Shughuli ya ongezeko la kinastaa ya mzunguko wa 5 inasababisha kuzuia dalili ya dopamini iliyosaidiwa na cocaine (2005)

abstract

Cocaine huongeza viwango vya dopamine ya synaptic kwenye striatum na hubadilisha usemi wa jeni kwenye densi ya dopaminocept kwa kuamsha njia za ndani zinazoeneza ishara ya awali kutoka kwa dopamine D1 receptor kwa kiini (1). Mfiduo wa mara kwa mara wa cocaine husimamia mambo kadhaa ya maandishi, na kusababisha mabadiliko ya kudumu kwa usemi wa jeni ambao hufikiriwa kubadili marekebisho ya neuroni katika ulevi wa kokaini (2). ΔFosB, inayotambuliwa kama sababu ya uandishi (3), imeonyeshwa kuongeza mwitikio wa tabia ya wanyama kwa cocaine (4, 5). Kwa hivyo, kitambulisho cha jeni lengwa ambacho kinadhibitiwa na uingizwaji wa osFosB kinatarajiwa kuchangia uelewaji mkubwa wa utaratibu wa Masi ya msingi wa ulevi wa cocaine. Hivi karibuni, matibabu sugu ya wanyama walio na cocaine yameonyeshwa ili kudhibiti uwasilishaji wa cyclin-tegemezi kinase 5 (Cdk5) na activator wake P35 kwenye striatum kupitia induction ya ΔFosB (6, 7).

Cdk5 ni mwanachama wa familia ya Cdk ya kinine / threonine kinases. Tofauti na Cdks zingine ambazo ni wasanidi wakuu wa mabadiliko ya mzunguko wa seli, Cdk5 inahusika sana katika fosforasi ya sehemu ndogo katika neurons za postmitotic (8). Utaalam wa neuronal wa shughuli za Cdk5 unapatikana kupitia ushirika na waanzishaji wake, ama p35 au p39, ambayo huonyeshwa kwa kiwango kikubwa katika neurons ya postmitotic (8). Kwa kuongeza jukumu muhimu la Cdk5 katika ukuzaji wa ubongo (9, 10), it pia imeathiriwa katika maambukizi ya dopaminergic katika ubongo wa baada ya kuzaa (11, 12). Uzuiaji wa shughuli za Cdk5 husababisha kuongezeka kwa dopamine kwenye striatum, kuonyesha kazi ya upendeleo ya Cdk5 kama mdhibiti hasi wa kutolewa kwa dopamine. (11). Kwa kuongezea, Cdk5 moduli ya ufanisi wa dalili za dynamini ya postynaptic dopamine na phosphorylating dopamine- na cAMP iliyosimamiwa na phosphoprotein, molekuli ya molekuli 32 kDa (DARPP-32) katika Thr-75, ambayo inabadilisha DARPP-32 kuwa inhibitor ya (12).

Hizi uchunguzi zinaonyesha kuwa Cdk5 na p35 ni wasanifu wa chini wa uanzishaji wa muda mrefu wa kuashiria dopamine baada ya kufichua ugonjwa wa cocaine na kwa hivyo katika ulevi wa cocaine. Ili kushughulikia zaidi jukumu la Cdk5 juu ya ishara driamini ya driamini, tulitoa mistari miwili ya panya ambayo Cdk5 au p35 iliongezwa zaidi katika neurons chini ya udhibiti wa mtangazaji wa P35. Matokeo yetu yalionyesha kuwa shughuli za Cdk5 zilisimamiwa na viwango vya protini za p35 lakini sio protini ya Cdk5, ikionyesha kuwa kiwango cha proteni ya P35 kinapunguza kiwango cha shughuli za Cdk5. Tunatoa hapa katika vivo Ushuhuda ambao uliongezea shughuli za Cdk5, kwa sababu ya p35 overexpression, husababisha kupokelewa kwa ishara ya dokamini ya cocaine iliyoelekezwa kwa kiini kupitia kizuizi cha kasinari za PKA na njia za nje za kinasaba za kinase (ERK).

