PSMC5, ATTase ya Proteasomal ya 19S, Inatawala Hatua za Cocaine katika Nucleus Accumbens (2015)

takwimu

 

  

Citation: Ahnishi YH, Ohnishi YN, Nakamura T, Ohno M, Kennedy PJ, Yasuyuki O, et al. (2015) PSMC5, XPUMXS Proteasomal ATPase, inasimamia Kitendo cha Cocaine katika Nambari za Nuksi. PLoS ONE 19 (10): e5. Doi: 0126710 / journal.pone.10.1371

Mhariri wa kitaaluma: James Edgar McCutcheon, Chuo Kikuu cha Leicester, JAMHURI YA UNITED

Imepokea: Desemba 10, 2014; Imekubaliwa: Aprili 7, 2015; Published: Huenda 11, 2015

Copyright: © 2015 Ohnishi et al. Hii ni nakala ya ufikiaji wazi iliyosambazwa chini ya masharti ya License ya Attribution Attribution, ambayo inaruhusu matumizi yasiyozuiliwa, usambazaji, na uzazi kwa kila aina, ikitoa mwandishi na chanzo cha awali ni sifa

Upatikanaji wa Data: Takwimu zote muhimu ziko ndani ya karatasi.

Fedha: Kazi hii iliungwa mkono na ruzuku kutoka kwa Taasisi za Kitaifa za Kiafya, Taasisi ya Kitaifa ya Dawa ya Dawa, na Ishibashi Foundation na Jumuiya ya Kijapani ya kukuza Sayansi (nambari za KAKENHI: 24591735, 26290064, 25116010). Wafadhili hawakuwa na jukumu katika muundo wa masomo, ukusanyaji wa data na uchambuzi, uamuzi wa kuchapisha, au utayarishaji wa maandishi.

Maslahi ya kushindana: Waandishi wametangaza kwamba hakuna maslahi ya mashindano yanayopo.

kuanzishwa

ΔFosB, bidhaa iliyopunguzwa ya FosB jeni, ni ya familia ya Fos ya sababu za uandishi, ambayo pia ni pamoja na c-Fos, FosB ya urefu kamili, Fra-1, na Fra-2. ΔFosB, kama proteni zingine za Fos, heterodimerize na protini ya familia ya Jun-c-Jun, JunB, au JunD-kutengeneza muundo wa uandishi wa AP-1 (activator protein-1), ambao huchochea au kurudisha nyuma usemi wa jeni maalum. [1,2].

ΔFosB imeonyeshwa kuchukua jukumu muhimu katika madawa ya kulevya [2]. Hasa kati ya protini za kifamilia za Fos, hujilimbikiza katika seli za nukta (NAc) na mikoa mingine inayohusiana na thawabu ya ubongo baada ya usimamizi wa mara kwa mara wa dawa za kulevya kwa sababu ya kiwango chake cha juu cha utulivu [3,4], ambayo inaingiliana na ukosefu wa vikoa vya uharibifu wa C-na na fosforisi na protini kadhaa za [5-7]. Induction kama hiyo ya ΔFosB katika upatanishi wa NAc iliongezea majibu ya kitabia kwa dawa za kulevya. Kwa hivyo, utaftaji mwingi wa ΔFosB katika eneo hili la ubongo wa wanyama wazima, ama kwa kutumia veti za virusi au panya wa busara usio na kipimo, huongeza usikivu wa mnyama kwa athari za kuchochea na za malipo ya cocaine na opaates pamoja na msukumo wa mnyama kujisimamia. cocaine [7-11]. Kinyume chake, utaftaji mkubwa wa wapinzani hasi wa ΔFosB husababisha tabia tofauti za tabia [10-12].

Sisi na wengine hapo awali tumethibitisha, kwa kutumia uozo wa kuhama kwa gel, kwamba JunD na labda protini zingine za familia ya Jun ndio washirika wakuu wa ΔFosB kwenye ubongo katika vivo [13-15]. Walakini, hadi sasa, hakujawa na tathmini iliyofunguliwa, isiyo ya wazi ya washirika wa ΔFosB katika ubongo. Hapa, tulitafuta kubaini washirika wa riwaya wa forFosB kwa kutumia chachu ya aina mbili ya mseto [16,17]. Takwimu yetu ilifunua kuwa PSMC5, pia inajulikana kama SUG1, ni mshirika hodari wa ΔFosB wote katika vitro na katika NAc katika vivo, ambapo hujiunga na ΔFosB kama sehemu ya uanzishaji wa uandishi wa cocaine-ikiwa, ambayo pia ina CBP (CREB binding proteni ) na p300 - zote mbili za histone acetyltransferases (HATs) na vile vile BRG1 (proteni ya kurekebisha chromatin). Tunaendelea kuonyesha kuwa udhihirisho sugu wa kokeni hubadilisha viwango vya nyuklia ya PSMC5, kitengo cha ATPase kilicho na tata ya proteni ya 19S, katika NAc na kwamba PSMC5 inadhibiti majibu ya tabia kwa cocaine.

Nyenzo na mbinu

Uchunguzi wa chachu ya mseto mbili

Seli za chachu ya MaV203 (Teknolojia ya Maisha ya Invitrogen) zilihamishwa pamoja na pDBLeu ikiongoza vipande tofauti vya protini ya ΔFosB, na maktaba ya ubongo ya panya ilitumbuliwa katika pPC86 (Attitrogen Life Technologies). Seli zilizobadilishwa zilikuzwa kwenye leucine isiyo na kati, tryptophan, na histidine, na iliyo na 10 mM ya 3-aminotriazole. Kufunga kati ya vipande vya FosB na mshirika wa mgombea hujumuisha aina tatu za mwandishi (His3, Ura3, na LacZ), na uingizwaji hufanya waongofu kuweza kuishi chini ya hali ya ibada inayotumika. Mazungumzo mazuri yalibadilishwa na vipande mpya vya pDBLeu-ΔFosB na urejeshaji wa upya kwenye seli za MaV203.

Mistari ya seli

Mouse Neuro 2A seli za neuroblastoma (ATCC) zilihifadhiwa katika kiwango cha chini cha muhimu cha Eagle (EMEM) (ATCC), ikiongezewa na 10% ya seramu ya nguruwe ya fetusi (FBS) kwa 37 ° C na 5% CO₂. Seli za Panya 1A zilikuwa zawadi kutoka kwa Yusaku Nakabeppu (Fukuoka, Japan) [18] na kudumishwa katika DEMU ya Dulbecco MEM (DMEM) (Maisha Teknolojia), iliyoongezewa na 10% FBS kwa 37 ° C na 5% CO₂. Uhamishaji wa seli zilizo na DNA ya plasmid ulitekelezwa kwa kutumia Athari za athari (Qiagen) kulingana na maagizo ya mtengenezaji.

