Diabetologia. 2017; 60 (8): 1502-1511.
Imechapishwa mtandaoni 2017 Mei 20. do: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1abstract
Malengo / hypothesis
Kupindukia kwa mafuta ya kula husababisha unene kwa wanadamu na panya. Uchunguzi wa hivi karibuni kwa wanadamu na panya umeonyesha kuwa ulevi wa mafuta hushiriki utaratibu wa kawaida na ulevi wa ulevi, nikotini na narcotiki kwa suala la kukamilika kwa mifumo ya ujira wa ubongo. Imeonyeshwa kuwa lishe yenye mafuta mengi (HFD) hupata dopamine D2 receptor (D2R) ikionyesha ishara kwenye mpangilio, mdhibiti muhimu wa mfumo wa malipo ya ubongo, na kusababisha kupindukia kwa hedonic. Tuliripoti hapo awali kuwa kahawia maalum wa mchele maalum wa mchele or-oryzanol alipata upendeleo kwa HFD kupitia udhibiti wa hypothalamic. Kwa hivyo tuligundua uwezekano kwamba γ-oryzanol inaweza kurekebisha utendaji wa mfumo wa ujira wa ubongo katika panya.
Mbinu
Panya wa kiume C57BL / 6J walishwa HFD walitibiwa kwa kinywa na γ-oryzanol, na viwango vya viwango vya habari vya molekuli vilivyohusika katika kuashiria kwa D2R vilitathminiwa. Athari za γ-oryzanol kwenye methylation ya DNA ya mtangazaji wa D2R na mabadiliko ya baadaye ya upendeleo kwa mafuta ya lishe yalipimwa. Kwa kuongezea, athari za 5-aza-2'-deoxycytidine, kizuizi chenye nguvu cha DNA methyltransferases (DNMTs), juu ya upendeleo wa chakula, kuashiria kwa D2R na viwango vya DNMTs kwenye striatum vilachunguzwa. Athari za kinga za γ-oryzanol kwenye shughuli za DNMTs zilitathminiwa kwa enzymatic katika vitro.
Matokeo
Katika mashtaka kutoka kwa panya kulishwa na HFD, utengenezaji wa D2Rs ulipunguzwa kupitia kuongezeka kwa methylation ya DNA ya mkoa wa kukuza D2R. Utawala wa mdomo wa γ-oryzanol ulipunguza kujieleza na shughuli za DNMTs, na hivyo kurejesha kiwango cha D2R katika striatum. Uzuiaji wa kifamasia wa DNMTs na 5-aza-2'-deoxycytidine pia uliboresha upendeleo wa mafuta ya malazi. Sanjari na matokeo haya, uchunguzi wa enzymatic katika vitro ulionyesha kuwa γ-oryzanol ilizuia shughuli ya DNMTs.
Hitimisho / tafsiri
Tulionyesha kuwa γ-oryzanol inaongeza shinikizo la damu ya HFD-ikiwa ya mkoa wa kukuza wa D2R katika harakati za panya. Jaribio letu la majaribio linaangazia γ-oryzanol kama dutu ya kuahidi ya antiobesity na mali tofauti ya kuwa modeli ya riwaya ya epigenetic.
Vifaa vya ziada vya umeme
Toleo la mkondoni la kifungu hiki (doi: 10.1007 / s00125-017-4305) lina nyenzo za kukaguliwa za rika-iliyopitishwa lakini isiyosaidiwa, ambayo inapatikana kwa watumiaji walioidhinishwa.
kuanzishwa
Kuzidisha kwa hisa za watu feta, angalau sehemu, njia za kawaida zilizo na madawa ya kulevya, nikotini na dawa za kulevya [1]. Pamoja na udhibiti wa hypothalamic na homoni ya hamu ya kula, mfumo wa malipo ya ubongo, haswa ishara ya dopamine, inahusiana sana na tabia ya kulisha au ya hedonic [2]. Uchunguzi wa awali katika panya ulionyesha kuwa kushuka kwa dopamine ya dopamine D2 receptor (D2R) na lentivirus-Mediated fupi hairpin inayoingilia RNA haraka ikiwa na upungufu wa tuzo-kama malipo ya kulazimishwa na kutafuta chakula kama kulazimishwa.3]. Kwa sababu ya wiani wa D2R uliopunguzwa, hali ya dorsal haitoi sana thawabu ya chakula ikilinganishwa na vikundi vya kudhibiti konda kwa wanadamu feta na panya3-5]. Kulingana na wazo hili, TaqIA ala ya ANKK1 gene locus (encoding DRD2 / ankyrin kurudia na kinase domain iliyo na 1), ambayo hupungua uzalishaji wa D2R, inahusishwa na phenotype ya feta katika wanadamu [6], wakati athari za kupunguza uzito baada ya upasuaji wa bariatric zinahusishwa na wiani wa driatal D2R [7]. Takwimu hizi zinaonyesha umuhimu wa driatal D2R kama lengo la matibabu ya riwaya kwa matibabu ya ugonjwa wa kunona. Walakini, dawa zingine ambazo zilitengenezwa ambazo zilifanya kazi kwenye mfumo wa ujira wa ubongo zilisababisha athari mbaya, pamoja na shida kubwa za akili, na kusababisha kujiondoa kwao kliniki [8].
