimamia kiwango cha uso cha kujieleza uso wa NMDA receptor, NR2B, na NRDA NRDA-mediated currents [15], [16]. Ni vyema kutambua kwamba vipande vingi vya ushahidi huonyesha uhusiano wa karibu kati ya Cdk5 na mfumo wa dopamini. Cdk5 phosphorylates tyrosine hydroxylase (TH), kusimamia utulivu wake, na hivyo kudumisha homeostasis ya dopaminergic [17]. Katika neurons postsynaptic, wakati mabaki T75 ya dopamine na cyclic-AMP kudhibitiwa phosphoprotein-32kD (DARPP-32) ni phosphorylated na Cdk5, inaweza kuzuia shughuli PKA na hivyo antagonze dopamine DRD1-mediated signal PKA [18]. Inashangaza, wakati cocaine, agonist ya moja kwa moja ya receptors ya dopamine, imetajwa mara kwa mara katika panya, mRNA na viwango vya protini vya ongezeko la Cdk5 katika neurons kati ya spiny [19]. Kwa pamoja, Cdk5 inaonekana kuhusishwa na marekebisho ya synaptic ya madawa ya kulevya. Katika somo hili, tunaonyesha ushirikiano wa kazi wa DRD2 na Cdk5 ambayo inaongeza zaidi nafasi ya Cdk5 katika dopamine ishara.

Vifaa na mbinu

Antibodies

Serum za kupambana na sungura zilifufuliwa dhidi ya peptidi zilizo na phospho-serine 321 (pS321) ya kitanzi cha tatu cha intracellular ya DRD2 (D2i3). Phospho-peptide, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), ilitumiwa kufanya safu ya peptide-conjugated kwa ajili ya utakaso kufanana (20401, PIERCE). Anti-pS321 antibody ilitengenezwa na mfumo wa utakaso baada ya maelekezo ya mtengenezaji. Phospho-antibody iliyosafishwa ilihifadhiwa kwenye PBS na 0.1% sodiamu ya azidi na 0.1% ya gelatin. Anti-mouse kupambana na Cdk5 antibody (sc-249) na anti-sungura anti-p35 antibody (sc-820) zilizotumiwa kwa magharibi na magonjwa ya immunocytochemistry ya Cdk5 / p35. Anti-mouse kupambana na GFP antibody (sc-9996) ilitumiwa kwa kuzuia immunoprecipitation na magharibi ya Magharibi ya DRD2-GFP. Anti-Sungura anti-FLAG antibody (sc-807), anti-anti-sungura anti-HA (sc-805), anti-mouse anti-GST antibody (sc-138), na anti-mouse anti-GAPDH antibody (sc- 32293) ilinunuliwa kutoka Biotechnologies ya Santa Cruz.

Wanyama

Kumbunga ya p35 panya ilikuwa ni zawadi za aina kutoka kwa Dk. Katsuhiko Mikoshiba katika Taasisi ya Sayansi ya Sayansi ya Riken nchini Japan na kutumika kwa utamaduni wa kwanza wa neuroni. Vipengee vinavyowekwa kwa ajili ya kujitenga ni 5'- GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC na 5'- TCCATCT GCACGAGACTAGT kama ilivyoelezwa hapo awali [20]. Panya za ICR na Sprague Dawley panya zilizotumiwa kwa ajili ya maandalizi ya ubongo. Taratibu zote za wanyama zilipitishwa na Chuo Kikuu cha Sayansi na Teknolojia ya Taasisi ya Wanyama na Kamati ya Matumizi.

Ujenzi wa plastiki

Binadamu DRD2 ndefu ya isoform katika vector plasmid ya EGFP-N1 na kitanzi cha tatu cha ndani ya DRD2 (212-373 amino asidi ya asidi ikiwa ni pamoja na mabaki ya amino asidi ya 29 ya kipekee kwa DRD2 isoform ndefu) katika vector plasmid ya pFLAG-CMV-2. Cdk5 ya Binadamu iliingizwa kwenye vector plasmid ya PCMV-HA na p35 ya binadamu iliingizwa kwenye vector plasmid pcDNA 3.1. Cdk5 ya kibinadamu iliingizwa chini ya mtetezi wa cytomegalovirus (CMV) pamoja na p35 ya binadamu katika vector pcDNA 3.1 ili kufanya jengo mbili la kujieleza (Cdk5 / p35) kwa ajili ya immunocytochemistry, uchunguzi wa ujuzi wa ndani, [³⁵S] -GTP_γS assing binding, redio radioliging binding na cAMP enzyme immunoassay.

In Vitro Kinase Assay

Imeunganishwa na IP vitro kinase ilijitokeza kama ifuatayo. Ubongo mmoja wa panya ulikuwa umewekwa katika 3 mL erythrocytes lysis buffer (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), NaCl ya 250, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) na kupigwa kwa 20 ya kupoteza homogenizer ili kupata lysates ya ubongo homogenized . Lysates walikuwa incubated juu ya barafu kwa 30 min, sonicated, na centrifuged katika 16,000 × g kwa 10 min. Wanyama supernatants walikuwa immunoprecipitated na antibody-kupambana na sungura anti-p35 ili kupata kazi Cdk5 / p35 tata. Cdk5 / p35 tata na kutakaswa protini ya fusion ya GST ilichanganywa na adenosine 5'-triposphate, [γ-³²P] (NEG-502H, PerkinElmer) na kuingizwa katika kinase buffer (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl₂, 0.2 mM DTT) kwa 1 h katika joto la kawaida [18], [21]. Cdk5 / p25 tata (14-516, Millipore) ilitumiwa pia vitro kinase kipimo kama ilivyoelezwa hapo juu. 2 × sampuli ya kupakia sampuli iliongezwa kwenye mchanganyiko wa majibu na kuchemshwa kwenye 100 ° C. Sampuli ziliwekwa chini ya SDS-PAGE na gel iliyokaushwa ilitathminiwa na uandishi wa habari.