Vifaa na mbinu

Antibodies. Antibodies za polyclonal hadi Cdk5 (C-8) na p35 (C-19) zilinunuliwa kutoka kwa Santa Cruz Biotechnology. Antibodies ya kutegemea phosphorylation na-kutegemewa kwa ERK kinase (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2, na proteni ya kumfunga-camu ya kipengele (CREB) ilipatikana kutoka Teknolojia ya Uainishaji wa Saini (Beverly, MA). Kingamwili kwa phospho-Thr-34 DARPP 32 (13), phospho-Thr-75 DARPP-32 (12), jumla ya DARPP-32 (12), na c-fos (14) zilitumika kama ilivyoelezewa. Anti anti to actin ilinunuliwa kutoka Sigma.

Wanyama wa Majaribio. Hapo awali tuligonga jini la p35 panya Cdk5r1, ambayo hushughulikia protini ya P35, na ina sifa ya muundo wake (15). Ili kutoa panya wa transgenic na upungufu wa madini ya neuronal ya p35 (Tgp35), 6-kb MwangwiRI-MwangwiSehemu ya RI iliyo na mkoa wa mtangazaji wa 1.2-kb iliingizwa kwa pGEM9Z (-) plasmid, na tag ya 45-bp inayotokana na SV40 iliingizwa KpnMimi tovuti chini ya aina ya (A⁺) ishara (Mtini. 1A). Lebo ilikuwa na a HotubaMimi tovuti kwa genotyping ya wanyama. Sehemu ya 6-kb ilitolewa kutoka kwa plasmid na ikatakaswa, ikifuatiwa na sindano ya matisho ya transgene kutengeneza panya wa transgenic. Kuchunguza hadhi ya kujieleza ya transgene iliyo chini ya udhibiti wa udhibiti wa mtangazaji wa 1.2-kb p35 katika vivo, panya wa transgenic mara mbili (Tgp35; p35 - / -) ilitolewa zaidi kwa kutumia mkakati wa kuzalisha wa hatua mbili ambao panya wa Tkup35 ilibadilishwa tena katika mfumo wa nyuma wa p35-null. Mitindo mingine ya panya iliyotumika kwenye utafiti huu ni pamoja na p35 + / -, P35 - / -, Cdk5 +/-, na panya wa kupandikiza aliye na uzoefu wa jumla wa Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17). Jenetiki za panya hizi ziliamuliwa kwa kufanya uchambuzi wa blot Kusini au PCR kwenye DNA ya genomic iliyotengwa na biopsies ya mkia. Panya ziliwekwa chini ya mzunguko wa taa ya 12-h / 12-h. Utunzaji wote ulitolewa kwa kufuata Maagizo ya kitaifa ya miongozo ya Afya juu ya utunzaji na utumiaji wa wanyama wa maabara na majaribio.

  

Mtini. 1.

Kizazi cha transgenic panya na orenxpression ya neuronal ya p35 iliyoelekezwa na mtangazaji wa p35 (Tgp35). (A) Uundaji wa transgene umeonyeshwa na muundo wa muundo wa aina ya mwitu na walengwa wa p35. Baa nyekundu zinaonyesha probe inayotumiwa kwa genotyping. ...

Uchambuzi wa Blot Kusini. DNA ya genomic iliyotolewa kutoka biopsies mkia ilining'olewa na MwangwiRI na HotubaMimi, nimechota umeme kwenye glasi ya agarose ya 0.9%, na kuhamishiwa kwenye membrane ya nylon. Membrane hiyo ilibadilishwa na iliyoandaliwa bila mpangilio ³²Pro-iliyoandaliwa kwa saa 42 ° C mara moja. Upelelezi wa 485-bp wa genotyping ya p35 Knout (p35 - / -) na panya za Tgp35 zilitolewa na PCR kwa kutumia primers zifuatazo: 5'-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 'na 5'-CCNGXA-XACUMX'ACA. Utando wa mseto uliosafishwa mara mbili katika 3 × SSC / 2% SDS kwa 0.1 ° C kwa 42 min, na mara mbili katika 10 × SSC / 0.1% SDS kwa 0.1 ° C kwa 65 min, na wazi kwa filamu ya x-ray.

