Proc Natl Acad Sci Marekani A. 2014 Apr 22; 111 (16): E1648-E1655.
Imechapishwa mtandaoni 2014 Mar 24. do: 10.1073 / pnas.1315542111
PMCID: PMC4000785
Neuroscience
John W. Muschamp,a,1 Jonathan A. Hollander,b Jennifer L. Thompson,c George Voren,b Linda C. Hassinger,a Sara Onvani,a Theodore M. Kamenecka,b Stephanie L. Borgland,c Paul J. Kenny,b na William A. Carlezon, Jr.a
TazamaKupinga majukumu ya kuchochea dynorphin na hypocretin kwa malipo na motisha”Juzuu ya 111 kwenye ukurasa wa 5765.
TazamaTaarifa za Ufanisi wa PNAS”Juzuu ya 111 kwenye ukurasa wa 5771.
Makala hii imekuwa imetajwa na makala nyingine katika PMC.
Umuhimu
Hypocretin (orexin) na dynorphin ni neuromodulators ambazo zina jukumu muhimu katika kusimamia athari na motisha. Orexin ni muhimu kwa malipo na inahusishwa na kutafuta madawa ya kulevya, wakati dynorphin hupatanisha mood mbaya na inahusishwa na majimbo kama vile unyogovu. Kuzingatia madhara haya yanayopinga, inaripoti kwamba peptidi zote mbili zinaonyeshwa katika neurons sawa na zimehifadhiwa ni za kinyume. Hapa, tunaonyesha kwamba orexin na dynorphin hupendekezwa ndani ya vifupisho sawa vya synaptic na kwamba hii rangi ya rangi ina ushawishi mkubwa juu ya malipo, dawa za kulevya, na tabia kama ya msukumo. Ukweli kwamba orexin huwa na madhara ya kutosha ya dynorphin yanabadilisha sana jinsi tunavyoona jukumu la kazi ya orexin katika ubongo.
abstract
Hypocretin (orexin) na dynorphin ni neuropeptides na vitendo vya kupinga juu ya tabia iliyohamasishwa. Orexin inahusishwa katika mataifa ya kuchochea na malipo, wakati dynorphin inahusishwa na majimbo yanayoteseka. Tunaonyesha kwamba, licha ya vitendo vyao vya kupinga, peptidi hizi zinatengenezwa katika vifupisho sawa vya synaptic ndani ya hypothalamus. Kuvunjika kwa kazi ya orexin huwaathiri athari za athari za hypothalamic (LH) za nyuma, hupunguza uchochezi wa cocaine, na hupunguza cocaine kujitegemea utawala. Uchanganyiko unaofaa wa kazi ya dynorphin inaruhusu mabadiliko haya ya tabia. Tunaonyesha pia kwamba orexin na dynorphin wana matendo ya kupinga juu ya msukumo wa eneo la vera (VTA) la dopamine neurons, lengo la pekee la neuroni zilizo na orexini, na kwamba upinzani wa intra-VTA orexini husababisha kupungua kwa cocaine binafsi-utawala na LH kujisifu ambazo zinaingiliwa na ugomvi wa dynorphin. Matokeo yetu yanatambua mchakato wa kipekee wa simu ambayo orexin inaweza kuharibu vizuizi vya malipo-kuinua madhara ya dynorphin ya msingi na hivyo kufanya kwa njia ya vibali ili kuwezesha malipo.
Orexin inakuza kuamka (1) na imehusishwa na madhara ya chakula (2, 3), tabia ya ngono (4), na madawa ya kulevya (5, 6). Inazalishwa hasa ndani ya hypothalamus (7), na hufanya saa ya orexin 1 receptor (OX1R) na OX2R (pia inajulikana kama Hcrt-R1 na Hcrt-R2), ambayo inaelezwa katika maeneo mengi ya ubongo, ikiwa ni pamoja na eneo la kijiji cha vita (VTA) ya midbrain (8). Dynorphin, kinyume chake, imeelezwa sana, inalenga tabia za kujisikia, na ina jukumu muhimu katika kupatanisha madhara ya aversive ya dhiki (9, 10). Activation ya receptor kappa-opioid (KOR), receptors ambayo dynorphin hufanya (11), inaweza kupunguza madhara ya madawa ya kulevya (12, 13) kupitia vitendo ambavyo vinapatanishwa, angalau kwa sehemu, ndani ya mifumo ya dopamine (DA) ya midbrain (14, 15). Licha ya madhara yao yanayothibitisha juu ya msukumo, kuna ushahidi kwamba peptidi hizi zinaweza kutenda kwa kiti; kwa mfano, orexin na dynorphin hutolewa wakati wa kuchochea umeme wa hypothalamus (16). Kama neurons DA, orexin na neurons dynorphin kuongeza shughuli zao kwa kukabiliana na kuchochea uchochezi kama malipo na stressors (17). Madhara ya kazi ya mfano huu wa msongamano wa neuropeptide juu ya mifumo ya malipo ya ubongo, na, kwa upande mwingine, juu ya tabia iliyohamasishwa, haijulikani kwa sababu orexin na dynorphin hazijasomwa pamoja. Kutokana na madhara yao ya kupinga juu ya tabia na physiolojia ya neuronal wakati kujifunza peke yake, inaweza kuwa hypothesized kwamba utawala katika madhara ya peptide moja juu ya nyingine inaweza kusababisha sana tabia tofauti phenotypes katika ufanisi wa fidia. Kwa mfano, ishara kubwa ya orexini inaweza kuongeza ushuhuda wa thawabu na kutafuta malipo, wakati kuashiria dynorphin kubwa kunaweza kusababisha kupungua kwa usiri na anergia. Kwa sababu mataifa haya yana umuhimu mkubwa kwa magonjwa ya akili kama vile kulevya na unyogovu, ambapo usindikaji wa malipo ni shida, tulijitahidi kuchunguza jinsi hizi peptidi, pekee na kwa pamoja, zinaathiri tabia zinazohamasishwa na mzunguko wa VTA DA unaowadhibiti. Ili kufanya hivyo, tumeutumia EM kuelezea rangi ya rangi ya peptidi katika ngazi ya miundo, pamoja na mbinu za tabia ambazo zinaweza kutambua uelewa wa mzunguko wa malipo ya ubongo, udhibiti wa msukumo, na kuchukua dawa za kulevya, baada ya uharibifu wa dawa au maumbile ya mfumo wa orexin-dynorphin. Zaidi ya hayo, tulitumia electrophysiolojia ili kujua jinsi uwepo wa orexin na dynorphin, peke yake au unaochanganywa na wapinzani katika mapokezi yao, huathiri excitability ya neurons ya VTA DA.