Marekebisho ya Epigenetic sio muhimu kwa maendeleo na tofauti, bali pia kwa sababu huibuka kama matokeo ya mabadiliko ya mazingira, pamoja na lishe na mtindo wa maisha [9]. Methylation ya DNA ni tukio kuu la epigenetic kwa utulivu wa usemi wa jeni [9]. Katika panya, mfiduo wa akina mama juu ya lishe yenye mafuta mengi (HFD) hubadilisha methylation ya DNA ndani ya mfumo mkuu wa ujira katika kizazi, na kusababisha kuzidishwa kwa HFD na watoto10]. Hasa, methyltransferases (DNMTs) zina jukumu muhimu katika udhibiti wa tabia ya kulisha na shughuli za mwili [10, 11], ikionyesha kuwa DNMTs zinaweza kuwa zinaahidi malengo ya matibabu kwa tiba ya ugonjwa wa ugonjwa wa ugonjwa wa kunona sana. Kwa kweli, vitu vingine vya asili vya chakula, pamoja na asidi ya kafeini na epigallocatechin, vinajulikana kama inhibitors za DNMT [12, 13].
Hivi karibuni tumeonyesha kuwa sehemu ya bioactive, kahawia maalum ya mchele, mchanganyiko wa esteri ya asidi ya asidi na phytosterols kadhaa, hupendelea upendeleo wa mafuta ya lishe kupitia kupungua kwa hypothalamic endoplasmic reticulum (ER) stress [14]. Katika panya na sungura, γ-oryzanol inasimamiwa kwa haraka kutoka kwa utumbo na kusambazwa hasa kwa ubongo [15, 16]. Kuchukua matokeo haya pamoja, bidhaa asilia zinazotokana na chakula zinazohusika kwenye mfumo mkuu wa neva zinaweza kuwa njia mbadala ya usalama wa tabia ya kulisha isiyo salama kwa fetma. Katika muktadha huu, tulijaribu nadharia kwamba or-oryzanol itabadilisha hadhi ya methylation ya DNA katika mfumo wa malipo ya ubongo, na kusababisha upendeleo wa HFD katika panya.
Mbinu
Wanyama
Panya wa kiume wa miaka saba C57BL / 6J panya waliopatikana kutoka Maabara ya Mto Charles Japani (Kanagawa, Japani) waliwekwa (3-4 kwa ngome) katika hali maalum-isiyo na vimelea kwa 24 ° C chini ya taa ya 12 h / 12 h / mzunguko wa giza. Baada ya juma la kuzoea, panya wenye umri wa wiki 8 walikuwa wamelinganishwa na kugawanywa katika vikundi viwili au vitatu kupitia kila jaribio. Panya waliruhusiwa kupata chakula na maji bure. Majaribio yote ya wanyama yalipitishwa na Kamati ya Maadili ya Jaribio la Wanyama wa Chuo Kikuu cha Ryukyus (Namba. 5352, 5718 na 5943).
Usimamizi wa γ-oryzanol na 5-aza-2'-deoxycytidine
Ili kutathmini upendeleo kwa HFD, γ-oryzanol (Wako Pure Chemical Viwanda, Osaka, Japan) ilitawaliwa na panya wa wiki ya 8 na gavage wakati wa jaribio la uchaguzi wa chakula kama ilivyoelezwa hapo awali [14, 17]. Kwa majaribio mengine, HFD (D12079B; Chakula cha Utafiti, New Brunswick, NJ, USA) iliyo na 0.4% γ-oryzanol ilitengenezwa kama pellets. Vipengele vya lishe vinaonyeshwa kwenye Jedwali la kuongeza umeme (ESM) Jedwali 1. Baada ya wiki 12 za kulisha, tishu zilikusanywa kutoka kwa striatum na hypothalamus. Ulaji wa kila siku wa γ-oryzanol, inakadiriwa kutoka kwa ulaji wa wastani wa panya, ulikuwa takriban 320 μg / g uzito wa mwili. Dozi za γ-oryzanol ziliamuliwa kama ilivyoelezwa hapo awali [14]. 5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) iliingizwa kwa njia ya ndani (0.25 μg / g uzito wa mwili) mara tatu kwa wiki kwa wiki 12 [18].
Makadirio ya upendeleo kwa mafuta ya malazi
Ili kutathmini upendeleo wa mafuta ya lishe, vipimo vya chakula vilitoa chaguo kati ya chow na HFD (D12450B na D12451; Lishe ya Utafiti) kama ilivyoelezwa hapo awali [14]. Vipengele vya lishe vinaonyeshwa kwenye Jedwali la ESM 1. Kwa kifupi, panya waliruhusiwa kupata bure kwa chow na HFD. Uingizaji wa chow na HFD ulipimwa kila wiki na kuchambuliwa kwa mabadiliko katika upendeleo wa mafuta ya lishe. Upendeleo wa HFD ulihesabiwa kulingana na fomula: Upendeleo wa HFD = [(ulaji wa HFD / ulaji wa jumla wa chakula) × 100].