Matibabu ya Dawa. Cocaine (Sigma) ilifutwa katika chumvi isiyoweza kuzaa. Wanyama waliingizwa sindano ya cocaine (15 mg / kg) au kiwango sawa cha chumvi katika umri wa miezi ya 3 na kuuawa kwa uporaji kwa viwango tofauti vya wakati (15, 30, 60, na 120 min) baada ya sindano. Wabongo waliondolewa haraka na kuzidiwa katika PBS ya barafu. Striata hizo zilitengwa nje na kufanyishwa uchanganuzi wa Kaskazini au Magharibi. Kwa uchambuzi wa immunohistochemical, sehemu za striatal zilipatikana kutoka kwa panya 2 h baada ya sindano.

Uchambuzi wa Blot Kaskazini. Jumla ya RNA ilitolewa kwenye striata na TRIzol reagent (Teknolojia ya Maisha ya Invitrogen, Carlsbad, CA) na kufanyiwa uchambuzi wa blot Kaskazini kama ilivyoelezewa (18). Kwa kugundua c-fos mRNA, kipande cha 189-bp cha c-fos cDNA kilitumiwa kama uchunguzi kama ilivyoelezea (19). Viwango vya c-fos mRNA vilifafanuliwa kwa kupima wiani wa macho wa bendi maalum kwa kutumia mfumo wa uchambuzi wa picha na programu ya picha ya nih, Toleo la 1.62.

Uchambuzi wa Blot Magharibi. Vidonda vya tumbo vilifanywa ndani ya 1% SDS na kuchemshwa kwa dakika 10. Mkusanyiko wa protini katika kila sampuli imedhamiriwa na assay ya proteni ya BCA (Pierce). Kiasi sawa cha protini kilitengwa na SDS / PAGE kabla ya kuhamishiwa kwenye membrane ya nitrocellulose. Utando ulizuiwa katika 1 × PBS iliyo na maziwa ya skim 5% na 0.05% Kati ya 20 na ilizikwa na antibodies za msingi mara moja saa 4 ° C. Incubation na peroxidase-conjugated anti-panya au sungura IgG (Sigma) ilifanywa kwa joto la kawaida kwa dakika 60. Ishara iligunduliwa na chemiluminescence iliyoimarishwa (Pierce), na wiani wa macho wa bendi hizo ulipitishwa kama ilivyoelezwa hapo juu.

Cdk5 Kinase Assay. Taa za striatal zilitayarishwa na buffer ya lining inayojumuisha 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 mM phenylmeth / 1 mNXLUM / XLUMX / XLUMX / XLUMX / XLUMX / XLUMX / 1 ml leupeptin / phosphatase inhibitors (mchanganyiko wa phosphatase inhibitor mimi na II, Sigma). Vipuli vilikuwa vimetungwa na anti-Cdk5 (C-8) au anti-p35 (C-19) antibodies. Cdk5 immunoprecipitates ilitayarishwa na incubation ya 300 atel ya lysate (sambamba na 300 μg ya protini) na anti-Cdk5 antibody (3 μg) mara moja huko 4 ° C ikifuatiwa na incubation zaidi na 25 μl ya Prote. Kupungua kwa buffer ya lysis; Santa Cruz Biotechnology) ya 50 h saa 3 ° C. Kwa ajili ya maandalizi ya immunoprecipitates ya p4, 35 μl ya lysate (sambamba na 500 mg ya protini) ilizikwa na anti-p1 antibody (35 μg) kama ilivyoelezwa hapo juu. Vifungashio vilikuwa vimeoshwa mara mbili na buffer ya lysis na mara mbili na buffer ya kinase inayojumuisha 3 mM Tris · HCl, pH 50 / 7.4 mM MgCl₂/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, imehifadhiwa tena katika 60 μl ya buffer ya kinase. Shughuli ya Kinase ilipimwa kwa kutumia histone H1 kama substrate (18).

