Вплив гіперекспресії ΔFosB на опіоїдну і каннабиноидную рецепторну сигналізацію в nucleus accumbens (2011)

Нейрофармакологія. 2011 Dec;61(8):1470-6. doi: 10.1016/j.neuropharm.2011.08.046.

Sim-Selley LJ, Кассіді МП, Спарта А, Захарій V, Nestler EJ, Selley DE.

Source

Кафедра фармакології та токсикології та Інститут досліджень наркотиків та алкоголіків, Медицинська школа університету штату Вірджинія, Річмонд, США, 23298, США.

абстрактний

Стабільний коефіцієнт транскрипції ΔFosB індукується в ядрах ядер (NAc) хронічним впливом кількох наркотиків, що зловживають, а трансгенна експресія ΔFosB у стриатумі посилює корисні властивості морфіну та кокаїнуе. Однак механістична основа цих спостережень не повністю зрозуміла. Ми використовували бітрансгенну модель миші з індукованою експресією ΔFosB в допамін D (1) рецептор / динорфін-містять смугасті нейрони для визначення впливу експресії ΔFosB на сигнали опіоїдних та канабіноїдних рецепторів в NAc. Результати показали, що опосередкована mu опіоїдами активність G-білка та інгібування аденілілциклази були посилені у NAc мишей, які експресували ΔFosB. Аналогічно, інгібування капі-опіоїдного аденілілциклази було посилено у мишей, що експресують ΔFosB.. На противагу цьому сигналізація, опосередкована канабіноїдними рецепторами, не відрізнялася між мишами, що надмірно експресують ΔFosB, і контрольними мишами. TРезультати досліджень свідчать про те, що сигналізація опіоїдних і канабіноїдних рецепторів диференційовано модулюється експресією ΔFosB, і вказують на те, що експресія ΔFosB може викликати деякі її ефекти за допомогою посиленої сигналізації опіоїдного рецептора mu та kappa в NAc.

Ключові слова: G-білок, аденілілциклаза, стриатум
Перейти до:

1. Введення

Опіоїдні рецептори та канабіноїд CB1 рецептори (КБ)1R) є нейробіологічними мішенями для двох широко використовуваних класів наркотиків, які включають морфін, опіоїди, що відпускаються за рецептом, та марихуану (Δ9-тетрагідроканабінол (ТГК)) відповідно. Гострий ефект опіоїдів і канабіноїдів опосередковується рецепторами, пов'язаними з G-білками, які активують головним чином Gв / в протеїни і продукують ефекторні реакції нижче, такі як інгібування аденілілциклази (Чайлдерс, 1991, Чайлдерс та ін., 1992, Howlett та ін., 2002). Руховий, погіршує пам'ять та психоактивні ефекти Δ9-THC виробляються CB1R (Huestis та ін., 2001, Zimmer та ін., 1999), які широко поширені в мозку, з високим рівнем в базальних гангліях, гіпокампі та мозочку (Herkenham та ін., 1991). Знеболюючі та корисні ефекти більшості клінічно значущих та зловживаних опіоїдними препаратами опосередковуються головним чином му-опіоїдними рецепторами (МОР) (Matthes та ін., 1996), які збагачені в лімбічній системі та стовбурі мозку (Мансур та ін., 1994). Мезолімбічна система, що складається з дофамінергічних проекцій від вентральної тегментальної області (VTA) до ядерних ядер (NAc), відіграє важливу роль у корисному впливі опіоїдів та канабіноїдів (Бозарт і Мудрий, 1984, Vaccarino та ін., 1985, Zangen та ін., 2006), а також інші наркотичні засоби зловживання (Koob і Volkow, 2010). Більше того, ендогенні опіоїдні та канабіноїдні системи беруть участь у корисних ефектах багатьох класів психоактивних наркотиків (Мальдонадо та ін., 2006, Trigo та ін., 2010). Таким чином, важливо з’ясувати механізми, за допомогою яких опіоїди та КБ1R сигналізація регулюється в NAc.

Центральним питанням у сфері зловживання наркотиками було визначення білків, які опосередковують перехід від гострих до тривалих наслідків психоактивних наркотиків. Коефіцієнт транскрипції AP-1 ΔFosB особливо цікавий тим, що він є стабільним урізаним варіантом сплайсингу продукту fosb ген, який накопичується при повторному впливі наркотиків зловживання або природних нагород (McClung та ін., 2004, Nestler, 2008, Nestler та ін., 1999). Ми виявили, що ΔFosB індукується в мозку після неодноразового впливу морфіну, Δ9-ТХК, кокаїн або етанол, кожен наркотик створює унікальну регіональну схему експресії ΔFosB (Perrotti та ін., 2008). Послідовним виявленням ліків було те, що ΔFosB був сильно індукований у стриатумі, де всі чотири препарати індукували ΔFosB в ядрі NAc і всі, крім Δ9-THC значно індукував експресію в оболонці NAc та хвостатих хвостах.

