ระเบียบความมั่นคง DeltaFosB โดย phosphorylation (2006)

J Neurosci 2006 May 10;26(19):5131-42.

แหล่ง

ภาควิชาจิตเวชศาสตร์ศูนย์ประสาทขั้นพื้นฐานมหาวิทยาลัยเท็กซัสตะวันตกเฉียงใต้ศูนย์การแพทย์ดัลลัสเท็กซัส 75390-9070 สหรัฐอเมริกา

นามธรรม

ปัจจัยการถอดความ DeltaFosB (หรือเรียกว่า FosB2 หรือ FosB [รูปแบบสั้น ๆ ]) เป็นสื่อกลางที่สำคัญของปั้นระยะยาวที่เกิดขึ้นในสมองโดยการสัมผัสเรื้อรังกับสิ่งเร้าทางจิตหลายประเภทรวมถึงยาเสพติดการละเมิดความเครียดและการชักด้วยไฟฟ้า . คุณสมบัติที่แตกต่างของ DeltaFosB คือเมื่อชักนำมันจะยังคงอยู่ในสมองเป็นเวลานานในกรณีที่ไม่มีการกระตุ้นเพิ่มเติม อย่างไรก็ตามกลไกที่แสดงถึงเสถียรภาพที่เด่นชัดนี้ยังไม่ทราบแน่ชัด ที่นี่เราแสดงให้เห็นว่า DeltaFosB เป็นปัจจัยการถอดความที่ค่อนข้างเสถียรโดยมีครึ่งชีวิตประมาณ 10 ชั่วโมงในการเพาะเลี้ยงเซลล์ นอกจากนี้เราแสดงให้เห็นว่า DeltaFosB เป็นฟอสโฟโปรตีนในสมองและฟอสโฟรีเลชั่นของเซรีนที่ตกค้างสูง (Ser27) ใน DeltaFosB ช่วยปกป้องมันจากการย่อยสลายของโปรตีน เรามีหลักฐานหลายบรรทัดชี้ให้เห็นว่า phosphorylation นี้เป็นสื่อกลางโดย casein kinase 2 การค้นพบเหล่านี้เป็นหลักฐานแรกที่ DeltaFosB เป็น phosphorylated และแสดงให้เห็นว่า phosphorylation ก่อให้เกิดความมั่นคงซึ่งเป็นหัวใจสำคัญของความสามารถในการไกล่เกลี่ยการปรับตัวที่ยาวนานในสมอง

บทนำ

ปัจจัยการถอดความΔFosBยังกำหนด FosB2 หรือ FosB [รูปแบบย่อ] เป็นรูปแบบ C ปลายทางเทอร์มินัสที่ถูกตัดทอนของยีนเริ่มต้นทันที fosb (Dobrazanski และคณะ, 1991; Nakabeppu และ Nathans, 1991; Yen et al., 1991) เช่นเดียวกับ FosB ที่มีความยาวเต็มรูปแบบΔFosBมีโดเมนพื้นฐานที่มีผลผูกพันกับดีเอ็นเอและซิป leucine ซึ่งมันจะลดขนาดลงด้วยโปรตีน Jun เพื่อสร้างโปรตีน activator-1 (AP-1) คอมเพล็กซ์ปัจจัยการถอดรหัสซึ่งควบคุมการแสดงออกของยีนต่างๆมอร์แกนและเคอร์แรน 1995; Rylski และ Kaczmarek, 2004) แม้จะไม่มีส่วนหนึ่งของโดเมนการถ่ายโอนข้อมูลที่พบใน C ปลายทางของ FosB แต่ΔFosBทำหน้าที่เป็นทั้งตัวเร่งปฏิกิริยาการถอดรหัสและการบีบอัดที่มีศักยภาพในเซลล์เพาะเลี้ยงและในสมอง (Dobrazanski และคณะ, 1991; Nakabeppu และ Nathans, 1991; เฉินและคณะ, 1997; McClung และ Nestler, 2003; Kumar et al., 2005).

ΔFosB ถูกชักนำให้อยู่ในระดับสูงในลักษณะเฉพาะภูมิภาคในสมองหลังเรื้อรัง แต่ไม่รุนแรงการสัมผัสกับสิ่งกระตุ้นทางจิตหลายรูปแบบรวมถึงความเครียดรอยโรคบางอย่างยาต้านโรคจิตและยากล่อมประสาทยาเสพติดและรางวัลจากธรรมชาติ (หวังว่าอัล, 1994b; Hiroi และ Graybiel, 1996; Moratalla และคณะ, 1996; Bing et al., 1997; Mandelzys และคณะ, 1997; Kelz และคณะ, 1999; Werme et al., 2002; Andersson และคณะ, 2003; Colby และคณะ 2003; Peakman และคณะ 2003; Perrotti et al., 2004; Zachariou และคณะ, 2006) การเหนี่ยวนำของΔFosBเกี่ยวข้องโดยตรงกับผลการทำงานของสิ่งเร้าเหล่านี้หลายอย่างในสมอง การคงอยู่ของΔFosBแม้ในกรณีที่ไม่มีการกระตุ้นเพิ่มเติมแยกแยะความแตกต่างจากปัจจัยการถอดความจากครอบครัว Fos อื่น ๆ ทั้งหมดซึ่งเกิดขึ้นอย่างรวดเร็วในการตอบสนองต่อสิ่งเร้าเฉียบพลันสลายกลับไปสู่ระดับฐานภายในไม่กี่ชั่วโมงความหวังและคณะ, 1992; Daunais และคณะ, 1993; Persico et al., 1993; Hiroi และ Graybiel, 1996; Perrotti et al., 2004) สิ่งนี้ทำให้ΔFosBเป็นตัวเลือกที่น่าสนใจในการเป็นสื่อกลางในการเปลี่ยนแปลงของการแสดงออกของยีนในระยะยาวที่รองรับการปรับตัวของเซลล์ประสาทที่เสถียรซึ่งเกิดจากสิ่งกระตุ้นบางอย่าง

เนื่องจากการมีอยู่เป็นเวลานานของΔFosBเกิดขึ้นเมื่อไม่มีการเหนี่ยวนำ mRNA เพิ่มเติม (เฉินและคณะ, 1995) เราคาดการณ์ว่าแตกต่างจาก FosB แบบเต็มความยาวและโปรตีนในตระกูล Fos อื่น ๆ ทั้งหมดซึ่งมีความไม่แน่นอนภายใน intFosB อาจเป็นปัจจัยการถอดรหัสที่เสถียรผิดปกติ (หวังว่าอัล, 1994b; เฉินและคณะ, 1997; Nestler et al., 2001; McClung และคณะ, 2004) ยิ่งไปกว่านั้นการวิเคราะห์อิมมูโนลอตติ้งจากเนื้อเยื่อสมองที่มีการกระตุ้นแบบเฉียบพลันและแบบเรื้อรังชี้ให้เห็นว่า M_r (มวลโมเลกุล) จาก ∼33 kDa ในสภาพเฉียบพลันถึง ∼35 – 37 kDa ระหว่างการรักษาแบบเรื้อรัง (Hope et al., 1994a; เฉินและคณะ, 1995) เนื่องจากไม่มีหลักฐานว่ามี mRNA เพิ่มเติมที่สามารถเข้ารหัสสำหรับไอโซฟอร์มต่าง ๆ เหล่านี้ได้เราจึงคาดการณ์เพิ่มเติมว่าΔFosBได้รับการแก้ไขหลังยุคปัจจุบันและอาจก่อให้เกิดเสถียรภาพที่ผิดปกติ อย่างไรก็ตามจนถึงปัจจุบันยังไม่มีรายงานการวิเคราะห์ทางชีวเคมีของการหมุนเวียนหรือการดัดแปลงหลังการแปลของΔFosB เป้าหมายของการศึกษาครั้งนี้คือการตรวจสอบว่าΔFosBเป็นฟอสโฟโปรตีนหรือไม่และฟอสโฟรีเลชั่นมีบทบาทในความเสถียรหรือไม่

ส่วนก่อนหน้า ส่วนถัดไป

วัสดุและวิธีการ

เส้นเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมและ DNA สร้างขึ้น

เซลล์ PC12 (Clontech, Mountainview, CA) ได้รับการเลี้ยงใน DMEM กลูโคสสูงที่มี l-glutamine (L-Gln) และเสริมด้วย 5% ซีรั่มวัวในครรภ์ของทารกในครรภ์ (FBS), 10% ม้าเซรั่ม (ทั้งจาก Invitrogen, Carlsbad, CA) , 100 U / ml penicillin และ 100 μg / ml streptomycin (ทั้งจาก Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) เซลล์ HeLa (American Type Culture Collection, Manassas, VA) ได้รับการเลี้ยงใน DMEM กลูโคสสูงที่มี L-Gln และเสริมด้วย 10% FBS, penicillin และ Streptomycin เส้นทั้งสองถูกเก็บรักษาไว้ที่ 37 ° C ใน 5% CO แบบชื้น₂ บรรยากาศ

สำหรับการถ่ายยีน transient ชั่วคราวด้วย DNA เซลล์ PC12 หรือ HeLa จะถูกนำไปวางบนเพลตหกหลุม (เคลือบด้วยคอลลาเจน I สำหรับเซลล์ PC12) เพื่อไปยัง 90 – 100% การบรรจบกันในวันถัดไปและถูกเปลี่ยนรูปโดยใช้ Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ในการทดลองบางอย่าง (ดู มะเดื่อ 1 ⇓⇓⇓⇓⇓-7) ΔFosBถูกแสดงออกชั่วคราวในเซลล์ PC12 ผ่านการติดเชื้อไวรัส recombinant herpes simplex (HSV)

osFosB และ FosB cDNA ได้มาจาก pTetop-constructs ของเราเอง (เฉินและคณะ, 1997) และ subcloned เป็นเวกเตอร์ pcDNA3.1 (Invitrogen) โครงสร้าง pcDNA3.1-ΔFosB / FosB เหล่านี้ใช้สำหรับการแสดงออกในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม Recombinant HSV-ΔFosBถูกจัดทำขึ้นตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า (Neve et al., 1997) และการเตรียมมี titer ของ ∼1 × 10⁸ PFU / ml

การทดลองแบบ Pulse-chase

ประมาณ 24 ชั่วโมงหลังจากการติดเชื้อ / ถ่ายเซลล์ (PC12 หรือ HeLa) ในจานหกหลุมถูกล้างสองถึงสามครั้งด้วย 2 ml ของ PBS และบ่มที่ 37 ° C สำหรับ ∼1 h ใน 2 ml ของ CEM / Met-free DMEM (Invitrogen) เสริมด้วย 5% dialyzed FBS (Hyclone, Logan, UT) เพื่อทำให้หมดสิ้นไปกับพูลภายในเซลล์ของ Met และ Cys ในตอนท้ายของช่วงเวลา“ ความอดอยาก” นี้จะมีการเพิ่มยา (ถ้าต้องรักษาเซลล์) และเซลล์ถูกระบุ (ชีพจร) ด้วย 12 – 25 μCiของ ³⁵S โปรตีนฉลากผสม (PerkinElmer, Wellesley, MA) สำหรับ ∼1 h ที่ 37 ° C เพื่อติดฉลากโปรตีนที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่ทั้งหมด จากนั้นล้างด้วย radiolabel โดยการล้างเซลล์สองถึงสามครั้งด้วย 2 ml ของ PBS และ ³⁵ติดตามโปรตีนที่มีเครื่องหมาย S (ไล่ล่า) โดยแทนที่สื่อด้วยสื่อ“ เย็น” (ไม่ได้แสดงปฏิกิริยา) ที่เสริมด้วย 5% FBS และเก็บเกี่ยวเซลล์ตามเวลาต่าง ๆ รักษาเซลล์ถูกรักษาตลอดการไล่ล่า ตัวเลขทั้งหมดของการทดลองเหล่านี้แสดงปริมาณเริ่มต้นที่คล้ายกันของโปรตีนต่างๆเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการเปรียบเทียบอัตราการหมุนเวียนของพวกเขา

สัตว์และการรักษาอาการชักด้วยไฟฟ้า

หนูตัวผู้ผสมพันธุ์ดอว์ลีย์ (200 – 300 g; Charles River Laboratories, Kingston, RI) ได้รับการรักษาวันละครั้งด้วยอาการคลื่นไฟฟ้าหัวใจ (ECS) สำหรับ 7 – 9 d ECS ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Hope et al., 1994a) ใช้ Ugo Basile (Comerio VA, อิตาลี) หน่วย ECS พร้อมการตั้งค่าต่อไปนี้: ความถี่, พัลส์ 100 / s; ชีพจรด้วย, 0.5 ms; ระยะเวลาช็อต 1.0 s; และปัจจุบัน 75 mA สัตว์ควบคุมเสแสร้งได้รับการรักษาแบบขนานโดยการใช้อิเล็กโทรดหูคลิปโดยไม่มีกระแสไฟฟ้า