Immunohistochemistry. Panya zilishughulikiwa na sindano za ip ya avertin (250 mg / kg, Fluka) na kuchomwa kwa njia ya siri na 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.4, ikifuatiwa na Streck Tissue Fixative (Maabara ya Streck, La Vista, NE), uvumbuzi usio na msingi. Akili zilizotengwa zilibadilishwa zaidi katika marekebisho sawa mara moja kwa 37 ° C. Halafu, akili ziliingizwa kwenye parafini, ikakatwa katika sehemu za coron za 5-μm-nene na ikawekwa kwa immunohistochemistry kwa kutumia mbinu tata ya avidin-biotin-peroxidase (Maabara ya Vector) na diaminobenzidine kama sehemu ndogo. Sehemu hizo zilifanywa na antibody iliyosafishwa ya polyclonal dhidi ya c-fos mara moja katika 4 ° C. Utaalam wa madoa ulitathminiwa kwa kukataliwa kwa antibody ya msingi.

Matokeo

Kizazi cha Transgenic Panya na Neuronal Overexpression ya p35. Transgene iliyotumiwa kupata ongezeko la kujielezea kwa neuroni ya p35 inajumuisha kipenyo cha 6-kb cha jini la panya la P35 iliyokatwa iliyo na mtangazaji wa 1.2-kb na mlolongo mzima wa utengenezaji wa p35 (Mtini. 1 A). Aina ya panya ilidhamiriwa na uchambuzi wa blot Kusini kwa kutumia uchunguzi ambao ulitengenezwa kutofautisha p35 - / - na panya wa Tkup35 na panya wa aina ya porini (Mtini. 1 A na B). Kuchunguza msemo wa transgene chini ya usimamizi wa mtangazaji wa 1.2-kb p35, tulitoa panya za transgenic mara mbili (Tgp35; p35 - / -) ambapo usemi wa p35 uliendeshwa tu kutoka kwa transgene. P35 kujieleza katika Tkup35; p35 - / - panya ilizingatiwa tu kwenye ubongo (Mtini. 1C), ambapo muundo wa spatial expression ulikuwa sawa na ule wa panya wa aina ya mwituni (Mtini. 1D). Ukosefu wa p35 umeonyeshwa kusababisha muundo usiokuwa wa kawaida katika kortini ya kizazi na hippocampus ya panya (10). Walakini, panya ya Tkup35; p35 - / - - ilionyesha uokoaji kamili wa p35 - / - - phenotype ya ubongo (Mtini. 1E). Takwimu hizi zilionyesha kuwa mtangazaji wa 1.2-kb p35 alidhibiti usemi wa transgene na maelezo mafupi ya kujieleza na ile ya p35 kutoka gene endo native p35.

Kiwango cha proteni cha P35 Ni Kiwango cha Kuwekeza kwa Udhibiti wa Shughuli ya Cdk5. Tulichunguza athari za jeni-kipimo cha aina ya encoding p35 na Cdk5 juu ya usemi wa protini katika dondoo za nje kutoka p35 - / -, p35 +/-, aina ya porini, Tgp35, Cdk5 +/--, na TgCNk5 ya miezi. Viwango vya proteni ya p3 na Cdk35 vilivyoingiliana vyema na kipimo cha jeni, kwa mtiririko huo (Mtini. 2 A na B). Panya ya Tgp35 ilionyesha ongezeko la ≈1.6-mara katika kiwango cha proteni ya P35 ikilinganishwa na panya wa aina ya mwituni, wakati viwango vya proteni ya Cdk5 havikufadhiliwa na viwango tofauti vya proteni ya P35. Panya ya TgCdk5 ilionyesha ongezeko la ≈1.9-mara katika kiwango cha protini ya Cdk5 ikilinganishwa na panya wa aina ya mwituni, wakati viwango vya proteni vya P35 havikuweza kufikiwa na viwango tofauti vya proteni ya Cdk5. Kuchunguza athari za kiwango tofauti cha proteni ya p35 kwenye shughuli za Cdk5, Cdk5 ilitolewa kutoka kwa dondoo za anti-Cdk5 na shughuli za kinase zilipimwa. Vivyo hivyo, kukagua athari za viwango tofauti vya protini ya Cdk5 kwenye shughuli za kinase, p35 ilitolewa kwa dondoo kutoka kwa dondoo za anti-p35, na shughuli ya kinase ilipimwa. Shughuli ya Cdk5 imeunganishwa vizuri na kiwango cha proteni ya P35 lakini sio na kiwango cha protini ya Cdk5 (Mtini. 2 C na D). Matokeo haya yalionyesha kuwa kiasi cha proteni ya P35 ni kiwango cha kupunguza kiwango cha shughuli za Cdk5. Kwa hivyo tulitumia panya za Tgp35 kuchunguza athari za kuongezeka kwa shughuli za Cdk5 kwenye saini ya dopamine ya driati.

