Kutengeneza mizunguko ya Neural ambayo Inasimamia Mashindano Makusudi Kutafuta (2015) (MECHANISM YA BINGE)

Ili kutambua neuroni za LH ambazo hutoa pembejeo ya monosynaptic kwa VTA katika vivo na kuangalia shughuli zao wakati wa tabia za kusonga kwa uhuru, tulitumia mkakati wa virusi viwili kuelezea kwa uangalifu channelrhodopsin-2 (ChR2) katika neurons za LH kutoa pembejeo ya monosynaptic kwa VTA (Takwimu 1A na S1). Tuliingiza vector ya virusi inayohusiana na adeno (AAV₅kubeba ChR2-eYFP katika fremu ya kusoma-wazi-inverted inayotegemea-Cre-recombinase-inverted open (DIO) kujenga ndani ya LH kuambukiza somata ya ndani na kudungwa virusi vya herpes simplex (HSV) inayosafiri tena inayobeba Cre-recombinase kwenye VTA. Urekebishaji wa baadaye uliruhusu opsin na usemi wa fluorophore kwa hiari katika neurons za LH kutoa uingizaji wa monosynaptic kwa VTA. Ili kudhibitisha njia yetu, tulifanya rekodi za ex-vivo nzima ya seli-kiraka kwenye vipande vya usawa vya ubongo vyenye LH na ilirekodiwa kutoka kwa neva zinazoelezea ChR2-eYFP, na pia jirani za LH ambazo zilikuwa hasi za ChR2-eYFP (Kielelezo 1B). Miinuko ya miiba iliyochomwa na mwanga, iliyopimwa kutoka mwanzo wa mapigo nyepesi hadi kilele cha uwezo wa kitendo, ilianzia kati ya 3-8 ms (Kielelezo 1C). Tuligundua pia kuwa hakuna seli yoyote isiyoonyesha (ChR2-hasi) iliyorekodiwa iliyoonyesha majibu ya kusisimua kwa upigaji picha (n = 14; Kielelezo 1C), licha ya ukaribu wao na seli za kuonyesha ChR2.

Ili kufanya kitambulisho cha upatanishi wa macho katika vivo, optrode iliwekwa ndani ya LH kurekodi shughuli za neuronal wakati wa kazi ya kutafuta sucrose. Katika kikao hicho hicho cha kurekodi, tulitoa mifumo kadhaa ya upigaji picha ili kutambua chr2-inayoelezea LH-VTA neuronsTakwimu 1D na S1). Tulichunguza usambazaji wa picha za kusisimua za kupendeza za kupindukia kwa neurons zote za LH kuonyesha mabadiliko yaliyofungiwa kwa wakati wa kiwango cha kurusha kwa kujibu mwangaza na tuligundua usambazaji wa bimodal (Kielelezo 1E). Tuliona idadi ya neuroni wakati wa rekodi za vivo na latitudo katika anuwai ya 3-8 ms. Hii ilikuwa sawa na safu ya latency inayopatikana katika ChR2-inayoelezea LH-VTA neurons wakati tulirekodi ex vivo. Tuliita vitengo hivi "Aina ya 1"Takwimu 1C, 1E, na 1F). Kwa kuongezea, kulikuwa na idadi tofauti ya seli zilizo na urefu wa onse100 ms photoresponse latency (Takwimu 1E na 1G), na tulitaja vitengo vya "Aina 2". Tuliona pia neurons ambazo zilikuwa zimezuiwa kujibu Photostimulation ya LH-VTA neurons (Kielelezo S2), na tulitaja vitengo vya "Type 3". Tulilinganisha muda unaowezekana wa vitendo (kama ilivyo kipimo kutoka kilele hadi kwenye nyimbo) na tunamaanisha viwango vya kurusha ya Aina ya 1 na vitengo vya Type 2 na zile ambazo hazikuonyesha picha ya kupigia picha (Kielelezo 1H). Usambazaji wa durations uwezo wa vitendo wa Aina 1 (Kielelezo 1I) na Andika 2 (Kielelezo 1J) vitengo vinaonyesha kuwa sehemu nyingi za Aina ya 1 zina muda wa kuchukua hatua chini ya 500 μs (84%; n = 16/19, usambazaji wa binomial, p = 0.002).

Ijapokuwa vitengo vya Aina ya 1 vinafaa vigezo vya kawaida kuainishwa kama ChR2 ikielezea (Cohen et al., 2012, Zhang et al., 2013), haikujulikana ikiwa majibu ya latency ya muda mrefu ya vitengo vya Aina ya 2 yalikuwa yanaonyesha neurons zinazoonyesha ChR2 zilizojibu polepole zaidi hadi kupiga picha, au ikiwa athari hii ilitokana na shughuli za mtandao. Kwa kuzingatia kuwa mradi wa ChR2-expression (Type 1) LH neurons moja kwa moja kwa VTA, uwezekano mmoja ni kwamba Aina ya 2 neurons walikuwa wakipokea maoni kutoka kwa VTA (Kielelezo 1K). Uwezo mwingine ni kwamba neurons za aina ya 2 ziliamilishwa na dhamana za axon kutoka kwa neurons za Aina 1 (Kielelezo 1L). Kutofautisha kati ya hizi aina mbili za mzunguko, tulizuia VTA kwa kushirikiana na utambulisho wa picha kwenye LH.

