Tabia ya aversive ikiwa inactivation inactivation ya ventral tegmental eneo dopamine neurons ni mediated na dopamine receptors D2 katika kiini accumbens (2014)

Proc Natl Acad Sci US A. Aprili 29, 2014; 111 (17): 6455-6460.

Iliyochapishwa online Aprili 15, 2014 Doi:  10.1073 / pnas.1404323111

PMCID: PMC4036004

Neuroscience

Makala hii imekuwa imetajwa na makala nyingine katika PMC.

Nenda:

Umuhimu

Dopamine (DA) neurons katika eneo la sehemu ya hewa (VTA) hujibu kwa kuchochea sana na kwa kunyamaza kwa muda mfupi. Bado haijulikani wazi ikiwa athari hii inasababisha majibu moja kwa moja katika tabia ya panya. Tulichunguza swali hili kwa kudhibiti dawati za DA katika VTA na kugundua kuwa uvumbuzi wa neurons wa DA ulisababisha majibu ya kupindukia na kujifunza. Kiini cha mkusanyiko (NAc), kiini kikubwa cha pato la neva ya VTA DA, kilizingatiwa kuwajibika kwa jibu hili, kwa hivyo tukachunguza ni yapi ya njia za msingi katika NAc ilikuwa muhimu kwa tabia hii kwa kutumia kubadilisha D1 au D2, na kugundua kuwa njia maalum ya receptor ya D2 ilikuwa muhimu kwa tabia hii.

abstract

Maambukizi ya Dopamine (DA) kutoka eneo la sehemu ya vizio (VTA) ni muhimu kwa kudhibiti tabia zenye kufadhili na za kutazama. Ukimya wa muda mfupi wa neurons za DA ni moja ya majibu kwa uchochezi wa athari, lakini athari zake na mifumo ya neural kuhusu majibu ya kujifunza na kujifunza imebaki sana. Hapa, tunaripoti kwamba uvumbuzi wa optogenetic wa neurons za VTA mara moja husimamia viwango vya chini vya viwango vya DA na ikiwa imeweka juu ya udhibiti wa shughuli za neural katika mkusanyiko wa nukta (NAc) kama inavyotathminiwa na usemi wa Fos. Tkukandamiza kwake optogenetic ya kurusha kwa neuron ya DA mara moja kulizindua majibu ya kupindukia kwenye chumba cha giza kilichochaguliwa hapo awali na kusababisha ujifunzaji wa usawa kuelekea mahali palipo na hali ya hewa. Kwa kweli, ubadilishaji wa mahali hapa ulifutwa kwa kufutwa kwa dopamine D2 receptors lakini sio kwa ile ya receptors D1 katika NAc. Silencing ya neurons ya DA katika VTA kwa hivyo ilikuwa muhimu kwa kushawishi majibu ya kugeuza na kujifunza kupitia dopamine D2 receptors katika NAc.

Mfumo wa dopaminergic wa mesolimbic sio tu ina jukumu muhimu katika anuwai ya motisha na kujifunza (1-3), lakini kutokuwa na kazi pia kumeingizwa katika shida kubwa ya ugonjwa wa neuropsychiatric kama ilivyoonyeshwa katika ugonjwa wa Parkinson, schizophrenia, na madawa ya kulevya. Dopamine (DA) neurons katika eneo la sehemu ya hewa (VTA) hujibu kwa kuchochea yenye kuridhisha na kurusha kwa phasic, na kazi kuu ya kurusha hii ni kusudi la kuweka "kosa la utabiri wa malipo," tofauti ya bei kati ya thawabu iliyotabiriwa na malipo halisi (4). Kinyume na majibu ya kuchochea yenye thawabu, athari zao kwa uchochezi wa kuelekeza ni mbali na kufahamisha; n.k.a neurons zingine za DA zimeamilishwa kujibu kichocheo cha kutuliza, wakati wengine wengi hujibu kwa kukandamiza shughuli zao (5-9). Kwa kweli, tafiti za hivi karibuni zimefunua kwamba uanzishaji wa optogenetic ya neuroni za GABAergic na uvumbuzi wa matokeo ya utumiaji wa tuzo za DA na upezaji majibu.10, 11). Walakini, imebaki kwa urahisi kuwa ni mifumo gani katika mizunguko ya neural ni muhimu kwa upatikanaji wa ujifunzaji wa kujifunza kufuatia uvumbuzi wa neuroni za DA katika VTA na jinsi majibu ya tabia inadhibitiwa kwa kukandamiza utumiaji wa tuzo na tabia za kukandamiza.

Ushuhuda unaosababishwa umebaini kuwa ujifunzaji wa motisha na utambuzi katika kukabiliana na ushawishi mzuri na hasi umedhibitiwa sana na mizunguko ya neural pamoja na gangal baslia (12), ambayo hupokea idadi kubwa ya makadirio ya dopaminergic kutoka kwa miziba. Katika mashtaka, duru mbili za msingi za neural zinaundwa na neuroni maalum za ukubwa wa kati (MSNs), kila moja ikielezea aina tofauti ya receptor ya DA (13).

  • Mzunguko mmoja ni njia ya moja kwa moja, ambayo inajumuisha Miradi inayohusika moja kwa moja kwa nukta ya pato la gangali, kikubwa nigra par reticulata (SNr), na kuelezea dopamine D1 receptors (D1Rs).
  • Njia nyingine ni njia isiyo ya moja kwa moja, inayojumuisha ma-NSN ambayo hulenga moja kwa moja kupitia globus pallidus kwa SNr na kimsingi kuelezea dopamine D2 receptors (D2R).

Ishara za DA kutoka kwa mbebaji hubadilisha njia hizi mbili sambamba kwa njia tofauti kupitia D1Rs na D2R, na mabadiliko haya yanapaswa kuwezesha kujifunza kwa motisha (3, 14).