³² การติดฉลาก P เผาผลาญ

สำหรับการติดฉลากชิ้นส่วนสมองหนูถูกตัดหัวสมองจะผ่าอย่างรวดเร็วและชิ้นส่วนเยื่อหุ้มสมองด้านหน้า 300 μmถูกเตรียมด้วยไมโคร DSK (Ted Pella, Redding, CA) ชิ้นส่วนถูกบ่มในหลอดพลาสติกในซีเอสเอฟ 2 มล. ที่ขาดฟอสเฟต (ACSF) และรักษาที่อุณหภูมิ 30 ° C ภายใต้ฟองที่คงที่ด้วย O₂/ CO₂ ส่วนผสม (Hemmings และคณะ, 1989) ชิ้น (สองชิ้นต่อหลอด) ถูกระบุด้วย 1.3 mCi สำหรับ 8 – 10 h ในที่ที่มีหรือไม่มีกรด okadaic (100 ng / ml) ในตอนท้ายของการฟักตัวนี้ชิ้นถูกล้างอย่างน้อยสามครั้งด้วย ACSF เย็นแล้ว homogenized โดย sonication ใน 250 μlของการตรวจหาสารก่อภูมิแพ้ด้วยความเย็น (RIPA) [PBS, pH 7.4, NaNX mm ) Igepal, 150% (w / v) โซเดียม deoxycholate, 1% (w / v) SDS, 0.5 mm EDTA] เสริมก่อนใช้กับ SDS สูงสุด 0.1%, โปรติเอสยับยั้งโปรตีนสำหรับเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม (ใช้ที่ 1 μl / ml; Sigma-Aldrich), phosphatase ยับยั้งค็อกเทล I และ II (ใช้ที่ 0.6: 5; Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF และ 100% กลีเซอรอล จากนั้นโฮโมจีเนทจะถูกต้มเพื่อ 1 นาทีและล้างด้วยการปั่นแยกที่ 2 × g สำหรับ 15 ขั้นต่ำ ความเข้มข้นของโปรตีนใน supernatants ที่เกิดขึ้นได้รับการประเมินโดยใช้การทดสอบโปรตีน BCA (Pierce, Holmdel, NJ)

สำหรับ ³²การติดฉลาก P ของเซลล์ที่เพาะเลี้ยง N24 h หลังจากการติดเชื้อ / การถ่ายเซลล์ถูกล้างสองถึงสามครั้งด้วยสื่อที่ปราศจากฟอสเฟตและบ่มในสื่อนี้สำหรับ ∼1 ชั่วโมง หลังจากช่วงเวลาที่อดอาหารนี้ 0.2 – 0.3 mCi ของ ³²PH₃PO₄ (PerkinElmer) ถูกเพิ่มเข้าไปในแต่ละหลุมและเซลล์มีการติดป้ายกำกับสำหรับ 4 – 12 h ขึ้นอยู่กับประเภทของการทดสอบ (ดูรูปที่ XIG XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX สำหรับรายละเอียด) เซลล์ถูกล้างแล้วสามครั้งด้วย PBS และ lysed บนน้ำแข็งเป็นเวลา 1 นาทีด้วย 7 μlของบัฟเฟอร์ RIPA เสริม Lysates ถูกเก็บรวบรวมโดยการขูดและผ่าน 15 ครั้งผ่านเข็ม 50 ga เพื่อตัด DNA ต้มเป็นเวลา 10 นาทีและหมุนเหวี่ยงที่ 25 rpm สำหรับ 10 – 15,000 นาทีที่ 15 ° C lysates ที่ล้างออก (supernatants) ถูกถ่ายโอนไปยังหลอดใหม่และทำการทดสอบโปรตีน BCA (Pierce) ตัวเลขทั้งหมดของการทดลองเหล่านี้แสดงปริมาณรวมของ wild-type (WT) และ S30A ΔFosBโปรตีนในปริมาณที่ใกล้เคียงกันเพื่อปรับการเปรียบเทียบระดับ phosphorylation สัมพัทธ์ของพวกมันให้เหมาะสม

สารเคมีและการบำบัดเซลล์

กรดโอคาดะอิก (OA; Sigma-Aldrich) ถูกละลายในเอทานอลและใช้ที่ความเข้มข้นสุดท้ายของ 100 ng / ml 5,6-Dichloro-1---d-ribofuranosyl-benzimidazole (DRB; Biomol, ประชุมพลีมั ธ , PA) ถูกละลายใน dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich) และใช้ในการเพาะเลี้ยงเซลล์ที่ความเข้มข้นสุดท้ายของ 50 μm Spermine (Sigma-Aldrich) ถูกละลายในน้ำและใช้ที่ความเข้มข้นสุดท้ายของ 200 μm Calphostin-C (Biomol) ถูกละลายใน DMSO และใช้ที่ 0.2 μmในขณะที่ phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA; Promega, Madison, WI) ถูกละลายใน DMSO และใช้ที่ 0.1 μm myristoylated-autocamtide-2 ที่เกี่ยวข้องกับการยับยั้งเปปไทด์ (m-AIP; Biomol) ถูกละลายในน้ำและใช้ที่ความเข้มข้นสุดท้ายของ 1 และ 10 μm ไคเนสโปรตีนในวงกว้างสเปกตรัม H-7 และ H-8 (Biomol) ถูกละลายในน้ำและใช้ที่ความเข้มข้นสุดท้ายของ 150 และ 200 μmตามลำดับ MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) และ epoxomicin (Peptides International, Louisville, KY) ถูกละลายใน DMSO และใช้ที่ความเข้มข้นสุดท้ายของ 12.5 และ 7.5 μmตามลำดับ ในการทดลองทั้งหมด DMSO (ยานพาหนะ) ถูกเพิ่มเข้ากับเซลล์ตามความจำเป็นเพื่อรักษา DMSO ในปริมาณที่คงที่ตลอดการรักษา สำหรับ ³²P การทดลองการติดฉลากยาจะถูกเพิ่มทันทีก่อนที่จะติดฉลากและเก็บไว้ในช่วงเวลาที่เหลือของการติดฉลาก สำหรับการทดลองแบบพัลส์เชสพบว่ามีการเพิ่มยาเสพติดในช่วงเวลาที่“ อดอยาก” ของ Cys / Met ตลอดระยะเวลาการติดฉลากจากนั้นเพิ่มกลับเข้าไปในสื่อการไล่ล่า สารยับยั้ง proteasome ถูกแทงทุก 3 – 4 ชั่วโมงตลอดการไล่ล่าเพื่อชดเชยการหมุนเวียนอย่างรวดเร็วของเปปไทด์เหล่านี้

immun การสร้างภูมิคุ้มกันให้กับโฟสบีการสร้างภูมิคุ้มกันและการบันทึกภาพอัตโนมัติ

สำหรับ immunoprecipitations, lysates ถูกเจือจาง 1: 5 ด้วย RIPA ธรรมดาที่จะนำความเข้มข้นของ SDS ลงไปที่ 0.1% ก่อนที่จะดำเนินการกับ immunoprecipitation (IP) เพื่อ จำกัด การจับที่ไม่เฉพาะเจาะจง lysates ถูกล้างออกครั้งแรกโดย immunoprecipitating ที่ไม่มีภูมิต้านทาน IgG และโปรตีน G-Sepharose (Sigma-Aldrich) เป็นเวลาอย่างน้อย 4 ชั่วโมง ΔFosBได้รับการกระตุ้นภูมิคุ้มกันจาก lysates ที่ล้างด้วยแอนติบอดีจากแพะ polyclonal ที่รับรู้ epitope ภายในที่มีอยู่ในทั้ง FosB และΔFosB (SC-48G; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ที่ 0.5 – 1 μg IgG ต่อ XNGXG (10 – 50 μgของโปรตีนทั้งหมด) ในปริมาณรวมของ 300 ml IP ผสมกันอย่างนุ่มนวลที่ 0.5 ° C บนโรเตอร์อย่างน้อย 4 ชั่วโมงจากนั้นเพิ่มโปรตีน G-Sepharose 8 μlและเพิ่ม IP อีกครั้งอย่างน้อยอีก 15 ชั่วโมง IP ถูกอัดเป็นเม็ดโดยการหมุนที่ 4 × g สำหรับ 3 – 5 ขั้นต่ำที่ 4 ° C ล้างสามครั้งด้วย RIPA เย็นธรรมดา 0.5 มล. และสองครั้งด้วย PBS เย็นที่มี 0.1% Tween 20 จากนั้น IPs จะถูกนำกลับมาใช้ใหม่ใน PBS เย็นของ 0.5 ml, ถูกถ่ายโอน, อัดเป็นก้อนในหลอดใหม่และโปรตีนที่ได้รับอิมมูโนโปรตีนจะถูกชะล้างด้วยการเติม 15 – 25 μlของ 2 ×ตัวอย่างบัฟเฟอร์ Laemmli โปรโตคอล IP นี้ทำให้เกิดการตกตะกอนที่เฉพาะเจาะจงและมีประสิทธิภาพของΔFosBเกือบทั้งหมดใน lysate โปรตีนที่ไม่ผ่านการตกตะกอนนั้นอยู่ภายใต้ SDS-PAGE โดยการโหลด IP ทั้งหมดลงในเจลเกณฑ์มาตรฐาน 12.5% Tris-HCl (Bio-Rad, Hercules, CA) แล้วถ่ายโอนไปยัง PVDF หรือ nitrocellulose หลังจากการถ่ายโอนเมมเบรนจะถูกทำให้แห้งและ ³²P- และ ³⁵S-radiolabeled โปรตีนแถบถูกบันทึกโดย autoradiography โดยใช้ Kodak (Rochester, NY) ฟิล์ม autoradiographic เช่นเดียวกับ phosphorimaging ใช้ Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) PhosphorImager ตรวจพบทั้งหมด (unphosphorylated และ phosphorylated) ΔFosBในเซลล์ lysates หรือ homogenates สมองถูกตรวจพบโดย immunoblotting ทั้งโปรตีน immunoprecipitated (ใช้เมมเบรนเดียวกันที่ใช้ในการตรวจสอบ ³²โปรตีน P-label) หรือโปรตีน lysate / homogenate ในปริมาณเท่ากันภายใต้ SDS-PAGE และถ่ายโอนไปยัง PVDF หรือ nitrocellulose เมมเบรนถูกบล็อกโดยการบ่มด้วย 1% (w / v) นมแห้งไขมัน (Bio-Rad) ใน PBS เสริมด้วย 0.1% (v / v) Tween 20 (Sigma) สำหรับ 1 h ที่ 25 ° C จากนั้นเมมเบรนจะถูกตรึงไว้ที่ข้ามคืนที่ 4 ° C พร้อมแอนติบอดีที่ทำจากโพลีโคลนอลแอนติบอดีต่อต้านกระต่าย FosB ของเราที่สร้างขึ้นต่อต้านกรดอะมิโน 1 – 16 ของ FosB / ΔFosB (ใช้ที่ 1: 10,000) หลังจากการบ่มเบื้องต้นเยื่อหุ้มถูกล้างสี่ครั้งสำหรับ 5 นาทีด้วยการปิดกั้นบัฟเฟอร์แล้วบ่มที่ 25 ° C สำหรับ ∼1 ชั่วโมงด้วยการต่อต้านแพะกระต่าย IgG ผันกับพืชชนิดหนึ่ง peroxidase (ใช้ที่ 1: 5000 ในการปิดกั้นบัฟเฟอร์จาก Vector ห้องปฏิบัติการ Burlingame, CA) เมมเบรนจะถูกล้างสามครั้งสำหรับ 10 min ด้วยการปิดกั้นบัฟเฟอร์และหนึ่งครั้งสำหรับ 5 min ด้วย PBS แถบโปรตีน osFosB ทั้งหมดถูกมองเห็นได้บนแผ่นฟิล์ม Kodak MR โดยการเสริมเคมีเคมิลูมิเนสเซนซ์ (เพียร์ซ) และ / หรือโดยการตรวจหาการเรืองแสงโดยใช้น้ำยา ECL-Plus (Amersham Biosciences) และ Storm PhosphorImager

การแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์ของ recombinant ΔFosBจากเซลล์แมลง

ΔFosBได้รับการแสดงออกมากเกินไปในเซลล์แมลง Sf9 ในฐานะที่เป็น N terminus hexa-His-tagged โปรตีน (N-His (6) ΔFosB) โดยใช้ระบบแสดงออก Bac-to-Bac baculovirus (Invitrogen) และทำตามคำแนะนำของผู้ผลิต สังเขปΔFosB cDNA (กาก 2 – 237) นำหน้าด้วยแท็กความสัมพันธ์ N-terminal MGHHHHHHHAG ถูก subcloned ในเวกเตอร์ pFASTBacTM1 ซึ่งถูกใช้เพื่อสร้าง recombinant baculovirus เซลล์ Sf9 ที่ติดเชื้อไวรัส recombinant และ N-His (6) ΔFosBบริสุทธิ์จากเซลล์ lysates โดยขั้นตอนหลายขั้นตอนรวมถึงโครมาโตกราฟฟีสัมพันธ์โดยใช้คอลัมน์นิกเกิล (Qiagen, Valencia, CA), การแลกเปลี่ยนประจุลบโดยใช้คอลัมน์ mono-Q (Amersham) Biosciences) และการแยกขนาดโดยใช้คอลัมน์ gel-filtration (Amersham Biosciences)