Kulingana na mifano yetu ya mzunguko, tunatarajia kizuizi cha distal kuwa na athari kwa picha za chR2-expression LH neurons. Walakini, ikiwa upigaji picha zaidi, lakini bila kuelezea, neurons za LH zilitegemea maoni kutoka VTA kupata majibu ya muda uliofungwa kwa kujaa (Kielelezo 1K), tunatarajia kupatikana kwa picha kwenye neurons hizi kwenye vizuizi vya VTA. Tulielezea ChR2 katika seli za LH-VTA kama hapo juu, lakini wakati huu pia ilionyesha halorhodopsin 3.0 (NpHR) iliyoimarishwa katika VTA na kuingiza nyuzi za macho katika VTA kwa kuongeza fomati ya LH (Kielelezo 2A). Tulitoa muundo huo wa mwangaza wa rangi ya bluu kwenye LH kwa muda wote wa tatu lakini pia tulipiga picha VTA na taa ya manjano kwenye kipindi cha pili (Kielelezo 2A).

Picha za vitengo vya Aina 1 hadi taa ya bluu-taa katika LH hazikugunduliwa na picha ya VTA, ambayo inaambatana na usemi wa ChR2 katika aina ya neuron ya Type 1 LH-VTA (Kielelezo 2B). Kwa upande mwingine, idadi kubwa ya vitengo vya Aina 2 (87%; n = 13/15, usambazaji wa binomial, p = 0.004) ilionyesha upunguzaji mkubwa wa majibu ya picha kwa kunde zenye taa za samawati zilizotolewa kwenye LH juu ya kuzuia picha ya neva za VTA. Majibu ya vitengo vya Aina ya 1 na Aina ya 2 wakati wa kuzuia picha ya VTA yalikuwa tofauti sana (chi-mraba = 7.64, p = 0.0057; Takwimu 2B na 2C). Tofauti hizi zinaweza pia kuonekana katika alama za Z wakati wa maonyesho ya mtu binafsi (Kielelezo 2D) na wakati wa manjano-JUU iliyorekebishwa kwa wakati wa manjano-YA (Kielelezo 2E). Takwimu hizi zinaonyesha kuwa aina ya 2 LH neurons hupokea uingizaji (moja kwa moja au isiyo ya moja kwa moja) kutoka VTA (Kielelezo 1K) badala ya kupitia mikataba ya axon ya eneo hilo (Kielelezo 1L).

Baada ya kugundua aina hizi mbili tofauti za neurons za LH kwenye kitanzi cha LH-VTA, tulitaka kuchunguza shughuli za kawaida za neural wakati wa kazi ya kujitawala ya kujitawala (Kielelezo 3A). Panya walifundishwa kufanya majibu ya pua kwa cue kutabiri utoaji wa sucrose kwenye bandari iliyo karibu (kama ilivyo kwa Tye et al., 2008). Ili kuturuhusu kutofautisha majibu ya neva kwa pua na kidokezo, cue na sucrose zilitolewa kwa ratiba ya uimarishaji wa sehemu, ambapo 50% ya vipuli vya pua viliunganishwa na cue na utoaji wa sucrose.

Aina ya vitengo vya 1 ilionyesha majibu ya phasic ya kuingia kwa bandari, kama inavyoonekana katika kitengo cha Aina ya 1 (Kielelezo 3B), na pia data ya idadi ya watu kwa vitengo vya Aina ya 1Kielelezo 3C). Majibu ya phasic ya vitengo vya Aina ya 2, hata hivyo, yalionyesha majibu zaidi kwenye utabiri wa utabiri wa malipo (Takwimu 3D na 3E). Mifumo ya kawaida ya kurusha ya neuroni zote zilizorekodiwa (n = 198, imegawanywa katika Aina ya 1, 2, 3, na vitengo visivyo vya kujibu) huonyeshwa kwa kila sehemu ya kazi: vipuli vya pua vilivyooanishwa na cue, vidonda vya pua bila kukosekana, na kuingia kwa bandari ya sucrose (Kielelezo 3F). Vipengee vyote vya Aina ya 1 ambavyo vilionyesha mabadiliko ya phasic yanayofaa katika shughuli (74%; n = 14/19) zilikuwa za msisimko wa kimapenzi au zilizozuiliwa na kuingia kwa bandari ya sucrose, na idadi ndogo pia ikionyesha kizuizi cha phasic kwa ishara ya utabiri wa tuzo (Takwimu 3B, 3C, na 3G). Kwa kulinganisha, vitengo vya Aina ya 2 vilikuwa vyenye nguvu zaidi, na neurons zinazojibika kwa kazi zinazoingiliana na hiari hiari (35%), kuingia kwa bandari kwa hiari (26%), au uingiaji wa cue na bandari (12%; Takwimu 3D, 3E, na 3H). Ili kuonyesha nguvu ya majibu ya Aina ya 1 na aina ya 2 kwa hafla zinazohusiana na kazi, tulipanga kila kiini kwenye shamba la pande tatu kulingana na alama ya Z (Kielelezo 3I). Kuonyesha usambazaji wa mabadiliko ya phasic katika kurusha kwa matukio kadhaa yanayohusiana na kazi kwa kiwango cha ubora, tulipanga idadi ya seli za kila aina ya picha ambazo zilianguka katika kitengo fulani (Kielelezo 3J).