Chromatography ya Lidudu (LC) -Mass Spectrometry (MS) / MS Uchambuzi

Protein ya GST-D2i3 iliyorejeshwa ilikuwa kuchambuliwa na LC-MS / MS ifuatayo IP-zilizounganishwa vitro kinase kipimo. Tulifanya kitambulisho cha peptidi ya data ya LC-MS / MS kwa kutumia X !! Tandem (toleo la Dec-01-2008). Kila faili ya data ya RAW ilibadilishwa kwa mzXML kwanza kwa kutumia bomba la trans-proteomic (TPP; version 4.3). MS / MS inafuta katika mzXMLs zilizobadilishwa kisha zimewekwa chini ya utafutaji dhidi ya database ya Programu ya Programu ya Programu ya Programu ya Programu ya Programu ya Programu ya Mfumo wa Ufuatiliaji (kutolewa 2010_07) ikiwa ni pamoja na mlolongo wa GST-D2i3 kwa kutumia X !! Tandem. Uvumilivu uliwekwa kwa 3 Da kwa ions ya maandamano na 2 Da kwa ions vipande. Specific enzyme kwa trypsin ilitumiwa. Chaguzi za mabadiliko mbalimbali zinazotumiwa kwa carbamidomethylation ya cysteine ​​(57.021 Da), oxidation ya methionine (15.995 Da), hydrolysis ya asparagine (0.987 Da) na phosphorylation ya serine (79.966 Da).

Ukosefu wa kinga

Ukosefu wa immunoprecipitation ulifanyika kwenye lysates za seli katika buffer ya ELB lysis. Anti-GFP antibody ilikuwa imeongezwa kwa lysates na imechukuliwa kwa 3 h katika 4 ° C. Immunocomplexes walikuwa wakitakaswa kwa kutumia protini-A ugarose. Vipeperushi vilikuwa vimewekwa na sampuli ya kupakia SDS kwa sampuli ya 30 saa 37 ° C, na inakabiliwa na SDS-PAGE na blots za Magharibi.

Msaada wa GST Kuondoa

10 μg ya GST iliyojitakasa na GST-D2i3 yalishirikiwa na lysate ya ubongo ya panya kwa 1.5 h katika 4 ° C. 30 μL ya glutathione (GSH) -shujaa wa Sefarose 4B shanga (17-0756-01, GE Healthcare) sawa na buffer lysis ilikuwa aliongeza na incubated kwa ziada 1 h. Shanga zilikusanywa kwa centrifugation kwenye 2,000 ×g na kusafisha na buffer lysis 4 mara [22], [23]. Vipimo vilikuwa vinachambuliwa na magharibi ya Magharibi kutumia anti-Cdk5 na anti-p35 antibodies.

Immunocytochemistry

Vipimo vya HEK 293 vilivyotambuliwa na neurons za kuzaa zilizopandwa kwenye vipuniko vilikuwa vikanawa mara moja na saluni iliyopulizwa kwa phosphate (PBS) na imara kwa kuzamishwa kwa baridi 4% paraformaldehyde / PBS kwa 30 min. Antibody ya msingi ilikuwa diluted katika ufumbuzi kuzuia (2% serum farasi na 1% Triton X-100 katika PBS). Alexafluor-647-conjugated anti-mouse antibody (A20990, Invitrogen) na Alexafluor-568-conjugated anti-sungura antibody (A11011, Invitrogen) ilitumiwa kama antibodies ya sekondari. Hoechst zilizotumiwa kwa udongo wa kiini. Picha zilipatikana kwa microscopy ya confocal (Olympus, FluoView-1000).

Msaada wa Kimataifa wa Msaada

24 h baada ya transfection, seli zilipatiwa na 1 μM quinpirole (Q102, Sigma) kwa 30 min na min 90 katika 37 ° C. Viini vimesimamishwa katika PBS ya 2 mL baridi na aliquots ya 200 μL zilizotumiwa kwa kila mmenyuko. Matibabu ya dawa za kulevya yalifanyika kwa joto la kawaida kwa 3 h katika viwango vifuatavyo; 3 nM [³H] -spiperone (NET-565, PerkinElmer), 3 μM sulpiride (895, TOCRIS), 10 μM haloperidol (H1512, Sigma). Hydrophobic [³H] -spiperone ilitumiwa kwa studio ya jumla iliyopokea vilivyopokea na sulpiridi ya hydrophilic ilitumiwa kuchukua nafasi ya membranous receptor-bound [³H] - ishara za spiperone. Ishara za receptor zinazohusishwa na membrane zimehesabiwa kwa kuondokana na maadili ya receptor ya intraellar kutoka kwa jumla ya maadili ya receptor. Vipengele vilichujwa kwenye chujio cha GF / B (Millipore) na kuosha mara 3 na kuosha buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), na 100 mM NaCl). Filters zilikuwa zameuka na redio ya redio ilipimwa kwa kutumia counter-scintillation counter [24].