Matokeo
Orexin na Dynorphin ni Wafanyabiashara.
Tulihakikishia upungufu wa orexini na dynorphin ndani ya neurons sawa ya mviringo wa panya, uharibifu, na hypothalamus ya dorsomedial kwa kutumia microscopy ya fluorescence (18) (Mtini. 1A). Uwepo wa neurons ambao huonyesha wasambazaji wengi umeelezewa katika duru nyingine za ubongo na inaweza kuwakilisha msingi wa neural kwa kuchuja utaratibu ambao kutolewa kwa washauri wa neurotransmitter waliojitokeza hutokea kwa viwango vya kutofautiana vya kurusha (19). Kutumia EM, tuligundua, hata hivyo, kuwa orexin na dynorphin hupigwa rangi ndani ya vipodozi sawa vya synaptic. Mara nyingi matukio ya uhamasishaji walizingatiwa katika mchakato usiojulikana, taratibu za ugonjwa wa damu, ambapo immunolabeling ilipatikana ndani ya vidole au karibu. Ndani ya miili ya kiini ya neuronal, uandikishaji muhimu ulihusishwa na tata ya Golgi, ambapo hakuna hata ilipatikana katika nuclei iliyo karibu (Mtini. 1 B na C). Dendrites pia yalikuwa na lebo ya kuhusishwa kwa peptidi zote mbili, zinaonyesha kutolewa kwa dendritic ya watumaji hawa. Nambari ndogo ya maelezo ya miundombinu imechukua vituo vilivyounganishwa na kusafirisha kwa peptidi zote mbili ziko katika sehemu kubwa (~100 nm) zilizopo nje ya eneo la kutolewa la synapses asymmetrical (Mtini. 1 B na C), kutoa msaada kwa hitimisho la kuwa orexin na dynorphin hufanya kazi kama watangazaji na kwamba, kwa hali ya kawaida, hutolewa pamoja badala ya kutofautiana kama kazi ya mzunguko wa kupiga kiini.
Mshahara-Kutoa Mipango ya Orexin Blockade Inabadilishwa na Dynorphin Blockade.
Ili kuchunguza umuhimu wa kazi ya mfano huu wa pekee wa kujieleza, tumejaribu ikiwa uharibifu katika orexini na dynorphin ishara inaweza kuathiri tabia tata zinazoonyesha motisha kawaida na aberrant. Katika C57BL / 6 panya zilizofundishwa kufanya uchangamfu wa kibinafsi (ICSS) zimeimarishwa na msukumo wa hypothalamic (LH) wa nyuma (20), blockade ya OX1Rs na N- (2-methyl-6-benzoxazolyl) -N "-1,5-naphthyridin-4-yl urea (SB334867) wakati wa awamu ya mwanga ilisababisha ongezeko la dozi linategemea kiwango cha malipo (Mtini. 2A; njia moja ya mara kwa mara ANOVA kwa Dose: F3,12 = 4.44, P <0.02). Ongezeko la vizingiti vya ICSS huonyesha upunguzaji unaosababishwa na matibabu katika athari ya kusisimua, ishara inayofanana na unyogovu inayoonyesha kupungua kwa unyeti wa malipo (20). Athari hii haikutolewa na sedation au uharibifu mwingine wa tabia isiyo ya kawaida, kwa sababu viwango vya majibu ya ICSS hayakuathiriwa (Mtini. 2B; njia moja ya mara kwa mara ANOVA kwa Dose: F3,24 = 0.33, P > 0.80).
Upeo katika vizuizi vya malipo unasababishwa na SB334867 ulizuiliwa na utangulizi na wala-binaltorphimine (norBNI) [hatua mbili za mara kwa mara ANOVA kwa Dawa (kati ya suala hilo) × Dose SB (ndani ya suala hilo) F3,24 = 3.98, P <0.01], ambayo hutoa kizuizi cha kudumu cha vitendo vya dynorphin kwenye KORs (10). Takwimu hizi zinaonyesha kuwa kupoteza kwa ishara ya orexini huonyesha madhara ya antireward ya latent ya dynorphin ya msingi. Utawala wa norBNI peke yake haukupungua vizuizi vya malipo. Ingawa athari hii inaweza kuwa na uhusiano na pharmacodynamics ya kipekee ya norBNI na wengine antagonists KOR prototypical (10), inaweza pia kuonyesha kuwa kuna redundancy katika michakato ambayo hufanya kazi ya mzunguko wa upeo wa ubongo au kwamba ongezeko la phasic katika sauti ya orexin pekee (isiyopigwa na dynorphin ya msingi) haitoshi kutoa ishara ya malipo kutoka kwa tovuti ya kuchochea kwenye hypothalamus ya nyuma. Matokeo haya yanaweza kuonekana kuwa sawa na kazi ya wengine ambao walichunguza SB334867 kwenye kizingiti cha ICSS wakati wa giza awamu (21). Hata hivyo, kuna ushahidi mkubwa ambao hupungua kwa kazi ya orexin inaweza kuwa na matokeo ambayo hutegemea kama wanyama wanajaribiwa wakati wa awamu yao ya mwanga au giza. Kwa mfano, chakula na maji huhifadhi madhara yao ya malipo katika panya ya orexin KO wakati uhakiki unafanywa wakati wa giza lakini si wakati wa awamu ya mwanga (22), wakati ambapo tulifanya upimaji wetu wote wa tabia.