PSMC5 na ΔFosB huunda

Aina kadhaa za mabadiliko za PSMC5, kila alama ya FLAG kwa N-terminus yao, ilitolewa kwa matumizi ya chanjo au majaribio ya uhamishaji wa jeni yaliyosababishwa na virusi. Hizi ni pamoja na: PSMC5-K196M, PSMC5-Δcoiled-coil domain (PSMC5-ΔCC, ukosefu wa amino asidi 27-68), PSMC5-NT (inayojumuisha sehemu ya N-terminal ya proteni, amino acid na CNXXNXXNXNXX na 1 na XNUMNNXXNXX na 151NXX. -C (inayojumuisha kipande cha protini C-terminal, protini za 5 amino) (ona Mtini 1). Tulitumia pia aina za N-terminal MYC-tagged za porini ΔFosB na pia ΔFosB na mabadiliko katika uwanja wake wa leucine-zipper (mabadiliko ya amino asidi 182 hadi 205 ambayo inajulikana kwa kupunguza heterodimerization na proteni za familia za Jun [6].

Shusha: 

• Ppt

  Slide ya PowerPoint

• PNG

  picha kubwa (742KB)

• TIFF

  picha ya awali (1.13MB)

Kielelezo 1. ΔFosB inafungwa kwa PSMC5 katika vitro.

 

A. Schematic ya ΔFosB, ΔFosB-LZM ambayo kikoa cha leucine zipper kilirekebishwa ili kuondoa heFosB heterodimerization na protini za Jun, na Δ2ΔFosB ambayo haina asidi ya kwanza ya 78 ya ofFosB N-terminus. B. Schematic ya PSMC5, PSMC5-NT ambayo inajumuisha asidi ya amni ya 151 ya kwanza ya PSMC5, PSMC5-CT ambayo haina asidi ya kwanza ya amino ya 235 ya PSMC5, na PSMC5-ΔCC ambayo iko chini ya co -XNNXXNNX2868. . Kikoa cha AAA kinalingana na motif, ATPases Zinazoshirikiana na Shuguli anuwai za mkononi, zilizopo katika ATPases nyingi. C. 2.4 μg ya pcDNA3.1-ΔFosB (vichochoro 1-4) au ΔFosB-LZM (njia ya 5) ilibadilishwa na 2.4 μg ya CRGC tagged PSMC5 au aina tofauti za kuondolewa kwa seli za Neuro2a. Siku mbili baada ya kuhamishwa, seli zilikatwakatwa na kutiwa chanjo ya kuzuia anti-FLAG halafu Magharibi ilifutwa na anti-ΔFosB au anti-FLAG antibody. Kumbuka kuwa ΔFosB, lakini sio ΔFosB-LZM, inafungamana sana na PSMC5 au PSMC5-NT, lakini sio PSMC5-CT au PSMC5-ΔCC. Takwimu zilizoonyeshwa kwenye takwimu zilibadilishwa mara tatu katika kila jaribio tatu tofauti.

toa: 10.1371 / journal.pone.0126710.g001

Wanyama

Panya wa kiume wa XXUMXBL mwenye wiki tisa hadi 11BL / 57J (Maabara ya Jackson) walitumiwa kwa majaribio yote. Wanyama waliwekwa kwenye mzunguko wa-giza wa 6-h na upatikanaji wa chakula na maji ad libitum na walikuwa makazi ya 1 wiki kabla ya majaribio. Regimens mbili za matibabu ya cocaine zilitumiwa. Kusoma athari za biochemical za cocaine, wanyama walipewa kipimo cha kila siku cha 7 cha cocaine (20 mg / kg) au saline, na kuuawa kwa utapeli wa 24 hr baada ya sindano ya mwisho. Hii ni itifaki ya hali ya kawaida, ambayo imeonyeshwa kutoa majibu kadhaa ya kimasihi na ya rununu kwa dawa [7]. Ili kusoma ushawishi wa PSMC5 katika mkusanyiko wa majibu ya tabia ya kahawa, tulitumia kipimo cha chini cha dawa (7.5 mg / kg; angalia hisia za Locomotor hapa chini) kwa kuzingatia wazo kwamba PSMC5 ingeongeza, unyeti wa mnyama kwa cocaine [8]. Majaribio yote ya wanyama yalipitishwa na Kamati ya Utunzaji wa wanyama na Matumizi ya Mlima Sinai.

Ukosefu wa kinga na kufutwa kwa Magharibi

Seli za Neuro 2A zilihamishwa na aina ya pori au aina ya mutMPXMUMX. Siku mbili baada ya kuhamishwa, seli zilinaswa katika PBS, zimewekwa katika RIPA buffer (5 mM Tris pH 50, 7.4 mM NaCl, 150 mM EDTA, 1% NP-1, 40% sodium deoxycholate, 0.25 mM sodium in ligate. . Vipuli viligawanywa na kuingizwa na ama nonimmune IgG (Sigma) au antibodies anti-FLAG (Sigma) ya 10 hr saa 3 ° C. Ukosefu wa kinga ulifanywa na shanga za proteni G (Attitrogen) kama ilivyoelezewa [19]. Kwa kifupi, proteni zilizokamatwa zilifanywa na SDS-PAGE na kuchambuliwa na kuzama kwa Magharibi kwa kutumia anti-FosB / ΔFosB (Teknolojia ya Uainishaji wa Kiini) kulingana na itifaki iliyochapishwa [7]. Kwa maana katika vinu vya kufunga proteni ya vivo, tulitumia vipande vya nyuklia vilivyotakaswa kutoka kwa punch-dissected NAc ya panya baada ya matibabu sugu ya cocaine (20 mg / kg IP kila siku kwa siku za 7, na panya zilizotumiwa 24 hr baada ya sindano ya mwisho). Ukosefu wa ushirikiano kutoka kwa vipande vya nyuklia ulifanywa kwa kutumia kifaa cha IP cha Nyuklia (Active Motif) kufuatia maagizo ya mtengenezaji. Antibodies zifuatazo zilitumika: MYC au ß-actin, Teknolojia ya Kuashiria Saini (Danvers, MA), PSMC5 na histone H3, Abcam (Cambridge, MA), CBP, p300 na BRG1, Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), na FLAG M2, Sigma.

