PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
นามธรรม
การเปลี่ยนแปลงที่เกิดจากโคเคนในการแสดงออกของยีนทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาและพฤติกรรมของเซลล์ประสาทที่อาจเกิดจากการติดโคเคน เราระบุบทบาทสำคัญสำหรับ dimone ฮีสโตนฮิสโตน 3 ไลซีน 9 (H3K9) และไลซีน dimethyltransferase G9a ในโครงสร้างและพฤติกรรมพลาสติกที่เกิดจากโคเคน การบริหารโคเคนซ้ำ ๆ ลดระดับส่วนกลางของ dimethylation H3K9 ในนิวเคลียส accumbens Tการลดฮิสโตนเมทิลเลชั่นเป็นสื่อกลางผ่านการกดขี่ของ G9a ในบริเวณสมองนี้ซึ่งควบคุมโดยปัจจัยการถอดรหัสโคเคนที่เกิดขึ้นΔFosB จากการใช้เงื่อนไขการกลายพันธุ์แบบมีเงื่อนไขและการถ่ายโอนยีนที่มีไวรัสเป็นสื่อกลางเราพบว่าการลดลงของ G9a ช่วยเพิ่มความแข็งแรงของกระดูกสันหลังของ dendritic spine ของนิวเคลียส accumbens เซลล์ประสาทและเพิ่มความพึงพอใจของโคเคนจึงสร้างบทบาทสำคัญสำหรับฮิสโตน
บทนำ
การสัมผัสโคเคนซ้ำ ๆ นั้นมีลักษณะโดยการเปลี่ยนแปลงอย่างต่อเนื่องของการแสดงออกของยีนและการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาของเซลล์ประสาทภายในนิวเคลียส accumbens (NAc) ซึ่งเป็นองค์ประกอบสำคัญของวงจรการให้รางวัลของสมอง (1-2). การดัดแปลง Chromatin มีความสำคัญในการเปลี่ยนแปลง transcriptional ที่ผิดปกติในพื้นที่สมองนี้ซึ่งอาจเป็นส่วนหนึ่งของการติดโคเคน (3-9) การควบคุมโคเคนของโครงสร้างโครมาตินในผลลัพธ์ของ NAc ส่วนหนึ่งมาจากการดัดแปลงโคเคนที่เกิดจากเครื่องจักรกลโครมาตินโดยตรงซึ่งนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงในฮิสโตนอะเซทิเลชั่นและฟอสโฟรีเลชั่น4, 7-9); อย่างไรก็ตามยังไม่มีการศึกษาบทบาทของเอนไซม์ที่ควบคุมฮิสโตนเมทิลเลชั่น
การวิเคราะห์จีโนมไวด์โปรโมเตอร์เมื่อเร็ว ๆ นี้โดยใช้ chromatin immunoprecipitation ควบคู่ไปกับ microarrays (ChIP-Chip) ระบุรูปแบบที่เปลี่ยนแปลงของฮิสเทอเรสที่กดทับซ้ำในการรักษาด้วยวิธี NAC ซ้ำ (ต่อไปนี้) ซ้ำซ้อนกับ H3K96) ดังนั้นเราจึงทำการวิเคราะห์ lysine methyltransferases (KMTs) และ demethylases (KDMs) จำนวนมากซึ่งเป็นที่รู้จักในการควบคุม H3K9 หรือ H3K27 methylation (รูปที่ 1A). มีเพียงเอนไซม์สองตัวคือ G9a และ GLP ที่แสดงกฎการถอดเสียงแบบถาวร 24 ชั่วโมงหลังจากการบริหารโคเคนซ้ำ ๆ กันเมื่อการแสดงออกของยีนทั้งสองถูกลดลงอย่างมีนัยสำคัญ. เนื่องจาก G9a และ GLP เร่งปฏิกิริยาการเร่งเมทิลเลชันของ H3K9 (H3K9me2) โดยเฉพาะการลดระดับโคเคนของพวกเขาสอดคล้องกับระดับโลกที่ลดลงของ euchromatic H3K9me2 ที่จุดนี้รูปที่ 1B) ในทางตรงกันข้ามระดับทั่วโลกของ heterochromatic H3K27 methylation ยังคงไม่เปลี่ยนแปลงจากการสัมผัสโคเคนซ้ำ (ภาพที่ S1 รองรับวัสดุออนไลน์) เนื่องจากมีกิจกรรมเร่งปฏิกิริยาในระดับสูงทั้งคู่ ในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย (10) เราออกไปสำรวจความสำคัญของการทำงานของการปราบปราม G9a เพิ่มเติมหลังจากการสัมผัสโคเคนซ้ำใน NAc ระดับของโปรตีน G9a เช่นระดับ mRNA ของมันลดลงอย่างมีนัยสำคัญ 24 ชั่วโมงหลังจากการบริหารโคเคนซ้ำ ๆ (รูปที่ S2) แม้ว่าการแสดงออกของ G9a mRNA นั้นลดลง 35% ใน NAc แต่การวิเคราะห์ทางอิมมูโนฮิสโตเคมีเปิดเผยว่าการลดลงของโปรตีน G15a ในระดับปานกลางนั้นสอดคล้องกับการลดลงของปริมาณ H9K21me3 ในระดับปานกลางรูปที่ 1B) การแสดงออกของ G9a mRNA นั้นลดลงในบริเวณสมองนี้โดย 20% หลังจากการดูแลโคเคนด้วยตนเองซ้ำ ๆ (รูปที่ S3).
ในการระบุว่าการเปลี่ยนแปลงของ euchromatic H3K9me2 นั้นสัมพันธ์กับการดัดแปลงจีโนมในการแสดงออกของยีนใน NAc หรือไม่เราใช้การวิเคราะห์ microarray เพื่อตรวจสอบการแสดงออกของยีนที่แสดงออกโดยการกระตุ้นโคเคนในสัตว์ที่มีหรือไม่มีประวัติโคเคน รายการยีนใน ตาราง S1 – S3) สัตว์ที่ได้รับโคเคนซ้ำแสดงการแสดงออกของยีนเพิ่มขึ้นอย่างมาก 1 ชั่วโมงหลังจากความท้าทายโคเคนเมื่อเปรียบเทียบกับสัตว์ที่ได้รับการรักษาอย่างรุนแรง (รูปที่ 1C) การแสดงออกของยีนที่เพิ่มขึ้นนี้ยังคงเกิดขึ้นในการตอบสนองต่อความท้าทายโคเคนที่ให้หลังจาก 1 สัปดาห์ของการถอนตัวจากโคเคนซ้ำ สอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้มียีนจำนวนเล็กน้อย (~ 10%) แสดงคำตอบการถอดเสียงตามการจัดการโคเคนซ้ำ ๆรูปที่ 1C; ดู ตารางที่ S1) (5) ในการตรวจสอบโดยตรงบทบาทของการลดระดับของ G9a ในการแสดงออกของยีนที่เพิ่มขึ้นซึ่งสังเกตได้หลังจากโคเคนซ้ำ ๆ หนูได้รับการฉีดพาหะของไวรัสเริม Herpes Simplex (HSV) ที่แสดงการแสดงออกของ GFP หรือ G9a และแสดงว่า G9a เพียงพอที่จะป้องกันการเพิ่มประสิทธิภาพการแสดงออกของยีนโคเคนซ้ำแล้วซ้ำอีก จากชุดของยีนที่เลือกแบบสุ่มของ 12 แสดงระดับการแสดงออกที่สูงขึ้นหลังจากโคเคนซ้ำเราสังเกตว่า G9a ลดการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของ 50% ของยีนเหล่านี้อย่างมีนัยสำคัญ (ตารางที่ S4).