Kuweka localization madhara ya utawala wa mfumo wa SB334867 na norBNI juu ya ICSS, kikundi tofauti cha panya kilichangizwa na electrodes za LH za kuchochea na vn guide cannulae. Microinfusion ya SB334867 katika VTA imesababisha ongezeko la alama katika vizuizi vya malipo, ikionyesha kupungua kwa ufikiaji wa malipo. Ingawa intra-VTA wala BSI peke yake haikuwa na athari kwenye vizingiti vya ICSS, ilizuia madhara ya kuinua kizingiti cha infusion ya SB334867 (Mtini. 2C; njia moja ya mara kwa mara ANOVA kwa Madawa: F3,9 = 10.98, P <0.01). Ingawa infusions za dawa za ndani zilileta upunguzaji wa wastani katika viwango vya juu vya kujibu ikilinganishwa na sindano za dawa za kimfumo, athari hizi hazikufikia umuhimu wa takwimu (Mtini. 2D; njia moja ya mara kwa mara ANOVA kwa Madawa: F3,9 = 1.03, P = 0.112).
Impulsivity Iliyowekwa na Orexin na Dynorphin Transmission.
Impulsivity ina sifa ya upungufu katika kukandamiza tabia za kutafuta malipo, na kiwango cha juu cha msukumo ni kipengele cha kawaida cha magonjwa mengi ya akili (23). Madawa ya unyanyasaji, ikiwa ni pamoja na cocaine, inaweza pia kusababisha ongezeko la msukumo, ambayo ni hypothesized kuendesha maendeleo ya kulevya (24). Kuzingatia jukumu muhimu kwa orexin ya msingi na dynorphin katika kudhibiti uelewa kwa athari zawadi ya kuchochea LH katika mtihani wa ICSS, tunafikiri kuwa ushirikiano kati ya neva hizi mbili zinaweza kuathiri msukumo wa msingi na upungufu wa cocaine katika tabia hii. Impulsivity inaweza kupimwa katika panya kwa kupima majibu ya mapema katika kazi ya wakati wa majibu ya mfululizo wa 5 (5-CSRTT) (25), mfano wa wanyama unaofanana na mtihani wa utendaji ulioendelea kutumika kujifunza makini katika wanadamu. Kabla ya kukabiliana na mtihani huu huelekea kuwa chini chini ya hali ya kawaida na imezidishwa na madawa ya kulevya ambayo yanainua maambukizi ya DA (26). Tulitumia 5-CSRTT kuchunguza mchango wa mfumo wa orexin-dynorphin kwa tabia ya kihisia na ya kikaboni. Unapotumiwa peke yake, SB334867 ilipunguza zaidi idadi ya chini ya majibu ya mapema ya mapema (Mtini. 3A; F3,21 = 4.89, P <0.01). Upunguzaji huu ulitokea bila kukosekana kwa athari kwa usahihi wa majibu (F3,21 = 1.45, P = 0.25), latency retrieval latency (F3,21 = 0.91, P = 0.44), au idadi ya majaribio ya kuchochea yamekamilishwa (F3,21 = 1.46, P = 0.25), akionyesha kwamba hawakuwa kutokana na uangalifu wa uangalizi au magari. Utawala wa norBNI, hata hivyo, ilibadilisha madhara ya SB334867 juu ya kujibu mapema (Mtini. 3B; F3,18 = 0.45, P = 0.71), wakidai kuwa uhamisho wa dynorphin usio na upinzani ni muhimu katika kupatanisha madhara haya ya kupambana na dawa. Kutokana peke yake au kwa kuchanganywa na SB334867, walaBNI haikuzalisha athari juu ya hatua za usahihi wa majibu (F3,18 = 0.66, P > 0.58), kuchelewa (F3,18 = 3.09, P > 0.06), au idadi ya majaribio ya kichocheo yamekamilika (F3,18 = 2.38, P > 0.10). Matibabu ya mapema na SB334867 pia ilizuia kuongezeka mara mbili kwa kujibu mapema kunasababishwa na kokeni (Mtini. 3C; F6,24 = 5.84, P <0.01). Takwimu hizi hutoa ushahidi kwamba orexin neurotransmission inaweza kudhibiti tabia ya msukumo chini ya hali zote za kimsingi na zilizochochewa na cocaine kwa njia nyeti ya dynorphin.
Watawala wa Dynorphin Kupunguza Utawala wa Uwekezaji wa Cocaine katika OX1Panya R-Null.