Фармакологічні дослідження показали, що одночасне застосування дофаміну D1 рецептор (D1R) антагоніст SCH 23390 блокував індукцію ΔFosB в NAc та хвостатих хворобах після періодичного введення кокаїну або морфіну, що дозволяє припустити важливість D1R-експресуючі нейрони (Мюллер і Унтервальд, 2005, Nye та ін., 1995). Вплив індукції ΔFosB на поведінку, опосередковану наркотиками, досліджено за допомогою бітрангенних мишей, які експресують ΔFosB у специфічних популяціях нейронів NAc та дорзальному стриатумі (Chen та ін., 1998). Миші, які експресують ΔFosB у динорфіні / D1R позитивні нейрони в NAc та дорсальному стриатумі (лінія 11A) демонструють змінені реакції на зловживання наркотиками, особливо підвищену чутливість до корисних ефектів кокаїну чи морфіну (Колбі та ін., 2003, Kelz та ін., 1999, Zachariou та ін., 2006). Ці зміни відбувалися за відсутності змін рівня MOR або різних субодиниць G-білка. Однак рівень мРНК динорфіну був знижений у NAc мишей, що експресують ΔFosB (Zachariou та ін., 2006), припускаючи, що одна мішень ΔFosB є геном, що кодує ендогенний опіоїдний пептид. Індукція ΔFosB також може призвести до зміни поведінки, регулюючи сигналізацію рецепторів в NAc, але ця можливість не досліджена. Тому в цих дослідженнях використовували бітрансгенну модель миші, щоб визначити, чи є надмірна експресія ΔFosB в динорфіні / D1R, що містить смугасті нейрони, змінює активність G-білка, опосередковану MOR, та інгібування аденілілциклал-циклази, опосередковану MOR та KOR. Вплив ΔFosB на CB1Р-опосередковану активність G-білка також оцінювали через Δ9Введення -THC індукує ΔFosB в NAc (Perrotti та ін., 2008) і, як відомо, ендоканабіноїдна система регулює схеми винагороди мозку (Гарднер, 2005, Мальдонадо та ін., 2006), але вплив ΔFosB на ендоканабіноїдну систему не досліджено.

Перейти до:

2. Матеріали і методи

2.1. Реагенти

[35S] GTPγS (1250 Ci / ммоль), [α-32P] АТФ (800 Ci / ммоль) і [3H] cAMP (26.4 Ci / ммоль) купували у PerkinElmer (Shelton, CT). АТФ, GTP, ВВП, цАМФ, альбумін сироватки великої рогатої худоби, креатинфосфокіназа, папаверин, імідазол та WIN-55212-2 були придбані у Sigma Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі). GTPγS був придбаний у корпорації Roche Diagnostic (Чикаго, штат Ілінойс). DAMGO забезпечувався Програмою з постачання наркотиків Національного інституту зловживання наркотиками (Rockville, MD). Сцинтиляційна рідина Econo-1 була отримана від Fisher Scientific (Norcross, GA). Еколітову сцинтиляційну рідину отримували з ICN (Коста-Меса, Каліфорнія). Усі інші хімічні речовини були отримані від Sigma Aldrich або Fisher Scientific.

2.2. Миші

Чоловічі бітрангенні миші, отримані з NSE-tTA (лінія A) × TetOp-ΔFosB (лінія 11), були сформовані, як описано в Kelz et al. (Kelz та ін., 1999). Бітрангенні миші були задумані та вирощені на доксицикліні (100 мкг у питній воді) для придушення експресії трансгену. У віці 8 тижнів доксициклін був випущений з води для половини мишей, щоб дозволити експресію трансгену, тоді як інші миші підтримували доксициклін для придушення трансгену. Мозок був зібраний 8 тижні пізніше, час, коли транскрипційний ефект ΔFosB є максимальним (McClung і Nestler, 2003). Була використана друга трансгенна лінія миші, в якій Δc-Jun, домінуючий негативний антагоніст c-Jun, виражається в D1R / динорфін і D2R / енкефалінові клітини стриатуму, гіпокампу та тім'яної кори (Пікман та ін., 2003). С-Джун та споріднені білки сімейства Джун димеризуються з білками сімейства Fos і зв'язуються з AP-1 сайтом цільових генів для регулювання транскрипції. Однак усічення N-кінця c-Jun (Δc-Jun) робить комплекс транскрипційно неактивним і здатний перешкоджати зв'язуванню ДНК активних комплексів AP-1. Чоловічі бітрангенні миші, отримані з NSE-tTA (лінія A) × TetOp-FLAG-Δc-Jun (лінія E), були сформовані, як описано в Peakman et al. (Пікман та ін., 2003). Бітрангенні миші були задумані та вирощені на доксицикліні (100 мкг у питній воді) для придушення експресії трансгену. Тварин відлучували на 3 тижні, генотипували та розділяли на групи, половину вміщували на воді, що містить доксициклін, а половину - на звичайній питній воді, щоб викликати експресію FLAG-Δc-червня. Мозок був зібраний 6 тижні пізніше, час, за який вимірювали максимальні рівні FLAG-Δc-червня (Пікман та ін., 2003). Всі процедури на тваринах проводилися відповідно до Національного посібника з охорони здоров’я з догляду та використання лабораторних тварин.

2.3. Підготовка мембрани

Мозок зберігали при -80 ° C до дня аналізу. До аналізу кожен мозок був розморожений, а NAc розсікали на льоду. Кожен зразок гомогенізували в 50 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 7.4 (мембранний буфер) з обведеннями 20 зі скляного гомогенізатора при температурі 4 ° C. Гомогенат центрифугували при 48,000 × g при 4 ° C протягом 10 хв, ресуспендували в мембранному буфері, знову центрифугували при 48,000 × g при 4 ° C протягом 10 хв і ресуспендували в 50 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl2, 0.2 mM EGTA, 100 mM NaCl, pH 7.4 (буфер аналізу). Рівень білка визначали методом Бредфорда (Бредфорд, 1976) із використанням стандартного альбуміну сироватки великої рогатої худоби (BSA).