ในการระบุเหตุการณ์การถ่ายทอดต้นน้ำที่ไกล่เกลี่ยการปราบปรามโคเคนที่เกิดซ้ำของการแสดงออก G9a เราได้ตรวจสอบบทบาทที่เป็นไปได้สำหรับΔFosBผลิตภัณฑ์ประกบที่มีความเสถียรสูงของยีนเริ่มต้นทันที fosB. ΔFosBสะสมใน NAc หลังจากได้รับโคเคนซ้ำ ๆ ซึ่งมันถูกเชื่อมโยงกับรางวัลโคเคนที่เพิ่มขึ้น (11) ΔFosBสามารถทำหน้าที่เป็นตัวเร่งปฏิกิริยาการถอดรหัสหรือเครื่องอัดขึ้นอยู่กับยีนเป้าหมายที่เกี่ยวข้อง (3, 5, 6, 12) การใช้ bitransgenic NSE-TTA × tetOP-ΔFosB หนูสามารถแสดงออกทางสีหน้าของ BFosB อย่างมีชั้นเชิงใน NAc และหลัง striatum ของสัตว์ที่เป็นผู้ใหญ่ (13) เราตรวจสอบผลกระทบของการแสดงออกของ BFosB ต่อการควบคุมโคเคนของ H3K9me2 และ KMTs ใน NAc expressFosB การแสดงออกมากเกินไปก็เพียงพอที่จะลดระดับของทั้ง H3K9me2 (รูปที่ 1D) และการแสดงออก G9a (รูปที่ 1E) จึงเลียนแบบผลกระทบของโคเคนซ้ำแล้วซ้ำอีก ในทางตรงกันข้ามΔFosBไม่ได้ลดการแสดงออกของ GLP ในบริเวณสมองนี้และไม่มีผลต่อ SUV39H1 และ EZH2 ซึ่งเป็นเอนไซม์หลักที่ทำการปรับลดเมทิลเอทิลีนสำหรับ H3K9 และ H3K27 ตามลำดับ (รูปที่ S4) เพื่อยืนยันข้อมูลเหล่านี้โดยใช้ระบบการแสดงออกของ overFosB ที่เป็นอิสระหนูตัวใหญ่ที่เป็น wildtype ได้รับการฉีดภายในสองระดับของเวกเตอร์ Adeno-virus virus (AAV) ที่แสดงทั้ง GFP หรือΔFosB การแสดงออกของไวรัสมากเกินไปของΔFosBลดระดับการแสดงออกของ G9a ในบริเวณสมองนี้ (รูปที่ 1E).
การควบคุมที่เด่นชัดและเฉพาะเจาะจงของ G9a ทำให้เราตรวจสอบว่าการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของ G9a โดยเฉพาะในเซลล์ประสาท NAc ควบคุมการตอบสนองต่อพฤติกรรมของโคเคนหรือไม่ หนู Wildtype ได้รับการฉีดพาหะนำโรค HSV ภายในเซลล์เพื่อแสดง GFP หรือ G9a จากนั้นนำมาวิเคราะห์โดยใช้โคเคนแบบไม่มีเงื่อนไขตามมาตรฐานโคเคน การแสดงออกของไวรัส G9a ในเซลล์ประสาท NAc ได้รับการยืนยันจากการทดสอบพฤติกรรม (รูปที่ 2A) G9a overexpression ลดลงอย่างมีนัยสำคัญการตั้งค่าสำหรับโคเคนเมื่อเทียบกับสัตว์ overexpressing GFP (รูปที่ 2B) และเพิ่มระดับ H3K9me2 ใน NAc (รูปที่ 2C) การแสดงออกของ G9a ที่กลายเป็นตายอย่างเร่งด่วน (G9aH1093K) (14) ไม่ส่งผลต่อการตั้งค่าโคเคน (รูปที่ 2B) และไม่มีผลกระทบต่อระดับ H3K9me2 ในพื้นที่สมองนี้ (รูปที่ 2C).
เพื่อศึกษาเพิ่มเติมบทบาทของ G9a ในผลกระทบด้านพฤติกรรมของโคเคนและโดยเฉพาะอย่างยิ่งเพื่อเลียนแบบการปราบปรามโคเคนที่เกิดซ้ำของการแสดงออก G9a ใน NAc, G9a สำหรับผู้ใหญ่ชั้น / ชั้น หนู (14) ได้รับการฉีดอินเวกเตอร์ภายในของ AAV เพื่อแสดง Cre recombinase หรือ GFP เป็นตัวควบคุม AAV-Cre การล้มลงของ G9a ใน NAc ซึ่งได้รับการยืนยันทางอิมมูโนรูปที่ S5) เพิ่มผลกระทบของโคเคนในการทดลองปรับสภาพและลดระดับ H3K9me2 ใน NAc (รูปที่ 2D, E) ตัวยับยั้งทางเภสัชวิทยาของ G9a และ GLP, BIX01294 ที่มีขายในท้องตลาด (15-16) ใช้เพื่อยืนยันว่าการยับยั้งเอนไซม์มีผลต่อพฤติกรรมตอบสนองต่อโคเคนหรือไม่ อันที่จริงการยับยั้งทางเภสัชวิทยาของ G9a และ GLP เพิ่มความพึงพอใจของโคเคนและลดลงอย่างมีนัยสำคัญ H3K9me2 ใน NAc (รูปที่ 2F, G).
การบริหารโคเคนซ้ำ ๆ เพิ่มความหนาแน่นของเงี่ยง dendritic ในเซลล์ประสาทกลางหนาม NAc (17) กระบวนการที่เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงการทำงานที่ excitatory glutamatergic synapses ไปยังเซลล์ประสาทเหล่านี้ (18-19) และการตอบสนองพฤติกรรมไวต่อยาเสพติด (17, 20). เราจึงตั้งสมมติฐานว่าการลดลงของกิจกรรม G9a ใน NAc โดยโคเคนซ้ำอาจเป็นสื่อกลางความสามารถของโคเคนในการควบคุมความหนาแน่นของกระดูกสันหลัง dendritic ของเซลล์ประสาท NAc การใช้ chromatin immunoprecipitation (ChIP) กับแอนตี้ - G9a แอนติบอดีเราระบุหลายยีน G9a เป้าหมายใน NAc สมมุติสมมุติซึ่งแต่ละคนมีส่วนเกี่ยวข้องในโคเคน - dendritic ปั้นพลาสติก (รูปที่ 3A) (20-26) เราพบว่าการบริหารโคเคนซ้ำลดลงอย่างมีนัยสำคัญ G9a ผูกพันเช่นเดียวกับระดับของ H3K9me2 ที่ผู้ก่อการยีนเหล่านี้ (รูปที่ 3B) ในทางตรงกันข้ามการบริหารโคเคนเฉียบพลันได้อย่างรวดเร็วสรรหา G9a ให้กับผู้สนับสนุนยีนเดียวกันเหล่านี้บางอย่างสอดคล้องกับการแสดงออกของ G9a เพิ่มขึ้นที่สังเกตได้ใน NAc 1 ชั่วโมงหลังจากปริมาณโคเคนเฉียบพลัน (รูปที่ S6) แม้ว่า G9a จะมีผลผูกพันกับยีนโปรโมเตอร์บางตัวที่สัมพันธ์กับการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของมัน แต่ก็ยังไม่ชัดเจนว่าเหตุการณ์ดังกล่าวจะถูกสื่อโดยการเปลี่ยนแปลงระดับโลกของ G9a ใน NAc และ / หรือโดยความแตกต่างในการสรรหา G9a หลังจากเฉียบพลัน เมื่อเทียบกับ การบริหารโคเคนซ้ำแล้วซ้ำอีก
จากกฎระเบียบของ G9a เกี่ยวกับยีนที่เกี่ยวข้องกับความเป็นพลาสติกจำนวนมากใน NAc เราตรวจสอบโดยตรงว่าการบำรุงรักษาการแสดงออกของ G9a ในบริเวณสมองนี้หลังจากการรักษาโคเคนซ้ำนั้นเพียงพอที่จะป้องกันการเกิดโคเคน dendritic ที่เกิดจากโคเคน ก่อนหน้านี้การใช้โปรโตคอลการรักษาโคเคนแสดงให้เห็นถึงการส่งเสริมการเหนี่ยวนำกระดูกสันหลัง dendritic ใน NAc (20) เราตรวจสอบความหนาแน่นของกระดูกสันหลังในสัตว์ที่ฉีดด้วย HSV-GFP หรือ HSV-G9a ในข้อตกลงกับการค้นพบก่อนหน้านี้เราพบว่ามีการเพิ่มขึ้นของความหนาแน่นกระดูกสันหลัง dendritic ใน NAc หลังจากการรักษาโคเคนซึ่งเป็นผลที่ถูกปิดกั้นอย่างสมบูรณ์โดย G9aรูปที่ 3C) การแสดงออกเพียงอย่างเดียวของ G9a ไม่เพียงพอที่จะลดความหนาแน่นของกระดูกสันหลังเอ็นโดรินิติในระดับที่ไม่มีโคเคน เพื่อเสริมข้อมูลเหล่านี้ G9aชั้น / ชั้น หนูได้รับการฉีดสาร HSV-Cre และความหนาแน่นของกระดูกสันหลังภายในหนูขาวเมื่อเปรียบเทียบกับสัตว์ที่ได้รับ HSV-GFP เมื่อไม่มีโคเคน การล้มลงของการแสดงออกของ G9a ช่วยเพิ่มความหนาแน่นของกระดูกสันหลังในเซลล์ประสาทกลางหนาม NAc อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 3C).