  • Kama habari ya kuchochea yenye thawabu, viwango vya juu vya kudhibitiwa vya DA ambavyo vinasababishwa na ishara za kufadhili vinachukuliwa kuamsha D1R na kwa hivyo kuwezesha njia kuu moja kwa moja kwenye mkusanyiko wa nukta (NAc).
  • Kwa upande mwingine, kukandamiza firings ya neuron ya DA katika kukabiliana na uchochezi wa kupindukia kunapunguza viwango vya DA katika NAc; na mwitikio huu unastahili kukuza hasa maambukizi ya ishara katika njia isiyo ya moja kwa moja kupitia D2Rs.

Ingawa masomo ya kutumia mikakati ya kifamasia na njia inayozuia njia ya kuzuia nurolojia (RNB) imeunga mkono utaratibu huu wa kanuni katika NAc (15, 16), imebaki haijulikani ikiwa kukandamiza kwa kurusha kwa neuron ya DA ni ya kutosha kukuza shughuli za njia isiyo ya moja kwa moja na baadaye kusababisha tabia ya kujiepusha. Katika utafiti huu wa hivi sasa, tulishughulikia suala hili kwa kuchagua hiari ya mucosa ya DA katika VTA kwa kudadisi protini ya Arch ya utando-hyperpolarizing (17) na ilionyesha wazi kuwa ukandamizaji wa neurons za DA katika VTA baadaye ulipunguza viwango vya DA katika NAc na kusababisha athari ya kujifunza na kujifunza. Kwa kuongezea, tulichunguza mifumo ya udhibiti wa athari hii na kufichua kuwa athari ya kupindua ilikuwa inadhibitiwa na D2R katika NAc.

Matokeo

Uvumbuzi wa optogenetic wa Upendeleo wa vyumba vya DA Neurons.

Ili kuchagua kwa hiari maonyesho ya mishipa ya DA, tuliingiza virusi vya ubunifu wa adeno-visivyo vya kuhusika vya kuunda-kisiri vya Arch-eGFP [AAV-mara mbili iliyojaa wazi (Dio) -Arch]17) kwa unilaterally ndani ya VTA ya watu wazima tyrosine hydroxylase (TH) -Cre panya (18) na aina ya pori (WT) na kuweka nyuzi za macho juu ya VTA (Kielelezo S1 A na C). Wiki mbili baada ya upasuaji, Arch-eGFP aligunduliwa kizuizini katika VTA (Kielelezo S1B). Tulijaribu athari ya hyperpolarizing ya protini ya Arch na kurekodi kwa umeme na kupima athari ya kuchochea macho ya VTA ya panya za TH-Cre zilizoingizwa na AAV-DIO-Arch. Katika rekodi za elektroni za elektroniki za vivo kutoka kwa VTA ya panya wa anesthetised TH-Cre ilifunua kwamba kusisimua kwa macho ya neurons ya DA ya kizuizi kulizuia maonyesho yaoKielelezo S2), ikionyesha kuwa kuchochea kwa macho kwa usawa kunasababisha uwezo wa membrane ya seli za kuelezea-arch za DA na kwa hivyo kuwazuia kurusha kwao kwa hiari.

Kwa kutumia panya hizi, baadaye tukagundua ikiwa uboreshaji wa macho ya DA ya neuroni katika VTA inaweza kutumika kama ishara ya kugeuza ujifunzaji wa tabia. Panya wana tabia ya ndani ya kupendelea mazingira ya giza (19). Tuliandaa vifaa vya tabia ambavyo panya wanaweza kuchunguza kwa uhuru chumba cha giza na kufungua nafasi mkali (Mtini. 1A). Baada ya makazi, panya wa WT alikaa kimapendeleo katika chumba cha giza ama na au bila kusisimua kwa macho katika chumba cha giza (Kielelezo S1D), kuhakikisha kuwa kuchochea macho yenyewe hakukuwa na ushawishi juu ya tabia yao ya kuchagua chumba. Tulipanga jaribio la tabia ya wanyama ili kujaribu athari za kutokuonekana kwa neuroni za DA juu ya tabia zao (Kielelezo S1E). Baada ya makao na ustadi, panya walikuwa na hali ya kuchochea neurons za DA katika VTA wakati walikaa kwenye chumba cha giza. Hata wakati wa dakika ya 5 ya kwanza ya hali, panya wa TH-Cre alikaa nje ya chumba cha giza kilichochaguliwa hapo awali na kwa mafanikio akaepuka chumba cha giza katika hali yoyote (Mtini. 1B). Panya wa TH-Cre hawakugeuza kuepukwa kwao dhidi ya chumba cha giza hata hawakupata msukumo wa macho huko ukumbini (Mtini. 1C). Hizi data zinaonyesha kuwa hyperpolarization ya neuron ya DA sio tu ilisababisha tabia ya kupindukia ya muda mfupi lakini pia ilitumika kama ishara ya kujifunza kupindukia dhidi ya chumba cha giza na pia zinaonyesha kuwa uvumbuzi wa neurons wa DA ulishiriki jukumu la kuathiri tabia ya muda mfupi ya kujifunza na kujifunza kwa muda mrefu.

Mtini. 1.  

Inactivation ya optogenetic ya neurons za DA huzuia upendeleo wa chumba giza la panya. (A) Mfano wa vifaa vinavyotumika kwenye mtihani wa upendeleo wa chumba giza. Panya waliruhusiwa kuzunguka kwa uhuru kwenye chumba giza na nafasi mkali. (B) Kozi ya wakati ...

Utaratibu wa chini wa Udhibiti wa Viwango vya DA katika NAc.