ในหลอดทดลอง การศึกษาฟอสฟอรัส

ในหลอดทดลอง ปฏิกิริยาฟอสโฟรีเลชันสำหรับเวลาและการวิเคราะห์ปริมาณสารสัมพันธ์ถูกดำเนินการในปริมาณของ 30 μlที่มีสารตั้งต้น 10 μm (N-His (6) ΔFosBหรือสารตั้งต้นควบคุมที่เป็นบวก), 250 μM ATP และ 1 μCi / μm³²P] ATP บัฟเฟอร์ที่จัดทำโดยผู้ผลิต kinase และหนึ่งใน kinases ต่อไปนี้: CK2 (20 ng / μl; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / μl; Upstate), PKC (1.6 ng / μl; Calbiochem) หรือ p70S6K (2.5 mU / μl; ตอนเหนือ) ปฏิกิริยาของเวลาแน่นอนถูกดำเนินการโดยการเอาส่วน 5 μlออกจากสารละลายที่จุดเวลาที่กำหนดและเพิ่มปริมาณเท่ากับ 4 ×ลดบัฟเฟอร์ตัวอย่าง Laemmli โปรตีน Michaelis-Menten พารามิเตอร์จลน์สำหรับปฏิกิริยา CK2 ถูกกำหนดภายใต้เงื่อนไขเชิงเส้นคงที่ที่ชัดเจน ปฏิกิริยาเหล่านี้ถูกดำเนินการสำหรับ 15 min ในปริมาณ 10 μlที่มี 2 ng / μlเอนไซม์, 250 μm ATP, 1 μCi / μl [γ-³²P] ATP และ N-His (6) concent ความเข้มข้นของ FosB มีตั้งแต่ 2.5 – 30 μm ปฏิกิริยาทั้งหมดถูกดำเนินการที่ 30 ° C ในอ่างน้ำ หลังจาก SDS-PAGE และการย้อมสีของเจลด้วย Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad) เจลแห้งและ ³²การรวมตัวกันของ P-phosphate ได้รับการประเมินโดยการวิเคราะห์ฟอสฟอรัม (ดูด้านล่างปริมาณข้อมูลการคำนวณและสถิติ)

แผนที่สองมิติและการวิเคราะห์กรดฟอสฟอมิโน

การวิเคราะห์ทั้งสองนี้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดย Ploegh และ Dunn (2000). สั้น ๆ ชิ้นส่วนเจลแห้งที่มี ³²P-label ΔFosB (อย่างใดอย่างหนึ่งจาก ในหลอดทดลอง ปฏิกิริยาหรือจาก immunoprecipitates ของเซลล์ที่มีข้อความการเผาผลาญ), ถูกตัดตอน, rehydrated, ล้างและภายใต้การย่อยอาหาร tryptic Supernatant ที่มีผลิตภัณฑ์การย่อยสลายแบบ tryptic นั้นถูกทำให้แห้งโดย lyophilized และ lyophilate จะถูกล้างหลาย ๆ ครั้งและจะถูกแขวนใหม่ใน 10 μlของบัฟเฟอร์อิเล็กโทรโฟเรซิส, pH 1.9 ตัวอย่าง (3 μl) ถูกพบบนแผ่นเซลลูโลส thin-layer chromatography (TLC) (Analtech, Newark, DE) และแยกในมิติหนึ่งโดยอิเล็กโตรโฟรีซิสและอีกมิติหนึ่งโดยการขึ้น TLC แผนที่ฟอสโฟเปปไทด์ที่เกิดขึ้นนั้นถูกมองเห็นได้ด้วยระบบออโตเรดิโอกราฟฟี สำหรับการวิเคราะห์กรดฟอสโฟมิโน 2 μlของ tryptic digests ที่ถูกแขวนลอยใหม่ในอิเล็กโทรโฟเรซิสบัฟเฟอร์จะถูกแยกออกโดย HCl ไฮโดรไลซิสที่ 105 ° C เป็น 25 m ใน HN ภายใต้ N₂ บรรยากาศ. ปฏิกิริยาหยุดลงโดยการเจือจางหกเท่าในน้ำและส่วนผสมถูกทำให้แห้ง ไลโอฟิเลทถูกแขวนลอยใหม่ใน 5 μlของบัฟเฟอร์อิเล็กโทรโฟเรซิส, pH 1.9 และพบบนแผ่น TLC ของเซลลูโลสพร้อมกับมาตรฐาน phospho-Ser, -Thr และ -Tyr อิเล็กโทรโฟเรซิสถูกดำเนินการมากกว่าครึ่งหนึ่งของความยาวของแผ่น TLC โดยใช้อิเล็กโทรโฟเรซิสบัฟเฟอร์, pH 1.9 และจากนั้นแผ่นจะถูกถ่ายโอนไปยังบัฟเฟอร์ pH 3.5 และทำการอิเล็กโตรโฟรีซิสให้เสร็จ มาตรฐานกรดฟอสฟอมิโน่ถูกมองเห็นได้ด้วยการพ่นแผ่น TLC ด้วยสารละลายนินไฮดริน 1% (v / v) ในอะซิโตนและ ³²ตัวอย่างกรดอะมิโนที่มีป้ายกำกับ P ถูกมองเห็นได้โดยระบบอัตโนมัติ

CK2αที่เหนี่ยวนำโดย siRNA

เราใช้วิธีการรบกวน RNA ในการเลือกระดับ CK2 ที่เลือก (ใน Maira และคณะ, 2005) เซลล์ PC12 ถูกฝังลงบนแผ่นหกคอลลาเจน I-coated เพื่อไปให้ถึง ∼70 – 80% ที่มาบรรจบกันในวันถัดไปเมื่อพวกมันถูก transfected ชั่วคราวด้วย 20 nm (ความเข้มข้นสุดท้าย) ของ siRNA หรือ siRNA ที่พุ่งไปทาง mRNA ของ catalytic หน่วยย่อยαของหนู CK2 โดยใช้ 5 μlของ SilentFectin (Bio-Rad) เอเจนต์การถ่ายสารตัวแทนและทำตามคำแนะนำของผู้ผลิต ประมาณ 24 ชั่วโมงต่อมาเซลล์ได้รับการถ่าย transiently ด้วยΔFosBพลาสมิดตามที่ระบุไว้ข้างต้น ประมาณ 24 ชั่วโมงต่อมา (∼48 ชั่วโมงหลังจากการถ่ายยีน siRNA) เซลล์จะต้องอยู่ภายใต้ ³²P การติดฉลากแบบเมตาบอลิซึมหรือการวิเคราะห์ชีพจร - การไล่ล่าตามที่อธิบายไว้ข้างต้น สี่CK2α siRNAs ต่อไปนี้ถูกนำมาใช้กับผลลัพธ์ที่คล้ายกัน: 5′P-CAAACUAUAAUCUUUUCUUUUUCUUAUUUUUCUUCUUCUUCUUCUUUUUCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUAUUUUAUUUUCAUUUUUUCUUUUUUCUUUAUUUUCUUUAUUUCAUUUUCAUUUUCAUUUUCAUUUUCAUUUUCAUUUUCUAUUCAUUUUCAUUCUAUUCAUUCUUUCUAUCOUUCUUUCUAUUCAUUCUUCUAUUCUUCAU-UUCAUUCAUUUUCAUUCAUUCUUAUUCAUUCAUUCAUUCAUA เป็นการควบคุมเชิงลบเราใช้ เครื่องระงับเสียง การควบคุมเชิงลบ #3 siRNA จาก Ambion (Austin, TX) ขอบเขตของการลดลงของ CK2 ได้รับการตรวจสอบโดย immunoblotting โดยใช้แอนติบอดี anti-CK2 polyclonal (แค็ตตาล็อก # 06-873 จากตอนเหนือ) ค้างคืนที่การเจือจาง 1: 1000 Tub-Tubulin ใช้เป็นตัวควบคุมการโหลดและตรวจพบด้วยโมโนโคลนอลแอนติบอดี (แค็ตตาล็อก # 05-661 จากทางตอนเหนือของรัฐ) ค้างคืนที่การเจือจาง 1: 20,000

การกลายพันธุ์ที่ทำให้เกิดไซต์โดยตรง

การกลายพันธุ์ของ Ser27 เป็น Ala หรือ Asp ทำได้โดยใช้ชุดการกลายพันธุ์ที่มีการควบคุมไซต์ที่เปลี่ยนแปลงอย่างรวดเร็ว (Stratagene, La Jolla, CA) และทำตามคำแนะนำของผู้ผลิต เพื่อแนะนำการกลายพันธุ์ของ Ser27 ในโปรตีนΔFosBของเมาส์จึงใช้ไพรเมอร์ซิสชั่นต่อไปนี้ Ser27 ถึง Ala: (reverse primer) 5′GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 ' Ser27 ถึง Asp (ไพรเมอร์ไปข้างหน้า) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 ' ฐานกลายพันธุ์เป็นตัวหนาและ codon Ser27 นั้นเป็นตัวเอียง

ชีวสารสนเทศศาสตร์

ไซต์ฟอสโฟรีเลชันที่มีศักยภาพและไคเนสสำหรับΔFosBถูกค้นหาโดยส่งลำดับโปรตีนของเมาส์ไปยังฐานข้อมูลเฉพาะรวมถึง ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost et al., 2004) และ NetPhosK (Blom et al., 2004).

ปริมาณข้อมูลการคำนวณและสถิติ

ปริมาณของโปรตีนที่มีอยู่ในเยื่อหุ้มเซลล์ PVDF หรือไนโตรเซลลูโลสจะถูกวัดปริมาณโดยใช้ Storm PhosphorImager และซอฟต์แวร์ ImageQuant ที่มาพร้อมกัน (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics) ในการศึกษาเซลล์เพาะเลี้ยงและการตัดฟอสฟอรัสในเซลล์สมองค่าที่ได้จากการ ³²โปรตีน P-label จะถูกหารด้วยค่าที่ได้รับทั้งหมดΔFosBและแสดงเป็นอัตราส่วน ใน ในหลอดทดลอง การศึกษา phosphorylation จำนวน ³²คำนวณ P-label osFosB ต่อโมลของΔFosB (ปริมาณสารสัมพันธ์) คำนวณตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Sahin และคณะ, 2004) การวัดทั้งหมดถูกถ่ายในช่วงความเป็นเส้นตรงของเครื่องมือที่ใช้ คำนวณค่าพารามิเตอร์จลน์โดยใช้แบบจำลอง Michaelis-Menten V = V_{แม็กซ์}[S] / ([S]+K_M) and V_{แม็กซ์} = k₂[E_รวม] ครึ่งชีวิต (t_1/2) ของΔFosBและ FosB ถูกประเมินจากพล็อตการไล่ล่าแบบพัลส์ (ใช้การถดถอยแบบไม่เชิงเส้นที่เหมาะกับจุดข้อมูล) และสอดคล้องกับเวลาที่ปริมาณโปรตีนที่เหลืออยู่เท่ากับ 50% ของต้นฉบับ ในตัวเลขทั้งหมดผลลัพธ์ที่แสดงเป็นตัวแทนของการทดลองอิสระอย่างน้อยสองถึงสามครั้ง ในกราฟทั้งหมดข้อมูลที่แสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SEM (3 ≤ n ≤16) นัยสำคัญทางสถิติของความแตกต่างถูกประเมินโดยใช้คู่ t ทดสอบถูกต้องสำหรับการเปรียบเทียบหลายรายการและเครื่องหมายดอกจันระบุ p ≤ 0.05

ส่วนก่อนหน้า ส่วนถัดไป

ผลสอบ

ΔFosBเป็นปัจจัยการถอดความที่ผิดปกติ

แม้ว่าเราได้คาดการณ์ก่อนหน้านี้ว่าΔFosBเป็นปัจจัยการถอดรหัสที่ค่อนข้างมีเสถียรภาพ (Nestler et al., 2001) การวิเคราะห์โดยตรงของรายละเอียดการหมุนเวียนของโปรตีนยังไม่ได้รับการดำเนินการวันที่ เพื่อตอบคำถามนี้เราทำการทดลองแบบพัลส์ - เชสโดยใช้เซลล์ PC12 ซึ่งถูกใช้อย่างกว้างขวางในรูปแบบเซลล์ประสาทคล้ายเซลล์ประสาทซึ่งΔFosBถูกแสดงออกชั่วคราวผ่านการติดเชื้อไวรัสเริมแบบไวรัส recombinant (HSV-ΔFosB) โปรตีนที่ถูกสังเคราะห์ใหม่นั้นถูกเผาผลาญด้วย ³⁵S-Met / Cys และรูปแบบการย่อยสลายของ ³⁵S- ป้ายกำกับΔFosB (³⁵S-ΔFosB) ถูกตรวจสอบโดย immunoprecipitating จากเซลล์ lysates ที่ได้รับ ณ เวลาต่าง ๆ หลังจากกำจัดกรดอะมิโน radiolabeled การวิเคราะห์ immunoprecipitates โดย SDS-PAGE และ autoradiography เปิดเผยว่าครึ่งชีวิตของΔFosBในเซลล์ PC12 คือ ∼10 h (มะเดื่อ. 1) การค้นพบเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าครึ่งชีวิตของΔFosBสูงกว่าปัจจัยการถอดความส่วนใหญ่ (ดูการสนทนา) รวมถึง FosB แบบเต็มความยาวซึ่งครึ่งชีวิตในการเพาะเลี้ยงเซลล์มีรายงานว่า ∼90 นาที (Dobrazanski และคณะ, 1991; Carle และคณะ 2004) นอกจากนี้ยังเป็นที่น่าสังเกตว่าการสลายตัวของΔFosBนั้นไม่เหมาะกับการสลายตัวของการสลายตัวแบบเอกซ์โปเนนเชียลระดับแรก แต่ค่อนข้างจะเป็น biphasic เริ่มต้นด้วยอัตราการย่อยสลายที่ช้าลง นี่แสดงให้เห็นการมีอยู่ของ speciesFosB มากกว่าหนึ่งชนิดและ / หรือมากกว่าหนึ่งเส้นทางการย่อยสลาย