Uvamizi wa kulevya huongezeka kwa kiasi kikubwa kwa watu wa msukumo, na ongezeko la cocaine-induced in impulsivity ni hypothesized kuchangia kuongezeka kwa kulevya (23, 27). Aidha, maambukizi ya orexin na maambukizi ya dynorphin yamekuwa yamehusishwa kwa uhuru katika kusimamia madhara ya cocaine na madawa mengine ya unyanyasaji (28-32). Tunafikiri kuwa mwingiliano kati ya orexini na uambukizi wa dynorphin unaweza kudhibiti moja kwa moja udhibiti wa madawa ya kulevya. Ili kuchunguza uwezekano huu, tulichunguza iv cocaine binafsi-utawala katika panya za kijiografia ambazo hazipatikani OX1R (OX1R- / -). Panya ya genotype hii huonyesha kiasi kikubwa cha cocaine kujitegemea utawala kwa kiasi kikubwa cha dozi (0.1-1 mg / kg kwa infusion) lakini kuonyesha majibu yasiyofanywa kwa ajili ya malipo ya chakula chini ya ratiba sawa ya kuimarisha (33), akisema kuwa kupunguza katika kuchukua cocaine si sekondari kwa upungufu katika utendaji tabia. Aidha, OX1R- / - panya huonyesha viwango vya kawaida vya cocaine binafsi-utawala wakati wa vikao vya awali vya tatu vya upatikanaji wa cocaine lakini kisha huonyesha haraka kupungua kwa cocaine (33). Tulihakikishia kipengee hiki kwa dozi ya mgongo wa 0.3 / kg kwa infusion, na kuonyesha kwamba ishara kupitia OX1Rs ina jukumu muhimu katika kuanzisha na kudumisha tabia ya cocaine self-administration [Mtini. 4; hatua mbili za mara kwa mara ANOVA, Genotype (kati ya suala la suala) × Dawa ya Madawa (ndani ya suala la sababu): F1,12 = 12.91, P <0.01]. Kama vile matibabu ya mapema na NorBNI yalirudisha ICSS ya kawaida na tabia kama ya msukumo katika panya zilizopewa SB334867, pia ilirejesha sehemu ya kujitawala kwa cocaine katika OX1R- / - panya, kutoa mfano wa pekee ambao upungufu wa tabia zinazozalishwa na upunguzaji wa maumbile katika kazi ya mfumo mmoja wa neurotransmitter huokolewa na blockade ya mwingine. Matokeo haya yanaonyesha kwamba, katika OX1R- / - panya, vitendo visivyopinga ya dynorphin huzuia mali yenye malipo ya cocaine, na hivyo hupungua utawala wa madawa ya kulevya. Kushangaza, katika OX1R+ / + (kudhibiti) panya, wala BSI bila kutarajia kupunguzwa cocaine binafsi utawala. Jambo moja linalowezekana kwa athari hii ni kwamba dynorphin iliyotolewa na neurons zisizo na sumu, kama vile kinachojulikana "moja kwa moja" ya neva ya spiny neuroni, ina madhara kinyume na ulaji wa cocaine na inaweza kweli kuwezesha athari za cocaine. Kuwepo kwa wakazi wawili wa KOR kwa majukumu tofauti katika malipo ya cocaine pia kuelezea kwa nini norBNI tu kuacha sehemu ya upungufu katika tabia ya cocaine-kuchukua kuchukuliwa katika OX1R KO panya. Vinginevyo, ugomvi wa KOR hupunguza madhara ya aversive au yanayoathiri ya uondoaji wa cocaine (34), ambayo huchangia kwenye mifumo ya ulaji wa madawa ya kulevya (17). Bila kujali, data hizi zinaonyesha kuwa madhara kama ya dynorphin yanaweza kutokea kwa kutokuwepo kwa ishara ya orexini isiyofaa, huzalisha kupunguza kwa madhara ya cocaine, wakati madhara ya orexin husababisha madhara ya cocaine, na kuongeza muda wao bila kutokuwepo kwa dynorphin ishara.
Orexin na Dynorphin Inaweza Kuwezesha Athari Zisizofaa za Kusisimua kwa Neurons za VTA DA.
Miundo ya ubongo ambayo inapokea pembejeo kutoka kwa orexin ya hypothalamic na neurons ya dynorphin inaweza kuonekana kwa peptidi zote mbili, na hivyo inaathirika na madhara yao ya kupinga juu ya msamaha wa neuronal (35, 36). Kiwango gani ambacho madhara ya peptidi moja hushinda juu ya yale ya uwezekano mwingine inategemea mambo mengi, ikiwa ni pamoja na wingi wa jamaa wa kila peptide, uhai wa muda mrefu katika nafasi ya ziada, na uingizaji wa mapokezi katika watu tofauti wa neurons za lengo, pamoja na ushirikiano kati ya receptors na mifumo yao ya ishara ya kuingilia kati ya seli katika postsnaptic seli. Uzoefu wa mshipa na cocaine umewekwa, angalau kwa sehemu, na neurons za DA katika VTA (26), lengo muhimu la seli za orexini zilizo na hypothalamic (37). Aidha, infusion ya orexin katika VTA inaongeza kutafuta madawa ya kulevya (6). Kutathmini michango ya jamaa ya kila peptide juu ya shughuli za neurons za VTA, tumefanya rekodi za electrophysiological kutoka kwa seli za DA katika vipande vya ubongo vya C57BL / 6 za ubongo ambazo zinajulikana kwa orexin na dynorphin kutumika peke yake au pamoja. Kama ilivyotarajiwa, ikiwa inatumiwa tofauti, orexin ilikuwa ya kusisimua kwa usawa, wakati dynorphin ilizalisha athari za kuzuia tu (Mtini. 5 A na B; F2,50 = 18.95, P ≤ 0.01). Katika wakazi wa neurons DA kumbukumbu, wengi waliitikia viwango vya kujaza ya peptides wote, ingawa wachache wachache walikuwa msikivu msikivu tu kwa orexin au dynorphin (Mtini. 5B). Kwa kushangaza, wakati peptidi zote mbili ziliwekwa kwenye neurons mbili-msikivu (n = 10), hakuwa na athari halisi ya kiwango cha kurusha (Mtini. 5A), Kupendekeza kwamba athari zinazopingana za kila peptidi kwenye viwango vya kueneza kwa ufanisi hughairiana kwa msingi wa tafadhali. Nuroni nne kati ya 10 zilionyesha kizuizi cha upendeleo na dynorphin licha ya uwepo wa orexin, wakati seli moja ilikuwa ikisisimua (> mabadiliko mara 1.5) na orexin licha ya uwepo wa dynorphin (Mtini. 5 A na C). Kwa ujumla, ingawa seli zaidi zilishughulikia orexin kuliko dynorphin, seli hizo zilizokubalika kwa peptidi zote mbili hazibadilika na kiwango cha kupiga risasi wakati orexin na dynorphini vilitumiwa, wakidai kuwa ushawishi wa kupinga wa kila peptidi ulikuwa uwiano ndani ya seti ya VTA DA neurons alisoma.