Immunohistochemistry

Immunohistochemistry ilifanywa kulingana na taratibu zilizochapishwa [20]. Panya zilishughulikiwa na kutumika kwa fitina hasa na 4% paraformaldehyde katika PBS. Ubongo ulibadilishwa tena na suti ya 30%, na kisha waliohifadhiwa na kuhifadhiwa kwa -80 ° C mpaka utumike. Sehemu za Coronal (40 μm) zilikatwa kwenye cryostat na kusindika kwa immunohistochemistry. Sehemu za kuelea za bure zilikuwa kabla ya kuingizwa kwenye buffer ya kuzuia iliyo na 0.3% Triton na 3% punda ya kawaida ya punda. ΔFosB iligunduliwa kwa kutumia mbuzi polyclonal antibody aliyeinuliwa dhidi ya sehemu ya N-terminal ya proteni (1 / 1000 Santa Cruz Biotechnology). PSMC5 iligunduliwa kwa kutumia sungura polyclonal antibody (1 / 100 Abcam, Cambridge, MA). Picha zilichukuliwa na darubini ya siri (ukuzaji wa 60x; Zeiss).

Uhamasishaji wa locomotor

Panya zote zilipokea sindano za IP za saline za kila siku kwa siku za 3 ili kuzihifadhi kwa dhiki ya sindano. Siku iliyofuata, panya waliingiza IP na saline au kipimo kidogo cha cocaine (7.5 mg / kg; angalia chini ya Wanyama hapo juu) na kuwekwa mara moja kwenye sanduku za riwaya mpya. Shughuli za locomotor ya panya zilirekodiwa kwa kutumia mfumo wa picha kama mpango wa kuvunja boriti kwa dakika ya 30. Matibabu haya yalirudiwa kila siku kwa siku za 3.

Uhamisho wa jeni wa virusi

Tulitumia njia zilizochapishwa sana kwa uhamishaji wa jeni-ulio kati ya jeni [7,8,11,19]. Kwa kifupi, plasmids ya kujieleza kwa PSMC5 au kwa mabadiliko kadhaa ya muundo wake (angalia PSMC5 na ΔFosB huunda hapo juu) iliangushwa kwenye bicistronic p1005 (+) HSV plasmid inayoelezea GFP chini ya usimamizi wa mtangazaji wa CMV, na PSMC5 au mutants ya hiyo chini ya hiyo mutants ya hiyo chini ya mabadiliko hayo. Mtangazaji wa IE4 / 5. Chini ya ketamine (100 mg / kg) / xylazine (10 mg / kg) anesthesia, panya ziliwekwa katika chombo kidogo cha stereota-mnyama, na uso wa cranial ulifunuliwa. Sindano thelathini na tatu za sindano zilitumika kuingiza 0.5 μl ya veta ya HSV ndani ya NAc kwa pembe ya 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV -4.4) kwa kiwango cha 0.1 μl / min. Wanyama wanaopokea sindano za HSV waliruhusiwa kupona kwa siku za 2 kufuatia upasuaji kabla ya majaribio.

Takwimu

ANOVA na vipimo vya mwanafunzi t zilitumika, kusahihishwa kwa kulinganisha nyingi, na umuhimu uliowekwa kwenye p <0.05.

Matokeo

PSMC5: Mshirika wa riwaya anayefunga ΔFosB

Tulifanya majaribio ya awali kubaini kipenyo sahihi cha osFosB ambacho kilifanya kazi kama bait katika chachu ya aina mbili ya mseto bila kuhuisha mfumo. Holo-ΔFosB ilisababisha shughuli ya jeni ya mwandishi peke yake, kama ilivyokuwa sehemu ya N-terminal 1-78 amino acid ya proteni. Walakini, N-terminal ilisababisha ΔFosB (Kielelezo 1A), inayoitwa Δ2ΔFosB, ambayo haina asidi ya kwanza ya protini za 78, haikuwa na athari hii. Kwa hivyo, tulitumia Δ2ΔFosB kama protini ya bait.

Kuangalia kwa washirika wanaoweza kumfunga, tulitumia maktaba ya ubongo wa panya iliyowekwa kwenye pPC86. Tuligundua wagombea wa 11 kwa washirika wanaofunga Ingawa protini hizi zilijumuisha washirika wa ΔFosB wanaojulikana wa heterodimerization, c-Jun na JunD (Meza 1), mgombeaji aliyeenea zaidi kwa sasa alikuwa PSMC5. Wakati ilikuwa ya kushangaza, hii ilikuwa ni ya kuvutia kupata, kwani PSMC5 ilionyeshwa katika ripoti moja miaka kadhaa iliyopita kuungana na c-Fos in vitro [21]. Walakini, hakuna ripoti za awali za kuhusika kwa PSMC5 katika hatua ya cocaine. Walakini, kwa sababu ya nguvu ya ishara ya PSMC5 katika chachu ya aina mbili ya mseto, tumepanga kusoma zaidi mwingiliano unaowezekana wa ΔFosB-PSMC5.

Shusha: 

• Ppt

  Slide ya PowerPoint

• PNG

  picha kubwa (60KB)

• TIFF

  picha ya awali (320KB)

Jedwali 1. Matokeo ya Uchunguzi wa Chachu ya Mbili na Mafuta ya Δ2ΔFosB.

toa: 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

Kwanza, ili kudhibitisha mwingiliano wa mwili kati ya ΔFosB na PSMC5, tulifanya majaribio ya vitro co-immunoprecipitation. Tuligundua hiyo kuwa na tagi ya tagi ya tagi ya CRAGCMNXXUMUMX (Kielelezo 1B), kuhamishiwa kwa seli za Neuro 2A, zilizowekwa vizuri ΔFosB (Kielelezo 1C). Pili, kubaini mkoa katika PSMC5 ambayo inawajibika kwa ΔFosB, tulitengeneza mabadiliko kadhaa ya tag ya PSAGCNNXX (Kielelezo 1B) na kurudia majaribio ya ushirikiano. ΔFosB ilishushwa chini na asidi ya amino ya N-terminal 151 ya PSMC5 (PSMC5-NT), lakini sio na kipenyo cha C-terminal 172 amino acid ya proteni (PSMC5-CT) (Kielelezo 1C). PSMC5 kukosa uwanja wake wa coil ulioandaliwa (PSMC5-ΔCC) pia haikufanikiwa katika kuagiza ΔFosB. Matokeo haya yanaonyesha kuwa PSMC5 inamfunga ΔFosB kupitia kikoa chake coil (amino asidi 27-68). Kwa kuongezea, CRG-tagged PSMC5 haikuhakikisha aina ya mutant ya ΔFosB na kikoa cha leucine zipper kilichobadilishwa (ΔFosB-LZM) (Kielelezo 1C), inayoonyesha kuwa ΔFosB ama inaweza kufunga PSMC5 kupitia kikoa hiki au, uwezekano mkubwa, kwamba heFosB heterodimerization inahitajika kwa PSMC5 binding.