ดูรุ่นใหญ่กว่า:

ดาวน์โหลดเป็น PowerPoint Slide

รูป 1

ΔFosBเป็นปัจจัยการถอดความที่ผิดปกติ ครึ่งชีวิตของΔFosBคือ ∼10 h ในการเพาะเลี้ยงเซลล์ ΔFosBแสดงออกในเซลล์ PC12 โดยการติดเชื้อ HSV-ΔFosBหรือ transfection ชั่วคราวด้วยพลาสมิดที่มีΔFosBและเซลล์ต้องถูกทดลองชีพจร - ไล่ตามที่อธิบายไว้ในวัสดุและวิธีการ ได้ผลลัพธ์ที่เท่าเทียมกันโดยไม่คำนึงถึงวิธีที่ใช้ในการแสดงผลเกินจริงΔFosB ภาพแสดงเวลาที่แน่นอน (และตัวแทนภาพอัตโนมัติ) ของการย่อยสลายΔFosB ข้อมูลที่ถูกพล็อตเป็นค่าเฉลี่ย± SEM ของจุดข้อมูลแต่ละจุดอย่างน้อย 15 ที่ได้จากการทดลองอย่างน้อยห้าครั้ง สำหรับการเปรียบเทียบรายงานครึ่งชีวิตของ FosB ที่มีความยาวเต็ม

ΔFosBเป็นฟอสโฟโปรตีนในสมอง

เราได้ตั้งสมมติฐานว่าการปรับเปลี่ยน trFosB หลังการแปลอาจช่วยให้เกิดความเสถียรที่ชัดเจน เพราะฟอสโฟรีเลชั่นแสดงให้เห็นถึงการปรับกิจกรรมของปัจจัยการถอดความในหลาย ๆ ด้านรวมถึงความเสถียร (สำหรับการตรวจสอบดู Desterro et al., 2000; Whitmarsh และ Davis, 2000) เราตรวจสอบว่าΔFosBเป็นฟอสโคโปรตีนหรือไม่ ด้วยเหตุนี้การแสดงออกของΔFosBเกิดขึ้นในสมองของหนูโดยใช้ ECS เรื้อรังซึ่งเป็นที่ทราบกันดีว่าการกระตุ้นΔFosBในระดับสูงโดยเฉพาะในเยื่อหุ้มสมองส่วนหน้า (Hope et al., 1994a) หนึ่งวันหลังจากการรักษา ECS ครั้งสุดท้ายเมื่อระดับ BFosB ยังคงสูงชิ้นส่วนเยื่อหุ้มสมองส่วนหน้าบางถูกเตรียมและติดฉลากเมตาบอลิซึมด้วย ³²P-ออร์โธฟอสเฟต ชุดของชิ้นส่วนแบบขนานนั้นไม่ได้ใช้คลื่นรัศมีและใช้เพื่อตรวจจับระดับ toFosB ทั้งหมด หลังการให้ภูมิคุ้มกันที่จำเพาะกับแอนติบอดีต่อต้าน FosB / ΔFosBที่เฉพาะเจาะจงและการแยกโปรตีนที่กระตุ้นภูมิคุ้มกันโดย SDS-PAGE, phosphorylated ³²P-label ΔFosBถูกตรวจพบโดยระบบอัตโนมัติในขณะที่ΔFosBทั้งหมดถูกตรวจพบโดย immunoblotting การวิเคราะห์นี้แสดงให้เห็นว่าΔFosBเป็นฟอสโฟรีเลชันในสมองตามที่ระบุไว้โดยเฉพาะ ³²วงดนตรีที่มีป้ายกำกับของ ∼35 kDa ปรากฏอยู่ในตัวอย่างสมองที่ได้รับการรักษาแบบเรื้อรัง แต่แทบจะไม่สามารถตรวจจับได้ในการควบคุมที่ได้รับการรักษาที่หลอกลวง (มะเดื่อ. 2A) ซึ่งสอดคล้องกับความจริงที่ว่าหากไม่มีการกระตุ้นเรื้อรังระดับพื้นฐานของΔFosBจะต่ำมาก ความจำเพาะของปฏิกิริยาต่อต้านการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันนั้นแสดงให้เห็นจากการขาดสัญญาณในการตกตะกอนของ IgG ที่ไม่เป็นภูมิคุ้มกัน

ดูรุ่นใหญ่กว่า:

ดาวน์โหลดเป็น PowerPoint Slide

รูป 2

ΔFosBเป็นฟอสโฟโปรตีนในสมอง A, ΔFosBเป็นฟอสโฟรีเลชันในสมอง Endogenous ΔFosBเกิดขึ้นในสมองของหนูโดยการรักษาแบบเรื้อรังด้วย ECS ดังที่อธิบายไว้ในวัสดุและวิธีการ เยื่อหุ้มสมองส่วนหน้าถูกเผาผลาญด้วย ³²PH₃PO₄ เป็นเวลาหลายชั่วโมง หลังจากการทำให้เป็นเนื้อเดียวกันของชิ้น, ΔFosBได้รับการกระตุ้นภูมิคุ้มกันและ phosphorylated ΔFosB (³²ตรวจพบ P-ΔFosBโดยระบบอัตโนมัติ (แผงด้านบน) ตรวจพบΔFosBทั้งหมดในภูมิคุ้มกันที่ไม่ได้รับการตอบสนองโดยใช้ immunoblotting (แผงด้านล่าง) ในฐานะที่เป็นตัวควบคุมเชิงลบ immunoprecipitate ของสัตว์ที่ได้รับการรักษาเสแสร้งและ IgG ที่ไม่ใช่ภูมิต้านทานจะแสดง Bไซต์ฟอสโฟรีเลชันของผู้สมัครและไคเนสที่มีคะแนนการทำนายที่สอดคล้องกันสำหรับลำดับโปรตีน mouseFosB ของเมาส์นั้นได้จากการวิเคราะห์ทางชีวภาพ เว็บไซต์ของผู้สมัครที่มีคะแนนการทำนายสูงกว่าจะถูกเน้นในลำดับโปรตีนและแสดงไว้ในตาราง โดเมนที่มีผลผูกพันกับดีเอ็นเอ (พื้นฐาน) และซิป leucine นั้นมีความหนาในลำดับโปรตีน C, D, ΔFosB phosphorylation เพิ่มขึ้นโดย Ser / Thr phosphatase ยับยั้ง OA C, ³²ระดับ P-ΔFosBใน immunoprecipitates จากชิ้นส่วนเยื่อหุ้มสมองด้านหน้าที่มีป้ายกำกับในกรณีที่ไม่มี (Ctr) หรือมี 100 ng / ml OA (กราฟและแผงด้านบน) ตรวจพบโดยอัตโนมัติ แผงด้านล่างแสดง totalFosB ทั้งหมดที่ตรวจพบใน immunoprecipitates จากชิ้นส่วนที่ไม่มีป้ายกำกับโดย immunoblotting D, PC12 เซลล์ติดเชื้อ HSV-ΔFosBหรือ HSV-LacZ (เวกเตอร์) และติดฉลากเมตาบอลิ ³²PH₃PO₄ ในกรณีที่ไม่มี (Ctr) หรือมี 100 ng / ml OA ³²ตรวจพบระดับ P-ΔFosBในระบบภูมิคุ้มกันโดยวิธีถ่ายภาพอัตโนมัติ (กราฟ, แผงควบคุมด้านบน) แผงด้านล่างแสดง totalFosB ทั้งหมดที่ตรวจพบในเซลล์ lysates โดย immunoblotting

ในขั้นตอนแรกสู่การอธิบายว่าไคเนสและไซต์เกี่ยวข้องกับฟอสฟอรัส osFosB เราอยู่ภายใต้ลำดับของกรดอะมิโนกับการวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศจำนวนมาก สิ่งนี้เผยให้เห็นว่าแม้ว่าΔFosBจะไม่มีไซต์ผู้สมัครไทริฟอสโฟรีเลชั่น แต่ก็มีไซต์ฉันทามติ Ser / Thr kinase หลายแห่งรวมถึงไซต์ CaMKII สามแห่งไซต์ CK2 สามแห่งและไซต์ PKC สองแห่งที่มีคะแนนทำนายโฟมะเดื่อ. 2B) ถ้าตามที่คาดการณ์ผ่านทางชีวสารสนเทศศาสตร์ΔFosBเป็นเพียง phosphorylated บน Ser หรือ Thr เหลือดังนั้น phosphorylation ของมันควรจะปรับอย่างมีนัยสำคัญโดยกิจกรรมของ Ser / Thr phosphatases เพื่อทดสอบสมมติฐานนี้เราระบุว่าชิ้นส่วนเยื่อหุ้มสมองส่วนหน้าด้วย ³²P-orthophosphate ในที่ที่มีหรือไม่มี OA, Ser / Thr โปรตีน phosphatase ยับยั้ง ตามที่ปรากฏใน รูป 2C, OA ทำให้มีขนาดใหญ่ขึ้น (∼2.5-fold) ³²P-ΔFosB นอกจากนี้ยังก่อให้เกิดการเพิ่มขึ้นเล็กน้อยในระดับΔFosBซึ่งสอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้ที่เชื่อมโยงผลการก่อมะเร็งของ OA กับความสามารถในการชักนำให้เกิดยีนในระยะแรก ๆ รวมถึงโปรตีน Fos (Miller et al., 1998; Choe และคณะ, 2004) ผลลัพธ์สุทธิเป็นการเพิ่มขึ้นโดยรวมอย่างมีนัยสำคัญ (∼60%) ในระดับฟอสฟอรัส phosphFosB

จากนั้นเราตรวจสอบว่าในเซลล์ PC12 ซึ่งคล้อยตามการจัดการทดลองมากขึ้นหรือไม่ΔFosBแสดงรูปแบบฟอสโฟรีเลชั่นเหมือนกับที่พบในสมอง เราแสดงΔFosBในเซลล์ PC12 ผ่านการติดเชื้อด้วย HSV-ΔFosBและเผาผลาญเซลล์ที่ติดฉลากด้วย ³²P-orthophosphate เมื่อมีหรือไม่มี OA การแสดงออกที่ประสบความสำเร็จและการกระตุ้นภูมิคุ้มกันของโปรตีนจากเซลล์ที่ติดเชื้อ HSV-ΔFosBจะแสดงโดยการปรากฏตัวของทั้งสองใน immunoblot (มะเดื่อ. 2Dแผงด้านล่าง) และ autoradiograph (แผงด้านบน) ของวง ∼35 kDa หายไปในเซลล์ที่ติดเชื้อเวกเตอร์ ตามที่สังเกตในสมอง OA ทำให้ระดับ totalFosB รวมเพิ่มขึ้นเล็กน้อย แต่เพิ่มขึ้นมาก (ประมาณสองเท่า) ใน ³²P-ΔFosBส่งผลให้เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (∼50%) ใน inFosB phosphorylation นอกจากนี้สอดคล้องกับการคาดการณ์ทางชีวภาพการรักษาเซลล์ PC12 ที่มีสารยับยั้ง Tyr phosphatase ไม่ส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญใน ³²P-ΔFosBระดับ (ไม่แสดงข้อมูล) จากการค้นพบนี้พบว่าΔFosBเป็นฟอสโฟรีเลชั่นใน Ser และ / หรือ Thr ที่ตกค้างในสมองและในเซลล์ PC12 และยืนยันว่าเป็นระบบการเพาะเลี้ยงเซลล์ที่ดี