2.4. Агоніст-стимульований [35S] GTPγS Пов'язування

Мембрани попередньо інкубували протягом 10 хв при 30 ° C з аденозиндезаміназою (3 mU / ml) в буфері для аналізу. Мембрани (білок 5 – 10 мкг) потім інкубували протягом 2 год при 30 ° C в буфері для аналізу, що містить 0.1% (мас. / Об.) BSA, 0.1 нМ [35S] GTPγS, 30 мкМ ВВП та аденозиндезаміназа (3 mU / ml) з та без відповідних концентрацій DAMGO або WIN55,212-2. Неспецифічне зв'язування вимірювали за допомогою 20 мкМ GTPγS. Інкубацію закінчували фільтруванням через фільтри зі скловолокна GF / B з подальшим промиванням 3 морозивом 3 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7.4. Пов'язану радіоактивність визначали за допомогою рідкої сцинтиляційної спектрофотометрії після екстракції протягом ночі фільтрів у сцинтиляційній рідині Econo-1.

2.5. Аналіз аденілілациклази

Мембрани (білок 5 – 25 мкг) попередньо інкубували аденозиндезаміназою, як описано вище, потім інкубували протягом 15 хв при температурі 30 ° C у присутності або відсутності 1 мкМ форсколіну, з або без DAMGO, U50,488H або WIN55,212H, що містить асимп, 2 50 мкМ АТФ, [α-32P] ATP (1.5 µCi), 0.2 mM DTT, 0.1% (мас. / Об.) BSA, 50 мкМ циклічний AMP, 50 µM ​​GTP, 0.2 mM папаверин, 5 mM фосфокреатин, 20 mM фосфокреатин, 3 мкм / мл креатину амінофосфат амінафосфосфату амінофосфат амінафосфосфат амінафосфосфат амінафосфат амінафосфосфат амінафосфат амінафосфат амінафосфат амінафосфат амінафосфат амінафосфат амінафосфат амінафосфат амінафосфат / мл) в кінцевому об'ємі 100 мкл. За цих умов загальний [α-32P] цАМФ відновлено, як правило, менше 1% від загальної кількості доданого [α-32P] АТФ у кожному зразку. Реакцію припиняли кип'ятінням протягом 3 хв і [32P] Циклічний AMP був виділений методом подвійної колонки (Dowex і глинозему) Salomon (Саломон, 1979). [3H] cAMP (10,000 dpm) додавали до кожної пробірки перед колонковою хроматографією як внутрішній стандарт. Радіоактивність визначали за допомогою рідкої сцинтиляційної спектрофотометрії (ефективність 45% для 3H) після розчинення 4.5 мл елюату в 14.5 мл сцинтиляційної рідини Ecolite.

2.6. Аналіз даних

Якщо не вказано інше, дані подаються у вигляді середніх значень ± SE для окремих експериментів 4 – 8, кожен з яких був виконаний у трьох примірниках. Чисто стимульована [35S] GTPγS-зв'язування розраховується як стимульоване агоністом зв'язування мінус базальне зв'язування. Чиста активізована форсколіном аденілілциклаза визначається як стимульована форсколіном активність - базальна активність (пмоль / мг / хв). Відсоткове інгібування активності, стимульованої форсколіном аденілілциклази, визначається як (чиста активована стимульованою форсколіном активність у відсутності агоніста - чиста активність, стимульована форсколіном у присутності активності, стимульованої агоністом / сіткою форсколіну у відсутності агоніста) × 100. Всі криві та статистичні аналізи проводили за допомогою Prism 4.0c (GraphPad Software, Inc., Сан-Дієго, Каліфорнія). Криві концентраційного ефекту аналізували за допомогою ітеративної нелінійної регресії для отримання ЕС50 і ЕМакс значення. Статистичну значимість даних про концентраційний ефект визначали двостороннім дисперсійним аналізом (ANOVA), використовуючи дозу агоніста та індукцію генів (увімкнено або вимкнено) як основні фактори. Статистичне значення кривих придатних значень (ЕМакс або ЄС50) визначали за допомогою неспареного двостороннього t-критерію Стьюдента, використовуючи корекцію Уелча або перетворення квадратних коренів даних, де це необхідно для виправлення на неоднакові дисперсії (виявлені за допомогою F-критерію) в EC50 значень.

Перейти до:

3. Результати

3.1. Вплив експресії ΔFosB на активацію опіоїдних і канабіноїдних рецепторів G-білка

Щоб визначити, MOR- або CB1R-опосередкована активація G-білка була змінена індукованою трансгенною експресією ΔFosB в NAc, стимульованому агоністом [35S] GTPγS-зв'язування досліджували в ізольованих мембранах, приготованих з цієї області бітрансгенних мишей, умовно експресуючи (ΔFosB включено) або не експресуючи (ΔFosB off) трансгену ΔFosB. MOR-селективний аналог енкефаліну DAMGO використовувався для активації MOR, а канабіноїд аміноалкіліндол WIN55,212-2 використовувався для активації CB1Р. Ці ліганди раніше показали, що вони є повноцінними агоністами при MOR і CB1R відповідно (Breivogel та ін., 1998, Selley та ін., 1997). Дослідити активність G-білка G-білка, опосередковану KOR, неможливо, оскільки в мозку гризунів сигнал занадто низький (Чайлдерс та ін., 1998). Результати показали стимуляцію активності G-білка як DAMGO, так і WIN55,122-2 в NAc від ΔFosB і ΔFosB на мишах (малюнок 1). Для стимульованої DAMGO діяльності (Малюнок 1A), двостороння ANOVA даних концентрації-ефекту виявила суттєві основні ефекти стану ΔFosB (p <0.0001, F = 22.12, df = 1) та концентрації DAMGO (p <0.0001, F = 29.65, df = 5) без значна взаємодія (p = 0.857, F = 0.387, df = 5). Нелінійний регресійний аналіз кривих концентрація-ефект виявив значно більший DAMGO EМакс значення ΔFosB на мишах (EМакс = 73 ± 5.2% стимуляція) щодо ΔFosB від мишей (EМакс = 56 ± 4.1% стимуляція; p <0.05, що відрізняється від ΔFosB на мишах за допомогою t-критерію Стьюдента). DAMGO EC50 значення не відрізнялися між ΔFosB на мишах та ΔFosB (302 ± 72 nM проти 212 ± 56 nM відповідно, p = 0.346).