จากหลักฐานที่แสดงว่าการลดลงของ G9a ใน NAc หลังจากโคเคนซ้ำนั้นถูกสื่อกลางโดยΔFosBเราจะตรวจสอบต่อไปว่าปัจจัยการถอดความนี้มีส่วนเกี่ยวข้องกับกฎระเบียบของกระดูกสันหลัง Dendritic ของ NAc หรือไม่. แม้ว่า osFosB ไม่ได้ถูกเชื่อมโยงกับสาเหตุของพลาสติก dendritic แต่เป้าหมายหลายอย่างรวมถึงหน่วยย่อย Cdk5 และNFκBนั้นมีความเกี่ยวข้องกันมาก (20-23), และการแสดงออกของΔFosBในเซลล์ประสาท NAc สัมพันธ์กับความหนาแน่นกระดูกสันหลัง dendritic ที่เพิ่มขึ้นหลังจากการรักษาโคเคนซ้ำ (27) ครั้งแรกเราพบว่าการเหนี่ยวนำของΔFosBในหนูบิตเรนจินิกในกรณีที่ไม่มีโคเคนซึ่งลดลง G9a และ H3K9me2 นิพจน์ (รูปที่ 1D, E), G9a ที่ลดลงมีผลผูกพันกับยีนที่เกี่ยวข้องกับพลาสติกจำนวนมากซึ่งส่วนใหญ่ยังแสดงให้เห็นว่าเป็นเป้าหมายโดยตรงของΔFosBเอง (รูปที่ 3D) (3, 6). ต่อไปเราแสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของไวรัสΔFosBใน NAc เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเพิ่มความหนาแน่นของกระดูกสันหลัง dendritic ภายใต้เงื่อนไขพื้นฐาน คล้ายกับที่สังเกตหลังจากทำโคเคนซ้ำแล้วซ้ำอีก (รูปที่ 3E). ในทางกลับกันการแสดงออกที่มากเกินไปใน NAc ของ DJunD ซึ่งเป็นโปรตีนกลายพันธุ์ในเชิงลบที่โดดเด่นที่ทำให้กิจกรรมการถอดรหัส criptFosB กลายเป็นปฏิปักษ์ขัดขวางความสามารถของโคเคนซ้ำเพื่อเพิ่มการก่อตัวของกระดูกสันหลัง dendritic ใน NAc (รูปที่ 3C).
การสังเกตของเราว่าΔFosBควบคุมการแสดงออกของ G9a ใน NAc และΔFosBและ G9a ควบคุมยีนเป้าหมายเดียวกันบางส่วนทำให้เราตรวจสอบปฏิสัมพันธ์อื่น ๆ ระหว่างΔFosBและ G9a หลังจากโคเคนเฉียบพลันเมื่อระดับ G9a เพิ่มขึ้นให้จับ G9a กับ fosB ยีนที่เพิ่มขึ้นในขณะที่หลังจากโคเคนซ้ำเมื่อการแสดงออกของ G9a ถูกระงับ G9a ผูกพันกับ fosB ยีนลดลง (รูปที่ 3A) การลดลงของการรวม G9a ดังกล่าวหลังจากโคเคนซ้ำไม่ได้ถูกสังเกต C-เหลวไหล, ที่ G9a การรวมเพิ่มขึ้นจากโคเคนซ้ำ (รูปที่ S7) ซึ่งสอดคล้องกับความจริงที่ว่าไม่เหมือนกัน fosB, C-เหลวไหล ถูกกดขี่, ไม่ได้ถูกเหนี่ยวนำ, โดยการได้รับสารกระตุ้นจิตประสาทเรื้อรัง (5) expressFosB การแสดงออกที่มากเกินไปในหนูบิตทรานส์เจนิกนั้นเพียงพอที่จะลด G9a ที่จับกับ fosb ยีน (รูปที่ 3D) นอกจากนี้ G9a การแสดงออกมากเกินไปก็เพียงพอที่จะลดการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นΔFosBหลังจากการบริหารโคเคนซ้ำ ๆ (ตารางที่ S4). ข้อมูลเหล่านี้แนะนำลูป autoregulatory โดย G9a เริ่ม จำกัด การเหนี่ยวนำของΔFosBโดยการบริหารโคเคนเฉียบพลัน อย่างไรก็ตามเมื่อΔFosBสะสมด้วยการสัมผัสกับยาซ้ำหลายครั้งมันจะบีบอัด G9a และทำให้ potentiates เหนี่ยวนำตัวเองต่อไป
โดยสรุปเราได้แสดงให้เห็นว่าฮิสโตนไลซีนเมธิลใน NAc มีส่วนเกี่ยวข้องอย่างยิ่งในการควบคุมการแสดงออกของยีนประสาทในการตอบสนองต่อโคเคน การปราบปราม G9a และ H3K9me2 หลังจากการบริหารโคเคนซ้ำ ๆ จะส่งเสริมการตั้งค่าโคเคนส่วนหนึ่งผ่านการกระตุ้นยีนของยีนจำนวนมากที่รู้จักกันในการควบคุมรูปแบบผิดปกติของ dendritic พลาสติก การได้รับความเข้าใจที่ดีขึ้นของยีนที่ถูกควบคุมผ่านกลไกดังกล่าวจะช่วยพัฒนาความรู้ของเราเกี่ยวกับพื้นฐานทางชีววิทยาที่ซับซ้อนของการติดยาเสพติดและสามารถช่วยในการพัฒนาการรักษาที่มีประสิทธิภาพมากขึ้นของความผิดปกติของการเสพติด
วัสดุและวิธีการ
สัตว์และการรักษา
ยกเว้นว่าจะระบุไว้เป็นอย่างอื่นหนูถูกวางไว้สี่ถึงห้าตัวต่อกรงในกลุ่มที่มี 12 ชั่วโมงแสง / รอบมืด (ไฟจาก 7: 00 AM ถึง 7: 00 PM) ที่อุณหภูมิคงที่ (23 ° C) ด้วย โฆษณาฟรี การเข้าถึงน้ำและอาหาร โปรโตคอลสัตว์ทั้งหมดได้รับการอนุมัติจาก IACUC ที่ศูนย์การแพทย์ UT ตะวันตกเฉียงใต้และโรงเรียนแพทย์ Mount Sinai
สำหรับการทดลองโคเคน [immunohistochemitry, Western blotting, PCR เชิงปริมาณ (qPCR), การวิเคราะห์ microarray และ chromatin immunoprecipitation (ChIP)], 8- ถึง 10 - ตัวผู้ C57BL / 6J สัตว์ได้รับการฉีดทุกวันทั้ง 'น้ำเกลือ' (7 รักษาน้ำเกลือ, ip), 'เฉียบพลัน' โคเคน (6 รักษาน้ำเกลือ + หนึ่งรักษา 20 mg / kg โคเคน -HCl, ip) หรือ 'ซ้ำ' โคเคน 7 mg / kg cocaine-HCl, ip) หนูถูกสังเวยทั้ง 20 ชั่วโมงหรือ 1 ชั่วโมงหลังจากการรักษาขั้นสุดท้าย สำหรับการศึกษา microarray สัตว์ได้รับการรักษาทุกวันด้วย 'saline' (24 ทรีทเมนต์ saline, ip), 'เฉียบพลัน' โคเคน (15 ทรีทเมนต์ saline + 14 ทรีทเม้นต์ 1 mg / kg โคเคน -HCl, ip), 'ซ้ำ + เฉียบพลัน' โคเคน 20 รักษาน้ำเกลือ + รักษา 7 8 mg / kg โคเคน -HCl, ip) หรือ 'ถอนตัวซ้ำแล้วซ้ำ + โคเคน' เฉียบพลัน (20 