Maandalizi ya membrane ya kiini

Vipengele vyenye msimamo katika sahani ya utamaduni wa 100 mm baada ya kuambukizwa na kusafishwa na PBS ya barafu na baridi na kuvuna katika buffer ya XMUMX mL HME (1 mM HEPES (pH 25), 7.5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA). Lysates homogenized walikuwa centrifuged na 500 × g kwa 15 min na supernatants walikuwa hatimaye centrifuged na 36,000 × g kwa 30 min. Pellets imesimamishwa katika buffer ya HME ilitumiwa kwa ajili ya majaribio.

[³⁵S] -GTP_γS Assay Binding

Viambatisho vya membrane za kiini vilitanguliwa na 1 μM quinpirole (Q102, Sigma) katika buffer ya taya (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, EDN XMUMX na 1 PM Pato la Taifa) kwa 0.01 min. [³⁵S] -GTP_γS (NET-030H, PerkinElmer) iliongezwa kwenye mkusanyiko wa mwisho wa 3 nM katika 30 μL na zaidi imeingizwa kwa 90 min. 170 μL ya buffer ya barafu (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), NaCl XMUMX mM, 100 mM MgCl₂, na 0.1 mM GTP) iliongezwa ili kuacha majibu. Vipande vilitengenezwa kwenye chujio cha GF / B (Millipore) na kuosha mara 3 na kuosha buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), na 100 mM NaCl). Filters zilikaushwa na radioactivity ilipimwa kwa kutumia counter scintillation [25], [26].

Radioligand Binding Assay

Vipande vya seli vilivyoandaliwa vilikuwa vimewekwa na 0.01 nM [³H] -spiperone (NET-565, PerkinElmer) na kuongeza viwango vya quinpirole (Q102, Sigma) kwa 30 min katika buffer ya mchezaji (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, Naxl XMUMX mM, EDTA 100 mM). Vipande vilitengenezwa kwenye chujio cha GF / B (Millipore) na kuosha mara 1 na kuosha buffer (3 mM Tris-HCl (pH 50), na 7.4 mM NaCl). Menyukio ilifutwa na uchujaji wa haraka kupitia filters za GF / C. Radiactivity mara kwa mara ilipimwa kwa kutumia counter scintillation maji [27]-[29].

CAMP Immunoassay ya Enzyme

Vipengele vya HEK 293 vilivyoambukizwa vilitengenezwa na 10 μM rolipram (R6520, Sigma) kwa 1 h, na kisha kutibiwa na 0.1 μM forskolin (F6886, Sigma) na kuongezeka kwa viwango vya quinpirole (Q102, Sigma) kwa 30 min. Neurons ya kwanza ya matunda yaliyotengenezwa ilipatiwa na 10 μM rolipram kwa 1 h, na kisha 1 μM dopamine kwa 1 h [22]. Lysates za kiini ziliandaliwa na 0.1 M HCl na viwango vya cAMP ziligunduliwa na kitanda cha immunoassay ya sampuli (Sapphire Bioscience) kwa kufuata maelekezo ya mtengenezaji.

Neuroni ya Striatal ya Kukuza Msingi

Eneo la Striatal lilikatengwa na ubongo wa embryonic (E15). Tishu zilizokatwa zilichanganyikiwa katika vyombo vya habari muhimu (MEM) (11095, Invitrogen) iliyo na 0.25% trypsin (T4549-100, Sigma) na 0.1% DNase I kwa 6 min katika 37 ° C. Viini vimesimamishwa tena kwenye vyombo vya habari vya mchovyo (MEM na 0.01 M HEPES (pH 7.4) na 10% (vol / vol) serum ya farasi (16050-122, GIBCO)). Neurons zilikuzwa kwa siku 7 vitro (DIV 7) katika MEM na ziada ya B27 (17504-044, Invitrogen) kabla ya kutumika kwa immunoassays ya CAMP.

Matokeo

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 katika kitanzi cha tatu cha Intracellular ya DRD2 vitro

Ili kutambua substrates Cdk5 riwaya, tumefanya utafutaji wa utaratibu kwa kutumia (S / T) PX (K / H / R) kama utaratibu wa kukubaliana kwa Cdk5 [30] na kutambuliwa DRD2 kama substrate mgombea. Mlolongo wa makubaliano, ikiwa ni pamoja na serine 321, iko katika kitanzi cha tatu cha intracellular ya DRD2 (D2i3) ambapo mifumo mbalimbali ya udhibiti imechukuliwa [3], [10], [11]. Mlolongo ni mageuzi iliyohifadhiwa katika DRD2 katika viungo vya mgongo, ikiashiria umuhimu wa kazi ya mabaki (Kielelezo 1A).

Shusha:      

• Ppt

  Slide ya PowerPoint

• PNG

  picha kubwa (2.08MB)

• TIFF

  picha ya awali (4.36MB)

Kielelezo 1. Cdk5 phosphorylates serine 321 katika kitanzi cha tatu cha intracellular ya DRD2 katika vitro.