  

Mtini. 2.

Usimamizi wa shughuli za Cdk5 ni mdogo kwa kiwango cha proteni cha P35. (A) Blots za Magharibi zinazoonyesha kuwa kiwango cha protini cha p35 na Cdk5 kiunga na kipimo cha jeni cha p35 na jenasi la Cdk5, mtawaliwa. (B) Viwango vya jamaa vya p35 au proteni ya Cdk5 ...

Phosphorylation iliyosababishwa na Cocaine-DNPP-32 huko Thr-34 Imepatikana katika Panya la Tgp35. Kazi ya DARPP-32 inategemea hali yake ya phosphorylation kwenye tovuti nyingi (20). PKA phosphorylates DARPP-32 kwa Thr-34, wakati Cdk5 phosphorylates DARPP-32 katika Thr-75. Kwa hivyo, tulichunguza hali ya fosforasi ya DARPP-32 katika dondoo za nje kutoka kwa aina-mwitu na panya za Tgp35. Kiwango cha phospho-Thr-75 DARPP-32 kilikuwa cha juu zaidi katika panya za Tgp35 (Mtini. 3A; 1.6 ± 0.2-mara juu ya thamani ya panya wa aina-mwitu). Tulipima tena athari za shughuli za Cdk5 kuongezeka kwa ishara dopamine. Tulichunguza uanzishaji wa PKA iliyosababisha cococaine kwenye panya ya Tgp35 kwa kuchambua hali ya phosphorylation ya DARPP-32 huko Thr-34. Kiwango cha phospho-Thr-34 DARPP-32 kiliongezeka katika panya aina ya panya 15 min baada ya sindano ya cocaine (Mtini. 3B; 1.8 ± 0.2-mara juu ya kiwango cha basal). Walakini, athari ya kokeini kwenye fosforasi ya Thr-34 ya DARPP-32 ilipatikana katika panya wa Tgp35 (1.2 ± 0.3-mara juu ya kiwango cha basal). Matokeo haya yalionyesha kuwa ongezeko la shughuli za Cdk5 lilisababisha uanzishaji wa PKA iliyosababisha cococaine labda kupitia fomphorylation ya DARPP-32 huko Thr-75 (6, 12). Inawezekana pia kuwa ongezeko la shughuli za presynaptic Cdk5 husababisha kupungua kwa kutolewa kwa dopamine, na kwamba hii inachangia athari iliyopunguzwa ya cocaine. Kwa kweli, sindano moja ya cocaine haikuathiri viwango vya proteni ya p35 na Cdk5 na shughuli za kinase (Mtini. 3 C na D). Hii ni tofauti na utafiti uliopita ambao mfiduo wa kocaine umeonyeshwa kudhibiti hali ya p35 na Cdk5 (6).

  

Mtini. 3.

Usimamizi wa shughuli za Cdk5 huongeza kiwango cha phospho-Thr-75 DARPP-32 na hupata uanzishaji wa PKA ya cocaine-ikiwa. (A) Immunoblot inayoonyesha kuongezeka kwa phosphorylation ya DARPP-32 kwa Thr-75 (P-D32 Thr-75) katika dondoo za panya kutoka kwa panya ya Tgp35. Katika ...

