DeltaFosB побічно регулює активність промотора Cck (2010)

Brain Res. 2010 травня 6; 1329: 10 – 20.

Опубліковано онлайн 2010 березня 11. doi:  10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

Джон Енрайт, III,1 Меган Вальд,1 Медісон Паддок,1 Елізабет Хоффман,1 Рейчел Арей,2 Скотт Едвардс,2 Сад Спенсер,2 Ерік Дж. Нестлер,3 та Колін А. МакКлунг2, *

Інформація про автора ► Інформація про авторські права та ліцензії ►

Остаточна редагована версія цієї статті видавця доступна за адресою Brain Res

Див. Інші статті у PMC cite опублікованої статті.

Перейти до:

абстрактний

Деякі важливі біохімічні, структурні та поведінкові зміни, спричинені хронічним впливом наркотиків, виявляються опосередкованими високостабільним транскрипційним фактором ΔFosB. Попередня робота показала, що гіперекспресія ΔFosB у мишей за 2 тижнів призводить до збільшення експресії численних генів у стриатумі, більшість з яких пізніше знижується після 8 тижнів експресії ΔFosB. Цікаво, що велика кількість цих генів також підвищувалася у мишей, які переекспонували фактор транскрипції CREB. Однак з цього дослідження не було зрозуміло, чи короткочасний ΔFosB регулює ці гени через CREB. Тут ми бачимо, що 2 тижнів ΔFosB гіперекспресія збільшує експресію CREB в стриатуме, ефект, який розсіюється до 8 тижнів. Рання індукція пов'язана з підвищеним зв'язуванням CREB з певними промоторами цільового гена в цій області мозку. Дивно, але один ген, який був підозрюваним націлюванням CREB на основі попередніх звітів, холецистокінін (Cck), не контролювався CREB в стриатуме. Для подальшого вивчення регулювання Cck після перена експресії ΔFosB, ми підтвердили, що короткочасна перена експресія ΔFosB збільшує як Cck промоторной активності і експресії генів. Він також збільшує активність зв'язування на передбачуваному сайті зв'язування CREB (CRE) в Cck промотор. Проте в той час як сайт CRE необхідний для нормальної базальної експресії Cck, для індукції ΔFosB не потрібно Cck. Взяті разом ці результати дозволяють припустити, що в той час як короткочасна індукція ΔFosB збільшує експресію і активність CREB у певних промоторів гена, це не єдиний механізм, за допомогою якого гени підвищуються в цих умовах.

Ключові слова: nucleus accumbens, транскрипція, наркоманія

Перейти до:

ВСТУП

Хронічний вплив наркотичних засобів викликає біохімічні та структурні зміни в декількох областях головного мозку. Ці зміни передбачають зміни в профілях експресії генів в мезолімбічної системі. Ця система складається з дофамінергічних нейронів, які проектуються з вентральної тегментальної області (VTA) в середньому мозку до середніх колючих нейронів у nucleus accumbens (NAc) (вентральний стриатум), а також у ряді інших областей мозку. Зміни в активності двох факторів транскрипції, зв'язуючого білка цАМФ-відповіді (CREB) і ΔFosB (білка сімейства Fos), були запропоновані для опосередкування багатьох біохімічних, структурних і поведінкових змін, що спостерігаються при хронічному впливі наркотичних засобів ( переглянуто Nestler, 2005).

CREB є повсюдно експресованим фактором транскрипції, який є членом сімейства CREB / ATF. Гомодимери CREB зв'язуються з варіантами послідовності CRE (консенсус: TGACGTCA), виявленими в промоторах багатьох генів. Фосфорилювання CREB (переважно у серинової 133, хоча інші сайти були ідентифіковані) можуть бути стимульовані кількома сигнальними каскадами, включаючи ті, що розташовані нижче за дофаміновими рецепторами (Cole et al., 1995). Після фосфорилювання в серині 133, CREB набирає коактиваторний зв'язуючий білок CREB (CBP) або споріднені білки, що призводить до збільшення експресії генів (розглянуто Johannessen et al., 2004). Хронічне вплив на опіати або психостимулюючі наркотичні засоби викликає короткочасне збільшення активності CREB в nucleus accumbens (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), адаптація думала про зменшення корисних властивостей цих препаратів і сприяла негативному емоційному стану відміни ліків (Nestler, 2005).

LВважається, що адаптація до наркотичних засобів, що тривалий час, опосередкована частково ΔFosB, високостабільним сплайс-варіантом FosB (Nestler et al., 1999; McClung et al., 2004; Nestler, 2008). Члени сімейства Fos димеризуются з членами сімейства Jun для утворення комплексу активаторного білка 1 (AP-1). Транскрипційні комплекси AP-1 зв'язуються з варіантами елемента відповіді AP-1 (консенсус: TGACTCA) для регулювання транскрипції (розглянуто Chinenov і Kerppola, 2001). Хоча гострий вплив на наркотичні засоби призводить до короткочасної індукції (ч.) Членів Fos-сім'ї (а також підвищеної активності CREB), повторне опромінення лікарським засобом призводить до накопичення високостабільного ΔFosB (Hope et al., 1994; Perrotti et al., 2008), вираз якої зберігається протягом тижнів.

Бі-трансгенні миші, індукційно сверхэкспрессирующие або ΔFosB, або CREB у дорослому стриатумі, відображають багато біохімічних і поведінкових фенотипів, що спостерігаються у тварин, неодноразово підданих психостимуляторам або іншим наркотикам. AНаліз змін експресії генів у цих трансгенних тварин ідентифікував численні гени, регульовані короткочасною (2 тижнями) надекспресією ΔFosB, зміни, пов'язані з супутнім зниженням винагороди препарату. Зміни в експресії генів і поведінковій реакції з короткочасним ΔFosB були надзвичайно схожі з тими, що спостерігаються у тварин, які перенапрежують CREB протягом 2 або 8 тижнів (McClung і Nestler, 2003). При вражаючому контрасті довготривале надмірне експресія (8 тижнів) ΔFosB знижувало експресію багатьох цих же генів і призводило до збільшення винагороди за ліки (Kelz et al., 1999; McClung і Nestler, 2003).

Одним з генів, виявлених у цих дослідженнях, є холецистокінін (Cck), нейропептид, що продукується в декількох областях головного мозку, включаючи стриатум (Hokfelt et al., 1980). CCK може модулювати допамінергічну передачу (Vaccarino, 1992), беруть участь у винагороді і підкріпленні лікарського засобу (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002), і індукується в стриатуме хронічним кокаїном (Ding і Mocchetti, 1992). Додатково Cck показано, що промотор реагує як на комплекси CREB, так і на AP-1 (Хаун і Діксон, 1990; Deavall та ін., 2000; Хансен, 2001). Оскільки багато генів (у тому числі Cck), які виявили підвищену експресію після того, як були відомі або CREB, і короткочасна експресія ΔFosB або підозрювані гени-мішені CREB (McClung і Nestler, 2003), ми хотіли визначити, чи короткочасна експресія ΔFosB призводить до регуляції цих генів (з акцентом на Cck) через регуляцію CREB або через більш складні механізми генної регуляції.