รักษา 7 mg / kg โคเคน -HCl + 20 รักษาน้ำเกลือ + 7 ท้าทายบำบัด 1 mg / kg โคเคน -HCl, ip) และเสียสละ 20 ชั่วโมงหลังจากการรักษาขั้นสุดท้าย ในการทดลองเชิงพฤติกรรมหนูถูกนำมาใช้หลังการผ่าตัดเดี่ยวและได้รับการรักษาด้วยโคเคน - HCl 1 mg / kg, ip ตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง สำหรับการวิเคราะห์ dendritic กระดูกสันหลังและการตรวจสอบ microarray หลังจากการติดเชื้อ HSV-GFP และ HSV-G10a-GFP หนูได้รับการรักษาด้วย 'saline' (9 saline, ip) หรือ 'cocaine ซ้ำ' (5 mg / kg cocaine-HCl, ip ) ตลอดระยะเวลา 5 วันก่อนหน้านี้โปรโตคอลการฉีดนี้ได้รับการแสดงเพื่อเพิ่มความหนาแน่นของกระดูกสันหลังในนิวเคลียส accumbens (NAc) เซลล์ประสาทภายในระยะเวลาของไวรัสเริม (HSV) การแสดงออกของยีน (อ้างอิงเสริม S1) หนูที่ใช้สำหรับการวิเคราะห์กระดูกสันหลัง dendritic ถูกเสียสละ 4 ชั่วโมงหลังจากการรักษาครั้งสุดท้าย
เพื่อชักนำให้เกิดการลบเฉพาะส่วนของ G9a transcript ที่ จำกัด เฉพาะเซลล์ประสาท NAc เราใช้หนูกลายพันธุ์ homozygous สำหรับ G9a อัลลีลที่มีอาการฟูมซึ่งถูกอธิบายในรายละเอียดที่อื่น ๆ (S2) การรวมตัวกันอีกครั้งแบบ Cre-induced ผลิต Exon 22 ถึง 25 การประกบกันนอกเฟรมทำให้เกิดการสลายตัวแบบไร้สาระกลางของการถอดรหัสที่กลายพันธุ์ เราใช้ G9a หนูที่ลอยอยู่ซึ่งกลับไปที่ C57BL / 6J อย่างเต็มที่ หนูถูกฉีดเข้าไปในพาหะ NAc ด้วยเวกเตอร์ Adeno ที่เกี่ยวข้องกับไวรัส (AAV) (serotype 2) แสดง GFP หรือ Cre-GFP ระหว่างอายุ 7 และ 10 สัปดาห์ การวิเคราะห์ทางอิมมูโนวิทยาเคมีถูกนำมาใช้เพื่อตรวจสอบประสิทธิภาพของการรวมตัวกันของ Cre-mediated (ดู รูปเพิ่มเติม S5) เราใช้สัตว์ที่ฉีด AAV หลังการผ่าตัด 21 วันเนื่องจากการรวมตัวกันใหม่ในหนู GXXUMXa ที่ถูกทำให้เสถียรนั้นมีความมั่นคงและสูงสุด ณ เวลานี้ซึ่งสอดคล้องกับรายงานที่ตีพิมพ์ (S3-S4) G9a และΔJunDการทดลองการแสดงออกมากเกินไปได้ดำเนินการในทำนองเดียวกันโดยใช้เวกเตอร์ไวรัส HSV ที่แสดงทั้ง GFP, wildtype G9a-GFP, G9aH1093K-GFP ที่ตายแล้วอย่างเร่งด่วน S2 สำหรับรายละเอียดเกี่ยวกับการพัฒนาโครงสร้าง G9a) HSV หนูใช้งานมากเกินไป 3 วันหลังการผ่าตัดเนื่องจากการแสดงออกมากที่สุดคือสูงสุด ณ เวลานี้ตามที่สังเกตผ่าน immunohistochemistry เนื่องจากลักษณะชั่วคราวของการแสดงออก HSV และธรรมชาติที่มีเสถียรภาพมากขึ้นของการแสดงออก AAV จึงใช้เวกเตอร์ HSV ในการทดลองที่ต้องการการแสดงออกของยีนระยะสั้นอย่างรวดเร็วในขณะที่เวกเตอร์ AAV ถูกนำมาใช้ในการทดลองที่ต้องการการแสดงออกระยะยาว มีการแสดงเวกเตอร์ทั้งสองในการศึกษาก่อนหน้าอย่างกว้างขวางเพื่อติดเชื้อเฉพาะเซลล์ประสาทในพื้นที่สมองฉีดโดยไม่มีการติดเชื้อของเซลล์ประสาทอวัยวะหรือออกจากอวัยวะใด ๆ
สำหรับการทดลองเชิงพฤติกรรมโดยใช้ตัวยับยั้ง G9a / GLP ทางเภสัชวิทยานั้น BIX01294 (25 ng / μl) หนูถูกปลูกฝัง sterotaxically ด้วยปั๊มขนาดเล็กใต้ผิวหนังสองตัว Mini-pump ถูกเปิดใช้งาน 12 ชั่วโมงก่อนที่จะทำการฝังการส่งมอบอย่างต่อเนื่อง (0.25 μl / ชั่วโมง) ของยานพาหนะทั้งสอง (5 hydroxypropyl β-cyclodextrin) หรือยาสำหรับวัน 14 ในช่วงเวลาที่ประเมินพฤติกรรม
สำหรับ overFosB overexpression ทดลอง [Western blotting, qPCR และ ChIP], ตัวผู้ bitransgenic NSE-TTA × tetOP-ΔFosB หนูถูกนำมาใช้ (10 สัปดาห์เก่า) โดยในกรณีที่ไม่มี tetracycline อนุพันธ์ doxycycline (8 สัปดาห์ปิด doxycycline) สัตว์แสดงการแสดงออกที่แข็งแกร่ง จำกัด striative ของΔFosB (S5) expressFosB การแสดงออกมากเกินไปในหนูเหล่านี้ได้รับการยืนยันผ่าน qPCR เพื่อยืนยันสิ่งที่ค้นพบโดยใช้ NSE-TTA × tetOP-ΔFosB หนูตัวผู้ C8BL / 57J เพศเมียอายุ 6BL / 8J ตัวผู้ถูกฉีดเข้าไปในช่องว่างภายในด้วย NAOT ที่มีเวกเตอร์ AAV แสดงทั้ง GFP หรือΔFosB-GFP ในกรณีนี้ใช้เวกเตอร์ AAV เพื่อให้แน่ใจว่าการแสดงออกΔFosBสูงสุดที่ 8 สัปดาห์หลังการผ่าตัดช่วยให้การเปรียบเทียบโดยตรงระหว่างหนูที่ติดเชื้อไวรัสและ virFosB bitransgenic หนู overexpressing การแสดงออกของไวรัสมากเกินไปได้รับการยืนยันโดยใช้ qPCR ที่ 15 สัปดาห์หลังการผ่าตัด (เจาะ NAc 14-gauge NAc ถูกผ่าใต้บริเวณที่ฉีด) AAV-GFP และ AAV-ΔFosB-GFP overexpressing หนูที่ไม่ได้ใช้สำหรับ qPCR ได้รับการรักษาด้วยน้ำเกลือ (14 ทรีทเมนต์น้ำเกลือ, ip) หรือโคเคนซ้ำ (30 ทรีทเม้น 6 mg / kg โคเคน -HCl, ip) เริ่มต้นที่ 4 สัปดาห์ ศัลยกรรม. 4 วันหลังการรักษาขั้นสุดท้ายสมองได้รับการแก้ไขด้วย XNUMX% พาราฟอร์มัลดีไฮด์แบ่งส่วนบน vibratome และใช้สำหรับการวิเคราะห์กระดูกสันหลัง dendritic