PSMC5-ΔFosB inayofunga katika NAc baada ya usimamizi sugu wa cocaine

Kulingana na matokeo haya katika vitro, tulisoma ikiwa viwango vya PSMC5 katika NAc vinabadilishwa ili kujibu usimamizi sugu wa cocaine. Tuligundua kwa kugawanyika kwa sehemu ndogo na blotting ya Magharibi kwamba cocaine sugu huongeza viwango vya nyuklia vya PSMC5 katika mkoa huu wa ubongo bila mabadiliko katika viwango vya cytoplasmic (Kielelezo 2A). Athari hii haikuonekana baada ya kipimo kikuu cha cocaine (data haijaonyeshwa). Tulichunguza ujanibishaji wa PSMC5 na ΔFosB katika NAc na microscopy ya siri. Tulichambua panya 24 hr baada ya kipimo kikuu cha kurudia cha cocaine, wakati ambao ΔFosB ndio pekee inayoweza kugundulika FosB bidhaa ya jeni (tazama Nestler 2008). Tulipata chanjo ya nguvu ya PSMC5 katika NAc, pamoja na ishara kali ya nyuklia. ~ 85% ya ΔFosB + kiini kilichowekwa ndani ya PSMC5 (Kielelezo 2B). Kwa kuongezea, tulifanya majaribio ya ushirikiano wa chanjo ya ugumbaji juu ya dondoo za NAc na tukagundua kuwa, baada ya matibabu sugu ya cocaine, wasFosB ilirushwa chini na anti-PSMC5 antibody (Kielelezo 2C). Kwa kulinganisha, uchambuzi wa dawa ya na NAve NAc (baada ya sindano za saline zilizorudiwa) ilifunua ΔFosB haiwezi kugundua (data haijaonyeshwa). Hizi data ni sawa na matokeo yetu katika tamaduni ya seli na inathibitisha kwamba ΔFosB na PSMC5 inaingiliana katika NAc katika vivo.

Shusha: 

• Ppt

  Slide ya PowerPoint

• PNG

  picha kubwa (1.02MB)

• TIFF

  picha ya awali (1.31MB)

Kielelezo 2. Usaidizi wa PSMC5 katika panya NAc.

 

A. Uzuiaji wa Magharibi wa visehemu vya nyuklia na saitosoli ya NAc ya panya wanaotibiwa kila siku na chumvi au kokeni (20 mg / kg) kwa siku 7, na wanyama wamechambuliwa saa 24 baada ya sindano ya mwisho. Cocaine huongeza nyuklia lakini sio viwango vya cytosolic ya PSMC5. Historia H3 na ß-actin, ambazo hazijaathiriwa na kokeni, zilitumika kama udhibiti wa upakiaji. Takwimu ni za maana ± SEM (n = 8-10 / kikundi, * p <0.05). B. Ushirikiano wa ujanibishaji wa endm asili PSMC5 (kijani kibichi) na ΔFosB (samawati) katika NAc ya panya waliotibiwa sugu na cocaine kama katika lysates za Nyuklia za AC baada ya matibabu sugu ya kokeni yalifanywa kinga ya mwili na anti-PSMC5 antibody au IgG ya panya kama udhibiti , na kisha Magharibi ilifutwa na anti-FosB / ΔFosB antibody. Takwimu inaonyesha mwingiliano wa PSMC5-ΔFosB katika NAc katika vivo. Takwimu katika B na C ziliigwa mara tatu katika kila jaribio tatu tofauti.

toa: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5 huongeza expressionFosB kujieleza katika vitro

Kwa kuwa PSMC5 ni mwanachama anayejulikana wa tata ya proteni, tulijaribu ikiwa inadhibiti viwango vya ΔFosB kwa kutumia seli za Rat 1A. Utaftaji wa nguvu wa PSMC5 haukuwa na athari yoyote kwa viwango vya msingi vya ΔFosB, lakini ilisababisha ongezeko ndogo lakini muhimu la ujumuishaji wa ΔFosB juu ya kuchochea kwa serum ya seli (Kielelezo 3A). Hali kama hiyo ilionekana kwa FosB ya urefu kamili lakini athari hiyo haikufanikisha umuhimu wa takwimu. Kinyume chake, kukandamiza usemi wa asili wa PSMC5 katika seli za Rat 1A, zilizopatikana kwa matumizi ya siRNA ambazo zinalenga PSMC5, hazikuathiri viwango vya basal ΔFosB lakini zilizuia sana induction ya ΔFosB na kusisimua kwa serum (Kielelezo 3B). Athari sawa zilionekana kwa FosB ya urefu kamili. Takwimu hizi zinaonyesha kwamba PSMC5 haikuza uharibifu wa proteni ya ΔFosB, kwani inaweza kutarajiwa kama kiungo cha msingi cha proteni, lakini badala yake inahitajika kwa mkusanyiko mkubwa wa FosB bidhaa za jeni katika vitro, labda kupitia utulivu wa protini.

Shusha: 

• Ppt

  Slide ya PowerPoint

• PNG

  picha kubwa (605KB)

• TIFF

  picha ya awali (918KB)

Kielelezo 3. Udhibiti wa PSMC5 wa kujieleza kwa FosB / ΔFosB katika seli za Rat 1A.