Tulichunguza baadaye ikiwa uvumbuzi wa neurons za DA katika VTA kweli ulirekebisha mkusanyiko wa DA katika mkoa wake mkubwa wa kulenga, NAc. Tulipima viwango vya DA katika NAc kwa kupakua kasi ya volclic voltammetry (FSCV) katika panya za anesthetised TH-Cre ambazo zilikuwa zimeingizwa sindano na AAV-DIO-Arch ndani ya VTA yao. Viwango vya DA katika NAc viliinuliwa mara moja na kusisimua kwa umeme wa VTA, na kutolewa kwa DA kwa kupunguzwa kunapunguzwa sana na kuchochea macho wakati huo huo wa VTA (Kielelezo S3). Kisha tukajaribu ikiwa kuchochea kwa macho ya VTA inaweza kupunguza kiwango cha DA katika NAc. Katika mipangilio kama hiyo ya majaribio, tuliona kuwa kiwango cha DA katika NAc kilichopungua kwa muda mfupi na 20 s ya kuchochea macho ya VTA (Mtini. 2), ambayo inaambatana na majibu ya FSCV yaliyoripotiwa dhidi ya uchochezi wa kuasi (20). Takwimu hizi zinaonyesha kuwa kuchochea kwa macho ya VTA ilikuwa na nguvu ya kutosha kuharakisha neva za VTA DA na kupunguza kiwango cha DA katika NAc wakati wa jaribio la tabia.

Mtini. 2.  

Inactivation ya macho ya neurons za DA kwenye VTA hupunguza kiwango cha DA katika NAc. (A) Majibu ya DA ya wastani ya kuchochea macho katika NAc kama inavyopimwa na FSCV. Mstari wa kijani unaonyesha muda wa kuchochea macho (n = 7-11 ya athari). (B) Imesimamishwa ...

Usimamizi-juu ya Ufichuaji wa Fos Gene na Uvumbuzi wa macho wa Neurons za DA katika VTA.

Mabadiliko ya tabia yanayosababishwa na kutokubalika kwa neurons ya DA katika VTA ilionyesha kwamba uhamasishaji wa macho hubadilisha moja kwa moja shughuli za neural na kusababisha mabadiliko ya utendaji wa tabia. Kwa hivyo, tulichunguza mikoa ambayo shughuli za neural ziliinuliwa na hali ya kutokufanya kwa neuroni za DA kwa kuchunguza maelezo ya Fos, jini la mapema. Mara tu baada ya hali hiyo kufanywa katika jaribio la chumba cha giza, panya zilichakatwa haraka ili kuamua kiasi cha kujielezea kwa Fos kwa upimaji katika uchambuzi wa mseto wa mseto (Mtini. 3 na Kielelezo S4). NAc, mkoa ambao hupokea idadi kubwa ya makadirio ya dopaminergic kutoka VTA, ilionyesha kiwango kikubwa cha usemi wa Fos katika panya wa TH-Cre (Mtini. 3). Utaratibu huu wa juu pia uligunduliwa katika upande wa ubinafsi wa uhamasishaji wa macho, ambao inasemekana ulisababishwa na kiwango kidogo cha maambukizo ya virusi ndani ya upande huo. Walakini, kanuni ya juu ilikuwa juu sana kwa upande wa ipsilateral kuliko upande wa makubaliano ya kuchochea macho, na kupendekeza kuwa uvumbuzi wa macho wa neuroni za DA moja kwa moja ulisimamia shughuli za neural za NAc. Kuongezeka kwa Fos pia kulizingatiwa katika maeneo mengine ya ubongo ikiwa ni pamoja na septamu, mkoa wa ndani wa striatum, basolateral amygdala (BLA), na hypothalamus ya baadaye, lakini sio kwenye habenula ya baadaye au cortex ya mialoni (mPFC; Kielelezo S4). Matokeo haya yanaonyesha kuwa mikoa iliyoamilishwa na uvumbuzi wa macho wa neva za DA haikuzuiliwa kwa maeneo ya kulenga moja kwa moja ya VTA DA neurons, lakini badala yake ilijumuisha mikoa ambayo inaweza kuamilishwa kwa njia isiyo ya moja kwa moja kwa mzunguko wa neural. Uchunguzi huu unaonyesha kuwa uvumbuzi wa macho wa neuroni za DA ulirekebisha shughuli za mzunguko wa mzunguko na haukuweza tu kusababisha athari ya kutazama lakini pia husababisha kazi zingine kadhaa za ubongo kama vile wasiwasi, hofu, na majibu ya mafadhaiko (21).

Mtini. 3.  

Sauti inayohusiana na shughuli ya gene ya Fos inayosababishwa na inactivation ya neuroni ya DA ya optogenetic. (A-C) Picha za mwakilishi za Fos expression (njano) katika NAc. Picha zilichukuliwa kwa upande uliochochewa wa panya la TH-Cre (A), ya isiyoingizwa ...

Kuashiria kwa DA Kupitia D2R Ni Muhimu kwa Mbadilishaji wa Nafasi Iliyosababishwa na Vitu.

Ishara nyingi za dopaminergic kutoka VTA hupitishwa kwa MSN kwenye NAc kupitia receptors za DA, D1R na D2R. D1R inaonyeshwa peke katika dutu P (iliyoonyeshwa na jenasi la Tac1) -inasisitiza MSNs, na D2R imeonyeshwa kwa muda mrefu katika enkephalin (iliyoonyeshwa na geni ya Penk) - inasisitiza MSNs; kila aina ya MSN hufanya njia za moja kwa moja na zisizo za moja kwa moja, kwa mtiririko huo, katika NAc (3). Kwa kuwa ushirika kwa DA ni juu sana kwa D2R (nM agizo) kuliko D1R (µM oda) (22, 23), kupunguzwa kwa viwango vya DA hufikiriwa kusababisha uvumbuzi wa GiD2R -siyopatikana lakini bila kuwa na athari ya kufurahishwa kwenye D1R (3, 24), kwa hivyo kusimamia shughuli za neural haswa katika njia isiyo ya moja kwa moja. Kwa kuongezea, uanzishaji wa Fos ulizingatiwa zaidi katika seli za Penk- au Drd2 (D2R) -kuonyesha zaidi ya seli za Tac1- au Drd1a (D1R)Kielelezo S5). Kulingana na uchunguzi huu, tuligundua kwamba DA kuashiria kupitia D2R inaweza kuchukua jukumu kubwa katika hali ya kupindua ya kutazama.