Перейти до:

РЕЗУЛЬТАТИ

Перена експресію ΔFosB тимчасово збільшує рівні CREB

Ми використовували Вестерн-блот, щоб дослідити, чи є надмірної експресії ΔFosB підвищує рівень білка CREB в смугастому тілі мишей. Для цього дослідження ми використовували бі-трансгенні миші (лінія 11A), які несуть як NSE-TTA трансген, так і трансген TetOp-ΔFosB. За відсутності доксицикліну, ці миші демонструють значне збільшення експресії ΔFosB в позитивних нейронах динорфіну в стриатуме (Kelz et al., 1999). Цей метод надмірної експресії ΔFosB був широко задокументований і дозволяє враховувати специфічну для експресії область, що паралельно індукції ΔFosB, що спостерігається у тварин, які зазнали хронічного кокаїну (Hope et al., 1994; Kelz et al., 1999). Ми виявили, що у мишей 11A, які перенапружують ΔFosB, рівні білка CREB були значно регульовані після 2 тижнів експресії і ці рівні повернулися до базової лінії після 8 тижнів експресії (Малюнок 1A, n = 8). Щоб визначити, чи можна змінити рівні CREB при короткочасному надмірному вираженні ΔFosB в іншій системі, ми тимчасово надмірно виразили ΔFosB у клітинах PC12 і виявили, що рівні CREB значно зросли (p <0.05) порівняно з контролем (Малюнок 1B, n = 4). Ці результати демонструють, що короткочасна експресія ΔFosB збільшує рівні білка CREB.

малюнок 1

малюнок 1

Рівні CREB зростають з надекспресією ΔFosB. Вестерн-блот-аналіз лізатів з (A) миша striata з 11A мишей від dox для 2 або 8 тижнів або (B) Клітини PC12, сверхэкспрессирующие ΔFosB. Дані в A відображаються у відсотках у відсотках порівняно ...

Обидва ΔFosB і CREB зв'язуються з промоторами специфічних генів-мішеней в смугастому тілі після короткочасної перевираження ΔFosB

Ми використовували аналізи ChIP (хроматин-імунопреципітації) тканин стриата, щоб визначити, чи зв'язування ΔFosB або CREB відбувалося в певних промоторах цільового гена, і якщо це зв'язування було збільшено після короткочасної перевираження ΔFosB. Ми проаналізували зв'язування на BDNF та Cck промотори, оскільки обидва гени високорегульовані після короткочасної перевираження ΔFosB, гіперекспресії CREB або хронічного лікування кокаїном (McClung і Nestler, 2003). Ми також аналізували зв'язування на CDK5 промотор, оскільки він є відомою безпосередньою мішенню ΔFosB (Chen et al., 2000; Bibb et al., 2001; Kumar et al., 2005). Нарешті, ми вимірювали зв'язування на продінорфін промотор, оскільки попередні дослідження виявили, що він може бути пов'язаний як ΔFosB, так і CREB за різних умов (Andersson et al., 2001; Zachariou et al., 2006).

ChIP-аналіз виконували на стриатах мишей 11A, які надекспресували ΔFosB протягом 2 тижнів, використовуючи антитіла, які розпізнають CREB або ΔFosB. В нормальних умовах ми виявили, що ΔFosB зв'язується з CDK5 та продінорфін промоторів, в той час як не виявляється зв'язування на BDNF or Cck промоутери (Таблиця 1). Крім того, гіперекспресія ΔFosB збільшила зв'язування ΔFosB у CDK5 промотор, але не на продінорфін промотор. Далі ми виміряли зв'язування CREB на цих промоторах і виявили, що CREB зв'язується з CDK5, BDNF та продінорфін промоторів, але не до Cck промотор, в нормальному стриатумі, і що гіперекспресія ΔFosB протягом 2 тижнів збільшує зв'язування CREB на BDNF та продінорфін промоторів, але не CDK5 промотор. Взяті разом ці результати показують, що ΔFosB і CREB можуть обидва зв'язуватися з певними промоторами гена, такими як продінорфін та CDK5однак, зв'язування CREB є специфічним для інших промоторів, таких як BDNF. Крім того, гіперекспресія ΔFosB призводить до збільшення зв'язування ΔFosB у певних промоторах, як і очікувалося, але також до зв'язування CREB з конкретними промоторами, що узгоджується з ΔFosB-опосередкованою індукцією CREB, що спостерігається в цей момент часу.

Таблиця 1

Таблиця 1

Зв'язування передбачуваних регуляторних білків з різними промоторами у мишей, які надекспресують ΔFosB протягом двох тижнів.

Попередні роботи показали, що зміни в експресії генів, викликані тривалим перевираженням ΔFosB, пов'язані з модифікаціями хроматину, зокрема, ацетилювання гістону H3 у специфічних промоторів генаKumar et al., 2005). Щоб визначити, чи може це пояснювати зміни в експресії генів при короткочасному перена експресії ΔFosB, ми вимірювали зв'язування ацетильованого гистона H3 (модифікація гістонів, пов'язаного з транскрипційно активним хроматином), або метильований гістон H3 (Lys9, модифікація гістонів, пов'язана з транскрипційно неактивний хроматин). Ми виявили, що надекспресія ΔFosB протягом 2 тижнів не привела до змін у зв'язуванні ацетильованого H3 у будь-якому дослідженому генному промоторі (Таблиця 1). Ми виявили значне зниження зв'язування метильованого гистона H3 у продінорфін промотор, але не зв'язування Cck промотор і ніякої зміни в зв'язуванні на CDK5 та BDNF промоторів, що припускає, що це не загальний механізм, за допомогою якого ΔFosB, в короткостроковому періоді, регулює експресію генів. Ми були здивовані і зацікавлені в тому, що ми не виявили відмінностей у наших дослідженнях ЧІП, які могли б пояснити зростання Cck Експресія мРНК у мишей 11A після 2 тижнів експресії ΔFosB і вирішили додатково дослідити цей механізм.

КороткочаснийΔFosB збільшується Cck вираження в декількох системах

Характеристика мікрочіпів бі-трансгенних мишей 11A, які надекспресували ΔFosB в смугастому тілі, виявили, що Cck Рівні експресії збільшуються після 2 тижнів надекспресії, а потім поступово зменшуються з більш тривалим періодом експресії ΔFosB (Малюнок 2A, n = 3). Ми підтвердили цей ефект для Cck з використанням ПЛР в реальному часі на окремій групі тварин за 2 і 8 тижнях і знайдені результати в двох часових точках були аналогічні мікроматричному аналізу (дані не показані).

малюнок 2

малюнок 2

Короткочасна гіперекспресія ΔFosB збільшується Cck експресії генів. (A) Cck Експресія мРНК у стриатуме після перена експресії ΔFosB у мишей 11A для тижнів 1, 2, 4 або 8. Аналіз мікроматриць проводили на стриатичних зразках Cck рівні ...

Для подальшого дослідження здатності ΔFosB регулювати Cck експресії, ми використовували клітини PC12, тимчасово трансфіковані a Cckплазміду репортер-люциферази і плазміду експресії ΔFosB або рівну кількість pCDNA. Обидва дні (n = 5-9) і три (n = 11-13) днів з надчугою експресією ΔFosB призвели до значного збільшення Cckекспресії -люциферази. Крім того, три дні надмірної експресії ΔFosB призвели до значно більшого Cck- індукція люциферази порівняно з двома днями гіперекспресії (Малюнок 2B). Надекспресія ΔFosB не індукувала експресію конструкції люциферази без промотора (дані не показані). В умовах без лікування відбувалося зниження Cckактивність -люциферази очевидна. Ці результати показують, що короткочасна експресія ΔFosB збільшує активність Cck промотор і залишає без відповіді механізм, за допомогою якого тривале ΔFosB гіперекспресія пригнічує Cck вираз.