(A) Mipangilio ya mlolongo wa amino inayoonyesha mikoa iliyohifadhiwa ya DRD2 kutoka aina mbalimbali (kivuli). Tovuti ya Cdk5 phosphorylation inaonyeshwa na asterisk. (B) imeunganishwa na IP vitro kinase kipimo na recombinant GST-D2i3 na GST-D2i3 protini mutant. Cdk5 / tata ya p35 iliyoboreshwa kutoka kwa ubongo wa panya inayotokana na kupambana na p35 immunoprecipitation ilitumiwa kwa athari za kinase. Viporinidiografia ya protini za phosphorylated inavyoonyeshwa pamoja na uchafu wa rangi ya bluu ya Coomassie ya gel sawa. Mguu wa Mguu unaonyesha ishara ya mionzi inayoendana na GST-D2i3 na kichwa cha mshale wazi huonyesha ishara za mionzi kutoka p35. (C) MS / MS wigo wa kipande cha peptidi cha phosphorylated cha D2i3. Mifumo ya ugawanyiko wa kinadharia huonyeshwa chini ya wigo. Miongoni mwa ions zote za vipande, i-i na b-ions zilizogunduliwa zinaelezewa katika wigo. Y₆ na y₇ ions sana zinaonyesha phosphorylation ya Serine 321. (D) Katika vitro chunguza kinase kwa Cdk5 / GST-p25 tata kutumia GST-D2i3 na GST-D2i3 protini mutant. Protini za phosphorylated zilionyeshwa kwenye uandishi wa habari, pamoja na uchafu wa bluu wa Coomassie. Kichwa cha mguu kinaonyesha ishara ya mionzi inayofanana na GST-D2i3 na kichwa cha mshale wazi huonyesha ishara za redio kutoka GST-p25.

toa: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Ili tathmini uwezo wa Cdk5 kwa phosphorylate D2i3, tumefanya IP-linked vitro kinase ya majaribio kwa kutumia Cdk5 / p35 tata iliyoboreshwa kutoka kwa lysate ya ubongo na p35 immunoprecipitation na recombinant purified GST-D2i3 (amino asidi 212-373) protini kama substrates. Tuliona ishara za phosphorylation kwenye protini za GST-D2i3 na GST-D2i3 S297A, lakini ishara ilikuwa imepunguzwa kwa kiasi kikubwa kwa kutumia GST-D2i3 S321A (Kielelezo 1B). Ili kuthibitisha zaidi phosphorylation ya serine 321 katika GST-D2i3, tumefanya uchambuzi wa LC-MS / MS wa sampuli kutoka kwa IP-linked vitro nyanya za kinase kutumia spectrometry ya molekuli LTQ XL. Kwa kuzingatia, phospho-peptidi sambamba na wingi wa peptidi za phospho-serine 321 zilipatikana (Kielelezo 1C). Kuzingatia kwamba upatikanaji wa tegemezi wa data wakati wa uchambuzi wa LC-MS / MS huelekea kuchunguza protini nyingi katika sampuli [31], data hii inaonyesha kuwa mabaki ya serine 321 ni tovuti inayojulikana ya phosphorylation ya Cdk5 katika eneo la D2i3. Ili kuthibitisha phosphorylation moja kwa moja ya serine 321 katika GST-D2i3 na Cdk5, vitro kinase kujaribu kutumia Cdk5 / GST-p25 tata na protini recombinant kujitengeneza GST-D2i3 ilifanyika. Tuligundua ishara muhimu ya phosphorylation kwenye GST-D2i3 ambayo haikuwepo katika GST-D2i3 S321A (Kielelezo 1D). Kuchukuliwa pamoja, matokeo haya yanaonyesha kwamba mabaki ya D2i3 S321 ni lengo la kupendeza kwa phosphorylation ya Cdk5-mediated.

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 katika kitanzi cha tatu cha Intracellular ya DRD2 katika seli

Ili kutambua phosphorylation ya serine 321, tulipanda antibody maalum kwa phospho-serine 321 (pS321). Sampuli kutoka kwa IP-zilizounganishwa vitro nyasi ya kinase yalichambuliwa na magharibi ya Magharibi kutumia antibody pS321. Blots ilionyesha bendi tofauti katika majibu ya kinase ambayo yalitegemea GST-D2i3 (Kielelezo 2A). Ili kuthibitisha phosphorylation inayowezekana ya Serine 321 katika DRD2 na Cdk5 katika seli, anti-GFP immunoprecipitates kutoka kwa HEK 293 seli zinazoelezea DRD2-GFP na DRD2 S321A-GFP na bila au HA-Cdk5 na p35 zilichambuliwa na magharibi ya Magharibi kutumia anti-GFP na anti-pS321 antibodies. Dalili za bendi zilizopigwa na antibody ya kupambana na GFP ambazo zinajulikana kuwa ni kutokana na glycosylation nyingi za DRD2 zinazingatiwa tu mbele ya DRD2-GFP, na anti-pS321 antibody wanaona ishara sawa za DRD2 tu na Cdk5 / p35 ushirikiano wa ushirikiano (Kielelezo 2B) [7]. Ili kuthibitisha zaidi phosphorylation ya serine 321 na Cdk5, D2i3 (FLAG-D2i3) na fomu ya mutant ya D2i3 (FLAG-D2i3 S321A) ilizalishwa. FLAG-D2i3 na FLAG-D2i3 S321A iliyoonyeshwa kwa au bila ya HA-Cdk5 na p35 katika seli za HEK 293 zilichambuliwa na jaribio la kuhamia gel la kuhamia gel. Kuhama kwa Cdk5-tegemezi ya uhamiaji muhimu ilionekana kwa FLAG-D2i3, lakini si kwa FLAG-D2i3 S321A (Kielelezo 2C). Sisi pia tathmini kiwango cha phosphorylation ya DRD2 kwenye Ser321 juu ya kuchochea kwa agonist. HEK seli za 293 zinazoelezea DRD2-GFP na Cdk5 / tata ya p35 zilichochewa na quinpirole, na anti-GFP immunoprecipitates kutoka lysates za seli zilichambuliwa na magharibi ya Magharibi kutumia anti-GFP na anti-pS321. Tuligundua kuwa phosphorylation ya Cdk5-mediated ya DRD2 kwenye Ser321 haikuathirika na kuchochea kwa agonist, ambayo inaonekana tofauti na phosphorylations ya GRK-na PKC (Kielelezo 2D) [32], [33]. Kwa pamoja, matokeo haya yanaonyesha kwamba Cdk5 inaweza phosphorylate mabaki ya serine 321 ya DRD2 katika mazingira ya mkononi.