Ili kujaribu nadharia hii, tulifanya majaribio ya kugeuza nafasi ya vyumba vitatu (CPA) (Kielelezo S6). Tuliandaa vifaa vya kitabia vyenye vyumba viwili vilivyo na hali sawa na ukanda mmoja mdogo. Hali hii isiyo ya kawaida ya mazingira katika jaribio la CPA ilituwezesha kuchunguza zaidi ikiwa uvumbuzi wa neurons za VTA DA una uwezo wa kuchochea majibu na ujifunzaji, pamoja na kuzuia upendeleo wa chumba cha giza. Wakati wanyama waliruhusiwa kuzunguka kwa uhuru vifaa vyote, wengi wao walikaa katika vyumba viwili bila tabia yoyote ya kawaida kwa ustadi. Hali ya macho wakati huo ilifanywa kwa pairing msukumo wa macho na chumba kimoja. Hata wakati wowote wa vyumba vilitumika kwa kiyoyozi, panya wa TH-Cre mara kwa mara na kwa kiasi kikubwa aliepuka kukaa katika chumba kilicho na masharti wakati wa hali ya joto na baada ya kulala (Kielelezo S6 B-E). Uchanganuzi wa takwimu ulihakikisha upunguzaji mkubwa wa kukaa kwa panya wa TH-Cre kwenye chumba chenye hali iliyowekwa wazi wakati wa kulinganisha na muda wa kukaa kwa panya wa WT (Kielelezo S6F).

Kisha tukajaribu kutaja subtypes za receptor za DA zinazohusika na tabia hii ya kuhujumu kwa kukandamiza kila moja ya vipokezi vya DA katika NAc (Mtini. 4 na Kielelezo S7). Tulibuni na kuhalalisha veti za lentiviral zilizo na RNA fupi ya hairpin (shRNA) maalum kwa kila kipokezi cha DA na kujieleza kwa ukiritimba. Wiki tatu baada ya kuingiza lentivirus ndani ya NAc, maelezo madhubuti ya mCherry yalipatikana ndani ya NAc (Mtini. 4B). Kuanguka kwa ufanisi kwa usemi wa mRNA ya kila receptor ilithibitishwa na uchambuzi wa wakati halisi wa PCR (Mtini. S7A). Kupima viwango vya proteni kupitia kuzima Magharibi pia kunadhihirisha kuwa sindano ya kila lenti kwa njia ya hiari ilipunguza bidhaa ya protini inayolenga bila kuathiri usemi wa mtu mwingine wa receptor ya DA (Mtini. 4C na Kielelezo S7 B-G). Lentiviruse za shD1R- na shD2R-zimepunguza kiwango chao cha protini hadi 46.2 ± 1.1% na 38.4 ± 4.9%, mtawaliwa, ikilinganishwa na kiwango cha virusi vya kudhibiti (Mtini. 4C). Matokeo haya yalithibitisha kwamba veti za lentiviral zinazoelezea shRNA maalum kwa D1R na D2R kwa hiari na kwa usawa ziligandamiza lengo lao la RNA na kudhibitiwa chini ya kiwango cha bidhaa husika za proteni. Tulithibitisha pia kwamba msemo uliyopatanishwa na virusi vya mCherry haukugunduliwa katika VTA, ukiondoa uwezekano wa kwamba lengirus-mediated shRNA iliathiri moja kwa moja VTA.

Mtini. 4.  

DA kuashiria kupitia D2R ni muhimu kwa CPA iliyochochea optogenetiki. (A) Mfano unaonyesha utaratibu wa upasuaji. Lentivirus ya shRNA-encoding ya D1R au D2R iliingizwa moja kwa moja ndani ya NAc. AAV-DIO-Arch iliingizwa sindano kwa unilaterally ...

Kutumia lentivirus hizi zilizo na shRNA, tulijaribu ni aina gani ya receptor ya DA ndiyo iliyowajibika kwa tabia ya kugandamiza inayosababishwa na inactivation ya optogenetic ya neurons ya DA. Tuliingiza lenti za shRNA zenye lentivirus au lentivirus ndani ya NAC ya pamoja pamoja na AAV-DIO-Arch ndani ya VTA ya kushoto ya panya wa TH-Cre. Fiber ya macho pia iliingizwa juu ya VTA (Mtini. 4A). Wakati jaribio la CPA la vyumba vitatu lilifanyika kwa wiki tatu baada ya upasuaji, panya wa TH-Cre aliingizwa na lenti: shD1R-mCherry bado alionesha CPA wazi dhidi ya chumba cha kuchochea-macho kilicho sawa na ile ya panya la TH-Cre iliyoingizwa na panya wa TH-Cre. kudhibiti lentivirus (lenti: mCherry). Kwa kulinganisha, panya wa TH-Cre aliingizwa na lenti: shD2R-mCherry alishindwa kuonyesha CPA dhahiri wakati wa hali (Mtini. 4D). Upungufu wa kipekee wa ujifunzaji wa panya za TH-Cre zilizoingizwa na lenti: shD2R-mCherry iliimarishwa zaidi na uchanganuzi wa kujifunza kwa uhasama huko nyuma.Mtini. 4E). Matokeo haya yanaonyesha kuwa tabia ya kugandamiza kwa mahali iliyowekwa na uvumbuzi wa neuron wa DA iliondolewa haswa kupitia D2R, na sio kupitia D1R, katika NAc.