Надмірна експресія ΔFosB збільшує зв'язування на передбачуваному сайті зв'язування CREB в Cck промотор

Наш аналіз показав, що Cck експресія збільшується після короткочасної експресії ΔFosB, однак, наші дослідження ChIP виявили, що ні CREB, ні ΔFosB не зв'язуються з Cck промотор. Щоб визначити, чи є які-небудь зміни в зв'язуванні білків на Cck промотор після перевираження ΔFosB, ми використовували аналізи зсуву електрофоретичної рухливості (EMSA) з зондом, що містить передбачуваний CRE-подібний сайт, присутній в межах Cck промотор. Використовуючи ядерні екстракти з striata мишей 11A, які нагнітали ΔFosB протягом 2 тижнів, ми виявили збільшення зв'язування з передбачуваним CRE-сайтом в Cck промоутер (Малюнок 3 A, C, n = 4). Цікаво, що миші 11A перенаправляють ΔFosB протягом 8 тижнів, які показують зменшення Cck експресії, також показали збільшення зв'язування на цьому сайті (Фігура 3B, C, n = 4). Як порівняння, ми досліджували зв'язування з консенсусним сайтом CRE у мишей, які перенапружували ΔFosB протягом 2 тижнів, і виявили, що зв'язування CRE у стриатальних екстрактах є надійним, але ніякого збільшення зв'язування після індукції ΔFosB (Малюнок 3F, n = 4). Таким чином, незважаючи на збільшення ΔFosB загального рівня CREB, що спостерігається в цей момент часу, ці результати узгоджуються з нашими дослідженнями ChIP, які виявляють, що підвищене зв'язування CREB на промоторах після перена експресії ΔFosB є специфічним тільки для певних генів і не є глобальним явищем . Щоб визначити, чи пов'язано CREB з Cck промотор в нашому аналізі EMSA, ми виконували тести суперсдвига з антитілом CREB. У згоді з нашими дослідженнями ChIP ми не знайшли жодного зв'язування CREB з a Cck зонд, що містить передбачуваний сайт CRE в аналізах EMSA, в той час як CREB істотно зв'язував і перевершував консенсус-сайт CRE (Малюнок 3D, E, n = 4). ДНК-зв'язуюча активність на Cck промотор також не впливав антитілом на ΔFosB (дані не показані), в умовах, показаних в декількох попередніх дослідженнях для блокування зв'язування ΔFosB з добросовісними сайтами AP-1 (Hope et al., 1994a, 1994b; Chen et al., 1995, Hiroi et al., 1998). Ми також проводили аналізи ChIP на стриатах тварин 11A після 8 тижнів експресії ΔFosB і досі не знаходили зв'язування CREB або ΔFosB на Cck промотор (дані не показані). Таким чином, експресія ΔFosB призводить до збільшення зв'язування білка на Cck промотор після як 2, так і 8 тижнів експресії; однак ідентичність цих факторів залишається невідомою.

малюнок 3

малюнок 3

Білок зв'язування в Cck промотор. (A, B) Аналіз електрофоретичної рухливості з використанням Cck CRE-подібні ділянки з стриатической тканиною у тварин, що перенапружують ΔFosB протягом 2 тижнів (A) або 8 тижнів (B). У (А), конкуренція з надлишковим немаркованим конкурентом ...

Передбачуваний сайт CRE в Cck промотор не відповідає за підвищену промоторную активність

Оскільки ми виявили збільшення зв'язування білка за допомогою фрагмента Cck промотор, який містить передбачуваний сайт CRE, після перевисловлення ΔFosB, ми хотіли визначити, чи є цей сайт необхідним для збільшення Cck експресію після перевираження ΔFosB. Щоб перевірити цю можливість, ми трансфікували клітини PC12 за допомогою a Cckплазміда-люцифераза, що містить його інтактний CRE-подібний сайт або один, що містить мутацію в ділянці, яка скасовує будь-яку взаємодію з CREB. Цікаво, що мутація CRE-подібного сайту зменшила базальну Cck активність промоутера за 32% (Малюнок 4A, n = 9), але не впливає на Cck індукція промотору шляхом надмірної експресії ΔFosB (Малюнок 4B, n = 11-13). Це говорить про те, що, хоча Cck промотор вимагає інтактного CRE-подібного сайту для повної базальної активності, підвищена промоторная активність, індукована ΔFosB сверхэкспрессией, не вимагає CRE-подібної послідовності.

малюнок 4

малюнок 4

Команда Cck- подібно до CRE сайту не потрібно Cck індукція ΔFosB. (A) Cck-Luciferase активність вимірювали 2 днів після трансфекції або нормальним Cck-люциферази або такої, в якій CRE-подібний сайт мутував. * p <0.05 (B) Cck-люциферази ...

cFos пов'язує з Cck промотор

Попередні дослідження показали, що cFos мРНК зростає при короткочасному вираженні ΔFosB, однак після тривалої експресії ΔFosB здатність лікування кокаїном викликати cFos в стриатуме знижується (McClung і Nestler, 2003; Renthal et al., 2008). Тому можливо, що cFos сприяє збільшенню Cck експресія після короткочасної експресії ΔFosB. Ми провели дослідження ChIP з антитілом, специфічним для cFos, і виміряли зв'язування cFos у Cck промотор з і без короткочасної експресії ΔFosB. Хоча ми виявили, що cFos зв'язується з Cck промотор, це зв'язування не суттєво зростало після перевираження ΔFosB (малюнок 5, n = 5). Це говорить про те, що з cFos пов'язує Cck промотором, він може сприяти загальному регулюванню Cck вираження, але воно, ймовірно, не бере участь у регулюванні Cck промотор ΔFosB.

малюнок 5

малюнок 5

cFos пов'язує з Cck промотор. Аналізи імунопреципітації хроматину виконували з певним антитілом для cFos з використанням стриатической тканини від ΔFosB мишей, що перенапружують, або на докс, або після 2 тижнів видалення dox. Аналіз ПЛР у реальному часі ...

Перейти до:

ОБГОВОРЕННЯ

Це дослідження підтверджує і розширює попередні результати, які показують, що ΔFosB регулює експресію генів у смугастому тілі, і ми виявляємо, що він робить це через кілька механізмів після короткочасної експресії. Ми показуємо, що після 2 тижнів надекспресії, ΔFosB зв'язується безпосередньо з промоторами в певних генах, що призводить до змін експресії (тобто CDK5). Крім того, він підвищує рівень білка CREB, ефект, що спостерігається в культивованих клітинах, а також в стриатуме, що призводить до збільшення зв'язування CREB в інших промоторах гена (тобто динорфін та BDNF). У попередньому дослідженні ми виявили, що короткочасна гіперекспресія ΔFosB в стриатуме призводить до багатьох змін експресії генів, які виявляються при надмірній експресії CREB, і призводить до подібних поведінкових реакцій у преференціях кокаїну (McClung і Nestler, 2003). Таким чином, даний висновок, що ΔFosB призводить до індукції CREB, а також зв'язування CREB з певними промоторами гена, допомагає пояснити, чому так багато змін експресії генів були поділені цими двома факторами транскрипції.

Індукція CREB ΔFosB є цікавою, оскільки було показано, що препарати зловживання індукують зміни серинових рівнів 133-фосфорильованих CREB (Mattson et al., 2005) і збільшити CRE-опосередковану транскрипцію (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), не змінюючи загального рівня CREB. Можливо, що зміни рівнів CREB можуть бути тимчасовими і, отже, легко пропускаються в інших дослідженнях. У наших руках ми спостерігали індуковане кокаїном збільшення мРНК CREB в окремих експериментах, однак цей ефект сильно мінливий (неопубліковане спостереження). Оскільки як трансгенні миші 11A, так і клітини PC-12 показують індукцію CREB після короткочасної сверхэкспрессии ΔFosB, це говорить про те, що CREB дійсно індукується ΔFosB (або мішенню ΔFosB), забезпечуючи ще один механізм для пояснення індукованих препаратом змін у гені вираз.