 

A. Panya 1A seli zilihamishwa na 4 μg ya PSMC5 au kudhibiti DNA. Kuelezea kupita kiasi kwa PSMC5 hakukuwa na athari kwa viwango vya kujielezea vya msingi vya FosB au protini ya osBFosB kama ilivyoamuliwa na blotting ya Magharibi, lakini ilitoa ongezeko dogo lakini kubwa katika kuingizwa kwa osBFosB kwa kusisimua seramu (F (2,21) = 9.75, p = 0.001). B. Panya 1A seli zilihamishwa na 5 pmol ya moja ya siRNA mbili au RNA iliyosumbuliwa (kudhibiti). Zote mbili siRNA zilipungua viwango vya protini vya PSMC5 ikilinganishwa na hali ya kudhibiti (siRNA # 1, 23 ± 5% ya udhibiti; siRNA # 2, 18 ± 6%; p <0.05; n = 4). Kubomolewa kwa PSMC5 hakukuwa na athari kwa viwango vya msingi vya FosB au osBFosB lakini iligundua kuingizwa kwa FosB na ΔFosB kwa kusisimua seramu (FosB: F (2,6) = 20.99, p = 0.002; osBFosB: F (2,6) = 22.83 , p = 0.002).

toa: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

Fomu ya andFosB na PSMC5 na CBP, p300, na BRG1 katika NAc

Kuelewa vyema mifumo ya maandishi ambayo PSMC5 inaweza kushawishi kazi ya ΔFosB, tulichunguza washirika wengine wa ziada wa proteni hizo mbili katika NAc chini ya hali ya kutibu cocaine. Kuna ripoti moja ambayo PSMC5 inamfunga kwa CBP-HAT-na inaongeza historia ya H3 acetylation katika mpandishaji wa proximal wa MHC-seli katika seli za HeLa [22]. Kwa kuongezea, panya ambazo hazina upungufu katika uonyeshaji wa CBP zimepunguza unyeti wa tabia kwa cocaine na pia kupunguzwa kwa historia ya histoni kwenye FosB kukuza [23]. Kwa hivyo tulijaribu ikiwa PSMC5 inaweza kuunganika na ΔFosB kama sehemu ya maeneo ambayo pia yana CBP na labda waanzishaji wengine wa maandishi.

Kwanza tulionyesha kuwa ΔFosB imeondoa vizuri CBP na p300, HAT inayohusiana, katika seli za Neuro2A (Kielelezo 4A). Kinyume chake, aina ya leucine zipper mutant ya ΔFosB, kama inavyotarajiwa, haikuonyesha shughuli hii. Vivyo hivyo, PSMC5 imeondoa vizuri CBP na p300 (Kielelezo 4B). Kwa kufurahisha, athari hii ilionekana pia kwa PSMC5-ΔCC, ambayo haikuvunja ΔFosB, ikionyesha kuwa PSMC5 inaingiliana na CBP na p300 kupitia vikoa vingine vya proteni na kwa uhuru wa kufungwa kwake kwa ΔFosB.

Shusha: 

• Ppt

  Slide ya PowerPoint

• PNG

  picha kubwa (898KB)

• TIFF

  picha ya awali (1.39MB)

Kielelezo 4. ΔFosB na PSMC5 inaingiliana na CBP, p300, na BRG1 katika vitro na katika vivo.

 

Seli za Neuro2A zilihamishwa na 2.4 μg ya CFosB au MYC-tagged ΔFosB-LZM. Vidonge vya seli vilikuwa vimetungwa na anti-CBP au anti-p300 antibody, na precipitates zilifutwa kwa Magharibi na antibody yule yule au anti anti-MYC. Wote wawili wa CBP na p300 huingiliana na ΔFosB na mwingiliano kama huo unahitaji zipper ya leucine isiyofaa. Seli za Neuro2A zilihamishwa na 2.4 μg ya alama ya CRAG-PSMC5 au FLAG-tag ya PSMC5-ΔCC. Vidonge vya seli vilikuwa vimetungwa na anti-CBP au anti-p300 antibody, na precipitates zilifutwa kwa Magharibi na antibody yule yule au anti anti-FLAG. CBP zote mbili na p300 inaingiliana na PSMC5 na mwingiliano kama huu hauitaji kikoa cha CC. C. Vipu vya nyuklia vya panya NAc baada ya matibabu sugu ya cocaine yalifungiwa chanjo na anti-CBP au anti-p300 antibody. Mlipuko wa Magharibi uliofuata wa matokeo yanayosababishwa na anti-FosB / ΔFosB ilionyesha mwingiliano wa asili kati ya ΔFosB na CBP / p300. D. Aliquots ya lysates sawa za nyuklia zilifungwa kwa chanjo na anti-BRG1 au anti-PSMC5 anti-, ikifuatiwa na blotitates ya Magharibi na anti-FosB / ΔFosB au anti-BRG1 anti-. Matokeo yanaonyesha mwingiliano wa asili kati ya ΔFosB na BRG1, na BRG1 na PSMC5. E. Mfano wa kiufundi wa uanzishaji wa maandishi ulioamilishwa wa ΔFosB: JunD heterodimers inayoingiliana na CBP / p300, BRG1, na PSMC5.

toa: 10.1371 / journal.pone.0126710.g004

Ili kudhibitisha kuwa mwingiliano huu pia hufanyika katika vivo, tulidhibiti cocaine mara kwa mara kushawishi ΔFosB na viwango vya nyuklia vya PSMC5, kisha tukachana na dondoo za NAc na antibodies za anti-CBP au anti-p300. Sanjari na data ya utamaduni wa seli yetu, chanjo ya CBP au p300 imeondoa ΔFosB vizuri (Kielelezo 4C). Tulijaribu ikiwa BRG1, suluhisho la msingi la sWI-SNF chromatin tata, inaweza pia kuunganika kwa ΔFosB na PSMC5, kulingana na ugunduzi wetu wa mapema kwamba BRG1 imeandikishwa kwa aina fulani ya ΔFosB katika tamasha na uanzishaji wao katika NAc baada ya cocaine sugu [24]. Tuligundua kuwa chanjo ya BRG1 ilishusha ΔFosB katika dondoo za NAc, na kwamba chanjo ya PSMC5 vivyo hivyo ilichapisha BRG1 ya zamani.Kielelezo 4D). Ikizingatiwa, matokeo haya yanaonyesha kwamba ΔFosB-PSMC5 fomu tata katika NAc ambayo pia ni pamoja na CBP / p300 na BRG1 (Kielelezo 4E).

Ufuatiliaji wa hali ya juu wa PSMC5 huongeza majibu ya eneo kwa cocaine

Ufungaji maarufu wa PSMC5 na ΔFosB katika NAc ulitusababisha tuchunguze ikiwa kuongeza viwango vya PSMC5 katika mkoa huu wa ubongo vinasimamia majibu ya tabia kwa cocaine. Tulizalisha vepta ya Herpes Simplex Virus (HSV) ambayo inazidisha zaidi au ya porini PSMC5 au mojawapo ya vyanzo vyake na kuhakikishia vectors katika NAc katika vivo (Kielelezo 5A). Maoni ya upatanishi wa virusi ya predominates ya PSMC5 kwenye kiini cha seli (Kielelezo 5B). Panya overexpressing aina ya porini ya PSMC5 haikuonyesha majibu yaliyobadilishwa kwa kipimo cha awali cha cocaine, lakini ilionyesha uanzishaji ulioongezeka wa kukabiliana na kipimo cha kurudia cha cocaine ikilinganishwa na panya wa kudhibiti papo hapo wa GFP. Kwa kulinganisha, panya huzidi kukagua aina ya mabadiliko ya PSMC5 ambayo haina kikoa chake cha coil (PSMC5-ΔCC) haikuonyesha athari hii (Kielelezo 5B). Kwa kufurahisha, overexpression ya PSMC5-K196M, ambayo inakosa shughuli ya ATPase ya protini ya porini, pia majibu ya mtaftaji wa cocaine.