Majadiliano

Katika mashtaka, tafiti zimebaini kuwa uanzishaji wa GsD1R iliyopangwa - inawezesha kurusha kwake, wakati uanzishaji wa GiD2R iliyopangwa - inaleta ufanisi wa kufyatua kazi (25). Ackulingana na maalum ya kujielezea kwa receptor ya DA, maonyesho ya phasic ya neurons ya DA husababisha kuamilisha njia ya moja kwa moja kupitia D1R, ambapo kupungua kwa muda mfupi kwa firings za neuron ya DA kwa muda kunakuza uwezo wa njia isiyo ya moja kwa moja kupitia D2R (3, 26). Kwa msingi wa utaratibu huu wa kanuni, imependekezwa kuwa ukimya wa neurons za DA kwa kukabiliana na uchochezi wa kuelekeza unashughulikiwa sana kupitia njia isiyo ya moja kwa moja na husababisha tabia ya kutazama. (3). Uchunguzi wa hivi karibuni umeonyesha kuwa kizuizi cha usambazaji wa njia ya njia isiyo ya moja kwa moja huingiza kupatikana kwa tabia ya kugandamiza iliyopitishwa na mshtuko wa umeme (15) na kwamba uharibifu huu unasababishwa na kizuizi cha maambukizi ya ishara ya D2R16). Mimin kuongeza, uptogenetic up-kanuni ya D2R-kuelezea MSNs katika njia ya moja kwa moja evoke tabia ya kuzuia (27). Walakini, kwa sababu neurons ya DA inaonyesha maonyesho ya kuboresha na ya kukandamiza kujibu athari za kusisimua na kwa sababu habari zingine zinazohusiana na mshtuko zinashughulikiwa kwa wakati huo huo kwenye ubongo, bado inabaki kufafanuliwa ikiwa kutomesha kwa neurons za DA kunaweza kusababisha mmenyuko wa kujifunza na kujifunza, na ikiwa athari hii inadhibitiwa kupitia D2R-expression MSNs kwenye njia isiyo ya moja kwa moja.

Katika utafiti huu, tulitumia optogenetic kudhibiti ya firings ya neuron ya DA katika vipimo viwili vya tabia: mtihani wa upendeleo wa chumba cha kulia na mtihani wa vyumba vitatu vya CPA. Udanganyifu wetu wa optogenetic ilionyesha ukandamizaji mzuri wa uharamia wa DA katika neuroni na udhibiti wa chini wa viwango vya DA katika NAc.. Utangulizi wetu sahihi wa optogenetic ya firings ya neuron ya DA tu wakati wa kipindi ambacho wanyama walikaa kwenye chumba kilichowekwa hali iliyosababisha athari ya kutazama na kujifunza, ikionyesha kwamba kufutwa kwa muda kwa DA kulisababisha moja kwa moja tabia ya kujiepusha. Kwa kuongezea, uchunguzi huu umeweka wazi kuwa usindikaji wa ishara za upatanishi wa D2R ni kiashiria cha msingi cha kuingiza mmenyuko wa athari hii ya kujifunza na kujifunza.

Ingawa data yetu ilionyesha kuwa D1R haikuwa na athari katika majaribio ya tabia ya kumtoa CPA, tafiti kadhaa zimeonyesha kwamba kurusha kwa phasic ya neurons ya DA inahitajika kwa majibu ya woga na kujifunza kutazama.28, 29). Tofauti hii ni kwa sababu ya mpangilio wa majaribio; Kwa mfano, njia yetu ya optogenic iliondoa uwezekano wa kuashiria kwa njia iliyowashwa ya neuroni za DA ili kuamsha tabia ya kupindukia, ikionyesha kuwa katika kukuza neurons za DA kulitosha kushawishi tabia ya kujifunza na kujifunza. Kazi na usindikaji wa ishara ya utaftaji ulioamilishwa wa DA aliyehamasishwa na kuchochea kusisimua kunaweza kuwa na michango tofauti kwa tabia ya kupotosha kutoka kwa waliosoma hapa na wanahitaji kufafanuliwa katika siku zijazo.

Neurons za DA pia zinafanya miradi kwa mikoa mingine ikijumuisha mPFC, amygdala, na hippocampus. Utafiti wa hivi karibuni ulionyesha kuwa uanzishaji wa optogenetic ya neuron inayofuata inayoshughulikia neurons za DA katika VTA ina uwezo wa kushawishi tabia ya kupindukia, na hizi neuroni za DA hasa na zinalenga haswa kwa mPFC (30), ingawa hali yao ya optogenetiki ilikuwa tofauti na ile katika masomo yetu ya sasa, kwani kuchochea kwao kwa optogenetic kuliongezwa kwa muda mrefu wa kikao cha hali yote. Kwa sababu pembejeo la dopaminergic kwa mPFC imeripotiwa kuamilishwa sio tu na uchochezi wa kuhujumu lakini pia na dhiki sugu (31, 32), inawezekana kwamba uanzishaji wao endelevu wa mPFC-utaftaji wa neurons ya DA utagunduliwa kama ishara kutoka kwa mazingira yenye kukandamiza sana; na, kama matokeo ya mkusanyiko wa hali zenye kusisitiza, wanyama wangeonyesha tabia ya kupindukia kwa chumba kilicho na masharti. Kwa kulinganisha, tulizuia kupigwa risasi kwa neurons za DA tu wakati wanyama walikuwa wakikaa kwenye chumba kilicho na masharti. Matokeo ya majaribio yetu ya kitabia kwa kutumia hali ya kuendana na wakati yalionyesha kuwa kukandamiza ghafla kwa ishara ya DA kutatambuliwa kama pembejeo ya kugeuza ghafla, ambayo ilisababisha majibu yao ya haraka ya kutazama.

Neurons za DA pia zinafanya kazi kwa amygdala, mkoa ambao unachangia kwa kiasi kikubwa majibu ya woga. Hakika, DA kuashiria amygdala imeingizwa katika mwitikio wa hofu na kupatikana kwa kumbukumbu ya hofu (33, 34). Katika utafiti wetu, kwa kuweka herufi ya neurons ya DA katika VTA ilibaini seti ya neurons ya DA ya BLA, lakini kiwango cha makadirio haya yalikuwa chini sana kuliko ile ya mradi wa NAc. Ingawa hatuwezi kutenga athari ya hila ya amygdala-makadirio ya DA kuashiria tabia yetu ya kuadhimisha, athari kuu ya uvumbuzi wetu wa optogenetic ya neurons ya DA inapaswa kuwa kwenye NAc, kwa sababu majaribio yetu ya kushuka kwa D2R katika NAc yamepungua sana. tabia ya kupindua. Uchunguzi wa baadaye unaoshughulikia kuashiria maalum ya DA unahitajika kuelezea athari za mabadiliko ya mzunguko wa neurons za DA juu ya hali ya kuchukiza na ya hali ya hofu.