Kwa kuzingatia jukumu lililofafanuliwa vizuri la VTA katika kosa la utabiri wa thawabu (kwa mfano, upunguzaji wa kimapenzi wa DA neuron kurusha kwa kujibu upungufu uliotarajiwa wa tuzo na msisimko wa phasic kujibu utoaji wa tuzo usiyotarajiwa) (Schultz et al., 1997), tulichunguza ikiwa neuroni za LH zingeweka upungufu wa zisizotarajiwa wa tuzo ya sucrose. Ili kufanya hivyo, tulirekodi shughuli za neva za neva zinazohusika na picha wakati wa kazi sawa ya ujira katika wanyama waliofunzwa vizuri lakini kwa bahati mbaya tuliacha 30% ya uwasilishaji wa sucrose kufuatia cue (Kielelezo 4A).

Sehemu nyingi za Aina ya 1 (88%; n = 15/17, usambazaji wa binomial, p = 0.001) zilikuwa hazijali malipo ya upungufu (Takwimu 4B na 4D), wakati sehemu ndogo ya vitengo vya Aina ya 2 (67%; n = 12/18) ilionyesha jibu tofauti sana kwa majaribio yaliyowasilishwa na malipo-yaliyosimamishwa (Takwimu 4C na 4D). Tulihitimisha kuwa neurons za LH-VTA (Aina 1) ziliingiza kitendo cha kuingia bandarini, kwani majibu haya ya kuingia kwa bandari yalikuwa yanaendelea hata juu ya kuondoka kwa tuzo (Kielelezo 4D), tofauti na vitengo vya Aina 2 (chi-mraba = 10.9804, p = 0.0009).

Ili kubaini ikiwa majibu ya aina ya 1 kwa kuingia kwa bandari yalikuwa yamesisitiza majibu ya hali ya kawaida (CR), kinyume na utaftaji wa jumla wa ujiraishaji au tabia ya kuchungulia, tulirekodi kwenye panya ambalo halijafundishwa ambalo halijapata kazi hiyo. Katika panya wasio na kazi, tulipeleka bandari kwa kukosekana kwa cheni ya utabiri (utoaji wa malipo bila kutabiriwa) na kugundua kuwa vitengo vya Aina 1 havikuonyesha majibu ya phasic kwa kuingia kwa bandari (Takwimu 4E, 4F, na 4I), sanjari na mfano ambao Aina za 1 neurons huingiza CR (Kielelezo 4J).

Ifuatayo, kuamua ikiwa shughuli za kitengo cha 2 zinaendana na profaili ya majibu ya utabiri wa malipo, tulirekodi pia neuroni hizi kwa wanyama waliofunzwa vizuri wakati wa uwasilishaji wa malipo yasiyotabiri (Kielelezo 4G). Tuligundua kuwa sehemu ndogo ya vitengo vya Aina ya 2 ilijibu uwasilishaji wa sucrose usiotabirika (50%; Takwimu 4G-4I). Ikichukuliwa pamoja, vifaa vya vitengo vya Aina ya 2 ni nyeti kwa kukosekana kwa malipo yasiyotarajiwa (Takwimu 4C na 4D) na utoaji wa tuzo usiotabiriwa (Takwimu 4G-4I), sanjari na profaili ya majibu ya utabiri wa malipo.

Kama tulivyoonyesha hapo juu, vitengo vya Aina ya 1 vinawakilisha kiunganishi cha neural cha CR. Kwa kweli, ongezeko la kiwango cha kurusha huanza kabla ya CR, ikiongezeka hadi CR imekamilika (Takwimu 3B, 3C, na 4B). Ili kuamua ikiwa uanzishaji wa njia ya LH-VTA inaweza kukuza CR, tulitaka kujaribu uwezo wa uanzishaji wa LH-VTA katika kuendesha CR wakati wa matokeo mabaya. Katika panya wa aina ya mwituni, tulielezea ChR2-eyFP au zileFP pekee kwenye miili ya seli ya LH na kuingiza nyuzi za macho juu ya VTA (Takwimu 5A na S4). Kinyume chake, kujaribu jukumu la njia ya LH-VTA katika kupatanisha CR au tabia zinazohusiana na kulisha, tulielezea kwa pamoja NpHR-eYFP au eYFP peke yake kwenye seli za LH na kupandikiza nyuzi ya macho juu ya VTA (Takwimu 5A na S4).