Дивно, але ми виявили, що ні CREB, ні ΔFosB не зв'язуються з Cck промоутер, хоча Cck Експресія чітко підвищується після короткочасної експресії ΔFosB. Cck - рясний нейропептид, виражений як у VTA, так і в NAc (Hokfelt et al., 1980) і, ймовірно, беруть участь у поведінкових реакціях на наркотичні засоби (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002). У клітинній культурі аналізують Cck промоутер був широко охарактеризований і показав, що реагує на членів сімейства CREB і AP-1 (переглянуто Хансен, 2001). Хаун і Діксон (1990) показали, що комплекси AP-1 можуть зв'язуватися з Cck CRE-подібний сайт пробірціпізніше було показано, з використанням клітин нейробластоми SK-N-MC, що мутація CRE-подібної ділянки зменшила реактивність промотору до сверхэкспрессированной cFos / cJun (Рурк та ін., 1999). Дійсно, ми також знаходимо збільшені Cck активність промоутера (малюнок 2) і прив'язка до або навколо елемента, подібного до CRE (малюнок 3) при надекспресії ΔFosB, іншого члена сім'ї AP-1, але ми не знаходимо прямого зв'язування ΔFosB з Cck промотор в природних умовах or пробірцінавіть після її надмірної експресії.

Багато роботи продемонструвала роль КРЕБ у регулюванні Cck активність промотора. The Cck CRE-подібний сайт зберігається у хребетних (Хансен, 2001), і в деяких аналізах клітинної культури обидва комплекси CREB і AP-1 зв'язуються з цим сайтом і необхідні для Cck активність промоутера (Хаун і Діксон, 1990; Deavall та ін., 2000; Хансен, 2001). Додатково відомі кілька активаторів Cck Показано, що експресія (включаючи bFGF, PACAP, пептони та деполяризацію) діє через CREB (Хансен та ін., 1999; Deavall, et al., 2000; Bernard та ін., 2001; Геврей та ін., 2002; Хансен та ін., 2004). Наші CckДані генів-репортер-глюцинази підтримують істотну роль для CRE-подібного сайту в регуляції Cck промоторной активності, оскільки мутація цього сайту зменшує базальну Cck активність промотора і CckЕкспресія -Luciferase, індукована VP16-CREB, конститутивно активна форма CREB, втрачається при мутації цього сайту (неопубліковане спостереження). Таким чином, ми були здивовані тим, що CREB, здається, не зв'язується з Cck промотор в стриатальних екстрактах або на початковій лінії, або при короткочасному перевираженні ΔFosB при підвищенні рівнів CREB. Це стверджує, що рівні CREB сам по собі не є єдиним фактором у визначенні кількості обов'язкових для цього сайту, і це підтримується роботою інших (Cha-Molstad et al., 2004). Оскільки промотори інших, раніше ідентифікували гени-мішені CREB, такі як BDNF та продінорфін, пов'язували CREB, ми впевнені, що CREB не є обов'язковим для Cck промотор в стриатальних ядерних екстрактах. Крім того, індукція Cck-луциферазна активність ΔFosB не була залежною від інтактного CRE-подібного сайту, припускаючи, що ΔFosB не регулює Cck експресія шляхом регулювання прямого зв'язування CREB з Cck промотор.

Наша нездатність виявити CREB, що взаємодіє з Cck промотор підтримується Ренталь та ін. (2009), які використовували ChIP-чіп підхід, щоб подивитися на глобальні зміни у фосфорильованому CREB (pCREB) і ΔFosB зв'язування в striatum після хронічного впливу кокаїну. У цих експериментах ДНК-білкові комплекси иммунопреципитировали антитілами ΔFosB або pCREB, і обложену ДНК після мічення гібридизували з промоторним мікрочіпом. Хоча багато раніше охарактеризовані гени-мішені CREB були ідентифіковані за допомогою такого підходу (наприклад, BDNF, продінорфін), Cck не виявлено. Крім того, було продемонстровано, що зв'язування CREB з консенсусним сайтом CRE значно варіюється між культивованими лініями клітин (Cha-Molstad et al., 2004). Всі попередні дослідження, які виявили взаємодію CREB з Cck промотор проводили в культурі клітин (не мозок, з якого були отримані наші зразки EMSA і ChIP) і використовували аналізи зсуву гелю для дослідження взаємодій білок-ДНК. Хоча EMSA може оцінити потенціал фактору, який зв'язується з послідовністю ДНК, аналізи ChIP забезпечують новий погляд на ці взаємодії в природних умовах. Крім того, значна частина даних демонструє або індукцію Cck промоторная активність або зв'язування CREB з Cck промотор отримували з клітин, які були стимульовані такими факторами, як пептони (Bernard та ін., 2001), деполяризація (Хансен та ін., 2004), або різноманітні активатори внутрішньоклітинних сигнальних каскадів, включаючи цАМФ і ERK (Хансен та ін., 1999). В наших експериментах єдиним "стимулом", який використовувався, була надекспресія ΔFosB, яка є достатньою для індукування Cck вираз. Взяті разом, це свідчить про те, що здатність CREB зв'язуватися з (і потенційно регулювати) Cck промотор сильно залежить від типу клітин і активації окремих сигнальних шляхів. Крім того, Cck CRE-подібний промоторний елемент (принаймні, в неиндуцированних PC12-клітинах і в мишачому стриатуме) не є прямою мішенню або CREB, або ΔFosB. Цікаво, що регулювання Росії FosB Експресія CREB також специфічна для типу клітин і типу стимуляції. Дослідження Андерсона та ін. встановлено, що ін'єкція антисмислових олігонуклеотидів CREB в стриатум миші частково інгібує індукцію FosB після вживання кокаїну (Andersson et al., 2001). Однак вони також виявили, що здатність L-Dopa індукувати FosB на експресію в стриатумі з ураженим 6-OHDA не впливало присутність антисмислових олігонуклеотидів CREB.

Оскільки CREB і ΔFosB, здається, опосередковано регулюють Cck промотор, і зміни в структурі хроматину були задокументовані у відповідь на безліч стимулів, які індукують ΔFosB (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2008), ми обґрунтували, що ΔFosB може опосередковано модулювати активність промотора шляхом зміни структури хроматину. Однак у мишей, які перенапружують ΔFosB протягом 2 тижнів, не спостерігалося зміни ацетилювання гістону H3 на Cck промоутер (Таблиця 1). Це підтримується Chip-чіпом даних Ренталь та ін. (2009), які повідомили про відсутність зміни в ацетильованому зв'язуванні H3 на Cck промотор у мишей, що піддаються хронічному кокаїну. З тих пір Cck промотор активний в смугастому тілі, не очікувалося і не спостерігалося репресивного зв'язування метильованого гистона H3. Цікаво, що ми також не бачили змін через надмірну експресію ΔFosB в ацетильованому зв'язуванні H3 на BDNF промотор (який виявив збільшення зв'язування CREB) або в CDK5 та продінорфін промоторів (які показали збільшення зв'язування ΔFosB). Оскільки існує безліч модифікацій гістонів, пов'язаних зі змінами активності промотора (розглянуто Rando і Chang, 2009), є ймовірні інші модифікації хроматину, які зв'язуються з індукцією цих генів. Будь-яка окрема модифікація хроматину, хоча часто передбачає рівень активності промотора, може не змінюватися під час активації конкретного гена. У подальшій роботі було б цікаво подивитися на інші потенційні зміни у структурі хроматину Cck промотор після перена експресії ΔFosB. Цікаво, що хронічний кокаїн (ймовірно через Показано, що індукція ΔFosB індукує експресію сіртуїну 1 і 2, класу III деацетилази гістонів, які, здається, змінюють фізіологію нейронів, сигналізацію ERK і поведінкові реакції на кокаїн (Renthal et al., 2009). Індукція гистоновой деацетилази мала б можливість одночасно регулювати експресію великої кількості генів через глобальні зміни в структурі хроматину.