Vifaa na mbinu

Masomo.

Tyrosine hydroxylase :: IRES-Cre (TH-Cre) panya wa kugonga (EM: 00254) (18) zilipatikana kutoka Jalada la Panya la Mutant la Ulaya. Wanyama wote wa majaribio walikuwa wamerudishiwa kwa aina ya C57BL / 6J kwa vizazi zaidi ya 10. Panya zilikuwa zinaendana na panya za C57BL / 6J WT na zilizo na mzunguko wa kawaida wa taa ya 12-h / 12-h na kupewa chakula na matangazo ya maji. Ubunifu+ na Cre- panya kutoka takataka sawa (3-6 mo of age) zilitumika kwa majaribio. Majaribio yote ya wanyama yalipitishwa na kamati ya wanyama ya Taasisi ya Osaka Bioscience chini ya maelekezo ya majaribio ya wanyama.

Uchunguzi wa tabia.

Wakati wa vipimo vyote vya tabia, panya ziliunganishwa na nyuzi ya macho na kuruhusiwa kuzunguka vifaa vyote. Harakati za panya zilizingatiwa ili waweze kuzunguka bila vikwazo vyovyote hata wakati wameunganishwa na nyuzi ya macho kwenye vichwa vyao. Nafasi ya panya iligunduliwa na kamera ya video iliyosimamishwa juu ya vifaa vya tabia na kuchambuliwa na programu iliyotengenezwa na umila kwa kutumia programu ya Maabara.

Mtihani wa upendeleo wa chumba giza.

Vifaa vya kitamaduni vilivyotengenezwa kwa mazoea vilivyotumika kwenye jaribio viliundwa na chumba cha giza (15 × 9.5 cm) na nafasi wazi ya wazi (15 × 11 cm). Chumba cha giza kilikuwa na kuta, sakafu, na paa, ambazo zote zilikuwa na rangi nyeusi na mlango wa (4.5 cm urefu) kwa nafasi wazi wazi. Nafasi wazi wazi ilikuwa umbo kama mviringo na ilikuwa na sakafu ya gridi ya chuma na kuta wazi bila paa. Kabla ya jaribio, panya zote ziliwekwa kwa dakika ya 10 kwenye vifaa. Mtihani huo ulikuwa na vikao vitatu: katika nusu ya kwanza ya siku 1 (kibali: 5 min), panya waliruhusiwa kuchunguza vifaa vyote. Kuanzia nusu ya mwisho ya siku 1 hadi 4 ya leo (hali: 35 min jumla), panya walipokea msukumo wa macho wakati walikaa kwenye chumba cha giza. Siku ya 5, upendeleo wa chumba cha giza ulijaribiwa bila kusisimua kwa macho (chapisho: Dakika ya 5; Kielelezo S1E).

Mtihani wa CPA wa vyumba vitatu.

Mpangilio wa mahali palipokuwa na vifaa vya upendeleo wa vyumba vitatu / vifaa vya CPA vilivyotumiwa kwenye jaribio viliundwa na vyumba viwili (10 × 17 cm) na eneo la kuunganisha. Mtihani huo ulikuwa na vikao vitatu. Siku 1 (prest: 15 min): Panya waliruhusiwa kuchunguza kwa uhuru vifaa vyote. Panya ambazo zilikaa mara 1.5 tena katika chumba kimoja kuliko nyingine zilitengwa kwenye mtihani. Siku 2 na 3 (hali: 15 min kila): Panya walipokea msukumo wa macho wakati walikaa kwenye chumba kilicho na taa. Uteuzi wa chumba kilicho na taa-laini zilishindana. Siku 4 (chapisho: 15 min): Jaribio lilifanywa chini ya hali ile ile kama ile ya udanganyifu (Kielelezo S6A).

Katika kikao cha hali ya hewa, kuchochea kwa macho kulisimamishwa kwa 30 s wakati panya hukaa zaidi ya 30 s kwenye chumba giza au chumba kilicho na mwangaza ili kuzuia kuongezeka kwa joto. Nguvu ya laser ilidhibitiwa kuwa takriban 5 mW kwenye ncha ya nyuzi ya macho katika vipimo vyote vya tabia.

Katika Voltlic ya Voltlic ya Scan kasi ya Scan.

Majaribio ya FSCV yalifanywa kwa kutumia njia iliyoelezewa katika masomo ya awali (35-37). Panya walishonwa na mchanganyiko wa ketamine / xylazine kama ilivyoelezewa katika Vifaa na mbinu za SI na kuwekwa kwenye mfumo wa stereotaxic. Fiber ya macho inayotumiwa kwa kuchochea arch-kuelezea neurons ya DA ilikuwa iko karibu na elektroni ya kuchochea. Njia ya kuchochea iliwekwa kisha kuwekwa katika VTA (kutoka bregma: anterior-posterior, −3.2 mm; lateral, 0.5 mm; and dorsal-ventral, 3.5 mm) na dari kwa vipindi vya 0.25-mm. Microelectrode ya kaboni-fiber (300 µm kwa urefu) ya kurekodi voltammetric iliwekwa ndani ya NAc (kutoka bregma: anterior-posterior, 1.0 mm; lateral, 1.0 mm; and dorsal-ventral, 3.5 mm). Vipimo vya voltammetric vilifanywa kila 100 ms kwa kutumia waveformform (−0.4 V hadi + 1.3 V hadi −0.4 V dhidi ya Ag / AgCl, kwa 400 V / s) kwa microelectrode ya kaboni-fiber. Potentiostat iliyotengenezwa kwa desturi ilitumika kwa kutengwa kwa mabadiliko ya wimbi na ukuzaji wa sasa. Kutolewa kwa DA kuliondolewa na kuchochea umeme kwa mishipa ya DA kwa kutumia msukumo wa 24-pulse (100 µA, 5 msrefu, 30 Hz). Kuchochea kwa macho ya neurons ya DA (532 nm, ∼5 mW nguvu kwenye ncha ya nyuzi) ilitumiwa kwa 10 s kuanza 5 s kabla ya kuanza kwa msukumo wa umeme. Microelectrodes ya kaboni-kaboni ilibadilishwa katika suluhisho na viwango vya kujulikana vya DA (0.2 µM, 0.5 µM, na 1.0 µM). Takwimu zote za voltammetry zilichambuliwa na programu zilizotengenezwa maalum kwa kutumia programu ya Maabara na Matlab. Kupunguza viwango vya DA kwa kusisimua kwa macho kutatuliwa na uchambuzi wa sehemu kuu, kwa kutumia muundo wa muundo wa muundo wa DA kutoka kwa vichocheo vya VTA ya umeme kutenganisha ishara za dopamine (35, 36).