Utaratibu wa Bisulphite kwa methylation ya DNA
DNA ilitakaswa kwa kutumia DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Tokyo, Japan). Suluhisho la DNA lilichanganywa na 3 mol / l NaOH iliyotengenezwa hivi karibuni, iliyowekwa kwa 37 ° C kwa dakika 15 na kuongezwa kwa 5.3 mol / l urea, 1.7 mol / l sodium bisulphite na 4.9 mmol / l hydroquinone. Suluhisho lilikabiliwa na mizunguko 15 ya ubadirishaji kwa 95 ° C kwa 30 s na incubation saa 50 ° C kwa dakika 15 [19]. Dawa ya kutibiwa ya baculphite ilitakaswa kutumia MinElute PCR Usafishaji Kit (QIAGEN) na ilisafishwa na PCR kwa kutumia KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix PCR Kit (KAPA Biosystems, Woburn, MA, USA) na primers kuzunguka eneo la CpG la mkoa wa kukuza D2 . Utaratibu wa primer ulikuwa kama ifuatavyo: primer ya mbele, 5'-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3 ′; kubadilisha nyuma, 5'-ACCCTACCCTCTAAACCACAACTAC-3 ′. Ifuatayo, mlolongo wa adapta uliongezwa na kusafishwa kwa kutumia Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Sampuli ziliwekwa kisha kupakiwa kwenye GS Junior (Roche Diagnostics, Tokyo, Japan) kwa kufuata kulingana na itifaki ya mtengenezaji. Kiwango cha methylation kilionyeshwa kama asilimia ya cytosines za methylated katika mabaki yote ya cytosines.
Dawa ya shughuli ya DNMT
Dawati ya shughuli ya enzymatic ya DNMT ilifanywa kwa kutumia shughuli ya EpiQuik DNA Methyltransferase / Enhibition Assay Kit (Epigentek Group, Brooklyn, NY, USA) na EPIgenible Methyltransferase Assay kit (Cisbio Japan, Chiba, Japan) kulingana na itifaki ya mtengenezaji.
Ili kutathmini shughuli za maonyesho ya kila kiunzi kwenye methylation ya DNA, malezi ya S-adenosyl-l-homocysteine (SAH) ilipimwa mbele ya kila kiwanja (20 μmol / l kwa majaribio ya uchunguzi), S-adenosyl methionine (SAM; 10 μmol / l) na DNMT substrate (4 ng / μl) ifikapo 37 ° C kwa dakika 90. Ili kutathmini kinetiki cha Michaelis-Menten, DNMT1 (20 μmol / l) iliwekwa na γ-oryzanol, SAM (5 μmol / l) na mkusanyiko ulioonyeshwa wa poly dI-dC saa 37 ° C kwa dakika 90. DNMT3a (100 μmol / l) na DNMT3b (100 μmol / l) ziliingizwa na γ-oryzanol, SAM (5 μmol / l) na mkusanyiko ulioonyeshwa wa poly dG · dC kwa 37 ° C kwa dakika 120. Majaribio yalifanywa mara nne. Protini iliyotolewa (0.75 mg / ml) iliingizwa na SAM (5 μmol / l), poly dI-dC (5 μg / ml), na poly dG · dC (5 μg / ml) kwa 40 ° C kwa dakika 120, na Uundaji wa SAH ulipimwa.
Mshtuko wa shughuli zinazohusu estrogen-receptor
Shughuli inayoweza kupingana ya γ-oryzanol kwenye receptor-γ inayohusiana na estrojeni (ERRγ) ilipimwa kwa kutumia Mfumo wa Uchambuzi wa Mtangazaji wa Gamma ya Binadamu wa Estrogen (INDIGO Bioscience, Chuo cha Jimbo, PA, USA) kulingana na itifaki ya mtengenezaji. Kwa kifupi, seli za mwandishi wa mamalia zisizo za kibinadamu zinazoelezea ERRγ inayofanya kazi zilifunuliwa kwa viwango vilivyoonyeshwa vya kila kiwanja kwa saa 24 kwa tatu.
Western blotting
Hii ilifanywa kama ilivyoelezwa hapo awali [20] na kingamwili dhidi ya D2R (1: 500, sungura), msafirishaji wa dopamine (DAT; 1: 500, sungura), tyrosine hydroxylase (TH; 1: 1000, sungura) (AB5084P, AB1591P na AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, USA), transducer ishara na activator ya transcript 3α (STAT3α; 1: 1000, sungura), DNMT1 (1: 1000, sungura), DNMT3a (1: 1000, sungura) (nambari 8768, 5032 na 3598; Tokyo, Japan), DNMT3b (1 μg / ml, sungura), ERRγ (1: 1000, sungura) na β-actin (1: 10,000, panya) (ab16049, ab128930 na ab6276; Abcam, Cambridge, MA, USA).
PP ya muda halisi ya PCR
Usemi wa genge ulipitiwa kama ilivyofafanuliwa hapo awali [14]. viwango vya mRNA walikuwa kawaida kwa Rn18s (18S rRNA). Seti za primer zinazotumiwa kwa uchambuzi wa wakati halisi wa PCR zimefupishwa katika Jedwali la ESM 2.