малюнок 1 

Вплив експресії ΔFosB на стимульовану агоністом [35S] GTPγS-зв'язування в NAc. Мембрани мишей, що експресують ΔFosB (увімкнено ΔFosB), або контрольних (ΔFosB вимкнених) мишей аналізували, як описано в Методах, використовуючи різні концентрації ...

На відміну від результатів, отриманих з агоністом MOR DAMGO, ніяких ΔFosB-залежних від статусу відмінностей у активації G-білка не спостерігалось у агоніста канабіноїдів WIN55,212-2 (Малюнок 1B). Двостороння ANOVA даних концентрації ефекту WIN55,212-2 виявила значний основний ефект концентрації WIN55,212-2 (p <0.0001, F = 112.4, df = 7), але не стану ΔFosB (p = 0.172 , F = 1.90, df = 1) і взаємодії не було (p = 0.930, F = 0.346, df = 7). Подібним чином, не було впливу статусу ΔFosB на WIN55,212-2 EМакс значення (103 ± 6% проти 108 ± 8% стимуляції у ΔFosB на мишах, що вимикаються і вимикаються відповідно, p = 0.813 за t-тестом Стьюдента) або EC50 значення (103 ± 20 нМ проти 170 ± 23 нМ у ΔFosB на мишах, що вимикаються і вимикаються відповідно, p = 0.123).

Виходячи з форми кривих і того факту, що в наших попередніх дослідженнях було показано двофазні криві концентрації та ефекту WIN55,212-2 в мозку (Breivogel та ін., 1999, Breivogel та ін., 1998), криві WIN55,212-2 також були проаналізовані, використовуючи модель двох сайтів. Аналіз усереднених даних показав незначне поліпшення корисності при використанні двомістової моделі (R2 = 0.933 і 0.914, сума квадратів = 3644 і 5463 в мишах ΔFosB відповідно і поза) порівняно з односайтовою моделлю (R2 = 0.891 і 0.879, сума квадратів = 6561 і 6628 в мишах ΔFosB і вимикається відповідно). Однак суттєвих відмінностей між ΔFosB на мишах, що вимикаються, і поза ними, не було виявленоМакс або ЄС50 значення сайтів високої або низької потенції (Додаткова таблиця 1), хоча спостерігалася тенденція до зниження ЕК50 значення на місці високої потенції у мишей з ΔFosB на (EC)50висока = 28.0 ± 10.6 нМ) порівняно з тими, у яких ΔFosB вимкнено (EC50висока = 71.5 ± 20.2 нМ; p = 0.094). Більше того, не було впливу статусу ΔFosB на базальний [35S] GTPγS-зв'язування в мембранах NAc (253 ± 14 проти 226 ± 14 fmol / мг у ΔFosB на мишах, що вимикаються і вимикаються відповідно, p = 0.188). Ці дані вказують на те, що індукована трансгенна експресія ΔFosB в NAc мишей посилювала активацію G-білка, опосередковану МОР, не впливаючи суттєво на CB1R-опосередкована або базальна активність G-білка.

3.2. Вплив ΔFosB на інгібування аденілілциклази, опосередковане опіоїдними і канабіноїдними рецепторами

Оцінити вплив індукованої трансгенної експресії ΔFosB на модуляцію ефекторної активності за течією за допомогою MOR та CB1R, інгібування активності аденілілциклази, стимульованої форсколіном 1 мкМ, досліджували в мембранах NAc. Окрім MOR- та CB1R-опосередковане інгібування активності аденілілциклази, ефекти активності KOR також були досліджені з використанням повного агоніста KOR-селективного U50,488 (Чжу та ін., 1997), оскільки попередні результати показали, що мРНК динорфіну була мішенню ΔFosB у бітрангенній моделі (Zachariou та ін., 2006). Результати показали, що DAMGO, U50,488 і WIN55,212-2 кожен викликав концентрацію, залежне від концентрації аденілілциклази як у ΔFosB, так і ΔFosB на мишах (малюнок 2). Двостороння ANOVA даних концентрації даних DAMGO (Малюнок 2A) виявили суттєві основні ефекти стану ΔFosB (p = 0.0012, F = 11.34, df = 1) та концентрації DAMGO (p <0.0001, F = 29.61, df = 6), але відсутність значної взаємодії (p = 0.441, F = 0.986 , df = 6). Нелінійний регресійний аналіз кривих концентрації та ефекту DAMGO виявив значно нижчий показник DAMGO EC50 значення в ΔFosB на мишах (101 ± 11 нМ) порівняно з ΔFosB на мишах (510 ± 182 нМ, p <0.05 за t-критерієм студента). Однак суттєвої різниці в DAMGO E не булоМакс значення (20.9 ± 1.26% проти інгібування 19.8 ± 1.27% у ΔFosB на мишах, що вимикаються і вимикаються відповідно, p = 0.534).