Uchambuzi wa Takwimu.

Uchanganuzi wa takwimu ulifanywa kwa kutumia GraphPad PRISM 5.0 (Programu ya GraphPad). Takwimu zilichambuliwa na hatua zilizorudiwa ANOVA (Tini. 1B, , 4D,4D, na Kielelezo S6 D na E) au ANOVA ya njia moja (Tini. 1C, , 3D,3D, 4 C na E, na Mbegu. S4 K-M, S6F, na S7A), na uchambuzi wa baada ya hoc ulifanywa kwa kutumia mtihani wa Bonferroni. Alama zote / nguzo na baa ziliwakilisha maana na ± SEM, mtawaliwa.

Taratibu zingine za majaribio pamoja na utayarishaji wa virusi na sindano, kurekodi kwa umeme, na uchambuzi wa immunohistochemical na mRNA zimeelezewa kwa undani katika Vifaa na mbinu za SI.

Vifaa vya ziada

Kusaidia Taarifa:  

Shukrani

Tunamshukuru E. Boyden kwa ujenzi wa Arch, R. Matsui kwa ushauri wa kiufundi katika utengenezaji na utakaso wa lentivirus, na Y. Hayashi kwa ushauri wa kiufundi katika utengenezaji wa uchambuzi wa data. Kazi hii iliungwa mkono na Ruzuku ya Utunzaji wa misaada ya 22220005 (hadi SN), 23120011 (kwa SY na SN), 24700339 (hadi TD), na 25871080 (kwa SY) kutoka Wizara ya Elimu, Utamaduni, Michezo, Sayansi, na Teknolojia ya Japan na ruzuku kutoka Takeda Science Foundation (kwa SN).

Maelezo ya chini

 

Waandishi hutangaza hakuna mgongano wa maslahi.

Makala hii ina maelezo ya kusaidia mtandaoni mtandaoni www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1404323111/-/DCSupplemental.