Shusha:      

• Ppt

  Slide ya PowerPoint

• PNG

  picha kubwa (1.92MB)

• TIFF

  picha ya awali (3.5MB)

Kielelezo 2. Cdk5 phosphorylates serine 321 katika kitanzi cha tatu cha intracellular ya DRD2 katika seli.

Cdk5-mediated phosphorylation ya serine 321 ilipimwa kwa kutumia anti-pS321 antibody. (A) Sampuli kutoka IP-zilizounganishwa vitro kinase kujaribu kutumia protini za GST-D2i3 kuchambuliwa na Magharibi ya Magharibi (WB) na antibodies zilizoonyeshwa. Mishale inaonyesha GST-D2i3s. (B) DRD2-GFP na DRD2 S321A-GFP ilielezwa kwa au bila HA-Cdk5 na p35 katika seli za HEK 293. Kupambana na GFP immunoprecipitates walikuwa kuchambuliwa na magharibi Magharibi kutumia anti-GFP na anti-pS321 antibodies. Bunduki inaonyesha ishara ya DRD2 na mshale unaofungua unaonyesha ishara isiyo ya kawaida kutoka kwa anti-GFP immunoprecipitates. 'pembejeo%' ni% ya jumla ya lysate kwa mmenyuko wa IP. Dalili dhaifu za Cdk5 zilionyeshwa na nyota. (C) Gel kuhamia kuhama kujaribu. HEK seli za 293 zimeambukizwa kama zilivyoonyeshwa zilipimwa na magharibi ya Magharibi. (D) seli zilizoambukizwa za HEK 293 zilipatiwa na immunoprecipitates za quinpirole na za kupambana na GFP zilichambuliwa na magharibi ya Magharibi na anti-GFP na anti-pS321 antibodies. Fungua kichupo cha mshale inaonyesha ishara zisizo za kipekee kutoka kwa anti-GFP immunoprecipitates.

toa: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5 / P35 Complex na DRD2 ni Kimwili Associated

Tulifuatilia mwingiliano wa kimwili kati ya tata ya Cdk5 / p35 na DRD2 kwa sababu substrates nyingi za Cdk5 zinajulikana kwa kuhusishwa kimwili na Cdk5 / p35 tata [23], [34], [35]. Kwanza, jitihada ya kuvuta GST ilifanyika. Protein iliyosafishwa ya GST-D2i3 imekwisha kuingizwa na lysate ya ubongo na vidonge vya GST kuvuta-chini vinachambuliwa kwa kufungua Magharibi. Kama inavyoonekana Kielelezo 3A, Cdk5 na p35 hazijapatikana na zimejulikana katika hali ya chini ya kuvuta, inayoonyesha ushirikiano wa kimwili kati ya DRD2 na tata ya Cdk5 / p35 (Kielelezo 3A). Aidha, HA-Cdk5 na p35 ziligunduliwa katika immunoprecipitates ya kupambana na GFP kutoka kwa seli za HEK 293 zinazoonyesha DRD2-GFP na Cdk5 / p35 (Kielelezo 3B). Aidha, tulifanya uchambuzi wa immunocytochemical na kuona kwamba DRD2-GFP, HA-Cdk5 na p35 huonyesha ishara za ushirikiano muhimu katika sehemu ya membrane ya HEK 293 seli (Kielelezo 3C, paneli za juu). Pia tumefuatilia usanidi wa ushirikiano wa DRD2 na Cdk5 / p35 katika mazingira ya neuronal. Kwa ufanisi, DRD2-GFP pia ilionyesha ushirikiano mkubwa wa usanifu na Cdk5 na endogenous na p35 katika neurons zilizopangwa na ugonjwa (DIV7), zaidi kusaidia viungo vya kazi kati ya DRD2 na Cdk5 / p35 (Kielelezo 3C, paneli za chini). Matokeo yanaonyesha kwamba DRD2 na Cdk5 / p35 inaweza kuunda tata na hivyo, mkono dhana kwamba DRD2 ni sehemu ya kisaikolojia ya Cdk5.