малюнок 2 

Вплив експресії ΔFosB на пригнічення активності аденілілциклази в NAc. Мембрани мишей, що експресують ΔFosB (увімкнено ΔFosB), або контрольних (ΔFosB) мишей аналізували, як описано у Методах, у присутності 1 мкМ ...

Інгібування аденілілциклази, опосередковане KOR, також відрізнялося як функція індукованої трансгенної експресії ΔFosB (Малюнок 2B). Двостороння ANOVA даних концентрації ефекту U50,488 показала значні основні ефекти стану ΔFosB (p = 0.0006, F = 14.53, df = 1) та концентрації U50,488 (p <0.0001, F = 26.48, df = 3) , без значної взаємодії (p = 0.833, F = 0.289, df = 3). Нелінійний регресійний аналіз кривих концентрація-ефект виявив більший U50,488 EМакс значення в ΔFosB на мишах (18.3 ± 1.14% інгібування) порівняно з ΔFosB у мишей (12.5 ± 2.03% інгібування; p <0.05 відрізняється від ΔFosB на t-тесті Стьюдента), без суттєвої різниці в U50,488 EC50 значення (310 ± 172 нМ проти 225 ± 48 нМ у ΔFosB на мишах, що вимикаються і вимикаються відповідно, p = 0.324).

На відміну від ефектів, що спостерігаються при МОР та КОР, не було виражено значного впливу індукованої трансгенної експресії ΔFosB на інгібування аденілілциклази канабіноїдним агоністом WIN55212-2 (Малюнок 2C). Двосторонній ANOVA даних про концентрацію ефекту WIN55,212-2 показав значний ефект концентрації лікарського засобу (p <0.0001, F = 23.6, df = 2), але не стану ΔFosB (p = 0.735, F = 0.118, df = 1), а також не було значної взаємодії (p = 0.714, F = 0.343, df = 2). Крім того, не було впливу статусу ΔFosB на базальну або стимульовану форсколіном активність аденилілциклази за відсутності агоніста. Активність базальної аденилілциклази становила 491 ± 35 пмоль / мг / хв у ΔFosB на мишах порівняно з 546 ± 44 у ΔFosB у мишей (р = 0.346 за t-критерієм Стьюдента). Подібним чином, активність аденилілциклази у присутності 1 мкМ форсколіну становила 2244 ± 163 пмоль / мг / хв у ΔFosB у мишей проти 2372 ± 138 пмоль / мг / хв у ΔFosB у мишей (р = 0.555).

3.3. Вплив ΔcJun на інгібування аденілілциклази, опосередковане опіоїдними і канабіноїдними рецепторами

Оскільки індукована трансгенна експресія посиленої інгібіторної передачі сигналу ΔFosB від MOR та KOR до аденілілциклази в NAc, було цікавим визначити, чи буде домінантний негативний інгібітор транскрипції, опосередкованої ΔFosB, модулювати опіоїдний рецептор сигналу протилежним чином. Для вирішення цього питання інгібування активності аденілілциклази, стимульованої форсколіном, DAMGO та U50,488 досліджували в мембранах, підготовлених з NAc бітрансгенних мишей, умовно експресуючи ΔcJun. Результати не показали суттєвого впливу експресії ΔcJun на пригнічення активності аденіліциклази за допомогою MOR або KOR (малюнок 3). Двостороння ANOVA кривих концентрації-ефекту DAMGO показала значний основний ефект концентрації DAMGO (p <0.0001, F = 20.26, df = 6), але не стану ΔcJun (p = 0.840, F = 0.041, df = 1) і не було значної взаємодії (p = 0.982, F = 0.176, df = 6). Так само не було значної різниці в ЕМакс або ЄС50 значення між мишами з ΔcJun на (EМакс = 23.6 ± 2.6%; ЄС50 = 304 ± 43 nM) або ΔcJun off (EМакс = 26.1 ± 2.5%, p = 0.508; ЄС50 = 611 ± 176 нМ, p = 0.129). Подібні результати спостерігались і для U50,488, так що двостороння ANOVA кривих концентрація-ефект показала значний вплив концентрації (p <0.0001, F = 11.94, df = 6), але не стану ΔcJun (p = 0.127 , F = 2.391, df = 1) і не було значної взаємодії (p = 0.978, F = 0.190, df = 6). Так само не було значних відмінностей у ЕМакс або ЄС50 значення між мишами з ΔcJun на (EМакс = 14.8 ± 2.9%; ЄС50 = 211 ± 81 нМ) або вимкнено (EМакс = 16.7 ± 1.8%, p = 0.597; ЄС50 = 360 ± 151 нМ, p = 0.411).

малюнок 3 

Вплив експресії ΔcJun на пригнічення активності аденілілциклази в NAc. Мембрани мишей, що експресують ΔcJun (ΔcJun), або контрольних (ΔcJun off) мишей інкубували у присутності DAMGO (A), U50,488H (B) або WIN55,212-2 ...