Marejeo

1. RA mwenye busara. Dopamine, kujifunza na motisha. Nat Rev Neurosci. 2004; 5 (6): 483-494. [PubMed]
2. Schultz W. dopamine nyingi hufanya kazi kwa kozi tofauti za wakati. Annu Rev Neurosci. 2007; 30: 259-288. [PubMed]
3. Bromberg-Martin ES, Matsumoto M, Hikosaka O. Dopamine katika udhibiti wa motisha: Kuzuia, kutazama, na kuonya. Neuron. 2010; 68 (5): 815-834. [Makala ya bure ya PMC] [PubMed]
4. Schultz W, Dayan P, Montague PR. Sehemu ndogo ya utabiri na thawabu. Sayansi. 1997; 275 (5306): 1593-1599. [PubMed]
5. Schultz W, Romo R. Majibu ya nigrostriatal dopamine neurons kwa kiwango cha juu cha nguvu ya kusisimua kwa tumbili la anesthetized. J Neurophysiol. 1987; 57 (1): 201-217. [PubMed]
6. Ungina MA, Magill PJ, Bolam JP. Uzuiaji usiofanana wa neuropu ya dopamine katika eneo la kuvuta kwa vurugu na msukumo wa nyuma. Sayansi. 2004; 303 (5666): 2040-2042. [PubMed]
7. Brischoux F, Chakraborty S, Brierley DI, Ungless MA. Uchunguzi wa phasic wa neuropu ya dopamine katika VTA ya ventral na kuchochea isiyo na wasiwasi. Proc Natl Acad Sci USA. 2009; 106 (12): 4894-4899. [Makala ya bure ya PMC] [PubMed]
8. Matsumoto M, Hikosaka O. Aina mbili za dopamine neuron zinaonyesha wazi ishara chanya na hasi za motisha. Asili. 2009; 459 (7248): 837-841. [Makala ya bure ya PMC] [PubMed]
9. Cohen JY, Haesler S, Vong L, Lowell BB, Uchida N. Neuron-aina maalum ya ishara kwa malipo na adhabu katika eneo la kuvuta kwa mzunguko. Asili. 2012; 482 (7383): 85-88. [Makala ya bure ya PMC] [PubMed]
10. Tan KR, et al. Gaba neurons ya VTA inayoendesha gari mahali pa kuzidiwa. Neuron. 2012; 73 (6): 1173-1183. [PubMed]
11. van Zessen R, Phillips JL, Budygin EA, Stuber GD. Uanzishaji wa neuroni za VTA GABA usumbufu utumiaji wa tuzo. Neuron. 2012; 73 (6): 1184-1194. [Makala ya bure ya PMC] [PubMed]
12. Packard MG, Knowlton BJ. Kujifunza na kumbukumbu za kazi za gangal basal. Annu Rev Neurosci. 2002; 25: 563-593. [PubMed]
13. Surmeier DJ, Wimbo WJ, Yan Z. Uratibu wa matamko ya dopamine katika neonisi ya kati ya spiny. J Neurosci. 1996; 16 (20): 6579-6591. [PubMed]
14. Surmeier DJ, Plotkin J, Shen W. Dopamine na utunzaji wa plastiki katika mzunguko wa dorsal striatal kudhibiti uteuzi wa hatua. Curr Opin Neurobiol. 2009; 19 (6): 621-628. [Makala ya bure ya PMC] [PubMed]
15. Hikida T, Kimura K, Wada N, Funabiki K, Nakanishi S. Majukumu ya mbali ya usambazaji wa njia zilizoenea katika njia za moja kwa moja na zisizo za moja kwa moja za malipo na tabia ya kutazama. Neuron. 2010; 66 (6): 896-907. [PubMed]
16. Hikida T, et al. Njia maalum ya kusanifu ya mkusanyiko wa nukta katika ujira na tabia ya kuwarusha kupitia spishi za kuchagua za kusambaza. Proc Natl Acad Sci USA. 2013; 110 (1): 342-347. [Makala ya bure ya PMC] [PubMed]
17. Chow BY, et al. Utendaji wa hali ya juu wa kusisimua unaolengwa kwa macho ya neural na pampu za protoni zinazoendeshwa na mwanga. Asili. 2010; 463 (7277): 98-102. [Makala ya bure ya PMC] [PubMed]
18. Lindeberg J, et al. Usemi wa Transgenic wa Cre recombinase kutoka kwa locus ya tyrosine hydroxylase. Mwanzo. 2004; 40 (2): 67-73. [PubMed]
19. Bourin M, Hascoët M. Mtihani wa panya / sanduku la giza. Eur J Pharmacol. 2003; 463 (1-3): 55-65. [PubMed]
20. Roitman MF, Wheeler RA, Wightman RM, Carelli RM. Majibu ya kemikali ya wakati halisi kwenye mkusanyiko wa msongamano hutofautisha malipo yenye kurudisha na ya kusisimua. Nat Neurosci. 2008; 11 (12): 1376-1377. [Makala ya bure ya PMC] [PubMed]
21. LeDoux JE. Mizunguko ya hisia kwenye ubongo. Annu Rev Neurosci. 2000; 23: 155-184. [PubMed]
22. Maeno H. Dopamine receptors katika kiini cha canine caudate. Bi Cell ya seli ya Mol. 1982; 43 (2): 65-80. [PubMed]
23. Richfield EK, Penney JB, Young AB. Hali ya anatomical na ubia kulinganisha kati ya dopamine D1 na receptors D2 katika mfumo mkuu wa neva. Neuroscience. 1989; 30 (3): 767-777. [PubMed]
24. Hikosaka O. Basal ganglia mifumo ya harakati-ya jicho-mwelekeo wa jicho. Ann NY Acad Sci. 2007; 1104: 229-249. [PubMed]
25. Surmeier DJ, Ding J, Siku M, Wang Z, Shen W. D1 na moduli ya dopamine-receptor ya dopamine-receptor ya dalili za dharura za glutamatergic ya ndani ya striatal kati ya spiny. Mwenendo Neurosci. 2; 2007 (30): 5-228. [PubMed]
26. Frank MJ. Nguvu moduli ya dopamine katika genge basal: Akaunti ya neva ya nakisi ya upungufu wa utambuzi katika Parkinsonism iliyoandaliwa na isiyo na maandishi. J Cogn Neurosci. 2005; 17 (1): 51-72. [PubMed]
27. Kravitz AV, Tye LD, Kreitzer AC. Jukumu la kutofautisha kwa njia za moja kwa moja na zisizo za moja kwa moja za neuroni katika uimarishaji. Nat Neurosci. 2012; 15 (6): 816-818. [Makala ya bure ya PMC] [PubMed]
28. Fadok JP, Dickerson TM, Palmiter RD. Dopamine ni muhimu kwa hali ya uwongo-tegemezi ya cue. J Neurosci. 2009; 29 (36): 11089-11097. [Makala ya bure ya PMC] [PubMed]
29. Zweifel LS, et al. Uanzishaji wa neuropu ya dopamine ni muhimu kwa hali ya athari na kuzuia wasiwasi wa jumla. Nat Neurosci. 2011; 14 (5): 620-626. [Makala ya bure ya PMC] [PubMed]
30. Lammel S, et al. Udhibiti wa uingizwaji maalum wa thawabu na ubadilishaji katika eneo la mzunguko wa ventral. Asili. 2012; 491 (7423): 212-217. [Makala ya bure ya PMC] [PubMed]
31. Mantz J, Thierry AM, Glowinski J. Athari ya kushona kwa mkia kwa kiwango cha kutokwa kwa neuropiki ya mesocortical na mesolimbic dopamine: Uteuzi wa uteuzi wa mfumo wa mesocortical. Ubongo Res. 1989; 476 (2): 377-381. [PubMed]
32. Tidey JW, Miczek KA. Dhiki ya kushindwa kwa jamii huchagua kutolewa kwa mesocorticolimbic dopamine kutolewa: Utafiti katika uchunguzi wa vivo. Ubongo Res. 1996; 721 (1-2): 140-149. [PubMed]
33. Pezze MA, Feldon J. Mesolimbic dopaminergic njia katika hali ya hofu. Prog Neurobiol. 2004; 74 (5): 301-320. [PubMed]
34. de la Mora mbunge, Gallegos-Cari A, Arizmendi-García Y, Marcellino D, Fuxe K. Jukumu la mitambo ya dopamine receptor katika module ya amygdaloid ya hofu na wasiwasi: Uchambuzi wa muundo na utendaji. Prog Neurobiol. 2010; 90 (2): 198-216. [PubMed]
35. Heien ML, Johnson MA, Wightman RM. Kusuluhisha neurotransmitters hugunduliwa na voltlic ya sketta ya haraka. Mch Chem. 2004; 76 (19): 5697-5704. [PubMed]
36. Heien ML, et al. Kipimo halisi cha kushuka kwa dopamine baada ya cocaine kwenye ubongo wa tabia ya panya. Proc Natl Acad Sci USA. 2005; 102 (29): 10023-10028. [Makala ya bure ya PMC] [PubMed]
37. Natori S, et al. Kutoa kwa dopamine inayohusiana na thawabu inayohusiana na panya la dorsal striatum. Neurosci Res. 2009; 63 (4): 267-272. [PubMed]