การวิเคราะห์แบบ Western blot
14-gauge NAc punches นำมาจากส่วน 1 mm ที่ได้จากการใช้เมทริกซ์สมองของสแตนเลสสตีลและถูก sonicated ใน 1 M HEPES lysis buffer (1% SDS) ที่มีน้ำย่อยโปรตีนและ phosphatase 10-ตัวอย่าง 30 μgของโปรตีนทั้งหมดถูก electrophoresed บนเจล 18% SDS โปรตีนถูกถ่ายโอนไปยังเยื่อหุ้มเซลล์ PVDF และบ่มด้วย anti-H3K9me2 (โมโนโคลนัลของเมาส์, 1: 500: 1), แอนตี้ - β-tubulin (เมาส์โมโนโคลนัล, 60,000: 3), ฮิสโตนoneทั้งหมด anti-GFP (ใช้สำหรับการตรวจสอบการแสดงออกของไวรัสอย่างเท่าเทียมกันในเนื้อเยื่อที่ถูกเจาะ) (กระต่ายโพลีโคลนอล, 1: 5,000), แอนตี้ - H1K1000me3 (กระต่ายโพลีโคลน, 27: 3) หรือแอนติบอดีต่อต้าน (หนูโมโนโคลนอล, 1) 500 ° C (เยื่อหุ้มทั้งหมดถูกบล็อกในนม 1% หรือ 60,000% bovine serum albumin) เมมเบรนจะถูกบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่มีป้ายชื่อ peroxidase (4: 5-1: 60,000 ขึ้นอยู่กับแอนติบอดีปฐมภูมิที่ใช้) และแถบแสงถูกมองเห็นโดยใช้สารตั้งต้น SuperSignal West Dura แบนด์ที่ถูกวัดปริมาณด้วย NIH Image J Software และแถบความถี่ H3K9me2 ถูกปรับให้เป็นแบบแอคตินหรือ tub-tubulin และฮิสโตน H3 ทั้งหมดเพื่อควบคุมการโหลดเท่ากัน โคเคนซ้ำไม่มีผลต่อระดับของแอคตินรูปที่ S8) หรือ histone ทั้งหมด 3 (รูปที่ S1) ใน NAc นอกจากนี้การติดเชื้อ HSV-G9a-GFP และ HSV-G9aH1093K-GFP ไม่มีผลต่อระดับรวมของ tub-tubulin ใน NAc (รูปที่ S8).
immunohistochemistry
หนูถูกทำให้สงบด้วยปริมาณคลอเรตไฮเดรตที่ร้ายแรงถึงตายและถูกนำไปผสมกับ 4% paraformaldehyde ก่อนนำมาวิเคราะห์โดยอิมมูโนฮิสโตเคมีเดี่ยวหรือคู่ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (S6) สังเขปสมองโพสต์ตายตัวถูกบ่มที่อุณหภูมิห้องค้างคืนในซูโครส 30% ก่อนที่จะถูกจัดหมวดหมู่ที่ 35 μm (สมองที่ใช้สำหรับการวิเคราะห์กระดูกสันหลัง dendritic ถูกจัดหมวดหมู่บน vibratome ที่ส่วน 100 μm) ฟรีส่วนที่ลอยตัว NAc ถูกล้างด้วย 30X PBS, บล็อก (1% เซรั่มลาปกติ, 3% tritonX, 0.1X PBS) และต่อมาบ่มด้วย anti-GFP (polyclonal, 1: 1) และ / หรือแอนตี้ - G8000a (rabbityclon , 9: 1) แอนติบอดีในสารละลายบล็อก วิเคราะห์ส่วนสำหรับกระดูกสันหลัง dendritic ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีแอนตี้ - GFP กระต่าย polyclonal ที่ 500: 1 หลังจากฟักตัวชั่วข้ามคืนส่วน NAc จะถูกล้าง 200 ครั้งเป็นเวลา 3 นาทีด้วย 10X PBS ตามด้วยการบ่มด้วย Cy1 และ / หรือ Cy2 แอนติบอดีทุติยภูมิคู่ใน 3X PBS สำหรับการปิดกั้นชั่วโมง ส่วนที่ใช้สำหรับการศึกษาทางสัณฐานวิทยาถูกบ่มในแอนติบอดีทุติยภูมิข้ามคืนที่อุณหภูมิห้อง การย้อมสีนิวเคลียร์ทำได้โดยการบ่มส่วนใน 1X PBS ที่มี DAPI (2: 1) เป็นเวลา 1 นาที ส่วนถูกล้างอีกครั้งตามด้วยการคายน้ำเอทานอลและติดตั้งด้วย DPX ทุกส่วนถูกถ่ายโดยใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล
การแยก RNA และ qPCR
เจาะ NAc 14 เกจทวิภาคีถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันใน Trizol และประมวลผลตามคำแนะนำของผู้ผลิต RNA ถูกทำให้บริสุทธิ์ด้วยคอลัมน์ RNAesy Micro และสเปกโตรสโคปียืนยันว่าปันส่วน RNA 260/280 และ 260/230 เป็น> 1.8 จากนั้น RNA จะถูกถ่ายทอดย้อนกลับโดยใช้ Bio-Rad iScript Kit cDNA ถูกหาปริมาณโดย qPCR โดยใช้ SYBR Green แต่ละปฏิกิริยาทำงานซ้ำกันหรือเป็นสามเท่าและวิเคราะห์ตามวิธีΔΔCtตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยใช้ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) เป็นตัวควบคุมการทำให้เป็นมาตรฐาน (S7) ดู ตารางเสริม S5 สำหรับลำดับไพรเมอร์ mRNA
การวิเคราะห์ DNA microarray
กลุ่มที่สี่ (3 ที่เป็นอิสระทางชีวภาพซ้ำต่อกลุ่ม) ถูกนำมาใช้สำหรับการศึกษา microarray รวม 12 microarrays 1 ชั่วโมงหลังจากการฉีดโคเคนครั้งสุดท้ายสัตว์ถูกประหารอย่างรวดเร็วและสมองถูกกำจัดและวางบนน้ำแข็ง การผ่าของ NAc นั้นใช้เข็มเจาะแบบ 15 และถูกแช่แข็งอย่างรวดเร็วบนน้ำแข็งแห้งจนกระทั่ง RNA ถูกสกัดออกมา หมัดทวิภาคีถูกรวบรวมจากสัตว์สี่ตัวต่อหนึ่งซ้ำรวมเป็นหนู 12 ต่อกลุ่ม การแยก RNA, การประมวลผล microarray และการวิเคราะห์ข้อมูลได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (S8). โดยย่อ RNA ถูกแยกและทำให้บริสุทธิ์ตามที่อธิบายไว้ข้างต้นและได้รับการตรวจสอบคุณภาพโดยใช้ Bioanalyzer ของ Agilent การถอดความแบบย้อนกลับการขยายการติดฉลากและการผสมกับอาร์เรย์ Illumina MouseWG-6 v2.0 ดำเนินการโดยใช้กระบวนการมาตรฐานโดยแกน microarray ของ UT Southwestern ข้อมูลดิบถูกลบพื้นหลังและทำให้เป็นมาตรฐานเชิงปริมาณโดยใช้ซอฟต์แวร์ Beadstudio วิเคราะห์ข้อมูลที่เป็นมาตรฐานโดยใช้ซอฟต์แวร์ GeneSpring และ genelists ถูกสร้างขึ้นโดยใช้เกณฑ์นัยสำคัญของการตัดการเปลี่ยนแปลง 1.3 เท่าควบคู่ไปกับการตัดค่า p-value ที่ไม่เข้มงวดที่ p <0.05