Експресія ΔcJun також не суттєво впливала на інгібування аденилилциклази в NAc антагоністом канабіноїдів. Двостороння ANOVA кривих концентрації WIN55,212-2 показала значний основний ефект концентрації WIN55,212-2 (p <0.0001, F = 15.53, df = 6), але не генотипу (p = 0.066, F = 3.472, df = 1) і не було значної взаємодії (p = 0.973, F = 0.208, df = 6). Так само не було значних відмінностей у WIN55,212-2 EМакс значення (13.0 ± 2.3% та 13.6 ± 0.9% інгібування в ΔcJun у порівнянні з мишами, відповідно p = 0.821) та або EC50 значення (208 ± 120 nM та 417 ± 130 нМ у ΔcJun по відношенню до мишей відповідно p = 0.270). Таким чином, хоча спостерігалася незначна тенденція до зниження активності WIN55,212-2 у мишей, що експресують ΔcJun, трансген не суттєво змінив гальмування каннабіноїдів аденілілциклази. Крім того, не було впливу ΔcJun статусу на активність аденілілциклази, стимульованої фосколіном або форсколіном. Активна базальна аденілілциклаза становила 1095 ± 71 пмоль / мг / хв і 1007 ± 77 пмоль / мг / хв (p = 0.403) у мишей відповідно з ΔcJun відповідно. Активність аденілілциклази, стимульована 1 мкМ форсколіну, була 4185 ± 293 пмоль / мг / хв проти 4032 ± 273 пмоль / мг / хв (p = 0.706) у мишей відповідно з ΔcJun увімкнено або вимкнено.

3.4 Обговорення

Результати цього дослідження виявили посилену МОР-опосередковану активацію G-білка та інгібування аденілілциклази в NAc мишей з індукованою трансгенною експресією ΔFosB в динорфіні / D1R, що містить нейрони. Інгібування активності аденілілциклази, опосередковане KOR, також було посилено у NAc мишей, що експресують ΔFosB, що дозволяє припустити, що ΔFosB регулює ендогенну опіоїдну систему в NAc. DAMGO EМакс значення було більшим для стимульованих МОР [35S] GTPγS-зв'язування та його ЕС50 значення для інгібування аденілілциклази у мишей ΔFosB над експресією порівняно з контрольними мишами. Ці результати дозволяють припустити можливість резервування рецепторів для ефекторної модуляції, але не активацію G-білка в досліджуваних умовах аналізу. Висновок, що на максимальне пригнічення аденілілциклази агоністом KOR впливав експресія ΔFosB, говорить про низький резерв рецепторів для опосередкованої KOR відповіді, що відповідає низьким рівням сайтів зв'язування KOR у мозку миші (Unterwald та ін., 1991). На відміну від ЦБ1R-опосередкована активність G-білка та інгібування аденілілциклази не впливали на експресію ΔFosB, припускаючи, що опіоїдна і канабіноїдна системи відрізняються своєю реакцією на ΔFosB в цих нейронах NAc.

Вплив ΔFosB на опосередковану опіоїдними рецепторами сигналу узгоджується з нашою попередньою доповіддю, що експресія ΔFosB у стриатумі змінювала гострі та хронічні ефекти морфіну (Zachariou та ін., 2006). Одним із висновків цього дослідження було те, що миші з трансгенною експресією ΔFosB в динорфіні / D1R стритальні нейрони були більш чутливими до морфіну в умовах кондиціонування, ніж контролі. Крім того, цей ефект був імітований вірусно опосередкованою експресією ΔFosB шляхом специфічної для ін'єкції місця в NAc. Ці спостереження відповідають поточним результатам, які показують посилену МОР-сигналізацію в NAc.

Ми попередньо ідентифікували кодування гена динорфін як мішень ΔFosB, і запропонував, щоб знижений динорфін відповідав посиленим корисним властивостям морфіну у бітрансгенних мишей ΔFosB (Zachariou та ін., 2006). Наведені результати показують, що опосередковане KOR інгібування аденілілциклази в NAc посилюється у мишей, що експресують ΔFosB, що може відображати компенсаторне підвищення чутливості до KOR після зниження динорфіну. Попередні дослідження показали, що КОР регулювався у певних областях мозку мишей, що вибивали продинорфін, включаючи NAc (Кларк та ін., 2003).

На відміну від ΔFosB, індукована трансгенна експресія ΔcJun, домінантний негативний усічений мутант партнера, що зв'язує ΔFosB cJun, не змінювала гальмування аденілілциклази агоністами MOR або KOR. Ці результати говорять про те, що базальні рівні експресії ΔFosB, які є відносно низькими, не відіграють значної ролі в підтримці сигналізації опіоїдних рецепторів на цьому рівні передачі сигналу в NAc. Той факт, що умовне корисне дію морфіну було зменшено на експресію ΔcJun у нашому попередньому дослідженні (Zachariou та ін., 2006) дозволяє припустити, що індукція морфіну ΔFosB під час процедури кондиціонування має важливе значення для регулювання поведінкових реакцій на лікарський засіб, або що транскрипційні ефекти ΔFosB, крім тих, що впливають на проксимальну сигналізацію опіоїдними рецепторами, можуть впливати на опіоїдну винагороду. У будь-якому випадку результати цього дослідження чітко показують, що коли експресія ΔFosB підвищена над базальними рівнями у стритальному динорфіні / D1R-експресуючи нейрони, спостерігається стійке збільшення зв'язування MOR і KOR з інгібуванням аденілілциклази в NAc.