Shusha: 

• Ppt

  Slide ya PowerPoint

• PNG

  picha kubwa (680KB)

• TIFF

  picha ya awali (1.08MB)

Kielelezo 5. PSDC5 overexpression katika NAc huongeza majibu ya locomotor kwa cocaine.

 

A. Mwakilishi wa HSV-mediated transgene expression in NAC medial. AC, commissure ya nje. Sehemu za msingi za NAc na ganda zinajulikana kwenye takwimu. Ukuzaji wa juu wa uwakilishi (60x) wa kudhoofisha kinga ya mwili ya PSMC5 katika NAc neurons baada ya sindano ya HSV-PSMC5 kuonyesha kwamba protini hiyo ni nyuklia kama ilivyowekwa alama na DAPI. C. Panya walipokea sindano za nchi mbili za HSV katika NAc ikifuatiwa na sindano za IP za kila siku za kipimo kidogo cha kokeni (7.5 mg / kg). Majibu ya locomotor yanaonyeshwa kwa kujibu kipimo cha kwanza na cha mwisho cha kipimo cha kila siku cha dawa. Ufafanuzi zaidi wa PSMC3 au PSMC5-K5M huongeza majibu ya locomotor kwa cocaine mara kwa mara, athari ambayo haionekani na PSMC196-ΔCC. Hakukuwa na athari kubwa ya transgen kwenye majibu ya locomotor kwa kipimo cha kwanza cha cocaine. ANOVA F (5) = 3,125, * p <4.163 na mtihani wa posthoc wa Dunnett.

toa: 10.1371 / journal.pone.0126710.g005

Majadiliano

Matokeo ya utafiti wa sasa yanaonyesha utaratibu mpya ambao ΔFosB inaingiliana athari zake kwenye ubongo na utaratibu mpya unaohusika katika hatua ya cocaine. Kwa kutumia njia isiyo na ujuaji, chachu ya mahuluti mbili ya mahuluti, tuligundua PSMC5 kama mshirika wa riwaya anayefunga ΔFosB. Tulihakikisha upataji huu katika seli zilizowekwa ndani ya vitro na katika NAc katika vivo kwa kuonyesha nguvu ya PSMC5-ΔFosB. Kwa kweli, viwango vya nyuklia vya PSMC5 vimechimbwa katika NAc na utawala sugu wa cocaine. Tulionyesha zaidi kwamba kufunga kwa PSMC5-ΔFosB hufanyika katika tamasha na proteni nyingine kadhaa za uanzishaji, ambazo ni CBP na p300 (HAT mbili) na BRG1 (eneo muhimu la SWI-SNF complexes chromatin complexes). Pamoja, matokeo yetu yanaunga mkono wazo kwamba PSMC5 ni sehemu ya muundo wa uanzishaji wa maandishi ambao huandikishwa kwa angalau aina fulani za ΔFosB zilizochochea wakati wa utawala sugu wa cocaine (Kielelezo 4E). Sanjari na dhana hii ni ugunduzi wa ziada wa kwamba utaftaji mwingi wa PSMC5 katika NAc, kama utaftaji wa ΔFosB yenyewe, inakuza majibu ya tabia kwa cocaine. Itapendeza katika tafiti zijazo kufuata hizi katika uchunguzi wa vivo na tabia ya mwingiliano wa PSMC5-ΔFosB-HAT-BRG1 kwa kutumia milki ya mwandishi wa vitro.

Kuhusika kwa PSMC5 katika hatua ya cocaine ni riwaya kabisa. Iliyotambuliwa kama mwanachama wa familia kubwa ya ATPases ambayo inaunda proteni, PSMC5 imeonyeshwa kwa miaka mingi kuingiliana na mambo kadhaa ya uandishi, pamoja na c-Fos, p53, vifaa vya kupandikiza homoni za nyuklia, na maeneo ya eneo la maandishi ya basal [25], hata hivyo, masomo machache ya kazi yamefanywa kwa miaka mingi [26]. Kitendo chake kizuri ni kukuza shughuli ya maandishi ya MYC katika seli zilizohifadhiwa.27]. Maana ya PSMC5 katika mifumo ya uandishi imeonyesha jukumu linalowezekana kwa shughuli za ubinquitination-proteasomal katika udhibiti wa uandishi wa jeni, lakini kuhusika kwa PSMC5 katika kanuni kama hiyo bado kunasadikika hadi leo [28,29].

Kidogo sana kinachojulikana juu ya kazi ya PSMC5 katika ubongo. Utafiti wa mapema ulionyesha kuenea kwa jumla kwa PSMC5 mRNA katika ubongo wote [30], lakini shughuli ya kiutendaji imebaki bila kudhibitiwa. Matokeo yetu sasa yanachochea uchunguzi zaidi wa protini hii ya kufurahisha kuelewa jukumu lake katika kudhibiti uandishi wa jeni na uhusiano wake kwa kazi ya ubiquitination-proteasomal katika ubongo. Kufungwa kwa PSMC5 kwa ΔFosB kunapatanishwa na kikoa cha coil cha coMC5. Kwa kuongezea, uwezo wa PSMC5 kukuza majibu ya cocaine, wakati yanahitaji kikoa kilicho na coil, hauitaji shughuli ya ATPase ambayo ni ya ndani ya protini. Matokeo haya yanaongeza uwezekano kwamba, angalau katika mfumo wetu, shughuli kuu ya PSMC5 inaweza kupatanishwa kupitia kufungwa kwake kwa ΔFosB na proteni zingine za kisheria za kudhibiti na sio kupitia shughuli zake zinazohusiana na proteni kwa sekunde. Kazi zaidi inahitajika ili kujaribu moja kwa moja uwezekano huu na mbadala. Mawazo ambayo upindzaji wa wastani wa upatanishi wa virusi wa PSMC5 uliongezea majibu ya eneo la cocaine kupitia mwingiliano na ΔFosB yanafaa, licha ya matumizi ya regnen ya matibabu ya cocaine ya siku ya 3, kwa sababu inajulikana kuwa viwango vya kupendeza vya ΔFosB hujilimbikiza kwenye ubongo ndani ya wakati huu.3].