Kufafanua zaidi uwezekano wa uingiliano wa orexin-dynorphin ndani ya neurons ya VTA DA ambayo ilikuwa nyeti kwa orexin na dynorphin, tumejaribu, kwa njia nyingine, kuongeza madhara ya kuzuia dynorphin ya kuoga kwa matibabu na SB334867 (Kielelezo S2A; F5,25 = 2.13, P <0.01) au kuongeza athari za kufurahisha za orexin inayotumiwa na umwagaji kwa matibabu na norBNI (Kielelezo S2B; F3,27 = 5.48, P <0.01). Katika majaribio yote mawili, OX1R na KOR blockade haukufanikiwa kuzalisha madhara haya, ikionyesha kwamba SB334867 na norBNI haziathiri madhara kupitia vitendo visivyofaa. Jambo muhimu zaidi, data hizi zinaonyesha kuwa sauti ya peptidi kila katika vitro haitoshi kuathiriwa na matumizi ya wapinzani wadogo wa molekuli kama SB334867 na norBNI. Utafutaji huu ni sawa na kazi ya awali ambayo inaonyesha kuwa exocytosis ya vidogo vikubwa vya peptidi vyenye kawaida hutokea tu kwenye viwango vya juu vya kupiga mbizi ambazo si kawaida kwa maandalizi ya kipande (38).
Ili kuthibitisha kwamba norBNI haikuathiri tabia kupitia vitendo vya "off-target" moja kwa moja kwenye OX1R, sisi baadaye tuliona madhara ya mhusika huu juu ya OX1R ishara. Hasa, tulikuwa tulijaribu kutumia kielelezo cha kupiga picha ya sahani (FLIPR) ya fluorometric kuamua uwezo wa orexin A, SB334867, au norBNI ya kuogelea ili kuingiza vidonda vya kalsiamu ya seli katika seli za CHO zilizopangwa zinazoonyesha OX ya binadamu1R. Ingawa orexin A ilitokana na ongezeko la ongezeko la calcium ya kioevu (EC50 = 0.01 μM) na SB334867 inategemea dozi kutekeleza athari hii (EC50 = 0.035 μM), walaBNI haikuweza kuzalisha athari yoyote juu ya msingi au orexin A-kuongezeka kwa kuongezeka kwa calcium intracellular. Hii inaonyesha kuwa madhara ya norBNI kwenye physiolojia ya VTA DA neuronal ni tu kupitia njia zilizopendekezwa za kuashiria KOR na madawa ya kulevya hana athari moja kwa moja kwenye OX1R (39) (Kielelezo S3 A-C).
Uingiliano wa Orexin-Dynorphin katika VTA Kudhibiti Utawala wa Uwekezaji wa Cocaine.
Uchunguzi wetu wa electrophysiolojia unaonyesha kwamba mwingiliano wa nguvu kati ya orexin na dynorphin hutawala shughuli za VTA DA, na kwamba viunga vya VTA vinaweza kutumika kama substrate muhimu kwa madhara ya mfumo wa orexin-dynorphin juu ya tabia zilizohamasishwa. Kupima hypothesis hii moja kwa moja, sisi kuchunguza madhara ya intra-VTA infusion ya SB334867 juu iv cocaine binafsi utawala katika panya. Ikilinganishwa na infusion ya intra-VTA gari, intra-VTA SB334867 imesababisha kupunguza alama ya ulaji wa cocaine ambayo ilikuwa imefungwa na norBNI (Mtini. 6; ANOVA moja: F3,24 = 11.56, P <0.01), kupendekeza kwamba hatua za dynorphin zisizopingwa ndani ya eneo hili la ubongo hupunguza thawabu ya cocaine. Matokeo haya yanaonekana kutofautiana na yale ambayo yameonyesha kutokuwepo kwa intra-VTA SB334867 juu ya kujitawala kwa cocaine katika ratiba ya chini ya juhudi za uwiano wa 1 (FR1) za kuimarisha (40). Hata hivyo, ripoti kadhaa zimeonyesha kuwa kama kazi inahitaji kuongezeka, SB334867 inafaa zaidi katika kupunguza dawa za kuchukua dawa (2, 33). Kwa sababu panya katika jaribio hili walikuwa wakifanya jitihada za juu FR5, matokeo ya sasa yanaendana na vitabu hivi. Takwimu hizi hutoa ushahidi wa moja kwa moja kwamba asili ya kupinga ya orexin na dynorphin kwenye VTA DA neuronal physiology inaweza kuathiri athari kubwa katika tabia zinazoendeshwa na malipo.