Механізми, за допомогою яких МОР- та KOR-опосередкована сигналізація посилюються за допомогою надмірної експресії ΔFosB, є незрозумілими, але раніше ми показали, що рівні МОР, оцінені [3H] налоксон-зв'язування не відрізняються в NAc ΔFosB щодо мишей (Zachariou та ін., 2006). Це ж дослідження встановило, що GαiЕкспресія ΔFosB в цій області не впливала на рівень білка 1 та 2 в цій області. Однак попередні аналізи масиву експресії генів показали, що Gαo мРНК була регульована в NAc ΔFosB на мишах (McClung і Nestler, 2003). У майбутніх дослідженнях буде представляти інтерес всебічно вивчити вплив трансгенної експресії ΔFosB на експресію G-білкової субодиниці на рівні білка, а також на експресію багатьох модулюючих G-білків білків.

Цікаво, що експресія ΔFosB не посилювала CB1R-опосередкована сигналізація в NAc. Можливо, що зміни в КБ1R сигналізація виникає в дискретної популяції нейронів, яка затушована в цілому препараті NAc. Наприклад, введення Δ9- THC суттєво індукує ΔFosB в ядрі, але не в оболонці NAc (Perrotti та ін., 2008). Indeed, було показано, що виклик з Δ9-THC після повторного введення Δ9-THC збільшив вивільнення дофаміну в ядрі NAc, але зменшив вивільнення в оболонці (Кадоні та ін., 2008). Важливо також зазначити, що лінія бітрангенних мишей 11A експресує ΔFosB лише у динорфіні / D1R позитивні середні колючі нейрони стриатуму, але КБ1R виражаються в обох динорфінах / D1R і енкефалін / D2R позитивні смугасті нейрони (Гоман і Геркенхем, 2000), а також на терміналах кортикальних аферентів (Robbe та ін., 2001). Експресія домінантного негативного регулятора транскрипції, опосередкованої ΔFosB, ΔcJun, також не мала суттєвого впливу на сигналізацію канабіноїдних рецепторів, хоча ΔcJun індуктивно виражається в обох D1 і D2містять популяції середніх колючих нейронів у цих мишей (Пікман та ін., 2003). Однак можливо, що базальна експресія ΔFosB є достатньо низькою, щоб ΔcJun не впливав на рецепторну сигналізацію, як це підказують результати MOR та KOR. Можливо також, що КБ1R сигналізація скрізь підсилюється базальною експресією ΔFosB, таким чином, що подальше збільшення експресії ΔFosB або блокування його дії з ΔcJun мали лише незначні ефекти, які не досягли рівня статистичної значущості. Непряму підтримку цієї інтерпретації можна побачити, порівнюючи WIN55,212-2 EC50 значення між мишами, що експресують ΔcJun порівняно з ΔFosB. Співвідношення WIN55,212-2 EC50 значення для інгібування аденілілциклази у мишей з індукованою експресією ΔcJun до її ЕС50 значення для активації G-білка у мишей з індукованою експресією ΔFosB становило 4.0, тоді як таке ж співвідношення у мишей без індукції жодного трансгену було 1.2.

Альтернативно, канабіноїди можуть викликати експресію ΔFosB без прямого впливу на КБ1R сигналізація. У цьому сценарії канабіноїди могли б модулювати реагування на психоактивні ефекти інших лікарських засобів за допомогою регулювання транскрипції, опосередкованої ΔFosB. Яn факт, адміністрація Δ9-THC виробляє перехресну сенсибілізацію до опіоїдів та амфетаміну (Кадоні та ін., 2001, Lamarque та ін., 2001), що відповідає цій гіпотезі. Крім того, повідомлялося, що при повторному введенні агоніста канабіноїдів CP55,940 посилюється активація G-білка, опосередкована MOR, в NAc, аналогічно мишам, що індуктивно експресують ΔFosB в цьому дослідженні (Vigano та ін., 2005). Вплив експресії ΔFosB на Δ9-ТРТ-опосередкована поведінка не оцінювалася, але наявні результати не виключають взаємодії. Результати цього та нашого попереднього дослідження (Zachariou та ін., 2006) показують ΔFosB-індуковані зміни в MOR та KOR / динорфін у смузі. Ефекти нагородження Δ9-THC, вимірюваний перевагою місця, скасовується у нульових мишей MOR, тоді як делеція KOR ослаблена Δ9-ТВ відраза місця і виявлена ​​Δ9-THC налаштування місця (Ghozland та ін., 2002). Аналогічно, обумовлена ​​відраза місця до Δ9-THC відсутня в нокаут про-динорфіну порівняно з мишами дикого типу (Zimmer та ін., 2001). Ці дані дозволяють припустити, що Δ9-THC може бути більш корисним після індукції ΔFosB та відповідної індукції сигналу MOR зі зменшенням експресії динорфіну.

Підводячи підсумокy, результати цього дослідження показали, що експресія ΔFosB в D1Р / динорфінопозитивні смугасті нейрони посилювали МОР- та KOR-опосередковану сигналізацію на рівні G-білка, опосередкованого пригніченням аденілілциклази в NAc. Цей висновок узгоджується з дослідженнями, які продемонстрували роль ендогенної опіоїдної системи у нагороді (Trigo та ін., 2010) та забезпечити потенційний механізм опосередкованих ΔFosB ефектів на винагороду. На відміну від ЦБ1R-опосередкована сигналізація в NAc не зазнала суттєвого впливу на стритальну експресію ΔFosB при досліджених умовах, хоча для подальшого дослідження визначено вплив індукції ΔFosB на ендоканнабіноїдну систему.