Usimamizi-juu wa Shughuli ya Cdk5 Inasababisha Uanzishaji wa Cocaine-Iliyochochea ya ERK1 / 2. Ushuhuda wa hivi karibuni unaonyesha kuwa uanzishaji wa dopamine receptor kwenye striatum pia huamsha kasino zingine za ishara, pamoja na njia ya ERK (21, 22), ambayo ina jukumu muhimu katika majibu ya tabia kwa cocaine (23). Kwa hivyo tulichunguza ikiwa shughuli za Cdk5 zinaweza kuathiri uanzishaji wa cococaine ya njia ya ERK. Uanzishaji wa njia ya ERK ulizingatiwa baada ya sindano ya cocaine katika dondoo za panya kutoka kwa panya wa aina ya mwituni, kama inavyoonekana kwa kuongezeka kwa fosforisi ya MEK1 / 2 kwa Ser-217 na Ser-221 (1.5 ± 0.2-mara juu ya kiwango cha basal) na ya ERK1 / 2 saa Thr-202 na Tyr-204 (phosphorylation ya ERK2: 1.5 ± 0.2-mara juu ya kiwango cha basal) (Mtini. 4 A na B). Walakini, uanzishaji wa cococaine-ikiwa ya MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2-mara juu ya kiwango cha basal) na ya ERK1 / 2 (phosphorylation ya ERK2: kiwango cha 1.2 was 0.2-mara juu ya kiwango cha basal)Mtini. 4 A na B). Kwa kuongezea, viwango vya chini vya phospho-ERK1 / 2 vilikuwa vya chini katika panya za Tkup35 (0.8 ± 0.2-mara chini ya thamani ya panya wa aina ya mwituni), wakati hali hii haikuwa muhimu kihesabu. Matokeo haya ya mwisho yanaweza kuhusishwa na fosforasi ya utegemezi wa Cdk5 ya MEK1 huko Thr-286, na kusababisha kupungua kwa shughuli za uchochezi (24). Ili kutathmini uwezekano huu, tulikagua hali ya fosforasi ya MEK1 huko Thr-286 na tukagundua kuwa viwango vya juu vya phospho-Thr-286 MEK1 vilikuwepo katika dondoo za panya kutoka kwa panya wa Tgp35 (Mtini. 4C; 1.3 ± 0.1-mara juu ya thamani ya panya wa aina-mwitu). Kwa kuongezea, hali ya phosphorylation ya MEK1 huko Thr-286 haibadilishwa na sindano moja ya cocaine, sambamba na kugundua kuwa shughuli ya Cdk5 haikuathiriwa na matibabu (Mtini. 3D).

  

Mtini. 4.

Cdk5-mediated kizuizi cha MEK1 / 2 husababisha kupatikana kwa uanzishaji wa cococaine iliyosababisha ERK1 / 2. Vipimo vya dari vilitayarishwa kutoka kwa aina ya pori-mwitu (WT) na pine ya 35 pini ya 15 baada ya sindano ya cocaine au saline na kutolewa kwa chanjo. ...

Kueneza Dalili za Dopamine kwa Nuklia Imependekezwa na Shughuli Kuongezeka kwa Cdk5. Cocaine iliyosababishwa na coconine iliyosababisha kasino nyingi zinazojumuisha PKA na ERK husababisha uanzishaji wa baadaye wa kitu cha CREB kwenye kiini kupitia fosforasi yake huko Ser-133 (22, 25). Kuchunguza ikiwa athari ya kinga ya Cdk5-Mediated in PITA na kasinon uanzishaji wa ERK inaweza kuibuka kwenye fosforasi ya CREB kwenye kiini, tulichunguza hali ya fosforasi ya CREB huko Ser-133 katika duru za nje kutoka kwa aina ya pori na panya za Tgp35. Kiwango cha msingi cha phospho-CREB kilikuwa cha chini katika panya za Tgp35 (0.7 ± 0.1-mara ya thamani ya panya wa aina ya mwitu) (Mtini. 5). Kujibu kwa sindano ya cocaine, kiwango cha phospho-CREB kiliongezeka kwenye safu ya panya wa aina ya mwituni (1.5 ± 0.1-mara juu ya kiwango cha basal), lakini jibu hili kwa cocaine liligunduliwa katika panya za Tgp35 (1.2 ± 0.1- mara juu ya kiwango cha basal) (Mtini. 5).

  

Mtini. 5.