CK2 แต่ไม่ใช่ PKC หรือ CaMKII phosphorylates ΔFosB ในหลอดทดลอง

ตามที่อธิบายไว้ข้างต้นการวิเคราะห์ลำดับกรดอะมิโนΔFosBเปิดเผยคะแนนการคาดคะเนสูงสำหรับ CK2, PKC และ CaMKII phosphorylation ไซต์ ในการพิจารณาว่าไคเนสชนิดใดที่สามารถฟอสโฟรีเลทได้ΔFosBเราได้ดำเนินการชุดของ ในหลอดทดลอง ปฏิกิริยาฟอสโฟรีเลชันโดยใช้ไคเนสบริสุทธิ์และรีคอมบิแนนท์บริสุทธิ์ΔFosB ตามที่ปรากฏใน รูป 3Aในไคเนสทั้งสามของผู้สมัครมีเพียง CK2 phosphorylated ΔFosBอย่างมีนัยสำคัญ นอกจากนี้ยังมีการทดสอบไคเนสอื่น ๆ อีกหลายตัวอย่าง (เช่น GSK3 และ p70S6K) แต่ไม่สามารถฟอสโฟรีเลทได้อย่างมีนัยสำคัญΔFosB (ไม่แสดงข้อมูล) การจำแนกลักษณะเพิ่มเติมของปฏิกิริยา CK2 โดยการวิเคราะห์เวลาพบว่าไคเนสนี้สามารถกระตุ้นการรวมตัวของ ∼0.5 mol ของฟอสเฟตต่อโมลของ moleFosB (มะเดื่อ. 3B) ความจริงที่ว่า CK2 สามารถ phosphorylate ΔFosB ในหลอดทดลอง สำหรับปริมาณสารสัมพันธ์ปริมาณมาก (∼50%) เป็นปฏิกิริยาชี้นำที่เกี่ยวข้องกับสรีรวิทยา จากนั้นเราศึกษาจลนพลศาสตร์ของปฏิกิริยานี้โดยการบ่ม CK2 ในที่ที่มีปริมาณΔFosBที่บริสุทธิ์เพิ่มขึ้นและเราพิจารณาว่า CK2 phosphorylates XFosB ที่มี V_{แม็กซ์} ของ 5.8 pmol ·นาที^-1 ·μg^-1 ของเอนไซม์ K_M ของ 18.4 μmและ a k_แมว ของ 0.2 / s (มะเดื่อ. 3C) ค่าที่ได้รับสำหรับพารามิเตอร์การเคลื่อนไหวเหล่านี้ยังสนับสนุนความเกี่ยวข้องทางสรีรวิทยาของปฏิกิริยานี้ ตัวอย่างเช่น K_M ของ CK2 สำหรับ DARPP32 ซึ่งเป็นหนึ่งในวัสดุพิมพ์ที่รู้จักกันดีที่สุดคือ 3.4 μmและ k_แมว คือ ∼0.3 / s (Girault et al., 1989); K_M สำหรับช่วง ATP จาก ∼10 – 40 μm (Cochet et al., 1983; Silva-Neto et al., 2002) และสำหรับเคซีนในช่วง ∼10 – 50 μm (Meggio et al., 1977; Pyerin et al., 1987) ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าΔFosBเป็นสารตั้งต้นที่แท้จริงสำหรับ CK2 ในหลอดทดลอง.

ดูรุ่นใหญ่กว่า:

ดาวน์โหลดเป็น PowerPoint Slide

รูป 3

CK2 แต่ไม่ใช่ PKC หรือ CaMKII phosphorylates ΔFosB ในหลอดทดลอง. autoradiograph (แผงด้านบน) แสดงผลิตภัณฑ์ phosphorylated และเจลสี Coomassie (แผงด้านล่าง) แสดง totalFosB ทั้งหมดที่มีอยู่ในปฏิกิริยา Arecombinant บริสุทธิ์ΔFosBถูกยัดเยียด ในหลอดทดลอง ฟอสโฟรีเลชันโดยไคเนสของผู้สมัครหลายคน Bการวิเคราะห์เวลาและการวิเคราะห์ปริมาณสัมพันธ์บ่งชี้ว่า CK2 สามารถ phosphorylate ΔFosB ในหลอดทดลอง ด้วยปริมาณสารสัมพันธ์ของ ∼50% Cการวิเคราะห์จลน์ของปฏิกิริยาของ CK2 เปิดเผยว่าΔFosBนั้นเป็นจริงโดยสุจริต ในหลอดทดลอง สารตั้งต้น การทำให้เป็นเส้นตรงของปฏิกิริยาจะแสดงในพล็อตซึ่งกันและกันแบบคู่ (ด้านล่าง) แต่พารามิเตอร์การเคลื่อนไหวได้มาจากเส้นโค้ง Michaelis-Menten (บนสุด)

CK2 ปรับเปลี่ยนฟอสโฟรีเลชั่นและความเสถียรของΔFosBในเซลล์ที่ไม่เปลี่ยนแปลง

ในการประเมินความเกี่ยวข้องทางสรีรวิทยาของการสังเคราะห์ฟอสโฟรีเลชั่นโดยใช้ CK2 ของΔFosBเราทำการเปรียบเทียบการทำแผนที่ฟอสโฟเปปไทด์โดยใช้ ในหลอดทดลอง phosphorylated และ PC12-cell-phosphorylated ΔFosB หลังจาก SDS-PAGE และเจลชะล้าง ³²P-ΔFosB (จาก ในหลอดทดลอง ปฏิกิริยาหรือจากการกระตุ้นภูมิคุ้มกันของ ³²เซลล์ที่มีป้ายกำกับ P) โปรตีนถูกย่อยด้วยทริปซินและฟอสโฟเปปไทด์ที่ได้จะถูกแยกออกเป็นสองมิติ การวิเคราะห์นี้แสดงให้เห็นว่าฟอสฟอสเปปไทด์หลักจากปฏิกิริยาของ CK2 ที่ถูกรวมเข้ากับฟอสฟอร์เปปไทด์ที่สำคัญหนึ่งในสองจาก fromFosB phosphorylated ในเซลล์ PC12มะเดื่อ. 4A) ในขณะที่ phosphopeptides เป็นผลมาจากปฏิกิริยา PKC หรือ CaMKII (ไม่แสดงข้อมูล) ไม่ได้ทำ มีฟอสโฟเปปไทด์ตัวที่สองที่มีอยู่ในแผนที่จากเซลล์ PC12 แต่เนื่องมาจากความไม่สามารถของไคเนสที่เราได้ทำการทดสอบเพื่อสร้างฟอสโฟเปปไทด์ที่คล้ายกัน ในหลอดทดลองเราไม่ทราบว่าในปัจจุบันฟอสฟอสเปปไทด์ที่สองนี้มีไซต์ฟอสโฟรีเลชั่นซึ่งแตกต่างจากฟอสโฟเปปไทด์อื่นหรือไม่หรือว่ามันหมายถึงเปปไทด์ tryptic ที่แตกต่างกัน

ดูรุ่นใหญ่กว่า:

ดาวน์โหลดเป็น PowerPoint Slide

รูป 4

CK2 ปรับเปลี่ยนฟอสโฟรีเลชั่นและความเสถียรของΔFosBในเซลล์ที่ไม่เปลี่ยนแปลง ACK2 แต่ไม่ใช่ PKC ดูเหมือนว่าจะมีฟอสโฟรีลาทΔFosBในเซลล์ แผนที่ phosphopeptide สองมิติของ eptFosB phosphorylated โดย CK2 หรือ PKC ในหลอดทดลอง หรือโดยเซลล์ PC12 ที่ไม่เสียหาย ลูกศรแสดงถึงการรวมตัวกันของเปปไทด์ CK2-phosphorylated แต่ไม่ได้เป็นหนึ่งใน PKC- ฟอสโฟรีเลชันที่มีหนึ่งในฟอสเฟตเปปไทด์ΔFosBที่ได้จากเซลล์ PC12 B, phosphFosB phosphorylation ในเซลล์ PC12 เพิ่มขึ้นโดยการรักษาเซลล์ด้วย CK2 activator spermine (SP) และลดลงโดยการรักษาด้วย DRX CK2 inhibitor ในทางตรงกันข้ามΔFosB phosphorylation ในเซลล์ PC12 ไม่ได้รับผลกระทบจากการรักษาด้วย PKC activator (PMA) หรือ PKC-specific inhibitor calphostin-C (Calph) ระบบแสดงภาพอัตโนมัติ (แผงด้านบน) และอิมโมบิลล็อต (แผงด้านล่าง) แสดง C-Fผลของกิจกรรม CK2 ที่มีต่อเสถียรภาพΔFosB ตัวเลขแสดงเวลาที่แน่นอน (และตัวแทนภาพอัตโนมัติ) ของการย่อยสลายΔFosB เซลล์ PC12 ที่แสดงออกอย่างชั่วคราวΔFosBถูกทดลองชีพจร - การไล่ล่าที่ดำเนินการในกรณีที่ไม่มีหรือมี CKBNUMX ยับยั้ง DRB (C) สเปิร์ม CK2 activator (D) หรือตัวยับยั้งไคเนสในวงกว้างสเปกตรัม H-8 (E) ซึ่งใช้ในการควบคุมผลกระทบที่ไม่เจาะจงของ DRB Fผลของการทำให้ยูนิตย่อยที่เป็นตัวเร่งปฏิกิริยาของ CK2 มีผลต่อเสถียรภาพΔFosB เซลล์ PC12 ได้รับการเปลี่ยนถ่ายด้วย siRNA (Ctr) หรือ siRNA ที่ไม่กำหนดเป้าหมายหนูหนูCK2αและ 24 ชั่วโมงทำการถ่ายโอนด้วยพลาสมิดΔFosB พาเนลด้านบนแสดงอิมโมบิลโนตของไลซีนทั้งเซลล์แสดงผลของ CK2 siRNA บน CK2 และΔFosBระดับโปรตีน immunoblot ที่สอดคล้องกันสำหรับ tub-tubulin จะแสดงเป็นตัวควบคุมการโหลด

เพื่อแก้ไขเพิ่มเติมความเกี่ยวข้องทางสรีรวิทยาของ CK2 ในฐานะ kFosB kinase เราได้ทำการรักษา cellsFosB-expressing PC12 เซลล์ด้วยยาสองชนิดที่ปรับกิจกรรม CK2 ตามที่ปรากฏใน รูป 4B, phosphFosB phosphorylation ลดลงโดยการรักษาเซลล์ PC12 ด้วย CK2 ยับยั้ง DRX (CKXNUMX ยับยั้งเซลล์)Meggio et al., 1990; Szyszka et al., 1995) และเพิ่มขึ้นจากการรักษาด้วยโพลีเอมีนสเปิร์มเป็นที่รู้กันว่าเป็นยากระตุ้น CK2 ที่มีศักยภาพ (Cochet และ Chambaz, 1983; Meggio et al., 1983) ในทางตรงกันข้ามการรักษาเซลล์ PC12 ด้วยสารยับยั้ง PKC calphostin-C (โคบายาชิและคณะ 1989; Tamaoki และคณะ, 1990) หรือ PMA activator PKC (Schmidt และ Hecker, 1975; Beh et al., 1989) ไม่ส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในΔFosB phosphorylation ในกรณีของ PMA เพิ่มขึ้นเล็กน้อย (และไม่สำคัญ) ³²P-ΔFosBอาจถูกบันทึกโดยการเพิ่มขึ้นของระดับΔFosBทั้งหมดที่เกิดจากยานี้; ในความเป็นจริงมีรายงานว่า phorbol esters กระตุ้นการแสดงออกของโปรตีนในครอบครัว Fos หลายชนิดรวมถึง FosB (Yoza และคณะ, 1992; Suh et al., 2004) นอกจากนี้การรักษาเซลล์ด้วย CaMKII ยับยั้งการซึมผ่านของเซลล์เฉพาะ m-AIP (Ishida และ Fujisawa, 1995; Stevens และคณะ, 1999) ก็ไม่ได้ส่งผลให้ฟอสโฟรีเลชั่นฟอสโฟลดลง (ไม่แสดงข้อมูล) ผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องกับของเรา ในหลอดทดลอง การค้นพบและบ่งชี้ว่าในเซลล์ที่ไม่บุบสลายΔFosBนั้นมีแนวโน้มเป็นฟอสฟอรัสจาก CK2 แต่ไม่ใช่ PKC หรือ CaMKII ความจริงที่ว่าการยับยั้งของ CK2 ไม่ได้ป้องกันอย่างสมบูรณ์ phosphFosB phosphorylation บ่งบอกถึงการมีอยู่ของไซต์ phosphorylation เพิ่มเติมในโปรตีน

ต่อไปเราตรวจสอบว่า CK2 มีบทบาทในการหมุนเวียนของΔFosBและด้วยความเสถียร ด้วยเหตุนี้เราจึงทำการทดลองชีพจร - ไล่ล่าโดยใช้ usingFosB- แสดงเซลล์ PC12 ที่ได้รับการบำบัดด้วยตัวยับยั้ง CK2 หรือตัวกระตุ้น CK2 ที่ใช้ในการศึกษา phosphorylation ตามที่ปรากฏใน รูป 4Cการรักษาเซลล์ด้วยสารยับยั้ง CK2 DRB มีผลอย่างมีนัยสำคัญต่ออัตราการหมุนเวียนของ significantFosB เห็นได้จากการเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเส้นโค้งการสลายตัวจาก biphasic เป็นเส้นโค้งที่ใกล้เคียงกับการสลายตัวแบบเอกซ์โปเนนเชียล ในทางกลับกันการมีอยู่ของอสุจิ CK2 activator ทำให้อัตราการย่อยสลายลดลงอย่างมีนัยสำคัญของ significantFosB ซึ่งนำไปสู่การสะสมของโปรตีนในช่วงชั่วโมงแรกของการไล่ล่า (มะเดื่อ. 4D).