Majadiliano
Tunaripoti kwamba orexin na dynorphin, neva za neva ambazo zinaweza kuzalisha madhara kinyume na motisha, zinapatikana katika vifuniko sawa vya synaptic. Kutafuta kwamba hawa neva ya neuropeptidi ni copackaged na labda coreleased chini ya hali sawa ya kisaikolojia (16) ina athari nyingi kwa sababu inaleta uwezekano kwamba mchakato huu pia hutokea katika mifumo ya jadi iliyofikiriwa kulingana na kutegemea hasa kwa kila mtu. Pia tunaonyesha kuwa orexin, ishara kupitia OX1R, huzuia madhara muhimu ya utendaji na tabia ya dynorphin ya cotransmitter. Neurons ya Orexin-dynorphin inaongeza viwango vya ongezeko la jeni la mapema c-Fos katika kukabiliana na thawabu na cues za malipo-zawadi (4, 6, 22), akionyesha viwango vya juu vya uanzishaji wa neuronal ambao unapendelea kutolewa kwa neuropeptide. Sisi kisha kutoa ushahidi kwamba corelease ya orexin inaweza occlude madhara ya dynorphin juu ya tabia motisha kupitia vitendo vyake DA neurons katika VTA. Blockade ya orexin inaweza kuzalisha dynorphin-au KOR athari kama vile juu ya ICSS na tabia zinazohusiana na cocaine ambayo ni kuingiliwa na KOR antagonism (13, 41, 42). Masomo ya awali ya kila mmoja wa peptidi hizi kwa msaada wa kutengwa haya hitimisho: infusion ya moja kwa moja ya orexin katika VTA inarudi kutafuta madawa ya kulevya (6), wakati infusion intra-VTA ya KOR agonists hutoa madhara ya kuumia, kama vile dysphoria (43). Tunathibitisha kwamba orexin kawaida hufanya kazi pamoja na pembejeo za malipo ya msamaha kwa VTA [mfano, glutamate kutoka kando ya prefrontal na miundo mingine (44, 45)] kuondokana na ushawishi wa kuzuia uhamisho wa Dynorphin na wa ndani wa GABA juu ya neurons za DA, kuimarisha kutolewa kwa DA kabla ya kuhusishwa na malipo na tabia iliyohamasishwa.
Ni muhimu kusisitiza kuwa ingawa kuongeza maambukizi ya orexini inaonekana kuwa na uwezo wa kukomesha madhara ya kuathiriwa kwa uendeshaji wa KOR, KOR antagonism haipati tu athari ya kupendeza (kazi ya juu ya malipo). Tunafikiri kwamba hii inaweza kuwa kutokana, kwa sehemu, kwa maelezo tofauti ya pharmacodynamic na pharmacokinetic ya SB334867 na norBNI. Dawa ya zamani inaonyesha shughuli za kawaida na t1/2 ya ~24 min (46), wakati sindano moja ya mwisho hufanya upinzani wa kazi wa KOR unaoendelea kwa wiki (10). Kwa kuongeza, antagonists wa KOR kama vile norBNI ni "agonists wasio na faida" ambayo yanaweza kuamsha njia nyingine za kusafirisha wakati huo huo, kama ile ya c-Jun kinase (39), kwa hiyo huzalisha madhara ya papo hapo au marekebisho ya fidia yanayotosha ili kupunguza viwango vya juu vya sauti ya orexini. Hitimisho thabiti kuhusu kama madhara haya yanatarajiwa kukuza maendeleo ya wapinzani wa KOR wa muda mfupi ambao hawafanyii njia nyingine za kuashiria ishara; misombo hiyo haipatikani sasa (10). Zaidi ya hayo, majaribio ya sasa yanazingatia VTA na hawezi kuondokana na uwezekano kwamba madhara ya orexin na dynorphin huenda yasiwe na maumbo katika miundo mingine au kwamba VTA ni muundo pekee ambao uingiliano wa orexin-dynorphin huathiri tabia. Kwa mfano, kuna ushahidi kwamba orexin inashiriki katika majibu ya mkazo na inaweza kushiriki pamoja na dynorphin ili kuingiza mataifa mabaya ya kuathiri ambayo yanaongozana na uondoaji wa madawa ya kulevya (40, 47). Kwa wazi, kazi ya ziada ni muhimu kutambua mazingira, loci anatomical, na taratibu zinazoonekana kuruhusu dhidi ya matendo dhidi ya orexin na dynorphin katika dhana tofauti ya tabia.
Takwimu zetu pia zinaunga mkono maoni kwamba hatua ya peptidi zote mbili ni moduli, kwa sababu kuvuruga kwa OX ama1Rs au KOR zimepunguzwa lakini hazikuondoa tabia zilizojaribiwa. Kwa mfano, tabia ya ICSS iliendelea hata kwa kiwango cha juu cha SB334867, akionyesha kuwa orexin peke yake haitoshi kuzingatia athari zawadi za kuchochea LH. Jambo moja ni kwamba ingawa orexin haiwezi kudumisha tabia ya ICSS, inapunguza usumbufu wake kwa kukomesha hatua za dynorphin. Ufafanuzi tofauti wa orexini na dynorphin na idadi sawa ya neurons hypothalamic inaweza kuwa njia ambayo excitability ya DA neurons katika VTA inaweza kudhibitiwa na msukumo wa nje, pamoja na uzoefu au ugonjwa. Kama mfano mmoja, viwango vya mrena vya orexin vimepungua kufuatia aina ya matatizo ya kawaida ya kijamii yanayotokana na phenotype ya kupumua katika panya (48) na panya (49). Hisia hii ya uchochezi inaweza kuwa kutokana, angalau kwa sehemu, kupunguza uelewa wa orexin ambayo hufanya vitendo vya dynorphin bila kupinga. Matokeo haya yana maana muhimu kwa kutafsiri data zinazohusisha orexin na dynorphin kwa kutengwa, kwa sababu mabadiliko katika mfumo mmoja yanaweza kuwa sawa na kukabiliana na hali nyingine. Wanaweza pia kuongezea kubadilika katika kubuni mikakati ya matibabu ya kutibu magonjwa yanayotokana na ugonjwa wa narcolepsy na matatizo na udhibiti wa msukumo. Kwa mfano, mbinu ya pekee ya kutibu hali zinazosababishwa na dysregulation ya orexin inaweza kuwa kuendesha kazi ya KOR, na, kinyume chake, matatizo yaliyotambulika na kazi ya dynorphin yanaweza kupunguzwa na uendeshaji wa mifumo ya orexin.