Tuliandaa kazi ya hali ya Pavlovia ambayo panya waliokataliwa chakula walipaswa kuvuka gridi ya mshtuko ili kupata tuzo ya sucrose (Kielelezo 5B). Katika enzi ya "msingi" wa kwanza (na gridi ya mshtuko imezimwa), tulithibitisha kuwa kila panya alikuwa amepata kazi ya mkabala wa Pavlovia. Katika kipindi cha pili ("Mshtuko"), gridi ya mshtuko ilitoa mshtuko mdogo wa miguu kila sekunde. Mwishowe, katika enzi ya tatu ("Mshtuko + Mwanga"), tuliendelea kutoa mshtuko wa miguu lakini pia tuliangazia vituo vya LH katika VTA na taa ya samawati (10 Hz) katika panya zinazoonyesha ChR2 na kuendana na udhibiti wa eYFP na taa ya manjano (mara kwa mara) kwa panya wakionyesha NpHR na udhibiti wao wa eYFP (Kielelezo 5B).

Tuliona idadi kubwa zaidi ya viingizo vya bandari kwa cue wakati wa kipindi cha mshtuko + Mwanga na alama ya tofauti kubwa (Mshtuko wa taa - Mchanganyiko-mshtuko tu) katika panya wa ChR2 kwenye pice zaFF (Kielelezo 5C na Sinema S1). Kwa kulinganisha, picha za njia ya LH-VTA ilisababisha kupunguzwa sana kwa viingilio vya bandari kwa cue na alama tofauti katika panya wa NpHR na panya za eFF (Kielelezo 5D na Sinema S2). Majaribio ya kutoweka kwa kikao wakati wa maonyesho ya cue hayakufuatwa na uwasilishaji wa hiari yalionyesha hali kama hiyo ya athari (Kielelezo S4).

Kwa kweli, tulitaka kuamua ikiwa mabadiliko katika kutafuta sucrose ambayo tulipata yalisababishwa na mabadiliko katika tabia inayohusiana na kulisha au unyeti wa maumivu. Tuliona kuwa picha ya makadirio ya LH-VTA iliongezeka sana wakati uliotumika kulisha katika panya walio na chakula kizuri katika kundi la ChR2 (Kielelezo 5E). Walakini, picha ya njia ya LH-VTA haukupunguza sana kulisha (Kielelezo 5F), ingawa wanyama hawa walinyimwa chakula ili kuongeza uwezo wetu wa kugundua jamaa aliye na upunguzaji wa msingi (linganisha na wanyama walio kwenye Kielelezo 5E). Wala katika ChR2 (Kielelezo 5G) wala kikundi cha NpHR (Kielelezo 5H) je! Tuliona tofauti katika ucheleweshaji wa uondoaji mkia kutoka maji ya moto (Ben-Bassat et al., 1959, Grotto na Sulman, 1967), ikionyesha kuwa kudanganya makadirio ya LH-VTA haikuwa kubadilisha analgesia.

Ili kusoma muundo wa vifaa vya usafirishaji vya haraka vya pembejeo za LH kwa VTA ambavyo vilikuwa vinasababisha athari hizi, tulifanya rekodi za kubana-seli nzima kutoka kwa seli za VTA katika utayarishaji wa kipande wakati tunapowasha pembejeo za LH zinazoonyesha ChR2-eYFP (Takwimu 6A na S5). Kwa kuzingatia kuwa kuna ujamaa uliowekwa vizuri ndani ya VTA, pamoja na -65% neurons za DA, -30% GABA neurons, na -5% glutamate neurons (Margolis et al., 2006; Nair-Roberts et al., 2008, Yamaguchi et. al., 2007), tulijaza seli na biocytin wakati wa kurekodi kuruhusu utambulisho wa aina ya seli kwa kutumia immunohistochemistry ya baada ya hoc kwa tyrosine hydroxylase (TH; Kielelezo 6B), pamoja na kurekodi ujanibishaji wa sasa wa hyperpolarization (I_h) na ramani ya eneo la seli (Takwimu 6B na S5).

Kwanza, tulirekodi katika upigaji kura wa sasa wakati wa kupiga picha ya pembejeo ya ChR2-kuelezea LH na tuligundua kuwa 23 ya 27 neurons ilionyesha majibu yaliyofungwa kwa wakati wa upigaji picha wa pembejeo za LH (Kielelezo 6C). Sehemu kubwa ya neurons za DA zilizochapishwa katika VTA zilipokea pembejeo ya kusisimua kutoka kwa LH (56%), wakati sehemu nyingine ilionyesha kizuizi cha wavu (30%; Kielelezo 6C). Usambazaji wa anga wa neurons hizi za DA umewekwa kwenye ukuta kwa vipande vya usawa vyenye VTA (Kielelezo 6D).