Uchambuzi wa takwimu
Takwimu zinaonyeshwa kama maana ± SEM. ANOVA ya njia moja na hatua zinazorudiwa ANOVA ikifuatiwa na vipimo vingi vya kulinganisha (njia ya Bonferroni-Dunn) ilitumika inapofaa. Ya Mwanafunzi t jaribio lilitumiwa kuchambua tofauti kati ya vikundi viwili. Tofauti zilizingatiwa kuwa muhimu kwa p <0.05.
Matokeo
Uzuiaji wa kifamasia wa DNMTs na 5-aza-dC ulipendekeza upendeleo wa mafuta ya malazi katika panya
Katika panya kulishwa HFD, methylation ya DNA katika mkoa wa kukuza wa D2R kwenye striatum iliimarishwa sana ikilinganishwa na panya kulishwa chakula cha mlo (Mtini. (Mtini.1a) .1a). Kwa upande mwingine, methylation ya hypothalamic DNA katika mkoa wa kukuza wa D2R ilionekana kuwa juu kuliko ile kwenye striatum chini ya chakula cha chow (p <0.01) (Mtini. (Mtini.1a, 1a, f) na haibadilishwa na HFD (Mtini. (Mtini.1f) .1f). Katika panya kulishwa HFD, augmented methylation ya DNA katika mkoa wa kukuza wa D2R katika striatum ilibadilishwa kwa matibabu na 5-aza-dC, kizuizi cha DNMT chenye nguvu (Mtini. (Mtini.1a) .1a). Kwa kulinganisha, methylation ya DNA katika mkoa wa kukuza wa D2R katika hypothalamus haibadilishwa sana na matibabu na 5-aza-dC (Mtini. (Mtini.1f) .1f). Katika striatum ya panya wa kiume wa wiki 20 walilisha HFD kwa wiki 12, kiwango cha mRNA na protini za D2R zilipungua sana (Mtini. (Mtini.1b, 1b, k, l). Kwa kulinganisha, viwango vya dopamine D1 receptors (D1Rs, zilizosimbwa na Drd1), ambayo hutenda kwa njia tofauti na D2Rs kwenye mzunguko wa adenylyl na kuashiria kwa ishara ya ndani ya cAMP, haikubadilishwa (Mtini. (Mtini.1c) .1c). Kwa kuongezea, hakukuwa na mabadiliko katika viwango vya molekuli zingine zinazohusiana na kuashiria kwa D2R, kama vile TH na DAT kwa kiwango cha mRNA na / au kiwango cha protini (Mtini. (Mtini.1d, 1d, e, k, m). Kwa upande mwingine, hakuna mabadiliko dhahiri yaliyoonekana kwenye hypothalamus, pamoja na D2R (Mtini. (Mtini.1g-m) .1g-m). Kwa kweli, kiwango cha protini cha D2R na TH katika hypothalamus kilikuwa cha chini sana kuliko ile kwenye striatum (Mtini. (Mtini.1l, 1l, m), ikiwezekana kuonyesha umuhimu wa jamaa wa kuashiria dopamine receptor katika mfumo wa malipo ya ubongo ukilinganisha na hypothalamus.
Kuchunguza ikiwa methylation ya DNA katika mkoa wa kukuza wa D2R ingebadilisha upendeleo kwa mafuta ya lishe, tabia ya kulisha ya 5-aza-dC-panya iliyotibiwa ilichambuliwa. Kama inavyotarajiwa, 5-aza-dC iliongezeka sana kiwango cha mRNA na kiwango cha protini kwa D2R kwenye striatum ya panya zilizo na HFD (Mtini. (Mtini.1b, 1b, k, l). Kwa upande mwingine, hakukuwa na athari kwa viwango vya Drd1, Th na Slc6a3 (encoding DAT) kwenye striatum, au kwa viwango vya Drd2, Drd1, Th na Slc6a3 katika hypothalamus (Mtini. (Mtini.1c-e, 1c-e, g-m). Wakati panya zilizotibiwa na gari hupendelea HFD, upendeleo kwa HFD ulipungua sana katika panya zilizotibiwa 5-aza-dC (88% ya maadili ya panya zilizotibiwa na gari) (Mtini. (Mtini.1n) .1n). Kwa hivyo, matibabu na 5-aza-dC ilipunguza faida katika uzani wa mwili (Mtini. (Mtini.11o).
γ-oryzanol hupungua viwango vya DNMTs katika panya ya panya iliyolishwa na HFD
Kama tulivyoripoti hapo awali [14], usimamizi wa mdomo wa γ-oryzanol kwa panya wa kiume kwa gavage kwa kiasi kikubwa ulipata upendeleo kwa HFD (93% ya maadili ya panya zilizotibiwa na gari) (Mtini. (Mtini.2a), 2a), kusababisha kupatikana kwa dhahiri ya kupata uzito wa mwili (Mtini. (Mtini.2b) .2b). Kwa hivyo tuligundua athari inayowezekana ya γ-oryzanol kwenye moduli ya epigenetic ya D2Rs kwenye striatum.