Один з можливих кандидатів Cck Регуляція після перена експресії ΔFosB була членом сім'ї AP-1 cFos. Вираз cFos регулюється CREB (Sheng et al., 1990; Impey et al., 2004), а сверхэкспрессия cFos (узгоджена з гіперекспресією його зв'язуючого партнера cJun) збільшується Cck активність промоутера (Рурк та ін., 1999). Таким чином, підвищення рівня CREB внаслідок короткочасного перевираження ΔFosB може збільшити рівні cFos і призвести до підвищення зв'язування з Cck CRE-подібний сайт. cfos мРНК індукується у мишей після двох тижнів перена експресії ΔFosB (McClung і Nestler, 2003) і зменшилася у мишей, які зазнали хронічного кокаїну або довготривалого перевираження ΔFosB (Renthal et al., 2008). Тут ми знаходимо, що cFos зв'язується безпосередньо з Cck Промотор в тканини стриатула, однак, перена експресію ΔFosB не значно збільшує зв'язування. Це говорить про те, що в той час як cFos може бути залученим до регулювання Cck вираження в загальному випадку, зміна зв'язування cFos само по собі не є ймовірним механізмом, за допомогою якого ΔFosB регулює Cck вираз. Проте, можливо, що ΔFosB може викликати або посттрансляційні зміни в cFos (наприклад, змінене фосфорилювання) або індукувати експресію зв'язуючого партнера (такого як cJun) або ко-активаторного білка. Однак, оскільки інтактний CRE-подібний сайт (який раніше було показано, що є сайтом зв'язування для комплексів AP-1, див. Хаун і Діксон, 1990) не потрібно для збільшеного Cck активність промотору, що спостерігається при надмірній експресії ΔFosB (як оцінюється в наших експериментах генів-репортерів), очевидно, що інші транс-діючі фактори також регулюються ΔFosB.

Команда Cck промоторний фрагмент, який використовується в наших експериментах з генів репортера люциферази, містить консервативний сайт зв'язування Sp1 і E-box (розглянуто Hansen, 2002). Зокрема, показано, що послідовності E-box зв'язують численні фактори транскрипції (розглянуті Форрест і Макнамара, 2004). Використовуючи клітини PC12, ми побачили, що мутація E-box зменшується Cck промоторной активності, але не змінює відповідь промотору на ΔFosB (дані не показані). Цікаво, що Cck-рецептор-люцифераза, що містить мутації як в CRE-сайті, так і в Е-коробці, не має виявленої базальної активності і не реагує на гіперекспресію ΔFosB (неопубліковане спостереження). Інший потенційний медіатор дії ΔFosB на Cck промотором є АТФ, деякі форми яких, як відомо, індукуються в стриатуме при хронічному впливі психостимулятора (Green et al., 2008). Однак, ми не знайшли жодних доказів для індукції ΔFosB цих ATF (дані не показані), і ATF не очікували зв'язуватися з мутованим CRE-подібним сайтом на Cck промотор.

Одне застереження від цього дослідження полягає в тому, що ми використовуємо бі-трансгенну систему для надмірної експресії ΔFosB і, таким чином, необхідно бути консервативним у паралелях між цією парадигмою та адмініструванням хронічного кокаїну. Однак, трансгенні миші 11A надають унікальну можливість дивитися на специфічні ефекти ΔFosB в смугастому тілі, оскільки надекспресія обмежена цією областю мозку (Chen et al., 1998), в той час як введення кокаїну викликає зміни в багатьох інших областях головного мозку, які потім опосередковано впливають на стриатум. Крім того, у кількох дослідженнях було зареєстровано подібні поведінкові та молекулярні фенотипи у мишей 11A порівняно з нетрансгенними тваринами, які отримували хронічний кокаїн (Kelz et al., 1999; McClung і Nestler, 2003; Renthal et al., 2009). Крім того, Bibb et al. (2001) повідомляли про аналогічні рівні стриатів Cdk5 Індукція мРНК і білка в цьому ж штамі 11A при порівнянні з кокаїном, нетрансгенними літерами, а також подібні зміни в мішенях CDK5, p35 і DARPP-32.

На закінчення ми виявляємо, що короткочасне вираження ΔFosB призводить до індукції генів у смугастому тілі за допомогою безлічі механізмів. Вони включають безпосереднє зв'язування промотору, індукцію білка CREB і активність, модифікацію хроматину, на додаток до шляхів, які ще потрібно визначити.

Перейти до:

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ ПРОЦЕДУРИ

Звірята

Чоловічі бі-трансгенні тварини 11A (NSE-TА x TetOP-ΔFosB) використовувалися в цьому дослідженні і характеризуються Kelz et al., 1999. Для надмірної експресії ΔFosB мишей видаляли з доксицикліну між 3 і 6 тижнями віку, а контрольних мишей підтримували на доксицикліні. Всі миші були розміщені в групі та підтримувались на 12: 12 цикл світла / темряви, підсвічування в 7 am і вимикання в 7 pm, ad lib доступ до їжі та води. Всі експерименти з мишами відповідали протоколам, схваленим комітетом по догляду та використання тварин у Техаському Південно-західному медичному центрі в Далласі.

Репортер і плазміди експресії

Дикий тип (WT) Cck репортер промотор-люциферази був приготовлений шляхом вставки фрагмента PCR приблизно в 200 bp у вектор pGL3-luc (Promega). Цей фрагмент був отриманий з геномної ДНК миші (праймери: 5 'TATCCTCATTCACTGGGACGC 3' вгору по потоку) і спочатку 5 'TACCTTTGGATGGGGAAATCG 3' і вставлений в вектор pGEM-T Easy (Promega, #A1360). Фрагмент промотору потім клонували в сайти рестрикції Kpn1 / Xho1 pGL3-luc.

Для створення точкової мутації CRE в Cck промотор, мутагенний праймер, спрямований проти раніше повідомленого CRE-подібного сайту (сенсовий праймер: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGTAAACA 3 ', антисмисловий праймер: 5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACACG 3 . Це перетворює CRE-подібний сайт (ACTGCGTCAGC) на ACTGAGCTCC. Всі репортерні плазміди підтверджували секвенуванням ДНК. Експресійна плазміда ΔFosB містить послідовність ΔFosB на всю довжину, вставлену в сайт множинного клонування pCDNA 3.1, і була описана раніше (Улері і Нестлер, 2007).

Культура клітин і ДНК-трансфекції

Клітини феохромоцитоми щурів (PC12) підтримувались у модифікованому Дульбекко середовищі Eagle F-12, доповненому 10% кінської сироватки, 5% фетальної бичачої сироватки та 1% пеніциліну / стрептоміцину при 37 ° C і 5% CO2. Клітини трансфікували шляхом електропорації з використанням електропоратора BTX 360 (350 В, 0 Ом та 850 мкФ) у 800 мкл фосфатно-сольового розчину, забуференного фосфатом Дульбекко, у 4-міліметрових кюветах з 10 мкг репортера та 5 мкг експресійної конструкції. Порожню векторну плазміду (pCDNA) використовували для нормалізації загальної кількості ДНК. Після трансфекції клітини вирощували на посуді з 35-міліметровим покриттям з колагеном протягом зазначеного періоду часу.