อย่างเช่นกรณีที่มีไคเนสแอคติเวเตอร์และสารยับยั้งหลายตัวสเปิร์มและ DRB สามารถมีผลการเผาผลาญนอกการปรับกิจกรรม CK2 ในความเป็นจริง DRB ได้รับการแสดงเพื่อยับยั้งปัจจัยการถอดรหัส IIH (TFIIH) - kinase ที่เกี่ยวข้อง (Yankulov และคณะ, 1995) ซึ่งส่งผลในการยับยั้งการถอดรหัส RNA polymerase II-mediated เนื่องจากผลกระทบนี้อาจส่งผลกระทบต่อความเสถียรของΔFosBเราจึงวิเคราะห์ผลของสารยับยั้ง kinase สเปกตรัมในวงกว้าง H-8 (Hidaka และ Kobayashi, 1992) บน turnoverFosB ผลประกอบการที่ความเข้มข้น (200 μm) ที่รู้จักกันในการยับยั้ง kinase TFIIH ที่เกี่ยวข้อง แต่ไม่ได้ CK2 (Yankulov และคณะ, 1995) ตามที่ปรากฏใน รูป 4Eการรักษาด้วย H-8 ไม่ส่งผลต่ออัตราการหมุนเวียนของΔFosB ผลลัพธ์ที่คล้ายกันนั้นได้รับจาก H-7 ซึ่งเป็นตัวยับยั้งไคเนสในวงกว้างอีกสเปกตรัมหนึ่งที่ใช้ในความเข้มข้นที่ยับยั้งไคเนสที่เกี่ยวข้องกับ TFIIH แต่ไม่ใช่ CK2 (ไม่ได้แสดงข้อมูล) ข้อมูลเหล่านี้สนับสนุนการตีความว่าการลดลงของเสถียรภาพ stabilityFosB ที่เกิดจาก DRB นั้นน่าจะเกิดจากการยับยั้ง CK2

เพื่อสร้างบทบาทของ CK2 ในการหมุนเวียน turnoverFosB เราตรวจสอบผลที่ตามมาของการลดลงของ CK2 ผ่านทาง siRNA เราทำการทดลองเหล่านี้โดยใช้เซลล์ PC12 ที่ได้รับการถ่ายโอนครั้งแรกด้วยการควบคุม (ไม่กำหนดเป้าหมาย) siRNA หรือ siRNA ที่กำหนดเป้าหมาย mRNA ของหน่วยย่อยตัวเร่งปฏิกิริยาของหนู CK2 (CK2α) และ 24 ชั่วโมงภายหลังถ่ายทำด้วยΔFosB ตามที่ปรากฏใน รูป 4Fถ่ายด้วยCK2α siRNA อย่างมีประสิทธิภาพและลดระดับโปรตีนCK2αโดยไม่ส่งผลกระทบต่อระดับΔFosB (พาเนลด้านบน) การวิเคราะห์ด้วยพัลส์เชสเปิดเผยว่าการล้ม CK2 นั้นส่งผลให้อัตราการหมุนเวียนของΔFosBเพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดซึ่งเป็นหลักฐานจากการย่อยสลายโปรตีนที่เร็วขึ้น ข้อเท็จจริงที่ว่าการยับยั้งกิจกรรม CK2 (ไม่ว่าจะผ่านการรักษาด้วย DRB หรือ siRNA) จะเพิ่มการหมุนเวียนของΔFosBและส่งผลให้การหายตัวไปของส่วนประกอบที่มีอัตราช้าของเส้นโค้ง biphasic ในขณะที่การเปิดใช้งาน CK2 ช่วยเพิ่มระยะช้าของเส้นโค้ง แนวคิดที่ว่า CK2 มีบทบาทในการควบคุมเสถียรภาพΔFosB

CK2 phosphorylates ΔFosBบน Ser27

ในการเริ่มต้นระบุไซต์บนΔFosB phosphorylated โดย CK2 เราได้ทำการวิเคราะห์กรดฟอสโฟ - อะมิโนของ recombinant ΔFosB phosphorylated โดย CK2 ในหลอดทดลอง และของ lFosB phosphorylated ในเซลล์ PC12 การทดลองเหล่านี้เปิดเผยว่าในทั้งสองกรณีพบกรดฟอสโฟ - อะมิโนเพียงอย่างเดียวคือ phospho-Ser (มะเดื่อ. 5A) การค้นพบนี้พร้อมกับปริมาณสารสัมพันธ์ที่ได้รับสำหรับ CK2 ในหลอดทดลอง ปฏิกิริยาฟอสโฟรีเลชั่น (∼50%) (มะเดื่อ. 3B) และการปรากฏตัวของจุดสำคัญเพียงจุดเดียวบนแผนที่ CK2 phosphopeptide (มะเดื่อ. 4A) แสดงให้เห็นว่า CK2 phosphorylation ของΔFosBอาจถูก จำกัด ให้ตกค้างในซีรีนเดียว ข้อสรุปนี้สอดคล้องกับการวิเคราะห์ที่ตั้งฉันทามติของฟอสโฟรีเลชั่น (มะเดื่อ. 2B) ซึ่งทำนายได้เพียงหนึ่งซีรีนของผู้สมัครคือ Ser27 สำหรับ CK2 การวิเคราะห์ทางอนุกรมวิธานเปิดเผยว่า Ser27 ได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างสูงผ่านวิวัฒนาการของสมาชิกในครอบครัว Fosมะเดื่อ. 5B) แนะนำว่ามันอาจมีหน้าที่สำคัญทางสรีรวิทยา

ดูรุ่นใหญ่กว่า:

ดาวน์โหลดเป็น PowerPoint Slide

รูป 5

CK2 Phosphorylates atesFosB บน Ser27 Aการวิเคราะห์กรดฟอสโฟโนฟีโนของ CK2-phosphorylated (ในหลอดทดลอง) และ PC12 เซลล์ - phosphorylated ΔFosBแสดงให้เห็นว่าในทั้งสองกรณี phosphorylated ตกค้างที่สำคัญคือซีรีน Bการวิเคราะห์ข้ามสายพันธุ์ของลำดับกรดอะมิโน FosB / ΔFosBเปิดเผยการอนุรักษ์ Ser27 สูงในหมู่สมาชิกในครอบครัว Fos จากมนุษย์สู่ zebrafish (เน้นสีเข้ม) อย่างไรก็ตามสารตกค้างที่เป็นกรดที่ตำแหน่ง + 3 ซึ่งจำเป็นสำหรับไซต์ฉันทามติ CK2 ไม่ได้รับการอนุรักษ์ (เน้นแสง) Cเซลล์ HeLa ได้รับการถ่ายโอน transiently ด้วย wildFosB (WT) หรือ wild-type ที่มีจุดเปลี่ยนรูปแบบเพื่อทดแทน Ser27 ด้วย Ala (S27A) เซลล์ถูกเผาผลาญด้วย ³²PH₃PO₄ และรักษาด้วยยานพาหนะหรือด้วยสเปิร์ม (SP) เพื่อเปิดใช้งาน CK2 ระบบแสดงภาพอัตโนมัติ (แผงด้านบน) และอิมโมบิลล็อต (แผงด้านล่าง) ของภูมิคุ้มกัน immunFosB ที่ได้รับจะแสดงขึ้น immunoprecipitate ของ mock-transfected cells (vector) แสดงขึ้น

เพื่อตรวจสอบว่า Ser27 นั้นเป็นฟอสโฟรีเลตเลตในΔFosBหรือไม่เราได้ทำการเปลี่ยนรูปสารตกค้างนี้ให้เป็น Ala และวิเคราะห์ผลที่ตามมาของสถานะฟอสโฟรีเลชั่นของโปรตีน ด้วยเหตุนี้เราจึงใช้เซลล์ HeLa (ซึ่งสามารถแปลงร่างด้วยประสิทธิภาพที่สูงขึ้น) เพื่อแสดงออกอย่างรวดเร็ว WT หรือ S27A กลายพันธุ์ΔFosB ประมาณ 24 ชั่วโมงหลังจากการถ่ายเซลล์จะถูกระบุว่ามีการเผาผลาญ ³²P-orthophosphate และ lysates ทั้งเซลล์ถูกเตรียมไว้ การติดตามภูมิคุ้มกันและ SDS-PAGE ³²ตรวจพบ P-ΔFosBโดยระบบอัตโนมัติและΔFosBทั้งหมดโดย immunoblotting ตามที่ปรากฏใน รูป 5C (พาเนลด้านล่าง), ΔFosBไม่ถูกตรวจพบในเซลล์แบบเวกเตอร์ที่ถูกแปลงในขณะที่เซลล์ที่ถ่ายด้วย WT หรือ S27A กลายพันธุ์กลายเป็นΔFosBแสดงโปรตีนได้สำเร็จ เราพบว่าการกลายพันธุ์ S27A ทำให้เกิดการลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (∼30%) ³²ระดับ P-ΔFosB (มะเดื่อ. 5C, พาเนลและกราฟด้านบน) ซึ่งบ่งชี้ว่าในเซลล์ที่มีชีวิตΔFosBนั้นมีฟอสฟอรัสอยู่บน Ser27 ในความพยายามที่จะตรวจสอบว่าในเซลล์ Ser27 นั้นเป็นฟอสโฟรีเลชั่นโดย CK2 หรือไม่เราเปรียบเทียบความสามารถของสเปิร์ม CK2 activator เพื่อปรับเปลี่ยนฟอสโฟรีเลชั่นของ WT และ S27A ΔFosB อย่างที่เราเคยสังเกตในเซลล์ PC12 (มะเดื่อ. 4B) การรักษาเซลล์ HeLa ด้วยสเปิร์มเพิ่ม phosphorylation ของโปรตีน WT อย่างมีนัยสำคัญ ความจริงที่ว่าเอฟเฟกต์นี้ลดลงอย่างมากจากการกลายพันธุ์ของ S27A (มะเดื่อ. 5C) รองรับการตีความที่ Ser27 ในΔFosBเป็นสารตั้งต้นทางสรีรวิทยาสำหรับ CK2

การแยกฟอสเฟตของ Ser27 ควบคุมความเสถียรของΔFosB

การสร้างความมั่นคงของΔFosBจะลดลงเมื่อ CK2 ถูกยับยั้งและปรับปรุงเมื่อเปิดใช้งาน CK2 (มะเดื่อ. 4) และฟอสฟอรัส CK2 นั้นΔFosBบน Ser27 (มะเดื่อ. 5) เราคาดการณ์ว่าการป้องกันไม่ให้ฟอสโฟรีเลชั่นของไซต์นี้น่าจะทำให้โปรตีนเสถียร การทดลองแบบ chase-chase ที่ดำเนินการกับเซลล์ HeLa แสดงการกลายพันธุ์ WT หรือ S27A ชั่วคราว antFosB เปิดเผยว่าการกลายพันธุ์ของ S27A ดังที่คาดการณ์ไว้ส่งผลให้อัตราการย่อยสลายของΔFosBเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญและลดลงด้วยกันในครึ่งชีวิตของโปรตีน (มะเดื่อ. 6A) จากนั้นเราตรวจสอบว่ากลไกการกำกับดูแลนี้เกิดขึ้นในเซลล์ PC12 ที่มีลักษณะคล้ายเซลล์ประสาทมากขึ้นหรือไม่ การทดลองเหล่านี้เปิดเผยว่าตามที่เราเคยสังเกตในเซลล์ HeLa การกลายพันธุ์ของจุด S27A ทำให้การลดลงอย่างมากในครึ่งชีวิตของΔFosBในเซลล์ PC12 (จาก ∼11 ถึง ∼4 h) (มะเดื่อ. 6B) ความจริงที่ว่า destabilization นี้คล้ายกับที่เกิดจากการยับยั้ง CK2 หรือการทำให้ล้มลง (มะเดื่อ. 4) ให้การสนับสนุนเพิ่มเติมสำหรับแนวคิดที่ว่า CK2 ซึ่งเป็นสื่อกลางในการสังเคราะห์ฟอสเฟอร์ของ Ser27 ควบคุมความเสถียรของ regulFosB หลักฐานเพิ่มเติมสำหรับบทบาทด้านกฎระเบียบของ Ser27 phosphorylation ต่อการเปลี่ยนแปลงของโปรตีนΔFosBนั้นใช้ฟอสโฟมินิเมติค Ser27 to Asp กลายพันธุ์ (S27D) การกลายพันธุ์ของ S27D ถือเป็น phosphomimetic เนื่องจากวางกลุ่มขนาดใหญ่ที่มีประจุลบ (carboxyl) ที่กรดอะมิโน 27 และส่วนหนึ่งจึงเลียนแบบ phosphorylation ของ Ser27 ตามที่ปรากฏใน รูป 6Cการกลายพันธุ์ของ S27D ทำให้เกิดผลตรงกันข้ามของการกลายพันธุ์ของ S27A และส่งผลให้โปรตีนมีความเสถียรมากกว่าโปรตีน WT อย่างมีนัยสำคัญ ในทำนองเดียวกันกับผลที่ได้รับหลังจากการเปิดใช้งาน CK2 (มะเดื่อ. 4D) การกลายพันธุ์ของ S27D ส่งผลให้เกิดการสะสมและเพิ่มระดับΔFosBในช่วงชั่วโมงแรกของการไล่ล่า

ดูรุ่นใหญ่กว่า:

ดาวน์โหลดเป็น PowerPoint Slide

รูป 6

การแยกฟอสเฟตของ Ser27 ควบคุมความเสถียรของΔFosB A, Cการวิเคราะห์ Pulse-chase แสดงผลของ Ser27 phosphorylation ต่ออัตราการหมุนเวียนของΔFosB รายละเอียดการสลายตัวและครึ่งชีวิตโดยประมาณของ wildFosB (WT) ประเภทป่า, Ser27 ถึง Ala กลายพันธุ์ (S27A) และ SeromnumX ไปสู่ Asp กลายพันธุ์ (S27D) การค้นพบแบบเดียวกันนั้นได้รับในเซลล์ HeLa (A) และเซลล์ PC12 (B, C).