Shusha:      

• Ppt

  Slide ya PowerPoint

• PNG

  picha kubwa (3.91MB)

• TIFF

  picha ya awali (5.35MB)

Kielelezo 3. Cdk5 / p35 inaweza kuunda tata na DRD2.

(A) GST kuvuta chini kushughulikia kutumia recombinant recombinant GST-D2i3 protini na extract panya ubongo. Vipindi vya GT kuvuta-chini vinakabiliwa na uchambuzi wa magharibi wa Magharibi. 'Bead' inaonyesha precipitate ya kuvuta chini ya protini za GST. (B) Ukosefu wa immunoprecipitation wa DRD2 na Cdk5 / p35 tata. Anti-GFP IP kutoka kwa lysates kutoka seli zilizoambukizwa zimewekwa chini ya uchambuzi wa magharibi wa Magharibi. Bunduki inaonyesha ishara ya DRD2 na mshale unaofungua unaonyesha ishara isiyo ya kawaida kutoka kwa anti-GFP immunoprecipitates. Blot kali kwa pembejeo pia imeonyeshwa kwa haki. (C) Uchambuzi wa Immunocytochemical wa DRD2 na Cdk5 / p35. HEK seli za 293 zinazoelezea DRD2-GFP na Cdk5 / p35 ziliharibiwa na anti-Cdk5 na anti-p35 antibodies (Vipande vya Juu). DRD2-GFP ilielezewa peke yake katika neurons zilizopangwa na kuzama na kupambana na Cdk5 na antibodies ya kupambana na p35 (paneli za chini). Hoechst zilizotumiwa kwa udongo wa kiini. Bar ya ukubwa ni 5 μm. Picha zote zilipatikana kwa kutumia microscopy ya confocal (Olympus, FluoView-1000).

toa: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Cdk5-mediated Phosphorylation ya shughuli za Mpokeaji wa DRD2

Imeripotiwa kwamba phosphorylation hupangia mali muhimu za GPCRs kama vile kupambanua kwa protini ya G, internalization ya receptor, ujanibishaji wa intracellular, na kushirikiana na protini za modulator [9], [11], [24]. Ainternalization receptor internalization ni mchakato muhimu wa udhibiti wa transduction signal. Tulifanya uchunguzi wa Cdk5-mediated wa internalization DRD2. HEK seli za 293 zinazoonyesha DRD2-GFP na DRD2 S321A-GFP na au bila Cdk5 / p35 ziliingizwa na 1 μM quinpirole ili kuingiza internalization DRD2 ya agonist (stimulated)Kielelezo 4A). [³H] - ishara za spiperone za seli za DRD2-GFP zinazoelezea zilipunguzwa sana katika matibabu ya 30 min quinpirole na zimepatikana katika dakika 90. Kushangaza, [³H] - ishara za spiperone za DRD2-GFP na Cdk5 / p35 zinazoonyesha seli zilipunguzwa katika matibabu ya 30 min quinpirole lakini hazikutolewa katika 90 min (Kielelezo 4A, sehemu ya pili). Kwa upande mwingine, [³H] - ishara za spiperone za DRD2 S321A-GFP zinazoelezea seli zilipungua kwa minara ya 30 na zimepatikana katika minara ya 90, bila kujali ushirikiano wa Cdk5 / p35. Masomo ya awali yameonyesha kuwa internalized DRD2 inarudi tena kwenye membrane ya plasma juu ya kuchochea kwa muda mrefu wa agonist [11]. Tlakini inaonekana kwamba phosphorylation ya Cdk5-mediated ya DRD2 inashiriki katika mchakato wa kuhamasisha baada ya kugandishwa kwa agonist-ikiwa DRD2 internalisation.

Shusha:      

• Ppt

  Slide ya PowerPoint

• PNG

  picha kubwa (387KB)

• TIFF

  picha ya awali (1.31MB)

Kielelezo 4. Cdk5-mediated phosphorylation intenuates DRD2 uso uso na signal chini.

(A) DRD2 kutafakari uso kipimo na [³H] -spiperone ya kukimbilia. Vipengele vya HEK293 vilivyoambukizwa vilichochewa na 1 μM quinpirole kwa muda ulioonyeshwa na kuvuna, ikifuatiwa na 3 nM [³H] -spiperone matibabu kwa 3 h. Mionzi ilipimwa na ishara za uso zilihesabiwa. Baa za makosa zinawakilisha maana ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; Njia moja ya ANOVA na mtihani wa Dunnett post hoc: linganisha nguzo zote dhidi ya safu ya kudhibiti). (B) [³⁵S] -GTP_γS kumfunga. Vipande vya seli viliandaliwa kutoka kwenye seli zinazoambukizwa kama ilivyoonyeshwa. Maandalizi ya membrane yalikuwa yameingizwa na 1 μM quinpirole ikifuatiwa na 3 nM [³⁵S] -GTP_γS kwa dakika 90. Baa za makosa zinawakilisha maana ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; Njia moja ya ANOVA na mtihani wa baada ya Bonferroni: linganisha jozi zote za nguzo). (C) Kushindana kwa Quinpirole [³H] -spiperone ya kukimbilia. Maandalizi ya membrane kutoka kwa seli zilizoambukizwa zimeingizwa na 0.01 nM [³H] -spiperone na kuongezeka kwa viwango vya quinpirole kwa dakika 30. Ukandamizaji usio na mstari ulipatikana na GraphPad. Baa za makosa zinaonyesha maana ± SE (n = 3). (D) enzyme enzyme immunoassays katika seli za HEK 293 zilizohamishwa. Seli zilizoambukizwa zilitengenezwa na 10 µM rolipram kwa saa 1, na baadaye ikatibiwa na 0.1 forM forskolin na kuongeza viwango vya quinpirole kwa dakika 30. Ukandamizaji usio na mstari ulipatikana na GraphPad. Baa za makosa zinawakilisha maana ± SE (n = 4; ** p <0.01; mbili-tailed t-taka). (E) Kuzalishwa neurons ya kuzaa kutoka aina ya pori na p35 kukuza (DIV 7) walikuwa kutibiwa na 10 μM rolipram kwa 1 h ikifuatiwa na 1 μM dopamine kwa 1 h. Hitilafu za baa zinawakilisha maana ya ± SE (n = 4; **p<0.01; mkia miwili t-taka).