Аналізи люциферази

Через два-три дні після трансфекції клітини 3 рази промивали сольовим розчином, забуференним фосфатом Дульбекко, лізували (використовуючи 25 мМ гліцилгліцину, 15 мМ MgSO4, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 mM DTT), збирали і очищали центрифугуванням. 30 мкл лізату об'єднували з буфером для аналізу люциферази 140 мкл (25 мМ гліцилгліцин, 15 мМ MgSO)4, 4 мМ EGTA, 1 мМ DTT, 1 мМ АТФ, 1 мМ фосфат калію, 1 мМ кофермент А, рН 7.8). Активність люмінесценції вимірювали, використовуючи флуоресцентний флуоресцентний зчитувач FLx-800 після автоматизованої ін'єкції люциферину 40 мкл 1 mM на лунку. Активність люциферази нормалізувалася до загального вмісту білка, як визначено за допомогою аналізу білка BioRad.

Аналіз електрофоретичної рухливості

Ядерні екстракти з двосторонніх скибочок стриатума з біс-трансгенних мишей 11A (які зберігаються або виключаються доксицикліном протягом 2 або 8 тижнів) (McClung і Nestler, 2003) були приготовані відповідно до Хуан і Уолтерс (1996). 32Р-мічені дволанцюжкові олігонуклеотидні зонди були приготовані з використанням протоколу системи Promega Gel Shift Assay (#E3300) і зонди були очищені за допомогою колонок Roche Quick Spin. Консенсусні послідовності зондів CRE і AP-1 були отримані від Promega (#E328A і E320B, відповідно) і Cck CRE-послідовності були (Cck-CRE смисл: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTGCA; Cck-CRE антисмисло: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT).

Реакції зв'язування і електрофорез виконували з використанням модифікацій процедури Promega Gel Shift Assay (#E3300). 50,000 СРМ міченого зонда об'єднували з екстрактом стриатальної ядер 10 мкг. ДНК або антитіла холодного конкурента додавали до введення радіоактивно мічених зондів. Для експериментів із супершвидким використанням використовували 2 мкг антитіла CREB (Upstate Biotechnology # 06-083). Реакції електрофорезували на 4% поліакриламідних гелях, висушували і піддавали впливу плівки (використовуючи інтенсифікуючі екрани за 1 годину до 2 днів).

Імуноблотінг

Для клітин PC12 35-міліметрові пластинки трансфікованих клітин промивали крижаним сольовим розчином, забуференним фосфатом Дюльбекко, і лізати готували в крижаному буфері для лізису RIPA (50 мМ Tris pH 7.4, 5 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 1% дезоксихолат, 1 % Triton X-100, 0.1% додецилсульфат натрію), що містить інгібітори протеази. Після обробки ультразвуком, очищення та аналізу протеїну Бредфорда лізати повністю денатурували і 50 мкг кожного зразка піддавали електрофорезі на 10% поліакриламідних гелях SDS. Білки переносили на PVDF-мембрану, блокували на 1 годину в 3% нежирному сухому молоці в сольовому розчині, забуференному Tris, що містить 0.1% Tween-20 (молоко TBS-T), і досліджували протягом ночі при 4 ° C первинними антитілами (CREB- Біотехнологія штату Нью-Йорк # 06-083, застосовується у співвідношенні 1: 1,000; GAPDH-Sigma # G8795, використовується у співвідношенні 1: 80,000 1), розведений у молоці TBS-T. Після багаторазового промивання в TBS-T блоти досліджували протягом години при кімнатній температурі, використовуючи кон'юговані з лужною фосфатазою вторинні антитіла (Sigma), розведені 5,000: 170 у молоці TBS-T. Після багаторазового промивання сольовим розчином, забуференним Тріс, реакцію забарвлення проводили згідно інструкцій BioRad (# 6432-XNUMX). Мембрани сушили протягом ночі, сканували на планшетному сканері та проводили денситометрію за допомогою ImageJ (див. Нижче).

Для стриатальних екстрактів були проведені вестерн-блот-аналізи, опубліковані раніше (Hope et al., 1994). Тканину видаляли з обезголовлених мишей, поміщали на лід і розбивали на матрицю мозку при товщині 1 мм. Тканинні пуансони потім брали і заморожували при -80 ° C до використання. Тканини обробляли ультразвуком на льоду в модифікованому буфері на основі миючого засобу, що містить як інгібітори фосфатази, так і протеази (Roche, Sigma). Після обробки ультразвуком зразки денатурували у киплячій воді і центрифугували на 15,000xg протягом 15 хвилин; потім супернатант збирали і обробляли; Концентрацію білка потім кількісно визначали за допомогою аналізу Bradford (Bio-Rad). Зразки виконували на гелі 10% акриламіду / бісакриламіду, переносили на мембрану PVDF, блокували в молоці 5% і інкубували з первинними антитілами (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY). Блоти згодом візуалізували з використанням системи хемілюмінесценції (Pierce). Всі зразки були нормалізовані до GAPDH (Fitzgerald, Concord, MA). Стандартні криві виконували для забезпечення того, що ми знаходимося в лінійному діапазоні аналізу.

Денситометричний аналіз

Для імуноблотів PC12 аналіз денситометрії проводили з використанням ImageJ з калібруванням rodbard. Середній фоновий сигнал віднімали від кожного вимірювання і для кожного зразка обчислювали відношення сигналу CREB до GAPDH. Для стриатичних імуноблотів і аналізу EMSA було використано Scion Image 1.62c з відніманням фону.

Хроматинова імунопреципітація (ChIP)

Аналізи ChIP проводили згідно з методами Tsankova et al. (2004) та Kumar et al. (2005). Коротко, двосторонні смугасті зразки від мишей 11А, утримуваних на доксицикліні або поза ним, були зшиті 1% формальдегідом, а зшивання погашено гліцином (кінцева концентрація 0.125 М). Ці зразки були взяті з цілих зрізів мозку, відібраних на рівні ядра акубени з видаленою корою. Хроматин подрібнювали до фрагментів приблизно від 0.2 до 1 кб за допомогою ультразвукової обробки, очищали білком G бісером (Thermo Scientific # 22852) та вводили зразки, заморожені при -80 ° C. Для кожного осадження використовували від 60 до 100 мкг хроматину. Було використано 5-10 мкг кожного первинного антитіла (CREB: Біотехнологія штату штат # 06-863, ΔFosB: Біотехнологія Санта-Крус # SC-48x, ацетильований H3: Біотехнологія штатів штату № 06-599, метильований H3 (LYS9): Технологія сигналізації клітин, cFos: Біотехнологія Санта-Крус # SC-7202x). Комплекси антитіло-хроматин імунопреципітували білком G плюс бісер відповідно до інструкцій виробника (Thermo Scientific №22852). Після зворотного зшивання вхідних та обложених зразків кожен зразок піддавали кількісній ПЛР (qPCR). Використання всіх цих антитіл для ChIP було широко перевірено (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2009).

Рівні зв'язування білків на кожному цікавить промоторі гена були визначені шляхом вимірювання кількості пов'язаної ДНК за допомогою qPCR (Applied Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, CA). Вхідну або загальну ДНК (неиммунопреципитированную) і иммунопреципированную ДНК ампліфікували в трьох повторностях у присутності SYBR Green (Applied Biosystems, CA). Ct значення з кожного зразка були отримані з використанням програмного забезпечення Sequence Detector 1.1. Відносна кількісна оцінка матричної ДНК була виконана з використанням методу ΔΔCt (Tsankova et al., 2004). Використані праймери: промотор BDNF 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; AGTCCACGAGAGGGCTCCA CDK5 промотор: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Промотор Cck: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG Промотор продінорфіну: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

Статистичний аналіз

Усі дані представлені як середнє значення ± стандартна похибка середнього значення. Статистичну різницю визначали за двостороннім t-критерієм Стьюдента (р <0.05). Коли проводилося багаторазове порівняння, р-значення коригували за допомогою корекції Бонферроні.