Ser27 phosphorylation ทำให้เสถียรΔFosBโดยป้องกันการย่อยสลายของโปรตีน

เพื่อเริ่มอธิบายกลไกที่ phosphorylation ของ Ser27 เสถียรΔFosBเราตรวจสอบความสามารถของ proteasome inhibitors MG132 (Palombella และคณะ, 1994; Tsubuki และคณะ, 1996) และ epoxomicin (Hanada และคณะ, 1992; Kim et al., 1999) เพื่อปรับอัตราการย่อยสลายของ WT และ S27A กลายพันธุ์ΔFosB การทดลองแบบ chase-chase ดำเนินการโดยใช้เซลล์ PC12 ที่ติดเชื้อ recombinant HSV ซึ่งแสดง WT หรือ S27A ΔFosBทั้งสองและรับการรักษาด้วย DMSO หรือหนึ่งในสองตัวยับยั้ง proteasome การทดลองเหล่านี้เปิดเผยว่าถึงแม้ว่าอัตราการย่อยสลายของโปรตีน WT นั้นไม่ไวต่อการปรากฏตัวของสารยับยั้ง proteasome สองตัวมะเดื่อ. 7A), การกลายพันธุ์ของ S27A นั้นไวต่อยาเหล่านี้ (มะเดื่อ. 7B) สิ่งนี้บ่งชี้ว่าการกลายพันธุ์ของ S27A นั้นแตกต่างจากโปรตีน WT ซึ่งเป็นเป้าหมายของการย่อยสลายของโปรตีน แท้จริงแล้วการรักษาเซลล์ด้วย MG132 หรือ epoxomicin กลับผลของการกลายพันธุ์ของ S27A อย่างเต็มที่ต่ออัตราการย่อยสลายของΔFosBซึ่งพิสูจน์ได้จากการเพิ่มขึ้นของครึ่งชีวิตของ S27A กลายเป็น ∼4 h สำหรับ MG9 h สำหรับ MG132 h สำหรับ MG12 h สำหรับ MGXNUMX h XNUMX ชม. สำหรับ epoxomicin (มะเดื่อ. 7B) การค้นพบเหล่านี้บ่งชี้ว่าฟอสโฟรีเลชั่นของΔFosBบน Ser27 ปกป้องโปรตีนจากการย่อยสลายของโปรตีนและดังนั้นจึงเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับความเสถียรที่ผิดปกติ

ดูรุ่นใหญ่กว่า:

ดาวน์โหลดเป็น PowerPoint Slide

รูป 7

การแยกฟอสเฟตของ Ser27 ทำให้เสถียร izesFosB โดยป้องกันการย่อยสลายของโปรตีน A, B, การวิเคราะห์ Pulse-chase พร้อมเซลล์ PC12 ที่ติดเชื้อ HSV แสดงโปรไฟล์การย่อยสลายและครึ่งชีวิตโดยประมาณของ wildFosB (A) หรือ S27A ΔFosB (B) ในกรณีที่ไม่มีหรือมีสารยับยั้ง proteasome สองตัว [MG132 และ epoxomicin (Epoxo)] โปรดทราบความจริงที่ว่ายาเสพติดไม่ได้มีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อการหมุนเวียนของป่าชนิด osFosB ในขณะที่การรักษาเซลล์ด้วยโปรตีนยับยั้งอย่างใดอย่างหนึ่งส่งผลให้เสถียรภาพของ S27A ΔFosB Cแบบจำลองสำหรับบทบาทของ Ser27 phosphorylation ในความสามารถของΔFosBเพื่อเป็นสื่อกลางสำหรับสมองพลาสติกในระยะยาว เมื่อเหนี่ยวนำให้เกิดส่วนหนึ่งของΔFosBจะถูกทำให้เสถียรในสมองโดยการสังเคราะห์ฟอสโฟรีเลชั่นที่เป็นสื่อกลางของ CK2 ของ S27 สิ่งนี้ส่งผลให้เกิดการสะสมซึ่งจะส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงที่ยาวนานในการแสดงออกของยีน การเปลี่ยนแปลงที่มั่นคงในการแสดงออกของยีนส่งผลให้เกิดการปรับพฤติกรรมที่มั่นคง ตรงกันข้าม dephosphorylation ของ S27 โดย Ser / Thr phosphatases PP1 และ / หรือ PP2A ส่งผลให้เกิดการตกตะกอนของโปรตีนและการประมวลผลของมันด้วยเครื่องจักร proteasomal

ส่วนก่อนหน้า ส่วนถัดไป

การสนทนา

ในการศึกษาปัจจุบันเราแสดงให้เห็นว่าΔFosBมีครึ่งชีวิตของ ∼10 h ในการเพาะเลี้ยงเซลล์ซึ่งทำให้มีความเสถียรเมื่อเทียบกับ FosB ที่มีความยาวเต็มและปัจจัยการถอดความอื่น ๆ ที่เหนี่ยวนำได้ซึ่งครึ่งชีวิตในการเพาะเลี้ยงเซลล์นั้นสั้น ไม่กี่นาทีและเกิน 3 ชั่วโมง (Hann และ Eisenman, 1984; Dobrazanski และคณะ, 1991; Roberts และ Whitelaw, 1999; เฟอร์ราราและคณะ, 2003; Hirata และคณะ, 2004) นอกจากนี้เราพบว่าΔFosBเป็นฟอสโฟรีเลชันในสมองและฟอสโฟรีเลชั่นนั้นมีความอ่อนไหวต่อ PP1 / PP2A ซึ่งเป็นกรด okadaic การศึกษาการเพาะเลี้ยงเซลล์ของเราแสดงให้เห็นว่าความเสถียรของΔFosBนั้นถูกปรับโดย CK2 โดยที่กิจกรรม CK2 ที่สูงขึ้นจะทำให้โปรตีนมีเสถียรภาพ ในที่สุดการค้นพบของเราชี้ให้เห็นว่า CK2 phosphorylates ΔFosBในการอนุรักษ์ N terminus serine (S27) และแสดงให้เห็นว่า phosphorylation ของ S27 ปกป้อง proteFosB จากการย่อยสลายของโปรตีน ดังนั้นเราจึงเสนอแบบจำลองโดยฟอสโฟรีเลชั่นของΔFosBบน S27 โดย CK2 เป็นกลไกการกำกับดูแลที่สำคัญของการหมุนเวียนของΔFosB (มะเดื่อ. 7C) การรักษาเสถียรภาพของ phosphorylation-mediated ดังกล่าวของ ofFosB นั้นสำคัญต่อการทำงานเนื่องจากระดับที่เพิ่มขึ้นของΔFosBในบริเวณสมองโดยเฉพาะได้รับการแสดงเพื่อควบคุมยีนของเซลล์ประสาทจำนวนมากโดยตรง ในร่างกาย และออกแรงพฤติกรรมที่มีศักยภาพในรูปแบบสัตว์ที่มีความผิดปกติ neuropsychiatric หลาย (ดูบทนำ)

แม้ว่า phosphorylation เป็นวิธีที่รวดเร็วและย้อนกลับของการควบคุมกิจกรรมการถอดความของปัจจัยการถอดความบางอย่างเช่น CREB (องค์ประกอบการตอบสนองของค่ายโปรตีนที่มีผลผูกพัน) (Bohmann, 1990), การปรับลดการเสื่อมสภาพของปัจจัยการถอดรหัสให้รูปแบบของการควบคุมที่มีประสิทธิภาพยิ่งขึ้นDesterro et al., 2000) ปัจจัยการถอดความที่กิจกรรมการทำงานถูกควบคุมในระดับการย่อยสลายของพวกเขารวมถึงNFκB (Desterro et al., 2000), c-Myc (เซียร์และอัล 1999) และ c-Fos (เฟอร์ราราและคณะ, 2003), ท่ามกลางคนอื่น ๆ. ในหลาย ๆ กรณีฟอสโฟรีเลชั่นเป็นตัวควบคุมหลักของความเสถียรของปัจจัยการถอดรหัสตามที่แสดงสำหรับ c-Fos (Okazaki และ Sagata, 1995; Tsurumi และคณะ 1995), แอนติเจนที่เกี่ยวข้องกับ Fos-1 (Fra-1) (Vial และ Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe และคณะ, 2001), c-Jun (Fuchs et al., 1996), JunB (Fuchs et al., 1997), ATF2 (Fuchs et al., 2000) และ p53 (Buschmann และคณะ, 2001) การศึกษาของเราจึงเพิ่มΔFosBลงในรายการปัจจัยการถอดความซึ่งกิจกรรมการทำงานนั้นได้รับการควบคุมผ่านความมั่นคงขึ้นอยู่กับฟอสโฟ

CK2 เป็น Ser / Thr kinase ที่แพร่หลายและเป็นส่วนประกอบที่มีการระบุพื้นผิวที่อ้างว่ามีมากกว่า 300 ชนิดและเกี่ยวข้องกับกระบวนการทางชีววิทยาหลายอย่างรวมถึงการตายของเซลล์และการอยู่รอด (Litchfield, 2003; Unger et al., 2004) การตอบสนองความเครียดของเซลล์ (Yanagawa และคณะ, 1997; Kato และคณะ, 2003) และการซ่อมแซม DNA และการเปลี่ยนแปลง chromatin (Barz และคณะ, 2003; Krohn และคณะ, 2003) มากกว่าหนึ่งในสามของพื้นผิวสมมุติของ CK2 เป็นโปรตีนที่เกี่ยวข้องในการควบคุมการแสดงออกของยีน (Meggio และ Pinna, 2003) ในความเป็นจริง CK2 ได้รับการแสดงให้เห็นว่าเป็นไคเนสนิวเคลียร์ที่โดดเด่น (Krek et al., 1992) (สำหรับการตรวจสอบดู Yu และคณะ, 2001) และเพื่อโต้ตอบกับโดเมน bZIP ของหลายปัจจัยการถอดความ (Yamaguchi และคณะ, 1998) CK2-mediated phosphorylation ยังได้รับการแสดงเพื่อปรับการย่อยสลาย (เช่นการเพิ่มหรือลดลง) ของโปรตีนหลายชนิดรวมถึง IkB (Schwarz et al., 1996), PTEN (Torres และ Pulido, 2001), เลนส์ connexin (Yin et al., 2000) โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับโครมาติน HMG1 (Wisniewski et al., 1999) และปัจจัยการถอดความหลายอย่างเช่น HMGB (Stemmer และคณะ, 2002), Myf-5 (ฤดูหนาวและคณะ, 1997) และ c-Myc (Channavajhala และ Seldin, 2002) CK2 อุดมสมบูรณ์ที่สุดในสมอง (อัลคาซ่าร์อัล, 1988; Girault et al., 1990) และกิจกรรมของมันมีส่วนเกี่ยวข้องในหลาย ๆ ด้านของการทำงานของสมองรวมถึงการอยู่รอดของเส้นประสาท (Boehning และคณะ, 2003) ความแตกต่าง (Nuthall et al., 2004) ฟังก์ชั่นช่องไอออน (Jones และ Yakel, 2003; Bildl et al., 2004) และ potentiation ระยะยาวและเส้นประสาทพลาสติก (Diaz-Nido และคณะ, 1992; ลีเบอร์แมนและโมดี้ 1999; Reikhardt et al., 2003).