เรารักษาความเชื่อมั่นในข้อมูลเหล่านี้ในระดับสูงด้วยเหตุผลหลายประการ ประการแรกสัตว์ทุกตัวได้รับการจัดการบำบัดและฆ่าในเวลาเดียวกันภายใต้เงื่อนไขเดียวกัน รวมถึงการประมวลผลอาร์เอ็นเอและอาเรย์ทั้งหมดในเวลาเดียวกัน ประการที่สองเราดำเนินการเพิ่มขึ้นสามเท่าของอาร์เรย์และรวบรวมสัตว์หลายตัวต่อตัวอย่างอาร์เรย์ซึ่งจะช่วยลดความแตกต่างเนื่องจากความแปรปรวนของแต่ละบุคคลและการเพิ่มกำลังทางสถิติ (S9) ประการที่สามเกณฑ์การวิเคราะห์ข้อมูลที่ใช้สำหรับการศึกษาของเราได้รับการแนะนำโดยโครงการควบคุมคุณภาพ MicroArray เนื่องจากเกณฑ์เหล่านี้ได้รับการตรวจสอบแล้วเพื่อให้มีความสามารถในการทำซ้ำ intersite สูงและการทำซ้ำระหว่างและภายในแพลตฟอร์มS10-S11).
การก่อสร้างของเวกเตอร์ไวรัส
เนื่องจากข้อ จำกัด ขนาดการแทรกเวกเตอร์ของไวรัสลำดับการเข้ารหัสสำหรับ G9a Wildtype (G9a) หรือ catalytically G9a (G9aH1093K) ที่เร่งปฏิกิริยาของมนุษย์ในตอนแรก (G1005aH9K) ถูกย่อยสลายเป็นพลาสมิด p3.96 + HSV ขนาดการแทรกคือ ~ 2 kb ซึ่งเกินขนาดการแทรกสูงสุดสำหรับเวกเตอร์ AAV-4) โปรโมเตอร์ IE5 / 9 ขับเคลื่อนการแสดงออกของ G1005a ชิ้นส่วนถูก subcloned ลงใน bicistronic p9 + HSV พลาสมิดผ่านทางปลายทู่ด้วย Klenow ที่ได้รับการรักษา PmeI และ EcoRI ที่ถูกย่อย G3.1a (จาก pcDNA1005) และ CIP ที่รักษา p1005 + การย่อยอาหารตาม EcoRI สำหรับการผลิต HSV-unJunD-GFP ลำดับการเข้ารหัสของΔJDDขนาบข้างด้วยไซต์ข้อ จำกัด EcoRI ถูกสร้างขึ้นโดย PCR โดยใช้ไพรเมอร์โอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่มีไซต์ EcoRI จากนั้นผลิตภัณฑ์ PCR จะเชื่อมโยงกับไซต์ EcoRI ของ pXNUMX + เวกเตอร์ การแสดงออกในท้องถิ่นของ Cre recombinase ในเซลล์ประสาท NAc ทำได้โดยการจัดส่งยีนผ่านไวรัสโดยใช้เวกเตอร์ AAV ดังที่อธิบายไว้ (S12) GFP หรือ N-terminal fusion ของ GFP to Cre ถูก subcloned เป็นเวกเตอร์ AAV-2 recombinant ที่มีตัวโปรโมต CMV ที่มีลำดับตัวรับบริจาคผู้ประกบและสัญญาณ polyadenylation การแทรกเวกเตอร์ทั้งหมดได้รับการยืนยันโดยลำดับ ไวรัสพาหะเกิดขึ้นโดยใช้วิธีการเปลี่ยนถ่ายสามทางปราศจากผู้ช่วยตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (S13) ไวรัสบริสุทธิ์ถูกเก็บไว้ที่ −80 ° C ประเมินคุณภาพของไวรัสโดย titer ที่ติดเชื้อที่ประเมินในเซลล์ HEK293 AAV-ΔFosB-GFP ไวรัสจัดทำในทำนองเดียวกัน สำหรับ HSV-Cre นิพจน์ Cre ถูกผลักดันโดยผู้สนับสนุน IRES ซึ่งตรงข้ามกับโปรโมเตอร์ IE4 / 5 เพื่อลดการแสดงออกของ Cre และป้องกันความเป็นพิษของเส้นประสาท S14 สำหรับการสร้างไวรัส) ในทุกกรณีการตรวจสอบการแสดงออกของไวรัสมากเกินไปทั้งคู่ ในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย ผ่าน qPCR และไวรัสได้รับการยืนยันทางอิมมูโนฮีสโตเคมีเพื่อแสดงการ จำกัด การแสดงออกของ NAc หลังจากการผ่าตัด
การผ่าตัด stereotaxic
ภายใต้คีตามีน (100 มก. / กก.) / ไซลาซีน (10 มก. / กก.) การวางยาสลบหนูอยู่ในตำแหน่งที่เป็นเครื่องมือฆ่าสัตว์ขนาดเล็กและพื้นผิวกะโหลกถูกสัมผัส เข็มฉีดยาสามสิบสามเข็มถูกนำมาใช้ในการฉีดไวรัส 0.5 μlทั้งสองข้างลงใน NAc ที่มุม 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) ที่อัตรา 0.1 μl / นาที สัตว์ที่ได้รับการฉีด HSV ได้รับอนุญาตให้ฟื้นตัวเป็นเวลา 2 วันหลังการผ่าตัดในขณะที่หนูที่ใช้สำหรับการทดสอบพฤติกรรมที่ได้รับเวกเตอร์ AAV ได้รับอนุญาตให้กู้คืนเป็นเวลา 20 วันก่อนที่จะถูกปรับสภาพ เวลาเหล่านี้สอดคล้องกับช่วงเวลาของการแสดงออกของยีน transgene ไวรัสพึ่งมากที่สุดสำหรับทั้งสองเวกเตอร์ สำหรับการฉีด BIX01294 นั้น mini-pump สองตัวแต่ละตัวจะถูกวางใต้ผิวหนังที่ด้านหลังของเมาส์ การวางตำแหน่ง Cannulae ทำได้โดยการเจาะรูกะโหลกขนาดเล็กสองรูเหนือ NAc และโดยการส่ง cannula จาก bregma (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4) หนูได้รับอนุญาตให้กู้คืนจากการผ่าตัดสำหรับ 4 เป็น 5 วันก่อนเริ่มขั้นตอนการปรับสภาพสถานที่เป็นโคเคนตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง
การตั้งค่าสถานที่ที่มีเงื่อนไข