Vifaa na mbinu
Wanyama.
Mume mzima C57BL / 6J panya (8 wk wa umri; Jackson Laboratory) kutumika katika majaribio EM walikuwa kundi-housed (tatu hadi tano kwa ngome); wale waliotumiwa kwa ICSS walishirikiwa upasuaji baada ya upasuaji. Wanaume wazima (350 g) Panya za Dawley-Dawley (Maabara ya Mto Charles) zilitumiwa katika majaribio ya 5-CSRTT na cocaine binafsi-utawala na ziliwekwa katika vikundi vya nne. Mume mzima C57BL / 6J panya (siku za baada ya kuzaliwa 19-21) zilizotumiwa kwa majaribio ya electrophysiolojia zilikuwa kikundi-kilichowekwa (tatu hadi tano kwa kila ngome). OX1- / - panya na OX1 yao+ / + littermates (6 wk wa umri) kutumika kwa ajili ya tafiti binafsi-utawala walipatikana kutoka Jackson Laboratory na walikuwa nyuma zaidi ya vizazi saba kwa C57BL / 6 panya. Panya hizo zilikuwa kikundi-kilichowekwa (mbili kwa cage). Wanyama wote walikuwa wamewekwa chini ya hali ya kudhibiti joto la 12-h mwanga / mzunguko wa giza, na upimaji wa tabia ulifanyika 4-5 h katika mzunguko wa mwanga; chakula na maji zilipatikana ad libitum isipokuwa vinginevyo zinaonyeshwa. Taratibu zilifanyika kwa mujibu wa Taasisi za Afya za Taifa Mwongozo wa Huduma na Matumizi ya Wanyama wa Maabara (50) na kupitishwa na Kamati za Huduma za Mifugo na Matumizi ya Hospitali ya McLean, Chuo Kikuu cha British Columbia, na Scripps Florida.
Immunohistochemistry na Microscopy.
Fluorescence na immunolabeling ya dhahabu iliyoimarishwa kwa fedha kwa ajili ya orexini A au prodynorphin ilifanyika kwenye sehemu za ubongo za panya kulingana na taratibu zilizoripotiwa hapo awali (51), na kusindika zifuatazo protocols standard EM. Mikoa ya kupitisha ya tishu za immunolabeled ilichaguliwa kwa nasibu na kupiga picha kwa ajili ya quantification ya chembe kwa kutumia programu ya ImageJ (Taasisi za Taifa za Afya) (Vifaa na Mbinu za SI, Immunohistochemistry na Microscopy).
Electrophysiology.
Pipettes ya Patch (3-5 MΩ) ilijazwa na gluconate ya potassium ya 143, Hepes 10 mM, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgATP, 0.3 mM NaGTP (yenye pH ya 7.2), na 270-280 mMmol. Takwimu zilipatikana kwenye 20 kHz na kuchujwa kwenye 2 kHz kwa kutumia pClamp 10.0 programu (Vifaa vya Masi). Baada ya kupata upangilio wa seli, seli zilikuwa zimefungwa -70 mV na mfululizo wa hatua za voltage (250 ms, kutoka -60 hadi -130 mV katika hatua za 10-mV) ilitumiwa kuchunguza hyperpolarizing (Ih) mikondo. Ih iliamua kama mabadiliko ya sasa kati ya ~ xMUMX ms na 30 ms baada ya hatua ya voltage ilitumika. Shughuli ya asili ya neurons ya VTA DA ilipimwa kwa hali ya sasa ya clamp. Majaribio yalianza wakati kiwango cha msingi cha kupiga moto kilipatikana; substrates kisha zimewekwa kwa dakika ya 248 na kisha zimewashwa nje na maji ya bandia ya bandia. Sehemu ya mwisho ya 5 ya kila sehemu ya 3-min ilitumiwa kwa uchambuzi wa data. Dynorphin A (5-1; 17 nM) na orexin A (200 nM) zilipatikana kutoka Peptide ya Marekani na kufutwa katika maji yaliyotumiwa. Viwango hivi vilipatikana hapo awali ili kuathiri madhara yaliyojaa juu ya shughuli za seli za VTA (5, 52). Thiorphan (1 μM) na bestatin (10 μM) walipatikana kutoka Sigma-Aldrich, kufutwa katika maji yaliyotumiwa, na kutumika pamoja na dynorphin A (Vifaa na mbinu za SI, Electrophysiology).
Ushauri wa FLIPR.
OX1Shughuli R ilipimwa kwa kupima viwango vya kalsiamu ya intracellular na ufuatiliaji wa FLIPR kama ilivyoelezwa hapo awali (53) (Vifaa na mbinu za SI, Fomu ya Maabara ya Fomorometric Imaging Plate Reader).
ICSS.