Kuanzisha mchango wa monosynaptic wa pembejeo za LH kwa neurons za VTA DA, tulitumia ramani ya mzunguko iliyosaidiwa na ChR2, ambapo rekodi za voltage-clamp zilifanywa mbele ya tetrodotoxin (TTX) na 4-aminopyridine (4AP; Petreanu et al., 2007) . Sambamba na uchunguzi wetu kutoka kwa rekodi za sasa, tulibaini kuwa nyingi za VTA DA neurons zilizorekodiwa zilipokea tu maoni ya kusisimua ya monosynaptic kutoka kwa LH (67%), ikilinganishwa na neurons za VTA DA ambazo zilipokea tu pembejeo ya monosynaptic inayozuia (11%), au zote mbili (22%; Takwimu 6E na S6).

Tuligundua neuroni za VTA GABA kwa kuingiza fluorophore inayotegemea Uumbaji (AAV₅-DIO-mCherry) kwenye VTA ya VGAT :: Panya wa Cre na umetumia usemi wa mCherry kuelekeza kurekodi kwa neurons za VTA GABA (n = 24; Kielelezo 6F). Asilimia arobaini na sita ya neuroni za VTA GABA zilijibu kwa uchukuaji wa wavu, wakati 54% ilijibu kwa kizuizi chochote, kupiga picha kwa pembejeo za LR2-kuonyesha LH (Kielelezo 6G). Usambazaji wa anga wa seli hizi umeonyeshwa ndani Kielelezo 6H. Baada ya uchunguzi wa pembejeo ya monosynaptic kutoka LH (kama ilivyoelezwa hapo juu), tuligundua kuwa 18% ya sampuli za GABA zilizopokea sampuli zilipokea uingiliaji wa uchochezi tu na 9% ilipokea uingiliaji wa kiboreshaji pekee (Kielelezo 6I). Walakini, ikilinganishwa na neurons za VTA DA, tuligundua kuwa neurons nyingi za VTA GABA zilipokea GABA zote mbili za kusisimua na za kuzuia GABA_APembejeo ya monosynaptic ya R-mediated kutoka LH (73%; chi-mraba = 5.0505, p = 0.0246; Takwimu 6Mimi na S6).

Kwa kuzingatia kuwa rekodi zetu za zamani za vivo zilitoa ushahidi unaounga mkono uingizaji dhabiti kutoka kwa makadirio ya GABAergic na glutamatergic LH kwa VTA, baadaye tukachunguza jukumu la kila sehemu kwa uhuru. Ili kufanya hivyo, tulitumia laini za panya za transgenic zinazoelezea Cre-recombinase katika neurons ambazo zilionyesha msafirishaji wa glutamate 2 (VGLUT2) au msafirishaji wa GABA wa vesicular (VGAT). Tuliingiza AAV₅-DIO-ChR2-yeyFP au AAV₅-DIO-eyFP ndani ya LH ya VGLUT2 :: Cre na VGAT :: Panya za punda na kuingiza nyuzi za macho juu ya VTA (Kielelezo S7). Wanyama hawa wakati huo walikuwa wakiendeshwa kila moja ya tabia ya kuonyeshwa iliyoonyeshwa Kielelezo 5.

Hatukuona tofauti yoyote inayoonekana katika idadi ya viingilio vya bandari vilivyotengenezwa kwa cue kati ya panya kuelezea ChR2 au ileFP katika LH^glutMakadirio -VTA (Kielelezo 7A) au katika LH^GABAMakadirio -VTA (Kielelezo 7B). Walakini juu ya uchanganuzi wa video, tuligundua tabia mbaya za kusaga tabia kwenye LH^GABA-VTA: Kikundi cha ChR2 kwenye taa ya bluu-mwanga (ona Sinema S3 na S4). Katika LH^glutPanya -VTA, ingawa kulikuwa na mwelekeo kuelekea kupungua kwa kulisha juu ya upigaji picha katika kundi la ChR2 ikilinganishwa na kundi la EFP, hii haikuwa muhimu kwa takwimu (Kielelezo 7C). Kinyume chake, tuliona kuongezeka kwa nguvu kwa wakati uliotumiwa kulisha katika panya zilizopanda juu ya kuja kwenye LH^GABA-VTA: ChR2 kikundi cha jamaa na vidhibiti (Kielelezo 7D na Sinema S3). Katika kikundi chochote cha wanyama hakukuwa na athari ya kuchochea mwangaza katika ujio wa uondoaji wa mkia (Takwimu 7E na 7F).

Wakati wa kazi ya kulisha, kama tulivyofanya wakati wa kazi ya kutafuta-sucrose, tuligundua tena mlolongo wa gari zinazohusiana na kulisha ambazo hazijaelekezwa kwenye chakula. Tuliandaa panya ya mwakilishi katika LH^GABA-VTA: Kikundi cha ChR2 kwenye chumba wazi cha uwazi, na juu ya picha ya picha ya 20 Hz, tuliona mpangilio wa kawaida wa kupendeza kama vile kulamba na kusaga sakafu au nafasi tupu (Sinema S4). Tulielezea tabia hizi za "kusaga" wakati wa kazi ya kulisha katika aina ya LH-VTA ya porini (Kielelezo 7G), LH^glut-VTA (Kielelezo 7H), na LH^GABA-VTA (Kielelezo 7I) vikundi na kuonyesha kuwa LH^GABA-Vta: ChR2 panya zilizokua zaidi ya aina-mwitu au LH^glut-VTA: Panya za ChR2 wakati zinapigwa picha, ikilinganishwa na vikundi vyao vya EFP (Kielelezo 7J). Tulizingatia ikiwa tabia zinazohusiana na kulisha zinaweza kutengwa kutoka kwa kulishwa ipasavyo kwa masafa ya chini. Walakini, tulipojaribu LH^GABA-VTA: Kikundi cha ChR2 na 5 Hz na treni 10 za Hz za taa ya samawati, tumeona uhusiano sawa kati ya masafa ya kusisimua na kulisha na kutafuna (Kielelezo 7K).