Перейти до:

Подяки

Ми хотіли б подякувати Віру Ренгал і Арвінда Кумару за корисні обговорення. Ми також хотіли б подякувати NIDA за фінансування цих експериментів.

Перейти до:

Виноски

Заява видавця: Це PDF-файл неозброєного рукопису, який був прийнятий до публікації. Як послугу нашим клієнтам ми надаємо цю ранню версію рукопису. Рукопис буде підданий копіюванню, набору тексту та перегляду отриманого доказу до його опублікування в остаточній формі. Зверніть увагу, що під час виробничого процесу можуть бути виявлені помилки, які можуть вплинути на вміст, і всі правові застереження, які стосуються журналу, стосуються.

Умови класифікації:

Секція: #1 Клітинна та молекулярна біологія нервових систем

Перейти до:

посилання

  1. Andersson M, Konradi C, Cenci MA. Елемент-зв'язуючий білок цАМФ необхідний для дофамін-залежної експресії генів у інтактному, але не допамін-денервированном стриатуме. J Neurosci. 2001: 21: 9930 – 43. [PubMed]
  2. Барро М, Олів'є Д.Д., Перротті Л.І., Ділеон Р.Я., Бертон О., Ейш А.Я., Імпеі С., Шторм Д.Р., Неве Р.Л., Інь Ю.К., Захаріо V, Нестлер Е.Я. Активність CREB в оболонці nucleus accumbens контролює формування поведінкових реакцій на емоційні подразники. Proc Natl Acad Sci США A. 2002, 99: 11435 – 40. [PMC безкоштовна стаття] [PubMed]
  3. Бейнфельд М., Конноллі Дж. Лікування кокаїном збільшує позаклітинний холецистокінін (CCK) в оболонці nucleus accumbens неспатих, вільно рухаються щурів, що посилюється у щурів, які поведінково сенсибілізовані до кокаїну. J Neurochem. 2002: 81: 1021 – 7. [PubMed]
  4. Bernard C, Sutter A, Vinson C, Ratineau C, Chayvialle J, Cordier-Bussat M. Peptones стимулюють транскрипцію гена жовчного холецистокініну за допомогою циклічних аденозинмонофосфатних елементів. Ендокринологія. 2001: 142: 721 – 9. [PubMed]
  5. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Сагава ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Ефекти хронічного впливу кокаїну регулюються нейрональним білком Cdk5. Природа. 2001: 410: 376 – 80. [PubMed]
  6. Cha-Molstad H, Keller DM, Yochum GS, Impey S, Goodman RH. Специфічне для клітинного типу зв'язування фактора транскрипції CREB з елементом cAMP-відповіді. Proc Natl Acad Sci США A. 2004, 101: 13572 – 7. [PMC безкоштовна стаття] [PubMed]
  7. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ. Регулювання дельта-FosB і FosB-подібних білків шляхом електросудомного вилучення і лікування кокаїном. Mol Pharmacol. 1995: 48: 880 – 9. [PubMed]
  8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Трансгенні тварини з індукованою, цільовою експресією гена в мозку. Mol Pharmacol. 1998: 54: 495 – 503. [PubMed]
  9. Chen J, Zhang Y, Kelz MB, Steffen C, Ang ES, Zeng L, Nestler EJ. Індукція циклін-залежної кінази 5 в гіпокампі хронічними електроконвульсивними нападами: роль ΔFosB. J Neurosci. 2000: 20: 8965 – 71. [PubMed]
  10. Chinenov Y, Kerppola TK. Близькі зустрічі багатьох видів: взаємодії Fos-Jun, які опосередковують специфіку регуляції транскрипції. Онкоген. 2001: 20: 2438 – 52. [PubMed]
  11. Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman SE. Нейрональна адаптація до амфетаміну та дофаміну: молекулярні механізми регулювання генів продінорфіну в стриатуме щура. Нейрон. 1995: 14: 813 – 23. [PubMed]
  12. Deavall DG, Raychowdhury R, ​​Dockray GJ, Dimaline R. Контроль транскрипції гена CCK PACAP в клітинах STC-1. J J Physiol Gastrointest Фізіологія печінки. 2000: 279: G605 – 12. [PubMed]
  13. Ding XZ, Mocchetti I. Допамінергічна регуляція вмісту мРНК холецистокініну в стриатуме щура. Brain Res Mol Brain Res. 1992: 12: 77 – 83. [PubMed]
  14. Forrest S, McNamara C. Id сімейство факторів транскрипції і утворення ураження судин. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004: 24: 2014 – 20. [PubMed]
  15. Gevrey JC, Cordier-Bussat M, Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. Вимоги до циклічної AMP- і кальцій-залежної протеїнкінази для транскрипційної активації гена холецистокініну за допомогою білкових гідролізатів. J Biol Chem. 2002: 277: 22407 – 13. [PubMed]
  16. Зелена Т.А., Alibhai IN, Unterberg S, Neve RL, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ. Індукція активуючих транскрипційних факторів (ATF) ATF2, ATF3 і ATF4 в nucleus accumbens та їх регулювання емоційної поведінки. J Neurosci. 2008: 28: 2025 – 32. [PubMed]
  17. Гамільтон М.Е., Редондо JL, Фрімен А.С. Переповнення дофаміну і холецистокініну в ядрі щурів щурів у відповідь на гостре введення препарату. Синапс. 2000: 38: 238 – 42. [PubMed]
  18. Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. Мітоген-активована протеїнкіназа та протеїнкіназа A сигнальні шляхи стимулюють транскрипцію холецистокініну шляхом активації циклічного аденозину 3 ′, 5’-монофосфатного реакційного зв’язуючого білка. Моль Ендокринол. 1999; 13: 466–75. [PubMed]
  19. Гансен ТВ, ФК Нілсен. Регулювання транскрипції гена нейронального холецистокініну. Scand J Clin Lab Інвест Suppl. 2001: 234: 61 – 7. [PubMed]
  20. Телевізор Hansen. Транскрипція гена холецистокініну: елементи промотора, фактори транскрипції та сигнальні шляхи. Пептиди. 2001: 22: 1201 – 11. [PubMed]
  21. Хансен Т.В., Рехфельд Дж. Ф., Нільсен ФК. KCl і форсколін синергічно підвищують експресію гена холецистокініну за допомогою координатної активації CREB і ко-активатора CBP. J Neurochem. 2004: 89: 15 – 23. [PubMed]
  22. Haun RS, Dixon JE. Транскрипційний енхансер, необхідний для експресії гена холецистокініну щура, містить послідовність, ідентичну -296-елементу гена c-fos людини. J Biol Chem. 1990: 265: 15455 – 63. [PubMed]
  23. Hiroi N, Marek GJ, Brown JR, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, Duman RS, Greenberg ME, Nestler EJ. Суттєва роль гена fosB в молекулярних, клітинних і поведінкових діях хронічних електроконвульсивних нападів. J Neurosci 1998. 1998: 18: 6952 – 62. [PubMed]
  24. Hokfelt T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldstein M, Markey K. Докази співіснування дофаміну і CCK у мезо-лімбічних нейронах. Природа. 1980: 285: 476 – 8. [PubMed]