toa: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Sisi tathmini zaidi uwezekano wa mabadiliko ya agonist-stimulated G protini coupling kwa DRD2 kuhusishwa na Cdk5-mediated phosphorylation kwa kutumia [³⁵S] -GTP_γS kumfunga [25], [26]. DRD2-GFP na DRD2 S321A-GFP na au bila Cdk5 / p35 yalitolewa kwenye seli za HEK 293. Vipande vilitayarishwa na kuchochewa na 1 μM quinpirole na zaidi kuruhusiwa [³⁵S] -GTP_γS kuingizwa. DRD2-GFP na Cdk5 / p35 inayoonyesha membrane ya seli ilionyesha sana kuharibika [³⁵S] -GTP_γS binding ikilinganishwa na membrane nyingine zote za seli (Kielelezo 4B). Matokeo haya yanaonyesha kwamba phosphorylation ya Cdk5-mediated chini-inasimamia agonist-stimulated G protini binding katika DRD2.

Zaidi ya hayo, ushindani wa quinpirole [³H] -spiperone za kukamilisha ufuatiliaji zilifanywa ili kuchunguza mabadiliko yoyote ya uwezekano wa ushirika wa agonist kwenye DRD2 na phosphorylation ya Cdk5-mediated. Kisheria ya kisheria ya [³H] -spiperone juu ya matibabu ya kuongezeka kwa viwango vya quinpirole kwa maandalizi ya membrane kutoka kwa transfected ilikuwa kipimo. Kushindana kisheria ya quinpirole na [³H] -spiperone kwenye DRD2-GFP na DRD2 S321A-GFP ilifanya logi sawa_i maadili (-9.789 kwa DRD2-GFP; -9.691 kwa DRD2 S321A-GFP), akionyesha kwamba ushirika wa ligand kwa DRD2 hauathiriwa sana na phosphorylation ya Cdk5-mediated kwenye DRD2 (Kielelezo 4C).

Cdk5-mediated Phosphorylation Down-inasimamia DRD2-cAMP njia ya Ishara

Kisha, tulitathmini ikiwa mabadiliko ya DRD2 na Cdk5 huathiri njia za kuashiria njia za chini. Tulifuatilia uzuiaji wa DRD2 uliopatanishwa na uzalishaji wa cAMP wa forskolin-kuchochewa na chumvi ya adenylyl katika seli zinazoelezea DRD2-GFP na DRD2 S321A-GFP kwa kutumia kinga ya enzyme ya immunoassay. Siri za DRD2 zinaonyesha kupungua kwa viwango vya CAMP kwa kukabiliana na quinpirole kwa namna inayotegemea kipimo. Kwa kushangaza, ushirikiano wa Cdk5 / p35 umepungua kiasi kikubwa cha kuzuia maambukizi ya cAMP (Kielelezo 4D, jopo la kushoto). Kwa upande mwingine, katika seli za kuelezea DRD2 S321A-GFP, mafunzo ya cAMP yalizuiliwa kwa ufanisi kwa kukabiliana na matibabu ya quinpirole bila kujali maneno ya Cdk5 / p35 (Kielelezo 4D, jopo la kulia). Matokeo haya yanaonyesha kwamba phosphorylation ya Cdk5-mediated ya DRD2 inadhibiti shughuli za kuzuia DRD2 kwenye njia ya kusafiri ya CAMP ya chini. Ili kuthibitisha zaidi hali hiyo katika hali nzuri zaidi ya kisaikolojia, tulifanya matumizi ya neuroni za msingi za matunda kutoka kwa vibanda vya kubisha hazipo katika p35, activator muhimu ya Cdk5. Neurons ya kwanza ya matunda yaliyotengenezwa ilipatiwa na 1 μM dopamine na kuchambuliwa na immunoassay ya enzyme ya CAMP. Neurons kutoka pxNUMX kikwazo panya zilionyesha kupunguzwa viwango vya CAMP ikilinganishwa na neurons aina ya mwitu wakati kuchochea na dopamine (Kielelezo 4E). Tkuungana pamoja, tulihitimisha kuwa phosphorylation ya Cdk5-mediated ya DRD2 inapungua kwa tone la kuzuia kwenye njia ya CAMP inayoongozwa na DRD2.