Usimamizi wa shughuli za Cdk5 husababisha kupungua kwa fosforasi ya CREB huko Ser-133 katika panya na sindano ya saline au cocaine. Dondoo za dari zilitayarishwa kutoka kwa aina ya pori-mwitu (WT) na Tgp35 panya 30 baada ya sindano na kufungwa kwa chanjo. ...

Phosphorylation ya CREB huko Ser-133 inazidisha shughuli zake za maandishi kupitia kifaa cha kujibu cAMP katika mkoa wa kukuza wa jenasi fulani, pamoja na jeni la c-fos (26). Kwa hivyo tulichunguza uingizwaji wa c-fos katika hali ya aina ya pori na panya za Tgp35 baada ya sindano ya cocaine. Katika panya wa aina ya mwituni, kiwango cha c-fos mRNA kiliongezeka hadi kiwango cha kilele (1.8 ± 0.2-mara juu ya kiwango cha basal) Dakika ya 30 baada ya sindano ya cocaine, na baadaye akarudi katika kiwango cha chini na dakika ya 120 baada ya sindano (Mtini. 6 A na B). Walakini, viwango vya c-fos mRNA vilikuwa ≈30% chini katika Panya ya Tgp35 kuliko kwenye panya wa aina ya mwituni hadi dakika ya 30 baada ya sindano (Mtini. 6 A na B). Uingizaji mdogo wa c-fos katika panya ya Tgp35 uliboreshwa zaidi na immunohistochemistry (Mtini. 6 C-F). Utawala wa Cocaine iliongezea kinga ya c-fos, kwa nguvu katika sehemu za dorsomedial-dorsocentral na dhaifu katika sehemu za nyuma, katika aina za porini na panya za Tgp35. Walakini, kuongezeka kwa seli ya cocaine iliyochochea idadi ya seli za c-fos-immunopositive ilifanikiwa haswa katika hali ya panya ya Tgp35 (Mtini. 6G). Kwa pamoja, matokeo haya yalionyesha kuwa kuimarishwa kwa kokeini iliyoingiliana na dopamine ya dalili kwenye kiini kilizuiwa katika panya za Tgp35, matokeo uwezekano wa shughuli ya Cdk5 iliyoongezeka.

  

Mtini. 6.

Utaratibu wa juu wa shughuli za Cdk5 husababisha kupungua kwa usemi wa c-fos wa striatal na uingizwaji wake mdogo baada ya utawala wa cocaine. (A) Mbegu ya kaskazini inayoonyesha kozi ya wakati wa kujumlisha c-fos katika aina ya porini (WT) na panya wa Tgp35 (Tg) baada ya sindano ya cocaine. ...

Majadiliano

Cdk5 na mwanaharakati wake p35 wametambuliwa kama aina ya shabaha ambayo husimamiwa na mfiduo sugu wa cocaine (6). Tunaripoti hapa udhibitisho ulioongeza shughuli za Cdk5, kama matokeo ya usanifu wa p35 badala ya kanuni ya juu ya Cdk5, husababisha kupokelewa kwa dopamine ya cocaine-mediated dopamine katika neurons za striatal. Kuchunguza matokeo ya usemi uliyodhibitiwa wa Cdk5 au p35 juu ya ishara dopamini ya driamini, mistari miwili ya panya wa kupinduka, TgCdk5 na Tgp35 panya, zilichambuliwa. Tuligundua kuwa shughuli ya Cdk5 ilisimamiwa kwa kiwango cha kuongezeka kwa proteni ya P35 lakini haikuathiriwa na kiwango cha proteni ya Cdk5. Ripoti yetu ya zamani pia imeonyesha kuwa shughuli za Cdk5 katika ubongo wa panya wa TgCdk5 zilikuwa chini kuliko kwenye ubongo wa aina ya panya wakati shughuli hiyo ilipimwa kwa kutumia immunoprecipitates ya Cdk5 (17), kupendekeza kuwa Cdk5 overexpression inaleta kiwango cha kuongezeka cha monomeric Cdk5 ikiwa kiwango cha p35 haikuongezeka. Matokeo haya yalionyesha kuwa kiwango cha proteni ya P35 ni kiwango cha kupunguza kiwango cha shughuli za Cdk5.