  25. Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ. Лікування хронічної електроконвульсивної припадки (ECS) призводить до експресії довготривалого комплексу AP-1 у мозку з зміненою композицією та характеристиками. J Neurosci. 1994: 14: 4318 – 28. [PubMed]
  26. Надія BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ. Індукція тривалого комплексу AP-1, що складається з змінених Fos-подібних білків у мозку хронічним кокаїном та іншими хронічними методами лікування. Нейрон. 1994: 13: 1235 – 44. [PubMed]
  27. Хуан КХ, Уолтерс Дж. Допамінергічна регуляція активності транскрипційного фактора ДНК AP-1 в стриатуме щура. Неврологія. 1996: 75: 757 – 75. [PubMed]
  28. Impey S, McCorkle SR, Cha-Molstad H, Dwyer JM, Yochum GS, Boss JM, McWeeney S, Dunn JJ, Mandel G, Goodman RH. Визначення регулона КРЕБ: геномний аналіз регуляторних областей транскрипційного фактора. Cell. 2004: 119: 1041 – 54. [PubMed]
  29. Йоханнесен М, Дельганді МП, Моенс У. Що таке CREB? Сигнал клітинки. 2004: 16: 1211 – 27. [PubMed]
  30. Josselyn SA, Vaccarino FJ. Протилежні ефекти антагоністів CCK (A) і CCK (B) на розвиток умовної активності у щурів. Behav Pharmacol. 1996: 7: 505 – 512. [PubMed]
  31. Josselyn SA, De Cristofaro A, Vaccarino FJ. Докази участі CCK (A) рецепторів у придбанні кондиційної активності, що виробляється кокаїном у щурів. Brain Res. 1997: 763: 93 – 102. [PubMed]
  32. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr., Уіслер K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Чжан YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Баранаускас G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR , Nestler EJ. Експресія фактора транскрипції deltaFosB в мозку контролює чутливість до кокаїну. Природа. 1999: 401: 272 – 6. [PubMed]
  33. Кумар А, Чой Х., Ренталь W, Цанкова Н.М., Теобальд Д.Е., Труонг Х.Т., Руссо SJ, Лаплант Q, Сасакі Т.С., Уістлер К.Н., Неве Р.Л., Self DW. Хроматин ремоделювання є ключовим механізмом, що лежить в основі кокаїн-індукованої пластичності в striatum. Нейрон. 2005: 48: 303 – 14. [PubMed]
  34. Mattson BJ, Bossert JM, Simmons DE, Nozaki N, Nagarkar D, Kreuter JD, Hope BT. Індуковане кокаїном фосфорилювання CREB в ядрах акумульованих щурів кокаїну дозволяється за рахунок посиленої активації позаклітинної сигнально-спорідненої кінази, але не протеїнкінази A. J Neurochem. 2005: 95: 1481 – 94. [PubMed]
  35. McClung CA, Nestler EJ. Регулювання експресії генів та винагороди кокаїну CREB та DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003: 6: 1208 – 15. [PubMed]
  36. McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: молекулярний перемикач для тривалої адаптації в мозку. Brain Res Mol Brain Res. 2004: 132: 146 – 54. [PubMed]
  37. Nestler EJ, Kelz MB, Chen JS. ΔFosB: молекулярний медіатор довготривалої нервової та поведінкової пластичності. Brain Res. 1999: 835: 10 – 17. [PubMed]
  38. Nestler EJ. Чи існує загальний молекулярний шлях для залежності? Nat Neurosci. 2005: 8: 1445 – 9. [PubMed]
  39. Nestler EJ. Транскрипційні механізми наркоманії: роль DeltaFosB. Філос Транс Р Сок Лонд Б Біол. 2008: 363: 3245 – 55. [PMC безкоштовна стаття] [PubMed]
  40. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Відмінні закономірності індукції DeltaFosB в мозку наркотичними засобами. Синапс. 2008: 62: 358 – 69. [PMC безкоштовна стаття] [PubMed]
  41. Rando OJ, Chang HY. Геном-широкий погляд на структуру хроматину. Annu Rev Biochem. 2009: 78: 245 – 71. [PMC безкоштовна стаття] [PubMed]
  42. Renthal W, Carle TL, Maze I, Covington HE, 3rd., Truong HT, Alibhai I, Kumar A, Montgomery RL, Olson EN, Nestler EJ. Delta FosB опосередковує епігенетичну десенсибілізацію гена c-fos після хронічного впливу амфетаміну. J Neurosci. 2008: 28: 7344 – 9. [PMC безкоштовна стаття] [PubMed]
  43. Renthal W, Кумар А, Сяо Г, Уілкінсон М, Ковінгтон ВІ, 3rd, Maze I, Sikder D, Робісон AJ, LaPlant Q, Dietz DM, Руссо SJ, Vialou V, Чакраварти S, Кодадек TJ, Stack A, Kabbaj M, Nestler EJ. Геномний аналіз регуляції хроматину кокаїном виявляє роль сиртуїнів. Нейрон. 2009: 62: 335 – 48. [PMC безкоштовна стаття] [PubMed]
  44. Rotzinger S, Bush DE, Vaccarino FJ. Модуляція холецистокініну мезолімбічної функції дофаміну: регулювання мотивованої поведінки. Pharmacol Токсикол. 2002: 91: 404 – 13. [PubMed]
  45. Рурк І.Я., Хансен Т.В., Нерлов С, Рехфельд Й.Ф., Нільсен ФК. Негативна кооперативність між сусідніми E-box і cAMP / TPA-чутливими елементами в промоторі гена холецистокініну. FEBS Lett. 1999: 448: 15 – 8. [PubMed]
  46. Шоу-Лучман Т.З., Барро М, Уоллес Т., Гілден Л., Захаріо V, Імпеі С., Думан Р.С., Буря D, Нестлер Е.Я. Регіональне та клітинне картування CRE-опосередкованої транскрипції під час видалення морфіну, обложеного налтрексоном. J Neurosci. 2002: 22: 3663 – 3672. [PubMed]
  47. Шоу-Lutchman TZ, Impey S, Storm D, Нестлер Е.Я. Регулювання CRE-опосередкованої транскрипції в мозку миші амфетаміном. Синапс. 2003: 48: 10 – 7. [PubMed]
  48. Sheng M, McFadden G, Greenberg ME. Деполяризація мембрани і кальцій індукують транскрипцію c-fos за допомогою фосфорилювання транскрипційного фактора CREB. Нейрон. 1990: 4: 571 – 82. [PubMed]
  49. Цанкова Н.М., Кумар А., Нестлер Е.Я. Модифікації гістонів у областях промотора гена у гіпокампу щурів після гострих і хронічних електроконвульсивних нападів. J Neurosci. 2004: 24: 5603 – 10. [PubMed]
  50. Ulery PG, Nestler EJ. Регулювання транскрипційної активності DeltaFosB фосфорилюванням Ser27. Eur J Neurosci. 2007: 25: 224 – 30. [PubMed]
  51. Vaccarino FJ. Nucleus поглинає взаємодії з дофаміно-ССК у нагороду психостимулятора та пов'язану з ними поведінку. Neurosci Biobehav Rev. 1992, 18: 207 – 14. [PubMed]
  52. Захаріо V, Боланос С.А., Селлі Д.Е., Теобальд Д., Кесіді М.П., ​​Кельз М.Б., Шоу-Лутхманн Т, Бертон О, Сім-Селлі Л.Я., Ділеон Р.Ю., Кумар А. ΔFosB: Суттєва роль ΔFosB в nucleus accumbens в дії морфіну. Природа Neurosci. 2006: 9: 205 – 11. [PubMed]