Makadirio ya LH kwa VTA yamegunduliwa na masomo ya uchochezi wa umeme (Bielajew na Shizgal, 1986) na kwa muda mrefu imekuwa ikibadilishwa jukumu la kushughulikia malipo (Hoebel na Teitelbaum, 1962, Margules na Olds, 1962), bado ikionyesha hii jukumu limekuwa changamoto. Hapa, tunatoa mgawanyiko wa kina wa jinsi mambo ya kibinafsi ya mchakato wa kitanzi wa LH-VTA tofauti katika kazi inayohusiana na thawabu.

Kupitia utumiaji wa upigaji picha wa kati ya optogenetic (Kielelezo 1), tumegundua idadi mbili tofauti za neurons za LH: seli ambazo hutuma makadirio kwa VTA (Aina ya 1) na seli zinazopokea maoni kutoka VTA (Aina 2; Kielelezo 2) - Ingawa idadi hizi hazihitaji kuwa za kipekee, kwani inawezekana kwamba neurons za LH zinaweza kutuma na kupokea pembejeo kwenda na kutoka kwa VTA. Inafurahisha, tuligundua kwamba idadi ndogo ya picha za picha zilianguka nje ya usambazaji wa bimodal uliokuwa umefunga idadi hii ya watu wawili (Takwimu S2B na 1E). Kwa kuzingatia hii, pamoja na ucheleweshaji wa muda mrefu wa majibu ya picha ya Aina ya 2 (-100 ms), tunakisia kuwa kunaweza kuwa na njia moja kubwa inayochangia shughuli za Aina ya 2 ya neuroni. Kwa kuongezea, kwa sababu DA inamfunga vipokezi vyenye protini vya G, kinetiki ni polepole kuliko sinepsi nyingi za glutamatergic (Girault na Greengard, 2004) na inaweza kuelezea nguzo hii ya vitengo 100 vya latency photoresponsive. Inawezekana pia kwamba VTA inaweza kutoa maoni ya moja kwa moja kupitia maeneo mengine ya mbali, kupitia maeneo ya kati ya kusisimua kama amygdala, au kwa kuzuia kinga kupitia kiini cha mkusanyiko (NAc) au kiini cha kitanda cha stria terminalis (BNST).

Inafurahisha, wakati upigaji picha wa vitengo vya Aina ya 1 huibua majibu ya kusisimua katika vitengo vya Aina ya 2, Aina ya 1 na vitengo 2 huonyesha tabia tofauti za usimbuaji tabia. Kwa mfano, idadi ya vitengo vya Aina ya 1 na Aina ya 2 ambazo huchagua kidokezo cha utabiri wa thawabu ni tofauti sana (n = 0/19 Aina 1 dhidi ya n = 12/34 Aina ya 2, chi-mraba = 8.67, p = 0.003) . Mfumo huu wa majibu ya kushangaza inaweza kuwa ni kwa sababu ya michakato ya hesabu kwenye kipengee cha kati, kama vile VTA, ambayo inaweza kuwa ikicheza jukumu wakati wa kazi ya tabia lakini haifanyi kazi wakati wa kupiga picha. Kwa kuongezea, hali ya tabia ya mnyama inaweza kuathiri jinsi data hizi zinavyosindika.

Majaribio yetu ya kukomboa thawabu yalituruhusu kutofautisha kati ya LH neural encoding ya CR na matumizi ya kichocheo kisicho na masharti (US). Katika majaribio haya, sehemu ndogo ya vitengo vya Aina ya 2 ilijibu uchunguzi wa utabiri wa malipo (CS) na Amerika na pia ilionyesha kupungua kwa kiwango cha kurusha wakati tuzo zilizotarajiwa hazikuachwa. Kwa kuongezea, sehemu ndogo ya vitengo vya Aina ya 2 pia zinaonyesha uchochezi wa phasic juu ya utoaji wa malipo yasiyotarajiwa (Takwimu 4G na 4H). Takwimu hizi zinakumbusha njia DA neurons katika kosa la utabiri wa malipo ya VTA (Cohen et al., 2012; Schultz et al., 1997). Tunafikiria kwamba neurons za VTA zinaweza kupitisha ishara za makosa ya utabiri wa thawabu kwa seti ya neuroni za LH, ambazo zimewekwa vizuri kujumuisha ishara hizi kwa uamuzi wa pato la tabia inayofaa. Hasa, LH imeunganishwa kwa nguvu na maeneo mengi ya ubongo (Berthoud na Münzberg, 2011) na imekuwa ikihusishwa kwa sababu na majimbo ya homeostatic kama kulala / kuamka na njaa / shibe (Carter et al., 2009, Jennings et al. , 2013).