Katika mamalia, kuna DNMTs tatu kuu - DNMT1, 3a na 3b. DNMT1 inafanya kazi ya kudumisha methylation ya DNA, wakati DNMT3a na 3b zina jukumu la kuwezesha de novo DNA methylation [21]. Kuchunguza athari zinazowezekana za γ-oryzanol kwenye DNMTs katika vivo, tulipima viwango vya DNMTs kwenye akili za panya zilizopikwa na HFD. Ingawa HFD kwa se haikuwa na athari kwa mRNA na viwango vya protini ya DNMTs katika striatum au hypothalamus, nyongeza na γ-oryzanol ilipungua sana kiwango cha DNMTs kwenye striatum lakini sio kwenye hypothalamus (Mtini. (Mtini.2c-e, 2c-e, g-i, k-n). Hizi data huongeza uwezekano kwamba γ-oryzanol inaweza kudhibiti viwango vya DNMTs kwa njia maalum. Kwa mtindo kama huo, 5-aza-dC ilipungua sana kiwango cha mRNA cha DNMT3a na 3b haswa katika striatum (ESM Fig. 1a-d).
Kwa msingi wa utafiti uliopita kuonyesha kwamba kiwango cha mRNA cha DNMT1 kiliwekwa vizuri, angalau, kwa sehemu, na receptor ERRγ [22], tulikagua athari inayowezekana ya γ-oryzanol kwenye shughuli za ERRγ. Katika seli zisizo za wanadamu zisizo za binadamu zinaonyesha wazi ERRγ inayofanya kazi, 4-hydroxy tamoxifen, agonist nguvu ya ERRγ, ilipungua sana shughuli za ERRγ. Kwa kumbuka, γ-oryzanol kidogo ilipungua shughuli za ERRγ (upunguzaji wa takriban 40% wa thamani ya ndani) (Mtini. (Mtini.3a) .3a). Kwa kweli, ERRγ ilionyeshwa sana katika striatum lakini sio katika hypothalamus (Mtini. (Mtini.3b-d) .3b-d). Kinyume na hali ya striatum, γ-oryzanol iliongezeka sana kiwango cha proteni cha DNMT1 tu kwenye hypothalamus (Mtini. (Mtini.2k, 2k, l). Matokeo haya yanaweza kuelezewa, angalau sehemu, na kupata yetu kwamba STAT3cy, mdhibiti mzuri wa kiwango cha DNMT1 [23], ilionyeshwa kwa kiasi kikubwa katika hypothalamus lakini sio kwenye striatum (Mtini. (Mtini.33e-g).
Ili kutathmini zaidi athari ya γ-oryzanol juu ya shughuli ya DNMTs katika vivo, malezi ya SAH, mpango wa juu wa methylation ya DNA na pia kizuizi dhaifu cha DNMTs, kilitathminiwa katika panya za γ-oryzanol zilizolazwa na HFD. Hakukuwa na mabadiliko makubwa katika malezi ya SAH katika ama striatum au hypothalamus kati ya HFD-kulishwa na panya-kulishwa (Mtini. (Mtini.2f, 2f, j). Kwa wazi, γ-oryzanol ilipungua sana malezi ya SAH kwenye striatum (Mtini. (Mtini.2f) 2f) lakini sio kwenye hypothalamus (Mtini. (Mtini.2j), 2j), kupendekeza kwamba γ-oryzanol inaweza kukandamiza shughuli za DNMTs kwa njia maalum katika panya zilizo na HFD.
Mchanganuo wa Enzymatic juu ya mali ya kinga ya γ-oryzanol kwa DNMTs katika vitro
Tulipima tena athari ya γ-oryzanol kwenye shughuli za DNMTs katika vitro. Uwezo wa kuzuia ya γ-oryzanol, asidi ya Feruri, 5-aza-dC, haloperidol (mwakilishi mpinzani wa D2R), quinpirole (mwakilishi wa D2R agonist) na SAH dhidi ya DNMTs ilipimwa. Kama udhibiti mzuri, SAH ilikubali shughuli za DNMTs kwa njia inayotegemea kipimo (Mch. (Mtini.4a-f) .4a-f). Kama inavyotarajiwa, haloperidol na quinpirole hawakuonyesha athari kwenye shughuli za DNMTs (ESM fig. 2). Kwa wazi, γ-oryzanol ilizuia kwa kiasi kikubwa shughuli za DNMT1 (IC50 = 3.2 μmol / l), 3a (IC50 = 22.3 μmol / l) na 3b (upeo wa vizuizi 57%) (Mtini. (Mtini.4d-f) .4d-f). Kwa kulinganisha, shughuli ya inhibitory ya asidi ya Ferulic, metabolite ya γ-oryzanol, ilikuwa chini sana kuliko ile ya γ-oryzanol (Mtini. (Mtini.44d-f).