Majadiliano

Tuligundua DRD2 kama substrate ya riwaya ya Cdk5. Phosphorylation inaonekana chini-inasimamia kuelezea uso wa DRD2 kwa kuathiri hatima ya DRD2 ifuatayo internalization internalization na hivyo kupunguza DRD2 G_ikupunjika na njia ya chini ya cAMP. Kama mabaki ya phosphorylation S321 ipo katika DRD2 ndefu na isofizi fupi, utaratibu uliopendekezwa katika utafiti huu unaweza kuwa njia ya jumla ya kanuni katika ishara ya DRD2-mediated.

DRD2 katika neurons ya kati ya spiny haijaonekana tu kama sehemu ndogo ya dopamini receptor lakini pia imekuwa kutambuliwa kwa uwezekano wake kwa mabadiliko katika upatikanaji katika kukabiliana na msisitizo wa mazingira. Utekelezaji wa uharibifu wa Agonist na upungufu wa DRD2 umejifunza sana [11], [24]. Hasa, tafiti kadhaa zimeonyesha kuwa madhara ya kisaikolojia ya muda mrefu ya psychostimulant, kama vile cocaine na amphetamine, ambayo huongeza kiwango cha ziada cha dopamine katika synapse ya kujifungua, inashirikiana na mabadiliko makubwa ya DRD2 postsynaptically [36]. Kwa kweli, watumiaji wa cocaine wa muda mrefu wanajulikana kuwa wamepungua viwango vya DRD2 katika eneo la kuzaliwa, na upatikanaji wa DRD2 katika kiini cha kukusanyiko (NAcc) inaonyesha usawa mbaya na kutafuta madawa ya kulevya na tabia za kuimarisha katika panya na primates [37]-[39]. Matokeo haya yanaonyesha kuwa utendaji wa DRD2 huathiriwa sana na kanuni za fidia au fidia kwa kukabiliana na madai mbalimbali ikiwa ni pamoja na yatokanayo na madawa ya kulevya. Matokeo yetu yanaonyesha kuwa mabaki ya S321 katika kitanzi cha tatu cha intracellular ya DRD2 inaweza kuwa phosphorylated na Cdk5, ambayo inasababisha kupungua kwa ushawishi wa kuzuia DRD2 kwenye njia ya cAMP. Mwingiliano huu unapendekeza utaratibu wa udhibiti wa riwaya unaohusishwa na Cdk5 katika neurons za dopaminoceptive ambazo zinaweza kuunganishwa na hali ya nguvu ya upatikanaji wa uso wa DRD2.

Ikumbukwe kwamba Cdk5 inajulikana kuwa sehemu muhimu katika kupatanisha mabadiliko ya mabadiliko ya mazingira ya neuronal. Kwa mfano, mabadiliko ya miundo na ya kazi ya misuli ya dendritic katika neurons ya mzunguko wa limbic ni moja ya matokeo ya kurudia kisaikolojia ya psychostimulant [40]. Mabadiliko haya yanafuatana na mabadiliko mbalimbali ya Masi ikiwa ni pamoja na uingizaji wa protini ya kipengele cha majibu ya kampeni (CREB) na ΔFosB, sababu za usajili ambazo zinaonyesha udhibiti wa kudumu katika kukabiliana na uongozi wa muda mrefu wa cocaine [41], [42]. Muhimu, Cdk5 ni lengo la ΔFosB [19], na vipengele vingi muhimu vilivyohusika katika mienendo ya mgongo wa dendritic, kama vile PSD-95, kinamu iliyosababisha p21 (PAK), β-catenin, na spinophilin, ziliripotiwa kama substrates Cdk5 [43]-[46]. Kwa ufanisi, maumbile ya maumbile au ya pharmacological ya shughuli za Cdk5 husababisha mabadiliko ya morphology ya mgongo wa dendritic na majibu ya tabia kwa cocaine, akiwa na majukumu muhimu kwa Cdk5 katika mabadiliko ya molekuli na ya kimapenzi ya mizunguko ya dopamini ya macholimbic [47], [48]. Matokeo yetu yanaonyesha kwamba DRD2 ni lengo la riwaya la Cdk5 hutoa ufahamu wa ziada katika mabadiliko ya mabadiliko ya mfumo wa dopamini kwa kukabiliana na madhara ya dawa ya muda mrefu kwa sababu ya ΔFosB-mediated up-kanuni ya Cdk5 inaweza kusababisha ongezeko la tonic katika phosphorylation ya DRD2 . Aidha, DRD2 inajulikana kuathiri michakato ya simu za mkononi, ikiwa ni pamoja na udhibiti wa njia za CAMP na MAP kinase na matukio ya transcriptional ya chini [42], [49]. Kwa hiyo, matokeo ya utafiti huu yanaweza sio tu kuonyesha udhibiti wa moja kwa moja wa DRD2 na Cdk5 lakini pia kutoa ufahamu wa riwaya katika majibu yanayotokana na mfumo wa dopamine na yatokanayo na madawa ya kudumu.

Msaada wa Mwandishi

Mimba na iliyoundwa majaribio: JJ YUP DH SKP. Ilifanya majaribio: JJ YUP DKK YK. Ilibadilishwa data: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Vipengee vya reagents / vifaa / uchambuzi wa zana: YHS. Aliandika karatasi: JJ SKP.