Tabia ya kulazimisha kutafuta tuzo imekuwa ikijadiliwa haswa katika muktadha wa uraibu wa dawa za kulevya, ambapo dhana ya kawaida ya utaftaji wa madawa ya kulevya imekuwa kuchunguza kiwango ambacho tabia ya utaftaji wa madawa ya kulevya inaendelea mbele ya matokeo mabaya, kama mshtuko wa mguu (Belin et al., 2008, Pelloux et al., 2007, Vanderschuren na Everitt, 2004). Tulibadilisha kazi hii kwa sucrose kutafuta kuturuhusu kuchunguza ikiwa uanzishaji wa njia ya LH-VTA ilitosha kukuza utaftaji wa lazima wa sucrose. Kwa kuzingatia kuwa tofauti tofauti kati ya malipo ya dawa na asili ni kwamba malipo ya dawa sio lazima kwa kuishi, kuna ubishani juu ya tabia zipi zingefanya tabia ya kulazimisha ya kutafuta au kutafuta chakula. Ufafanuzi mbadala wa data yetu ni kwamba uanzishaji wa njia ya LH-VTA inaongeza tu gari ya kushawishi au hamu ya kutafuta viboreshaji vya hamu. Kwa kuwa viwango vya unene kupita kiasi vimeongezeka katika miongo ya hivi karibuni (Mietus-Snyder na Lustig, 2008), ulaji wa kula kupita kiasi na ulevi wa sukari ni hali zilizoenea ambazo ni tishio kubwa kwa afya ya binadamu (Avena, 2007). Tabia ya kulisha katika panya iliyoshiba (iliyolishwa kabisa) baada ya uanzishaji wa njia ya LH-VTA inakumbusha tabia za kula zinazoonekana kwa wanadamu wanaopatikana na shida ya kula kupita kiasi (au shida ya kula-binge) (DSM-V).

Imependekezwa kuwa hatua zinazorudiwa husababisha malezi ya mazoea, ambayo yenyewe husababisha malipo ya lazima ambayo yanaonyesha tabia ya adha (Everitt na Robbins, 2005). Ugunduzi wetu wa kuwa neurons za LH-VTA huingiza kiingilio cha bandari tu baada ya kuweka alama zinaonyesha kwamba njia hii ni kwa hiari kushughulikia majibu ya hali halisi, sio hatua ya kuhamasishwa tu. Hii ni sawa na uchunguzi wetu kwamba kuamsha makadirio haya inaweza kukuza utaftaji wa malipo ya lazima katika uso wa matokeo mabaya (Kielelezo 5C), na pia kwa kukosekana kwa hitaji (kama inavyoonekana kwenye panya za ukubwa, Kielelezo 5E). Tafsiri hii imethibitishwa zaidi na kupatikana kwetu kuwa picha za njia ya LH-VTA kwa hiari inapunguza utaftaji wa kujiuliza (Kielelezo 5D) lakini haipunguzi kulisha katika panya wenye vizuizi vya chakula (Kielelezo 5F). Changamoto moja kubwa katika kutibu kulazimisha kupita kiasi au shida za kula chakula ni hatari ya kuathiri tabia ya kulisha kwa ujumla. Kwa mtazamo wa kutafsiri, tunaweza kuwa tumegundua mzunguko fulani wa neural kama shabaha ya maendeleo ya uingiliaji wa matibabu kwa kulazimisha kupita kiasi au ulevi wa sukari bila kutoa tabia ya kulisha asili.

Tunaonyesha kuwa pamoja na kipengee cha glutamatergic LH-VTA (Kempadoo et al., 2013), pia kuna sehemu muhimu ya GABAergic katika makadirio (Leinninger et al., 2009), na kwamba LH neurons huunganisha moja kwa moja kwenye DA na Neuroni za GABA katika VTA (Kielelezo 6). Walakini, kuna tofauti katika urari wa pembejeo ya kufurahisha / ya kuzuia ndani ya VTA DA na neurons za GABA.