Tulichunguza zaidi hali ya kinga ya γ-oryzanol kwenye DNMTs. Uundaji wa SAH ulipimwa kupima shughuli za kinga ya γ-oryzanol kwenye DNMTs katika vitro. Takwimu juu ya malezi ya SAH wakati wa methylation ya DNMT-mediated DNA zinaonyesha muundo uliodumu wa Michaelis-Menten kinetics kwa uwepo na kutokuwepo kwa γ-oryzanol (Mtini. (Mtini.4g-i) .4g-i). Katika DNMT1-upatanishi wa methali ya DNA, uchambuzi wa Eadie-Hofstee ulionyesha kuwa γ-oryzanol haikuonyesha athari yoyote kwenye V max ya malezi ya SAH (gari, 597 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 619 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 608 pmol / min), wakati γ-oryzanol inaonekana iliongeza K m (gari, 0.47 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.67 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.89 μg / ml) (Mtini. (Mtini.4j) .4j). Matokeo haya yanaonyesha kwamba γ-oryzanol inhibitisha DNMT1 angalau sehemu kwa njia ya ushindani. Kwa upande mwingine, kwa DNMT3a- na 3b-upatanishi wa methali ya DNA, γ-oryzanol ilipunguza V max ya malezi ya SAH (DNMT3a: gari, 85.3 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 63.1 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 42.5 pmol / min; DNMT3b: gari, 42.3 pmol / min; -oryzanol 2 μmol / l; 28.0 pmol / min, γ-oryzanol 20 μmol / l, 15.0 pmol / min) na, vile vile, K m kwa mwitikio huu (DNMT3a: gari, 0.0086 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.0080 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0058 μg / ml; DNMT3b: gari, 0.0122 μg / ml; oryzanol 2 μmol / l, 0.0097 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0060 μg / ml) (Mtini. (Mtini.4k, 4k, l). Matokeo haya yanaonyesha kwamba γ-oryzanol inhibitisha DNMT3a na 3b angalau kwa njia isiyo ya ushindani.
γ-oryzanol inaongeza viwango vya D2R katika msukumo wa panya zilizo na HFD
Tulijaribu tena kwamba γ-oryzanol itaongeza yaliyomo ya D2R kupitia kizuizi cha DNMTs. Katika panya zilizolishwa na HFD, usimamizi wa mdomo wa γ-oryzanol umepunguza sana methylation ya DNA ya metali katika mkoa wa kukuza wa D2R (Mtini. (Mtini.5a), 5a), wakati haikufanya hivi kwenye hypothalamus (Mtini. (Mtini.5f) .5f). Kulingana na matokeo haya, mRNA na viwango vya protini ya D2R ziliongezeka mara kwa mara (Mtini. (Mtini.5b, 5b, g, k, l). Sawa na data juu ya matibabu na 5-aza-dC (Mtini. (Mtini.1), 1), hakukuwa na athari dhahiri kwenye RNA na viwango vya protini ya Drd1, Th na Slc6a3 (DAT) kwenye striatum, na hakuna athari kwenye viwango vya Drd1, Th na Slc6a3 katika hypothalamus (Mtini. (Mtini.5c-e, 5c-e, h-k, m).
Uchunguzi wa awali umeonyesha kuwa viwango vya D2R na DNMT1 vinasimamiwa na mafadhaiko ya ER na uchochezi angalau sehemu kupitia NF-κB [17, 24, 25]. Kwa hivyo tulichunguza viwango vya geni vinavyohusiana na mafadhaiko na yanayohusiana na uchochezi. Kama ilivyoonyeshwa hapo awali [26], HFD iliongezeka usemi wa aina ya kuingiza TNF-α (Tnfa), proteni ya monocyte chemoattractant – 1 (MCP-1) (Ccl2), C / EBP protini ya homologous (Chop), ER-iliyotengwa DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) na fomu iliyoangaziwa ya X -UMX inayoshughulikia protini 1 (Xbp1s) katika hypothalamus lakini sio kwenye striatum (Mtini. (Mtini.6) .6). Kwa kweli, nyongeza ya HFD na γ-oryzanol ilipunguza kwa kiasi kikubwa usemi uliodhabitiwa wa Ccl2, Chop, Dnajb9 na Xbp1s peke katika hypothalamus lakini sio kwenye striatum (Mtini. (Mtini.66).
Majadiliano
Upataji mkubwa katika utafiti wa sasa ni kwamba γ-oryzanol hufanya kazi kama kizuizi cha nguvu cha DNMT kwenye striatum ya panya, na hivyo hupata maoni, angalau sehemu, upendeleo kwa HFD kupitia moduli ya epigenetic ya D2R. Katika striatum kutoka kwa panya zilizochomwa na HFD, viwango vya D2R vilipunguzwa sana, wakati zile za D1R, TH na DAT hazibadilishwa (Mtini. (Mtini.1b-e, 1b-e, k-m). Hizi data ni sawa na wazo kwamba dysregulation ya driatal D2R ina jukumu muhimu katika mtazamo wa malipo ya chakula wakati juu ya HFD, na kusababisha kuzidisha heonti ya HFD katika wanyama feta.3]. Katika utafiti wa sasa, matibabu ya panya zilizo na HFD zilizo na 5-aza-dC ziliongezeka sana viwango vya striatal D2R (Mtini. (Mtini.1b, 1b, k, l) ikiwezekana kupitia kupunguzwa kwa kiwango cha methylation ya DNA katika mkoa wa kukuza D2R (Mtini. (Mtini.1a), 1a), na kwa hivyo kupatikana kwa upendeleo wa mafuta ya malazi (Mtini. (Mtini.1n) .1n). Utaftaji huu pia unaunga mkono jukumu muhimu la D2R striat katika mtazamo wa thawabu ya chakula wakati wa HFD.