Panya ya Tgp35 ilionyesha uhamishaji mdogo wa phosphorylation ya CREB na c-fos kwenye striatum baada ya sindano ya papo hapo ya cocaine, ikionyesha kuwa majibu ya dhabiti kwa cocaine yalizuiliwa na shughuli za Cdk5 zilizopita. Mkutano wa ishara ya dopamine ya kokeini iliyoingiliana na panya katika Tkup35 pengine iliweza kupatikana kupitia kizuizi cha kati cha Cdk5 cha kasino nyingi za saini zinazohusisha DARPP-32, PKA, na ERK. Utawala wa Cocaine uliongeza fosforasi ya PKA ya DARPP-32 huko Thr-34 katika panya wa aina ya mwituni, jibu hili lilipopatikana kwenye panya za Tgp35. Phosphorylation ya PKA ya DARPP-32 katika Thr-34 imeonyeshwa kuzuia shughuli za proteni phosphatase 1 (PP1), enzyme inayohusika na dephosphorylation ya Ser-133 ya CREB (27). Kwa hivyo, shughuli ya PP1 isingeweza kushughulikiwa kupitia njia ya DARPP-32 / PP1 katika panya za Tkup35.

Uanzishaji wa cocaine iliyosababishwa na ERK1 / 2 pia uliwekwa katika panya za Tgp35. Kuna mifumo kadhaa tofauti ambayo Cdk5 inaweza kuzuia uanzishaji wa cococaine ya ERK1 / 2. Kwanza, phosphorylation inayotegemea Cdk5 ya DARPP-32 kwa Thr-75 inaweza kuzuia PKA, na kusababisha kizuizi chochote cha PKA-mediated MEK1 / 2 kinachohitajika kwa uanzishaji wa ERK1 / 2. Utafiti wa hivi karibuni pia umegundua kuwa fosforasi ya DARPP-32 huko Thr-34 inahitajika kwa uanzishaji wa kokaini wa ERK1 / 2 na njia nyingi zinazohusisha uelekezaji wa moja kwa moja wa uanzishaji wa MEK na pia kuhusisha udhibiti wa phosphatase iliyoimarishwa. phosphatase ambayo hufanya moja kwa moja kwenye ERK1 / 2 (28). Msaada wa uwezekano huu unashauriwa na kugundua kuwa fosforasi ya cocaine iliyosababisha cocaine ya MEK1 / 2 huko Ser-217 na Ser-221 ilimalizwa katika panya za Tgp35. Njia nyingine inayowezekana ni kupitia fomati inayotegemea Cdk5 ya MEK1 huko Thr-286, ambayo inaweza kusababisha kupungua kwa shughuli zake za uchochezi na kusababisha kizuizi cha shughuli za ERK1 / 2 (24).

Uzuiaji wa shughuli za Cdk5 kwenye striatum umeonyeshwa athari za tabia za matibabu ya cocaine sugu katika wanyama (6). Sanjari na dhana kuwa upitishaji wa shughuli za Cdk5 unaweza kuchangia kwa urekebishaji wa neva kwa kupingana na athari za utawala wa mara kwa mara wa cocaine (6), tuligundua kuwa fomati ya Cdk5-iliyobadilishwa ya DARPP-32 na MEK1 ilichangia usanidi wa uanzishaji wa cococaine wa ERK1 / 2, na kusababisha uchochezi mdogo wa phosphorylation ya CREB na c-fos katika striatum. Matokeo yetu yanaunga mkono wazo ambalo liliongezea shughuli za Cdk5, kama matokeo ya kanuni ya juu ya p35, inaweza kubadilisha usemi wa jeni kwenye striatum baada ya kudhihirisha sugu ya cocaine. Hii inaweza kutokea kupitia mabadiliko katika shughuli za vitu vya uandishi kama CREB na c-fos. Kwa hivyo, manzishaji wa Cdk5 activator p35, kutokana na athari zake za kupunguza kiwango cha shughuli za Cdk5, inaweza kuchangia mabadiliko ya kudumu ya kazi ya neuronal ya msingi wa ulevi wa cocaine.

Shukrani

Vidokezo

Marejeo