Wakati tulitumia usindikaji wa immunohistochemical ili kuhakikisha kitambulisho cha neurons za VTA, pia tulipima I_h, hyperpolarization-imewashwa ndani kurekebisha cation isiyo maalum (Lacey et al., 1989, Ungless na Grace, 2012). Uwepo wa sasa huu umetumika sana katika masomo ya elektroniki kutambua neurons za DA, lakini imeonyeshwa kuwa iko tu katika idadi ndogo ya neurons za DA, iliyoainishwa na lengo la makadirio (Lammel et al., 2011). Ingawa hapo awali ilipendekezwa katika ukaguzi na Fields na wenzake kwamba "LH neurons zinaingiliana kwenye makadirio ya VTA kwa PFC, lakini sio zile zinazojitokeza kwa NAc" (Fields et al., 2007), data zetu zinaonyesha kwamba utata huu ufunguliwe kwa uchunguzi zaidi. Hata ingawa tuliona kikundi kidogo cha neurons za DA ambazo zilipokea msisimko wa wavu kutoka kwa LH na ilikuwa na mimi mdogo sana_h (sanjari na mPFC- au NAc medial shell-projecting DA neurons), tuliona pia kikundi cha chini cha DA ambacho kilipokea pembejeo za kupendeza na kuonyesha_h (inaambatana na sifa za neurons za DA zinazojitokeza kwa ganda la baadaye la NAc; Kielelezo S5; Lammel et al., 2011). Kinyume chake, neurons za VTA DA zilizopokea pembejeo ya vizuizi vya wavu zilionyesha I ndogo sana_h au ilikosa hii ya sasa, ambayo inalingana na dhana kwamba LH inapeleka pembejeo kubwa kwenye VTA DA neurons inayoangazia mPFC au ganda la medali la NAc. Tunaonyesha pia kuwa pembejeo za LH zinaweza kuzingatiwa katika VTA ya kati na ya baadaye, ikidokeza kwamba LH hutoa pembejeo kwenye VTA neurons na malengo anuwai ya makadirio, kwani inajulikana kuwa lengo la makadirio ya VTA linalingana kwa kiasi fulani na eneo la anga kando ya mhimili wa katikati ( Lammel et al., 2008).

Jukumu la njia ya LH-VTA katika kukuza tuzo hapo awali imepewa upeanaji wa glutamatergic katika VTA (Kempadoo et al., 2013), kwani mtangazaji wa CaMKIIα mara nyingi hufikiriwa kuwa anachagua neurons za makadirio ya kusisimua. Walakini, data zetu zinaonyesha wazi kuwa kuelezea ChR2 chini ya udhibiti wa mtangazaji wa CaMKIIcy pia inalenga neurons za makadirio ya GABAergic katika LH (Kielelezo 6).

Tabia ilichochewa na upigaji picha wa LH^GABANjia ya -VTA ilibatilishwa, kuelekezwa vibaya, na mbayaSinema S4). Tafsiri moja ni kwamba uanzishaji wa LH^GABANjia ya -VTA hutuma ishara kwa panya ambayo husababisha kutambuliwa kwa kistarehe ya hamu. Tafsiri mbadala ni kwamba LH^GABANjia ya -VTA inaweza kusababisha uwekaji wa motisha au "kutaka" kali, inayoendana na ishara ya msingi wa hali, lakini kwa kiwango kisicho cha kisaikolojia ambacho hutoa tabia hii inayohusiana na kulisha (Berridge na Robinson, 2003). Sanjari na hii, inawezekana kwamba uanzishaji wa LH^GABAMakadirio ya -VTA kwa kweli hutoa hisia kali za kutamani, au inahimiza kulisha. Walakini, majaribio yetu yanaonyesha kuwa uanzishaji wa LH^GABA-VTA haitoi kuongezeka kwa utaftaji wa kulazimishwa kwa sucrose, lakini hii inawezekana kwa sababu ya tabia mbaya ya kusaga na tabia ya kulaumi inayolenga vitu visivyo vya chakula kwenye chumba cha upimaji. Ingawa ni ngumu kuamua uzoefu wa panya wakati huu wa ujanja, ni wazi kuwa tabia zilizoelekezwa ipasavyo zinazohusiana na kulisha zinahitaji uanzishaji ulioratibiwa wa sehemu zote za GABAergic na glutamatergic ya njia ya LH-VTA.

Vidokezo vya optogenetic na pharmacogenetic ni zana zenye nguvu za kuanzisha uhusiano wa causal, bado hazifunuli hali ya asili, ya kisaikolojia ya vipengele vya mzunguko wa neural. Utafiti wetu unajumuisha habari juu ya kuunganishwa kwa kiunganishi, kazi ya asili inayotokea, na jukumu la njia ya LH-VTA, kutoa kiwango kipya cha ufahamu juu ya jinsi habari imejumuishwa katika mzunguko huu. Matokeo haya yanaonyesha umuhimu wa kuchunguza jukumu la neurons kwa kuunganishwa, pamoja na alama za maumbile. Neurons za LH-VTA zilizochaguliwa kwa hiari hatua ya kutafuta thawabu lakini haikuzungusha msukumo wa mazingira, wakati athari za kuridhisha na utabiri wa tuzo zilisambazwa na idadi kubwa ya watu walio na LH neurons chini ya VTA. Kwa kuongezea, tumegundua makadirio maalum ambayo yanahusiana kimsingi na utaftaji wa kutafuta-kutafuta na tabia ya kulisha. Uingilivu katika makadirio ya LH-VTA ni muhimu kwa kutoa usawa wa kukabiliana kati ya uhamasishaji wa kuendesha na kudhibiti tabia za kupendeza za hamu. Matokeo haya hutoa ufahamu unaofaa kwa hali ya kiolojia kama shida ya kulazimisha kupita kiasi, ulevi wa sukari, na ugonjwa wa kunona sana