Uwezo wetu wa vitro ulionyesha kuwa shughuli ya kinga ya γ-oryzanol dhidi ya DNMTs dhahiri ilikuwa na nguvu kuliko ile ya asidi ya asidi ya metabolite (Mtini. (Mtini.4d-f), 4d-f), ikionyesha umuhimu wa muundo kamili wa γ-oryzanol kwa hatua yake ya kuzuia kwenye DNMTs. Katika panya zilizolishwa na HFD, masomo yetu yanaonyesha kuwa, baada ya usimamizi wa mdomo, γ-oryzanol hufikia ubongo kama muundo kamili na hupunguza viwango na shughuli za DNMTs upendeleo katika striatum, na kupungua kwa matokeo ya methylation ya DNA katika mkoa wa kukuza D2R kwenye striatum. Kwa kuongezea, masomo yetu ya vitro yameonyesha kuwa γ-oryzanol hufanya kazi kama mpinzani dhidi ya ERRγ, ambayo kimsingi ni mdhibiti mzuri wa uzalishaji wa DNMT1 [22], na kwa sababu hiyo ilipungua shughuli ya DNMT1 (Mtini. (Mtini.3a) .3a). Kwa kweli, ERRγ ilionyeshwa sana katika striatum lakini sio katika hypothalamus katika panya (Mtini. (Mtini.3b) .3b). Hizi data zinaonyesha kwamba γ-oryzanol ina uwezo wa kupungua kiwango cha mRNA cha DNMT1, angalau sehemu, kupitia kizuizi cha ERRγ. Kinyume na striatum, γ-oryzanol hakuonyesha athari kwa kiwango cha D2R katika hypothalamus kutoka kwa panya zilizo na HFD (Mch. (Mtini.5g, 5g, k, l).
Kwa upande mwingine, tulionyesha kuwa γ-oryzanol iliongezeka sana viwango vya DNMT1 kwenye hypothalamus lakini sio kwenye striatum (Mtini. (Mtini.2k, 2k, l). Imeonyeshwa kuwa STAT3 inaongeza yaliyomo kwenye DNMT1 katika seli mbaya za T-lymphoma [23]. Kwa kweli, hapo awali tulionyesha kwamba γ-oryzanol iliongezeka sana fosforasi ya leptin-ikiwa na STAT3 katika hypothalamus kutoka kwa panya zilizo na HFD [14]. Ikumbukwe pia kwamba STAT3cy ilionyeshwa sana katika hypothalamus lakini sio kwenye striatum katika panya (Mtini. (Mtini.3e-g) .3e-g). Hizi data zinatujaribu kubashiri kuwa tofauti dhahiri ya athari ya or-oryzanol kwenye viwango vya DNMT1 kati ya hypothalamus na striatum inaweza kuhusishwa, angalau sehemu, kwa yaliyomo katika mkoa maalum wa STAT3cy na ERRγ katika ubongo wa panya. Mtini. (Mtini.3b-g) .3b-g). Kwa pamoja, inaonekana kuna muundo wa kurudisha wa usemi wa ERRγ na STAT3cy kati ya striatum na hypothalamus katika panya. Kwa msingi wa matokeo yetu, kwa hivyo ni busara kudhani kwamba katika hali ya striatum, ambapo uzalishaji wa ERRγ ni mwingi, γ-oryzanol inaweza kupungua kiwango cha mRNA na shughuli za enzyme ya DNMT1 kama mdhibiti hasi wa ERRγ. Kwa kulinganisha, katika hypothalamus, ambapo uzalishaji wa STAT3α ni mkubwa, γ-oryzanol inaweza kuongeza viwango vya DNMT1 haswa.
Utafiti wa hivi karibuni umeonyesha kuwa kusanyiko la striatal D2R kuashiria ikiwa na tabia ya kulisha ya dysregulates ya HFD [3], kupendekeza umuhimu wa kuzuia maonyesho ya DNMTs za kutibu ugonjwa wa kunona. Kwa upande mwingine, utafiti uliopita ulionyesha uwezekano kwamba hali ya methylation ya DNA ya receptor 4 jeni la melanocortin iliyoonyeshwa katika nukta maalum ya hypothalamic inaweza kubadilisha aina ya ugonjwa wa kunenepa katika panya wa njano anayeweza [27]. Ingawa tafiti zaidi zinahitajika kuainisha mifumo ya msingi, tafiti hizi zinaonyesha umuhimu wa tishu, gene- na mlolongo maalum wa methylation ya DNA katika pathophysiology ya ugonjwa wa kunona sana wa HFD.