Matokeo ya sasa yanathibitisha zaidi matumizi ya kutumia njia za majaribio zisizo wazi, zilizofunguliwa kwa kusoma msingi wa masi ya udhibiti wa ubongo. Uangalifu wetu wa kwanza kwa PSMC5 ulikuwa msingi wa dhamana yake maarufu kwa ΔFosB katika chachu ya aina mbili ya mseto, lakini inaonekana kuwa sehemu muhimu ya mabadiliko ya maandishi ambayo huandikishwa katika NAc na utawala wa mara kwa mara wa cocaine. Uelewa mzuri wa mifumo ya kina ambayo viwango vya nyuklia vya PSMC5 huchochewa na cocaine na, kwa upande wake, ambayo PSMC5 basi inachangia tata za uanzishaji wa cocaine ikiwa ndio lengo la uchunguzi wa sasa. Wakati huo huo, chachu yetu ya chachu ya mseto mbili ilifunua washirika kadhaa wa kisheria wa ΔFosB (Meza 1) ambayo pia sasa inahitajika uchunguzi wa moja kwa moja katika mifano ya cocaine. Pamoja, kazi hii inachangia uelewaji zaidi wa mifumo ngumu ya Masi ambayo njia za kongosho za kahawa zinafanya kazi NAC.

Shukrani

Kazi hii iliungwa mkono na ruzuku kutoka Taasisi ya Kitaifa ya Dawa Mbaya, na Ishibashi Foundation na Jumuiya ya Kijapani ya kukuza Sayansi (Nambari za KAKENHI: 24591735, 26290064, 25116010).

Msaada wa Mwandishi

Iliyofuata na iliyoundwa majaribio: YHO YNO EJN. Alifanya majaribio: YHO YNO PJK RN. Alichambua data: YHO YNO EJN. Waliochangiwa / vifaa / vifaa vya uchangiaji: TN MO OY AN RN TT. Aliandika karatasi: YHO EJN.