Panya zilianzishwa na electrodes zinazochochea monopoli au cannulae (PlasticsOne) chini ya ketamine / xylazine (80 na 10 mg / kg, kwa mtiririko huo, ip; Sigma) iliyoongozwa kwa stereotactically kwa LH (18) na / au VTA ya mfululizo [kutoka bregma: anteroposterior (AP), -3.2 mm; mediolateral (ML), -0.5 mm; dorsoventral (DV), -4.7 mm kutoka muda mrefu]. Baada ya kipindi cha kupona cha 7-d, panya zilifundishwa kujibu kwa kuchochea ubongo kama ilivyoelezwa awali (18). Mzunguko wa chini kabisa uliounga mkono kujibu (kizingiti) ulihesabiwa kwa kutumia uchambuzi mdogo wa mstari wa-bora-fit. Wakati panya zinakamilika vigezo vya utulivu kwa vizingiti vya ICSS (± 10% juu ya siku za mfululizo wa 5), madhara ya matibabu ya dawa yalipimwa. SB334867 (Scripps Florida) au gari la DMSO lilipatiwa siku zingine kwa kutumia sindano ya Hamilton (0.1 mL / kg ip), na vizingiti vilianzishwa mara moja katika vikao vya mtihani wa 15. NorBNI (10 mg / kg ip; Sigma) ilitolewa katika saline (10 mL / kg) 48 h kabla ya kuanza kwa majaribio ya ICSS.
5-CSRTT.
Panya zilikuwa vikwazo vya chakula (kwa 85% ya uzito wa kujifungua bure) na kufundishwa katika vyumba vya uendeshaji vinavyodhibitiwa na kompyuta vilivyoingizwa ndani ya makabati (Med Associates), na taratibu za 5-CSRTT zilizofanyika (25). SB334867 (katika DMSO, 0.1 mL / kg) na / au cocaine (katika saline, 1 mL / kg; Sigma) ilitolewa na IP sindano X min kabla ya kupima, kama ilivyo katika majaribio mengine, na norBNI ilitolewa angalau 10 h kabla ya kuanza kwa kupima (Vifaa na mbinu za SI, 5-Chagua Serial Reaction Time Task).
IV Cocaine Self-Utawala.
Panya na panya vilikuwa vimetakaswa na isoflurane (1-3% vol / vol) mchanganyiko wa mvuke wa oksijeni na upasuaji ulioandaliwa na catheters ya Visa (VWR Scientific) katika mshipa wa kawaida kulingana na taratibu zilizowekwa (54). Mara tu kufuatia upandikizaji wa katheta kwenye panya, cannulae ya mwongozo wa chuma cha pua ya nchi mbili (23 gauge, 17 mm kwa urefu) ilipandikizwa katika VTA (kutoka kwa bregma: AP, 5.3 mm; ML, ± 0.7 mm; DV, −7.5 mm kutoka kwa muda ). Kujaribu na SB334867 au norBNI wakati wa vikao vya kila siku vya dakika 60 vilifanywa baada ya ulaji thabiti wa cocaine kupatikana (<20% tofauti katika kujibu kwa siku 3 mfululizo; Vifaa na mbinu za SI, IV Cocaine Self-Administration).
Takwimu.
Takwimu zinaelezwa kama maana ± SEM. Kwa majaribio ya ICSS, hatua mbili za mara kwa mara ANOVA ilitumika kulinganisha njia kati ya hali ya kutibu SB334867 na norBNI + SB334867. Njia moja ya kurudia mara kwa mara ANOVA na majaribio ya baada ya Newman-Keuls yalitumiwa kulinganisha njia ndani ya hali ya SB334867 na norBNI + SB334867. Njia moja ya kurudia vipimo vya ANOVA na Newman-Keuls pia vilikutumiwa kulinganisha njia katika majaribio yote ya 5CSRTT. Hatua mbili za mara kwa mara ANOVA ilitumika kulinganisha njia kati ya makundi ya matibabu katika majaribio ya uendeshaji wa cocaine binafsi na OX1R KO panya. Njia moja ya mara kwa mara vipimo vya ANOVA na Newman-Keuls vilitumiwa kulinganisha majibu ya maana kwa orexin na dynorphin na neurons ya VTA DA. Njia moja ya mara kwa mara vipimo vya ANOVA na Newman-Keuls vilitumiwa pia kulinganisha njia za ulaji wa cocaine katika panya zilizohusika na SB334867 na norBNI. Tofauti zilizingatiwa kama iwapo P <0.05.
Shukrani
Tunamshukuru Dk Garrett Fitzmaurice kwa maoni yanayofaa juu ya maandishi na Miranda S. Gallo na Melissa Chen kwa msaada katika kukusanya data. Kazi hii iliungwa mkono na Taasisi za Taifa za Misaada ya Afya F32-DA026250 na K99-DA031767 (kwa JWM), F32-DA024932 na K99-DA031222 (kwa JAH), R01-DA023915 (kwa PJK), na R01-MH063266 (kwa WAC ) na kwa ruzuku ya ugunduzi wa Sayansi ya Sayansi ya Sayansi na Uhandisi (kwa SLB).
Maelezo ya chini
Mgogoro wa taarifa ya riba: WAC ina patent (US Patent 6,528,518; Assignee: McLean Hospital) kuhusiana na matumizi ya wapinzani kappi-opioid kwa ajili ya kutibu ugonjwa wa depression. Waandishi wengine wote wanatangaza maslahi ya mashindano ya kifedha.
Makala hii ni Uwasilishaji wa PNAS moja kwa moja.
Angalia maoni kwenye ukurasa 5765.
Makala hii ina maelezo ya kusaidia mtandaoni mtandaoni www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1315542111/-/DCSupplemental.
Marejeo