แม้จะมีหลักฐานที่เพิ่มขึ้นสำหรับบทบาทของ CK2 ในการควบคุมการทำงานของเซลล์ประสาท แต่ไม่ค่อยมีใครรู้เกี่ยวกับสิ่งที่ควบคุมกิจกรรมของมัน CK2 คิดว่ามีความแอคทีฟโดยมีกฎระเบียบว่าด้วยความสามารถในการฟอสโฟรีลาเลตสารตั้งต้นที่อาศัยการเปลี่ยนแปลงของการแปลภายในเซลล์ (เช่น cytosol vs นิวเคลียส)อาเหม็ดและ Tawfic, 1994; Yu และคณะ, 1999) ข้อมูลนี้ทำให้เกิดคำถามที่สำคัญเกี่ยวกับสัญญาณที่จำเป็นในการกระตุ้นΔFosBที่สะสมในสมองหลังจากการกระตุ้นเรื้อรัง (มะเดื่อ. 7C) ข้อกำหนดหนึ่งคือการเปิดใช้งานซ้ำของ fosB ยีนและการเหนี่ยวนำของΔFosB mRNA (เฉินและคณะ, 1995) ข้อมูลของเราระบุว่า CK2 phosphorylation ของΔFosBนั้นมีความสำคัญต่อความมั่นคงของสัญญาณแนะนำว่าสัญญาณที่สองอาจจำเป็นสำหรับผลกระทบระยะยาวของΔFosBต่อการแสดงออกของยีนคือสัญญาณที่กระตุ้นให้ phosphorylation ของโปรตีนโดย CK2 เรื่องนี้อาจเกี่ยวข้องกับการเปิดใช้งานของ CK2 โดยกลไกที่ไม่รู้จักหรือการย้ายไปยังนิวเคลียส อีกวิธีหนึ่ง CK2 phosphorylation ของΔFosBอาจเป็นส่วนประกอบเช่นแปลว่า osFosB โปรตีนในการตอบสนองต่อการกระตุ้นแต่ละส่วนหนึ่งของมันจะได้รับ phosphorylated และเสถียรดังนั้นจึงกระตุ้นด้วยซ้ำมันจะสะสมในระดับสูงในเซลล์ที่ได้รับผลกระทบ

การค้นพบของเราแสดงให้เห็นว่า CK2 และ S27 อาจไม่ใช่ไคเนสเท่านั้นและไซต์ที่รับผิดชอบสำหรับΔFosB phosphorylation เนื่องจากการยับยั้ง CK2 และการกลายพันธุ์ของ S27A นั้นไม่สามารถป้องกันการเกิดฟอสฟอรัสΔFosBได้อย่างสมบูรณ์ ในทำนองเดียวกันความจริงที่ว่าการกลายพันธุ์ของ S27A ส่งผลให้ 30% ลดลงใน phospho-ΔFosBให้เหตุผลว่า S27 เป็นแหล่งของฟอสฟอรัสที่สำคัญในโปรตีน อย่างไรก็ตามเรากำลังตรวจสอบไคเนสสมมุติและไซต์ฟอสโฟรีเลชั่นบน onFosB ในที่สุดมันก็มีความสำคัญเช่นกันในการวิเคราะห์ฟอสโฟรีเลชั่นของ S27 และไซต์ฟอสโฟรีเลชั่นอื่น ๆ ในΔFosBในสมอง ในร่างกาย หลังจากประเภทต่าง ๆ ของการกระตุ้นเรื้อรังตัวอย่างเช่นผ่านการใช้มวลสารหรือแอนติบอดี phosphospecific

ดังที่ได้กล่าวมาแล้ว S27 ในΔFosBได้รับการอนุรักษ์อย่างสูงตลอดการวิวัฒนาการและในบรรดาโปรตีนในตระกูล Fos อื่น ๆ อย่างไรก็ตามไซต์ฉันทามติสำหรับ CK2 ไม่ใช่: ดังที่แสดงใน รูป 5Bเพียง FosB / ΔFosB (และ Zebrafish xenolog) แต่ไม่ใช่ c-Fos หรือ Fra-2 มีสารตกค้างที่เป็นกรดที่ + 3 ซึ่งเป็นปัจจัยสำคัญของ CK2 phosphorylation (Marin และคณะ, 1986; Meggio et al., 1994) ดังนั้นการขาด CK2 phosphorylation บน S27 อาจอธิบายได้ว่าทำไมโปรตีนตระกูล Fos ชนิดอื่นจึงไม่เสถียรเท่ากับΔFosB อย่างไรก็ตามนี่ไม่ได้อธิบายว่าทำไม FosB แบบเต็มความยาวซึ่งมีไซต์ฉันทามติ CK2 เดียวกันกับΔFosBไม่เสถียรเหมือนกัน เราไม่ทราบว่า FosB ที่มีความยาวเต็มรูปแบบจะถูกสังเคราะห์โดย CK2 ในกากที่ได้รับการอนุรักษ์นี้หรือไม่ รายงานเดียวของ FosB (สกินเนอร์และคณะ 1997) และ c-Fos (Okazaki และ Sagata, 1995; เฉินและคณะ, 1996) ฟอสโฟรีเลชั่นอธิบายไซต์ในพื้นที่ C-terminal ของโปรตีนเหล่านี้ซึ่งหายไปในΔFosB ฟอสฟอรัสที่มีศักยภาพของ FosB แบบเต็มความยาวและโปรตีนตระกูล Fos อื่น ๆ โดย CK2 จำเป็นต้องมีการตรวจสอบโดยตรง อย่างไรก็ตามแม้ว่าพวกเขาจะถูกฟอสฟอรีลามิเนตโปรตีนของตระกูล Fos อื่น ๆ นั้นมีสารสำคัญที่ C termini ของพวกมันซึ่งกำหนดเป้าหมายโปรตีนสำหรับการย่อยสลายอย่างรวดเร็ว (Papavassiliou และคณะ, 1992; Jariel-Encontre et al., 1997; Acquaviva et al., 2002) ยกตัวอย่างเช่นมันแสดงให้เห็นว่ามีเศษ ∼21 ตกค้างอยู่ในเทอร์มินัส C ของโปรตีน Fos ตระกูลทั้งหมด แต่ขาดในΔFosBทำหน้าที่เป็นโดเมนสำหรับ c-Fos (Acquaviva et al., 2001) เราพบว่าถึงแม้ว่าลำดับนี้จะทำให้ FosB ที่มีความยาวเต็มตัวในทำนองเดียวกัน (Carle et al., 2004) การขาดงานของโดเมนนี้ในΔFosBไม่ได้อธิบายถึงการรักษาเสถียรภาพทั้งหมด แต่การรวมกันของการไม่มีโดเมนปลายทาง C และการเติมฟอสฟอรัส Ser27 ดูเหมือนว่าจะมีความแตกต่างอย่างมากในเรื่องเสถียรภาพระหว่าง stabilityFosB และ FosB ประมาณห้าเท่า

แม้ว่าการย่อยสลายของโปรตีนในครอบครัว Fos นั้นซับซ้อนและไม่เข้าใจอย่างสมบูรณ์ แต่การย่อยสลายของโปรตีนดูเหมือนจะเป็นเส้นทางสำคัญที่เกี่ยวข้อง (Salvat et al., 1999; Acquaviva et al., 2002; เฟอร์ราราและคณะ, 2003) ข้อมูลที่นำเสนอในที่นี้ซึ่ง proteasomal inhibitors นั้นไม่ได้เปลี่ยนแปลงอัตราการย่อยสลายของΔFosBอย่างมีนัยสำคัญให้เหตุผลว่าซึ่งแตกต่างจากโปรตีนในตระกูล Fos อื่น ๆ ΔFosBวิวัฒนาการ proteasome 26S และสิ่งนี้มีบทบาทสำคัญในการรักษาเสถียรภาพ ดังนั้นเราจึงเสนอโครงการโดยการเพิ่มเสถียรภาพของΔFosBเป็นผลมาจากการรวมกันของสองปัจจัยหลัก: (1) การขาดโดเมน C-terminal ที่ทำให้เสถียรและ (2) phosphorylation ของ S27 โดย CK2

โดยสรุปการศึกษาครั้งนี้ให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับกลไกว่าทำไมΔFosBซึ่งเป็นผลิตภัณฑ์ของยีนตัวแรกในทันที fosBซึ่งแตกต่างจากสมาชิกในครอบครัว Fos คนอื่น ๆ ซึ่งเป็นโปรตีนที่มีอายุยืนยาว แม้ว่าโปรตีนในตระกูล Fos อื่น ๆ นั้นคิดว่าจะเป็นสื่อกลางอย่างรวดเร็ว แต่การมีเพศสัมพันธ์แบบกระตุ้นชั่วคราวมอร์แกนและเคอร์แรน 1995) ความคงตัวสัมพัทธ์ของΔFosBทำให้เกิดความสามารถในการไกล่เกลี่ยการเปลี่ยนแปลงการถอดเสียงที่ยาวนานโดยการกระตุ้นเรื้อรัง สิ่งนี้สนับสนุนมุมมองที่ΔFosBทำหน้าที่เป็นสวิตช์โมเลกุลที่ยั่งยืนในสมองค่อยๆแปลงการตอบสนองเฉียบพลันเป็นการดัดแปลงเรื้อรัง การระบุ Ser27 phosphorylation เป็นกลไกสำคัญสำหรับความมั่นคงของΔFosBเปิดช่องทางใหม่สำหรับการพัฒนาวิธีการควบคุมการทำงานของΔFosBและปรับเปลี่ยนผลกระทบระยะยาวต่อพลาสติกและพฤติกรรม

ส่วนก่อนหน้า ส่วนถัดไป

เชิงอรรถ

รับพฤศจิกายน 21, 2005
การแก้ไขได้รับกุมภาพันธ์ 21, 2006
ยอมรับเมษายน 2, 2006

งานนี้ได้รับการสนับสนุนโดย National Alliance for Research เกี่ยวกับโรคจิตเภทและ Depression Young Investigator Award แก่ PGU, สถาบันยาเสพติดแห่งชาติ (NIDA) แห่งชาติรางวัลบริการงานวิจัยแห่งชาติเพื่อ PGU และทุนจากสถาบันสุขภาพจิตแห่งชาติและ NIDA ถึง EJN เรา ขอบคุณดร. เจมส์บิบบ์ที่ช่วยเขาด้วย ในหลอดทดลอง ฟอสโฟรีเลชั่นตรวจสอบดร. หมิง - หูหานสำหรับความช่วยเหลือในการจัดทำชิ้นส่วนสมองที่ใช้สำหรับการติดฉลากการเผาผลาญอาหารและดร. ราเชลเนวีให้ความช่วยเหลือด้านบรรจุภัณฑ์ของ HSV recombinant
ที่อยู่ปัจจุบันของ G.Rudenko: Life Sciences Institute and Department of Pharmacology, University of Michigan, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216
การติดต่อควรส่งไปยัง Eric J. Nestler, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75390-9070 อีเมล์: [ป้องกันอีเมล]

ส่วนก่อนหน้า

อ้างอิง

Acquaviva C, Brockly F, Ferrara P, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) บัตรประจำตัวของ C-terminal tripeptide motif ที่เกี่ยวข้องในการควบคุมการย่อยสลายของ proteasomal อย่างรวดเร็วของ c-Fos proto-oncoprotein ระหว่างการเปลี่ยนสถานะ G (0) -to-S มะเร็ง 20:7563-7572

นามธรรม

บทนำ

วัสดุและวิธีการ

เส้นเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมและ DNA สร้างขึ้น

การทดลองแบบ Pulse-chase

สัตว์และการรักษาอาการชักด้วยไฟฟ้า

32 การติดฉลาก P เผาผลาญ

สารเคมีและการบำบัดเซลล์

immun การสร้างภูมิคุ้มกันให้กับโฟสบีการสร้างภูมิคุ้มกันและการบันทึกภาพอัตโนมัติ

การแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์ของ recombinant ΔFosBจากเซลล์แมลง

ในหลอดทดลอง การศึกษาฟอสฟอรัส

แผนที่สองมิติและการวิเคราะห์กรดฟอสฟอมิโน

CK2αที่เหนี่ยวนำโดย siRNA

การกลายพันธุ์ที่ทำให้เกิดไซต์โดยตรง

ชีวสารสนเทศศาสตร์

ปริมาณข้อมูลการคำนวณและสถิติ

ผลสอบ

ΔFosBเป็นปัจจัยการถอดความที่ผิดปกติ

ΔFosBเป็นฟอสโฟโปรตีนในสมอง

CK2 แต่ไม่ใช่ PKC หรือ CaMKII phosphorylates ΔFosB ในหลอดทดลอง

CK2 ปรับเปลี่ยนฟอสโฟรีเลชั่นและความเสถียรของΔFosBในเซลล์ที่ไม่เปลี่ยนแปลง

CK2 phosphorylates ΔFosBบน Ser27

การแยกฟอสเฟตของ Ser27 ควบคุมความเสถียรของΔFosB

Ser27 phosphorylation ทำให้เสถียรΔFosBโดยป้องกันการย่อยสลายของโปรตีน

การสนทนา

เชิงอรรถ

อ้างอิง

บทความที่อ้างถึงบทความนี้

ข้อมูลน่าสนใจเพิ่มเติม

³² การติดฉลาก P เผาผลาญ