Marejeo

1. 1. Morgan JI, Curran T (1995) Jeni za mapema: miaka kumi. Mwenendo Neurosci 18: 66-67. jioni: 7537412 doi: 10.1016 / 0166-2236 (95) 80022-t
   • Tazama Ibara
   • PubMed / NCBI
   • Google
2. 2. Nestler EJ (2008) Njia za uandishi: jukumu la deltaFosB. Philos Trans R Soc London B Biol Sci 363: 3245-3255. Doi: 10.1098 / rstb.2008.0067. jioni: 18640924
3. Tazama Ibara
4. PubMed / NCBI
5. Google
6. Tazama Ibara
7. PubMed / NCBI
8. Google
9. Tazama Ibara
10. PubMed / NCBI
11. Google
12. Tazama Ibara
13. PubMed / NCBI
14. Google
15. Tazama Ibara
16. PubMed / NCBI
17. Google
18. Tazama Ibara
19. PubMed / NCBI
20. Google
21. Tazama Ibara
22. PubMed / NCBI
23. Google
24. Tazama Ibara
25. PubMed / NCBI
26. Google
27. Tazama Ibara
28. PubMed / NCBI
29. Google
30. Tazama Ibara
31. PubMed / NCBI
32. Google
33. Tazama Ibara
34. PubMed / NCBI
35. Google
36. Tazama Ibara
37. PubMed / NCBI
38. Google
39. Tazama Ibara
40. PubMed / NCBI
41. Google
42. Tazama Ibara
43. PubMed / NCBI
44. Google
45. Tazama Ibara
46. PubMed / NCBI
47. Google
48. Tazama Ibara
49. PubMed / NCBI
50. Google
51. Tazama Ibara
52. PubMed / NCBI
53. Google
54. Tazama Ibara
55. PubMed / NCBI
56. Google
57. Tazama Ibara
58. PubMed / NCBI
59. Google
60. Tazama Ibara
61. PubMed / NCBI
62. Google
63. Tazama Ibara
64. PubMed / NCBI
65. Google
66. Tazama Ibara
67. PubMed / NCBI
68. Google
69. Tazama Ibara
70. PubMed / NCBI
71. Google
72. Tazama Ibara
73. PubMed / NCBI
74. Google
75. Tazama Ibara
76. PubMed / NCBI
77. Google
78. Tazama Ibara
79. PubMed / NCBI
80. Google
81. Tazama Ibara
82. PubMed / NCBI
83. Google
84. Tazama Ibara
85. PubMed / NCBI
86. Google
87. Tazama Ibara
88. PubMed / NCBI
89. Google
90. 3. Matumaini BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, et al. (1994) Uzalishaji wa AP-1 ngumu ya muda mrefu inayojumuisha protini kama Fos-iliyobadilishwa katika ubongo na cocaine sugu na tiba zingine sugu. Neuron 13: 1235-1244. jioni: 7946359 doi: 10.1016 / 0896-6273 (94) 90061-2
91. 4. Hiroi N, Brown J, Haile C, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ (1997) panya mutant FosB: Kupoteza uingizaji sugu wa cocaine wa protini zinazohusiana na Fos na kuongezeka kwa unyeti kwa kisaikolojia ya cocaine na athari za malipo. Proc Natl Acad Sci USA 94: 10397-10402. jioni: 9294222 doi: 10.1073 / pnas.94.19.10397
92. 5. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ (2006) Udhibiti wa utulivu wa ΔFosB na phosphorylation. J Neurosci 26: 5131-5142. jioni: 16687504 doi: 10.1523 / jneurosci.4970-05.2006
93. 6. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, et al. (2007) Kukosekana kwa kikoa kilicho na uharibifu wa C-terminal kunachangia utulivu wa kipekee wa ΔFosB Euro J Neurosci 25: 3009-3019. jioni: 17561814
94. 7. Robison AJ, Vialou V, Mazei-Robison M, Feng J, Kourrich S, Collins M, et al. (2013) Majibu ya tabia na ya kimuundo ya cocaine sugu yanahitaji kitanzi cha mbele kinachoshirikisha ΔFosB na CaMKII kwenye ganda la mkufu. J Neurosci 33: 4295-4307 doi: 10.1523 / JNEUROSCI.5192-12.2013. jioni: 23467346
95. 8. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, et al. (1999) Uonyeshaji wa sababu ya maandishi ΔFosB kwenye ubongo inadhibiti usikivu wa cocaine. Asili 401: 272-276. jioni: 10499584
96. 9. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) ΔFosB huongeza motisha kwa cocaine. J Neurosci 23: 2488-2493. jioni: 12657709
97. 10. McClung CA, Nestler EJ (2003) Udhibiti wa kujielezea kwa jeni na tuzo la cocaine na CREB na DFosB. Nat Neurosci 11: 1208-1215. jioni: 14566342 doi: 10.1038 / nn1143
98. 11. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, mbunge wa Cassidy, Kelz MB, et al. (2006) ΔFosB: Jukumu muhimu kwa ΔFosB katika kiini cha mkusanyiko katika hatua ya morphine. Asili Neurosci 9: 205-211. jioni: 16415864 doi: 10.1038 / nn1636
99. 12. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, et al. (2003) Haifai, mkoa wa ubongo kujielezea maalum ya mutant hasi ya c-Jun katika panya wa transgenic hupunguza unyeti kwa cocaine. Brain Res 970: 73-86. jioni: 12706249 doi: 10.1016 / s0006-8993 (03) 02230-3
100. 13. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, et al. (1995) Udhibiti wa protini za FosB na protini za FosB-kama kushonwa kwa umeme na matibabu ya cocaine. Mol Pharmacol 48: 880-889. jioni: 7476919
101. 14. Hiroi N, Marek GJ, Brown J, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, et al. (1998) Jukumu muhimu la jenasi ya fosB katika hatua za kimisi, seli, na tabia ya kushonwa kwa elektroni. J Neurosci 18: 6952-6962. jioni: 9712664
102. 15. Perez-Otano I, Mandelzys A, Morgan JI (1998) MPins Parkinsonism inaambatana na usemi unaoendelea wa protini ya D-FosB-kama njia za dopaminergic. Brain Res 53: 41-52. jioni: 9473580 doi: 10.1016 / s0169-328x (97) 00269-6
103. 16. Ma J, Ptashne M (1988) Kubadilisha kizuizi cha maandishi ya eukaryotic kuwa activator. Kiini 55: 443-446. jioni: 3180218 doi: 10.1016 / 0092-8674 (88) 90030-x
104. 17. Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R, Mashamba S (1991) Mfumo wa mseto mbili: njia ya kutambua na kuunda jeni kwa protini zinazoingiliana na protini ya riba. Proc Natl Acad Sci USA 88: 9578-9582. jioni: 1946372 doi: 10.1073 / pnas.88.21.9578
105. 18. Nakabeppu Y 1, Oda S, Sekiguchi M (1993) Uanzishaji wa uchochezi wa seli za Quiescent Rat-1A na delta FosB. Bi ya seli ya Mol Cell 13: 4157-4166. jioni: 8321220
106. 19. Scobie KN, Damez-Werno D, Jua H, Shao N, Gancarz A, Panganiban CH, et al. (2014) Jukumu muhimu la ion ya poly (ADP-ribosyl) katika hatua ya cocaine. Proc Natl Acad Sci USA 111: 2005-2010. Doi: 10.1073 / pnas.1319703111. jioni: 24449909
107. 20. Perrotti LI, WeRa Weaver, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, et al. (2008) Njia tofauti za uingizwaji wa uctionFosB katika ubongo na dawa za kulevya. Synapse 62: 358-369. Doi: 10.1002 / syn.20500. jioni: 18293355
108. 21. Wang WL, Chevray PM, Nathans D (1996) Mammalian Sug1 na c-Fos katika proteni ya nyuklia ya 26S. Proc Natl Acad Sci USA 93: 8236-8240. jioni: 8710853 doi: 10.1073 / pnas.93.16.8236
109. 22. Koues OI 1, Dudley RK, Truax AD, Gerhardt D, Bhat KP, McNeal S, et al. (2008) Udhibiti wa acetylation katika mpandishaji mkuu wa darasa la proxompatability tata ya kukuza XXUMXS proteasomal ATPase Sug19. Bi ya seli ya Mol Cell 1: 28-5837. doi: 5850 / MCB.10.1128-00535. jioni: 08
110. 23. Levine AA, Guan Z, Barco A, Xu S, Kandel ER, Schwartz JH (2005) CREB-inayofunga protini inadhibiti majibu ya cocaine na historia ya acetylating katika mpandishaji wa fosB kwenye striatum ya panya. Proc Natl Acad Sci USA 102: 19186-19191. jioni: 16380431 doi: 10.1073 / pnas.0509735102
111. 24. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, et al. (2005) Kukarabati upya kwa Chromatin ni njia muhimu inayosababisha uboreshaji wa cocaine kwenye striatum. Neuron 48: 303-314. jioni: 16242410 doi: 10.1016 / j.neuron.2005.09.023
112. 25. St-Arnaud R (1999) Kazi mbili kwa wasimamizi wa nakala: hadithi au ukweli. J Cell Biochem Suppl 32/33: 32-40. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4644 (1999) 75: 32+ <32 :: aid-jcb5> 3.0.co; 2-x
113. 26. Ferrell K, Wilkinson CRM, Dubiel W, Gordon C (2000) Maingiliano ya subunit ya kisheria ya proteni ya 26S, shida ngumu. Mwenendo wa Biochem Sci 25: 83-88. jioni: 10664589 doi: 10.1016 / s0968-0004 (99) 01529-7
114. 27. von der Lehr N, Johansson S, Larson LG (2003) Athari ya ubiquitin / mfumo wa proteni katika maandishi ya myc-umewekwa. Mzunguko wa Kiini 2-5: 403-407. doi: 10.4161 / cc.2.5.484
115. 28. Geng FQ, Wenzel S, Tansey WP (2012) Ubiquitin na proteni zilizo katika maandishi. Annu Rev Biochem 81: 177-201. doi: 10.1146 / annurev-biochem-052110-120012. jioni: 22404630
116. 29. Collins GA, Tansey WP (2006) Proteasome: zana ya matumizi kwa maandishi? Curr Op Genet Dev 16: 197-202. jioni: 16503126
117. 30. Sun DH, Swaffield JC, Johnston SA, Milligan CE, Zoeller RT, Schwartz LM (1997) Utambulisho wa mwanafamilia wa Sug1 CAD aliyehifadhiwa kwa phylogenetically ambaye ameonyeshwa tofauti katika mfumo wa neva wa panya. Dev Neurobiol 33: 877-890. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4695 (199712) 33: 7 <877 :: aid-neu2> 3.0.co; 2-5