Hivi majuzi tuliripoti kwamba HFD iliongezeka kiwango cha D2R katika vijisumbua vya panya vya pancreatic17, 24]. Inawezekana kwamba uboreshaji kama huo umeingiliwa, angalau sehemu, na mafadhaiko na uchochezi kupitia NF-κB, kwa sababu kuna mambo kadhaa ya msikivu wa NF-κB katika mkoa wa kukuza wa D2R [17, 24]. Kwa kuongezea, utafiti wa hivi karibuni umeonyesha kuwa TNF-α na IL-1β zinaongeza kiwango na shughuli za DNMT1 katika tishu za adipose kutoka kwa panya zilizo na HFD [25]. Kwa maana, utafiti wa sasa ulionyesha kuwa HFD ilichochea mafadhaiko ya ER na kuvimba haswa katika hypothalamus lakini sio kwenye striatum (Mtini. (Mtini.6) .6). Mifumo ya kina ya tishu-, mkoa-, na tovuti maalum ya methylation ya DNA na uharibifu wa mazingira katika dhana yetu ya majaribio lazima isubiri uchunguzi zaidi.
Pamoja na ripoti yetu ya zamani inayoonyesha kwamba γ-oryzanol hupata upendeleo kwa HFD kupitia kanuni ya hypothalamic ya mafadhaiko ya ER katika panya [14], γ-oryzanol pia inawakilisha mali ya kipekee ya kuongeza usawazishaji wa hedonic na metabolic ya tabia ya kulisha. Kwa sababu dawa zingine za antiobesity ambazo zimetengenezwa zinajulikana kusababisha athari mbaya [8], njia ya asili ya msingi wa chakula kuelekea mfumo wa thawabu ya ubongo inatarajiwa kutunza salama ugonjwa wa ugonjwa wa kunenepa sana [16]. Katika dhana hii, γ-oryzanol ni mgombea anayeahidi wa antiobesity na mali tofauti ya kuwa modeli ya epigenetic.
Shukrani
Tunashukuru kwa S. Okamoto (Chuo Kikuu cha Ryukyus, Japan) kwa kukagua maandishi. Tunamshukuru M. Hirata, H. Kaneshiro, mimi Asato na C. Noguchi (Chuo Kikuu cha Ryukyus, Japan) kwa usaidizi wa sekretarieti.
Vifupisho
| 5-aza-dC | 5-aza-2'-deoxycytidine |
| D1R | Dopamine D1 receptor |
| D2R | Dopamine D2 receptor |
| Dat | Dopamine transporter |
| DNMT | DNA methyltransferase |
| ER | Retopulum endoplasmic |
| ERR | Receptor inayohusiana na estrogeni |
| HFD | Lishe yenye mafuta mengi |
| SAH | S-Adenosyl-l-homocysteine |
| SAM | S-Adenosyl methionine |
| STAT3cy | Transducer ya ishara na manzishaji wa maandishi 3cy |
| TH | Tyrosine hydroxylase |
Vidokezo
Upatikanaji wa data
Karatasi zinazozalishwa na / au kuchambuliwa wakati wa utafiti wa sasa zinapatikana kutoka kwa mwandishi anayeandamana juu ya maombi yanayofaa.
Fedha
Kazi hii iliungwa mkono na sehemu ya Ruzuku ya Msaada kutoka Jumuiya ya Japani ya kukuza Sayansi (JSPS; KAKENHI Grant Hesabu 15K19520 na 24591338), Baraza la Sayansi, Teknolojia na Ufundi wa ubunifu (CSTI), Mkakati wa kukuza mikakati ya ubunifu wa mawaziri. (SIP) 'Teknolojia za kuunda kilimo cha vizazi vijavyo, Misitu na Uvuvi', Taasisi ya Lotte, Jumuiya ya Kijapani ya Enzymology, Jumuiya mpya ya Maendeleo ya Teknolojia ya Viwanda (NEDO), Mradi wa Mabadiliko ya Mtandao wa Sayansi ya Maisha (shamba la Madawa ) (Mkoa wa Okinawa, Japani) na Mradi wa Uendelezaji wa Kichocheo cha Matibabu cha mkoa wa Okinawa, Japani, pamoja na ruzuku kutoka Jimbo la Okinawa la kukuza dawa ya juu (Jimbo la Okinawa, Japani).
Uso wa riba
Waandishi hutangaza kuwa hakuna dala ya maslahi inayohusishwa na nakala hii.
Taarifa ya michango
CK na HM iliyoundwa utafiti. CK na TK walifanya majaribio na kuchambua data. TK, CS-O, CT, MT, MM na KA walichangia kutafsiri kwa data. CK na HM waliandika maandishi hayo. Waandishi wote walichangia tafsiri ya data. Waandishi wote walijiunga na kurekebisha maandishi hayo na kupitisha toleo lake la mwisho. HM ndiye mdhamini wa kazi hii, alikuwa na ufikiaji kamili wa data zote na inachukua jukumu kamili kwa uadilifu wa data na usahihi wa uchambuzi wa data.
Maelezo ya chini
Vifaa vya ziada vya umeme
Toleo la mkondoni la kifungu hiki (doi: 10.1007 / s00125-017-4305) lina nyenzo za kukaguliwa za rika-iliyopitishwa lakini isiyosaidiwa, ambayo inapatikana kwa watumiaji walioidhinishwa.
Marejeo
;