ขั้นตอนการกำหนดสถานที่ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยมีการปรับเปลี่ยนดังต่อไปนี้ (S7). ในช่วงสั้น ๆ 3 วันหลังจากการฉีดเข้าภายในของ HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP หรือ HSV-GFP หนูถูกวางไว้ในห้องปรับอากาศซึ่งประกอบด้วยสภาพแวดล้อมที่แตกต่างกันสามสภาพแวดล้อม หนูที่แสดงความพึงพอใจอย่างมีนัยสำคัญสำหรับห้องปรับอากาศทั้งสองห้องถูกแยกออกจากการศึกษา (<10% ของสัตว์ทั้งหมด) จากนั้นกลุ่มการปรับสภาพได้รับการปรับสมดุลเพื่อปรับสมดุลของห้องที่อาจยังคงมีอยู่ ในวันต่อมาสัตว์ได้รับการฉีดน้ำเกลือและกักขังไว้ในห้องหนึ่งในช่วงบ่ายเป็นเวลา 30 นาทีจากนั้นฉีดโคเคน (10 มก. / กก., ไอพี) และกักขัง 30 นาทีไปยังห้องอื่นในตอนเย็นเป็นเวลา 2 วัน น้ำเกลือและโคเคนสองคู่) ในวันที่ทำการทดสอบหนูถูกวางกลับเข้าไปในเครื่องมือโดยไม่ได้รับการรักษาเป็นเวลา 20 นาทีและทำการทดสอบเพื่อประเมินว่าพวกเขาชอบด้านใด การตอบสนองของ Locomotor ต่อโคเคนได้รับการประเมินโดยการแบ่งลำแสงในห้องที่จับคู่โคเคนเพื่อให้มั่นใจถึงประสิทธิผลของการรักษาด้วยยา สำหรับการทดลอง AAV และ BIX01294 CPP จะมีการใช้โปรโตคอลที่ปรับเปลี่ยนเล็กน้อย สัตว์ได้รับการฉีดน้ำเกลือหรือโคเคนอีกครั้ง (10 มก. / กก., ไอพี) และกักขังไว้ในห้องเฉพาะเป็นเวลา 30 นาที แต่จะได้รับการปรับอากาศเพียงวันละครั้งเป็นเวลา 4 วันตามด้วยการทดสอบในวันที่ 5 (สัตว์ได้รับการปรับสภาพ ในตอนเย็นและการปรับสภาพจะสลับกันไป) สำหรับทุกกลุ่มการเคลื่อนไหวพื้นฐานในการตอบสนองต่อน้ำเกลือได้รับการประเมินเพื่อให้แน่ใจว่าการเคลื่อนไหวไม่ได้รับผลกระทบจากการรักษาด้วยไวรัสหรือสารยับยั้ง
การบริหารโคเคนทางหลอดเลือดดำด้วยตนเอง
หนูหนูอีแวนส์วัยรุ่นชายน้ำหนัก 230 – 250 กรัมที่จุดเริ่มต้นของการทดลองได้รับ พวกเขาตั้งอยู่ในสภาพแวดล้อมที่มีการควบคุมอุณหภูมิและความชื้นบนรอบแสง / รอบมืด / มืดของ 12 ที่กลับด้าน (ปิดไฟที่ 9: 00 am) ด้วย โฆษณาฟรี การเข้าถึงอาหารและน้ำ หนูได้รับอนุญาตให้ปรับตัวในสภาพแวดล้อมใหม่ของพวกเขาและได้รับการจัดการทุกวันเป็นเวลา 1 สัปดาห์ก่อนเริ่มการทดสอบ ทุกขั้นตอนดำเนินการตามแนวทางของสถาบันสุขภาพแห่งชาติเพื่อการดูแลและการใช้สัตว์ทดลองและได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ของเมาท์ไซนาย อุปกรณ์การดูแลตนเองติดตั้งลำแสงอินฟราเรดเพื่อวัดพฤติกรรมของหัวรถจักร การจัดการตนเองดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า (S15-S16) โดยใส่สายสวนเข้าไปในหลอดเลือดดำคอด้านขวาภายใต้การดมยาสลบไอโซฟลูเรน (2.4–2.7%) ท่อสวนล้างด้วยน้ำเกลือ 0.1 มล. ที่มี 10 U heparin และ ampicillin (50 mg / kg) หลังจากพักฟื้นจากการผ่าตัดหนึ่งสัปดาห์การฝึกการบริหารตนเองเริ่มขึ้นในช่วงมืดของวงจรแสง / ความมืด สัตว์ได้รับอนุญาตให้เข้าถึงโคเคนวันละ 3 ชั่วโมง (0.75 มก. / กก. / การฉีดยา) ภายใต้ตารางการเสริมแรงที่อัตราส่วนคงที่ -1 (FR1) โดยที่การกดคันโยก 1 ครั้งส่งผลให้ได้ยาเพียงครั้งเดียว หนูปรับการบริโภคโคเคนให้คงที่หลังจาก 6 วัน (อัตราการตอบสนองที่เปลี่ยนแปลง <15% ในช่วง 3 วันติดต่อกันโดยอย่างน้อย 75% ตอบสนองต่อคันโยกเสริมแรง) 24 ชั่วโมงหลังจากการบริหารตัวเองครั้งสุดท้ายหนูจะถูกตัดหัวอย่างรวดเร็วสมองถูกถอดออกอย่างรวดเร็วและประมวลผลเพื่อแยก RNA และ qPCR
โครมาตินกระตุ้นการตกผลึก (ChIP)
หมัดเด็ด NAc เป็นฟอร์มัลดีไฮด์เชื่อมโยงข้ามและเตรียมพร้อมสำหรับ ChIP ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (S17-S18) ด้วยการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย โดยสังเขป 4 14-gauge NAc punches ต่อสัตว์ (สัตว์ 5 pooled ต่อตัวอย่าง) ถูกรวบรวมข้ามแบบเชื่อมโยงกับ 1% ฟอร์มาลดีไฮด์และดับด้วย 2 M glycine ก่อนแช่แข็งที่ −80 ° C 1 วันก่อนตัวอย่าง sonication, anti-rabbit / mouse แกะ (ขึ้นอยู่กับแอนติบอดี precipitation) ลูกปัดแม่เหล็ก IgG ถูกจัดทำขึ้นโดยการบ่มลูกปัดแม่เหล็กที่เหมาะสมด้วยเกรด G9a (เกรด polyclonal ChIP ของกระต่าย) หรือ anti-H3K9me2meumxmexnumx แอนติบอดีค้างคืนที่ 4 ° C ภายใต้การหมุนคงที่ในสารละลายบล็อก Sonication เนื้อเยื่อและการตัดโครมาตินได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (S17) จากการ sonication ความเข้มข้นของโครมาตินที่เท่ากันถูกถ่ายโอนไปยังหลอดใหม่และ ~ 5% ของผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้ายถูกบันทึกไว้เพื่อทำหน้าที่เป็นตัวควบคุม 'อินพุต' หลังจากการล้างอย่างละเอียดและ resuspension ของผสม conjugated ลูกปัด / แอนติบอดีปริมาณแอนติบอดี / ผสมเท่ากับ (~ 7.5 μgแอนติบอดี / ตัวอย่าง) ถูกเพิ่มเข้าไปในแต่ละตัวอย่าง chromatin และบ่มชั่วโมง 16 ° C ภายใต้การหมุนคงที่ที่ 4 ° C ตัวอย่างถูกล้างและย้อนกลับข้ามเชื่อมโยงที่ 65 ° C ค้างคืนก่อนการทำให้บริสุทธิ์ด้วย DNA โดยใช้ชุดการทำให้บริสุทธิ์ด้วย PCR หลังจากการทำให้ดีเอ็นเอบริสุทธิ์ตัวอย่างจะถูกควบคุมโดย qPCR และปรับให้เป็นมาตรฐานสำหรับการควบคุม 'อินพุต' ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า (S17) immunoprecipitations IgG ของเมาส์ปกติโดยใช้แอนติบอดีต่อต้าน IgG ของเมาส์ polyclonal ได้ดำเนินการเพื่อควบคุมการเพิ่มประสิทธิภาพของการขยายสัญญาณที่เหมาะสม Adenine phosphoribosyltransferase (APRT) ถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบสำหรับการทดลองโคเคนและ osFosB ดู ตารางเสริม S5 สำหรับลำดับไพรเมอร์โปรโมเตอร์
การวิเคราะห์กระดูกสันหลัง Dendritic
เพื่อศึกษาบทบาทของ G9a ในการควบคุมสัณฐานวิทยาของเซลล์ประสาทในร่างกายเราใช้วิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ด้วยการปรับเปลี่ยนดังต่อไปนี้ (S1) สามวันหลังจากฉีด HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (ไวรัสทั้งหมดถูกนำมาใช้ในหนูชนิด C57Bl / 6J) หรือ HSV-Cre-GFP (ใช้ใน G9aชั้น / ชั้น หนู) เมื่อการแสดงออกของไวรัสมากที่สุดหนูถูกทำให้ยุ่งเหยิงสมองถูกแช่แข็งและต่อมาถูกแบ่งส่วนที่ 100 μmบน vibratome ส่วนที่ได้รับภูมิคุ้มกันโดยใช้แอนติบอดีต่อ GFP ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น (ดู Immunohistochemistry) เพื่อประเมินผลกระทบของการแสดงออกมากเกินไปและการทำให้ล้มลงของจำนวน G9a รวมถึงผลกระทบของการแสดงออกที่เกินขีด จำกัด ของ unJunD เราวัดจำนวนของกระดูกสันหลังในจำนวนประมาณ 1 – 2 neurites ต่อเซลล์ประสาทเท่ากับอย่างน้อย 299 μmของ dendrites รองจาก GFP-expressing NAc spiny neurons (MSNs) ระบุว่า MSNs มีลักษณะทางสัณฐานวิทยาแตกต่างจากประชากรเซลล์ประสาทอื่น ๆ ใน NAc เช่นเดียวกับรายงานก่อนหน้านี้ที่ระบุว่า HSV ส่วนใหญ่ติดเชื้อ DARPP-32 แสดงเซลล์ประสาทในพื้นที่สมองนี้ (S19) เรามั่นใจว่า MSN ได้รับการประเมินโดยเฉพาะในการศึกษาเหล่านี้ สำหรับสัตว์แต่ละตัวเราตรวจสอบเซลล์ประสาท ~ 6 – 8 ในสัตว์ 3 – 4 ต่อกลุ่ม (กลุ่ม 7) หลังจากนั้นได้รับค่าเฉลี่ยสำหรับสัตว์แต่ละตัวสำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติ การทดลองที่ออกแบบมาเพื่อตรวจสอบผลของ expressFosB ที่มีต่อการแสดงออกของความหนาแน่นของกระดูกสันหลัง NAc นั้นดำเนินการคล้ายกับที่อธิบายไว้ข้างต้นยกเว้นว่ามีการใช้เวกเตอร์ AAV เพื่อแสดง GFP หรือΔFosB-GFP เป็นระยะเวลานาน (8 สัปดาห์) ภาพ HSV ทั้งหมดถูกจับโดยใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลที่มีวัตถุประสงค์การแช่น้ำมัน 100X (ภาพ AAV ถูกถ่ายด้วยวัตถุประสงค์การแช่น้ำมัน 63X) ได้รับรูปภาพพร้อมชุดรูเข็มที่หน่วยโดยพลการ 1 และขนาดเฟรม 1024 × 1024 ความยาวของเอ็นเดนริทถูกวัดโดยใช้ซอฟต์แวร์ NIH Image J และจำนวนกระดูกสันหลังนับคนตาบอดโดยผู้ทดลองหลักเนื่องจากสไลด์ถูกเขียนรหัสก่อนการสแกนเชิงทดลอง คำนวณค่าเฉลี่ยจำนวนครีบต่อ 10 μmของ dendrite
การวิเคราะห์ทางสถิติ
การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวและสองทางดำเนินการเพื่อตรวจสอบความสำคัญของการเลือกสถานที่แบบมีเงื่อนไขและการวิเคราะห์กระดูกสันหลัง dendritic ที่มีมากกว่าสองกลุ่ม การทดสอบ t ของนักเรียนถูกใช้สำหรับการเปรียบเทียบอื่น ๆ รวมถึง qPCR, blotting ตะวันตก, การวิเคราะห์กระดูกสันหลัง dendritic เปรียบเทียบ HSV-GFP กับ HSV-Cre ใน G9aชั้น / ชั้น หนูการวิเคราะห์ microarray (ดูด้านบน) และการทดลองภูมิคุ้มกันด้วยโครมาติน การทดสอบ t ของนักเรียนที่วางแผนไว้ถูกนำมาใช้หลังจากการวิเคราะห์ความแปรปรวนสองทางของความหนาแน่นของกระดูกสันหลังส่วนล่างหลังจากการแสดงออกของΔFosBพร้อมกับการยืนยันผลกระทบหลักที่สำคัญของการรักษาด้วยยาและไวรัส ค่าทั้งหมดที่รวมอยู่ในคำอธิบายภาพแสดงถึงค่าเฉลี่ย± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001) การวิเคราะห์ทางสถิติโดยละเอียดสำหรับ มะเดื่อ 1-3 ในข้อความหลักจะได้รับใน: ตำนานรูปโดยละเอียดรวมถึงสถิติ
เชิงอรรถ
ฉันขอรับรองว่าไม่มีเนื้อหาใดรวมอยู่ในต้นฉบับที่มีสิทธิ์ บทบาทที่สำคัญของฮิสโตนเมทิลtransferase G9a ในพลาสติกที่เกิดจากโคเคน ได้รับการเผยแพร่ก่อนหน้านี้หรืออยู่ระหว่างการพิจารณาที่อื่นรวมถึงบนอินเทอร์เน็ต
งานทั้งหมดที่เกี่ยวข้องกับการใช้สัตว์ได้ดำเนินการตามแนวทางของสถาบันและ IACUC ทั้งที่ศูนย์การแพทย์มหาวิทยาลัยเท็กซัสตะวันตกเฉียงใต้และโรงเรียนแพทย์เมาท์ไซนาย
การอ้างอิงและหมายเหตุ
;