Основні дослідження

  • Сигналізація МОР посилюється в ядрах мишей, які експресують ΔFosB
  • Інгібування KOR аденілілциклази також посилюється у мишей, що експресують ΔFosB
  • Експресія ΔFosB не змінює CB1R сигналізація в ядрі акаундів
Перейти до:

Подяки

Автори дякують Хенджуну Хе, Джордану Коксу та Аарону Томарчіо за технічну допомогу в роботі [35S] Аналіз зв'язування GTPγS. Це дослідження було підтримано грантами USPHS DA014277 (LJS), DA10770 (DES) та P01 DA08227 (EJN).

Перейти до:

Виноски

Заява видавця: Це PDF-файл неозброєного рукопису, який був прийнятий до публікації. Як послугу нашим клієнтам ми надаємо цю ранню версію рукопису. Рукопис буде підданий копіюванню, набору тексту та перегляду отриманого доказу до його опублікування в остаточній формі. Зверніть увагу, що під час виробничого процесу можуть бути виявлені помилки, які можуть вплинути на вміст, і всі правові застереження, які стосуються журналу, стосуються.

Перейти до:

посилання

  • Бозарт М.А., Мудрий Р.А. Анатомічно окремі поля рецепторів опіату опосередковують винагороду та фізичну залежність. Наука. 1984;224: 516-517. [PubMed]
  • Бредфорд М.М. Швидкий і чутливий метод кількісного визначення кількості мікрограм білка, що використовує принцип зв'язування білкового барвника. Анальний. Biochem. 1976;72: 248-254. [PubMed]
  • Breivogel CS, Childers SR, Deadwyler SA, Hampson RE, Vogt LJ, Sim-Selley LJ. Хронічна дельта9Лікування -тетрагідроканабінолом призводить до втрати залежних від часу G-білків, активованих канабіноїдними рецепторами, у мозку. J. Neurochem. 1999;73: 2447-2459. [PubMed]
  • Breivogel CS, Selley DE, Childers SR. Ефективність дії агоніста канабіноїдних рецепторів для стимулювання [35Зв'язування GTPγS з мембранами мозочка щурів корелює з зниженням спорідненості до ВВП, спричиненої агоністом. Дж. Біол. Хімія 1998;273: 16865-16873. [PubMed]
  • Cadoni C, Pisanu A, Solinas M, Acquas E, Di Chiara G. Поведінкова сенсибілізація після повторного впливу дельта 9-тетрагідроканабінолу та перехресної сенсибілізації з морфіном. Психофармакологія (Берл) 2001;158: 259-266. [PubMed]
  • Cadoni C, Valentini V, Di Chiara G. Поведінкова сенсибілізація до дельта 9-тетрагідроканабінолу та перехресна сенсибілізація з морфіном: диференціальні зміни в накопичувальній оболонці та передачі дофаміну в ядро. J. Neurochem. 2008;106: 1586-1593. [PubMed]
  • Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Трансгенні тварини з індукованою, цільовою експресією генів у мозку. Моль Фармакол. 1998;54: 495-503. [PubMed]
  • Діти СР. Другі месенджери, пов'язані з опіоїдними рецепторами. Наук про життя 1991;48: 1991-2003. [PubMed]
  • Чайлдерс С.Р., Флемінг Л, Конкой С, Марккель Д, Пачеко М, Секстон Т, Уорд С. Опіоїдні та канабіноїдні рецептори інгібують аденілілциклазу в мозку. Ann. NY Acad. Sci. 1992;654: 33-51. [PubMed]
  • Чайлдерс SR, Xiao R, Vogt LJ, Sim-Selley LJ. Стимуляція опіоїдних рецепторів каппи [35S] Зв'язування GTPγS у мозку морської свинки: Відсутність доказів для каппа2-селективна активація G-білків. Biochem. Pharmacol. 1998;56: 113-120. [PubMed]
  • Clarke S, Zimmer A, Zimmer AM, Hill RG, Kitchen I. Регіональна селективна регуляція мікро-, дельта- та каппа-опіоїдних рецепторів, але не опиоїдних рецепторів 1, подібних до опіоїдних рецепторів, у мозку мишей, що вибивають енкефалін та динорфін. Неврологія. 2003;122: 479-489. [PubMed]
  • Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. Стреатальная клітина, специфічна для сверхэкспрессии DeltaFosB, підвищує стимул для кокаїну. J. Neurosci. 2003;23: 2488-2493. [PubMed]
  • Гарднер Е.Л. Ендоканабіноїдна сигнальна система та винагорода мозку: акцент на дофаміну. Фармакол. Біохімія. Бехав 2005;81: 263-284. [PubMed]
  • Ghozland S, Matthes HW, Simonin F, Filliol D, Kieffer BL, Maldonado R. Мотиваційний вплив канабіноїдів опосередковується му-опіоїдними та каппа-опіоїдними рецепторами. J. Neurosci. 2002;22: 1146-1154. [PubMed]
  • Herkenham M, Lynn AB, Johnson MR, Melvin LS, de Costa BR, Rice KC. Характеристика та локалізація канабіноїдних рецепторів у мозку щурів: кількісне in vitro авторадиографическое дослідження. J. Neurosci. 1991;11: 563-583. [PubMed]
  • Hohmann AG, Herkenham M. Локалізація мРНК рецептора канабіноїдів CB (1) в нейрональних субпопуляціях стриатуму щурів: подвійне дослідження in situ гібридизації. Синапс. 2000;37: 71-80. [PubMed]
  • Howlett AC, Barth F, Bonner TI, Cabral G, Casellas P, Devane WA, Felder CC, Herkenham M, Mackie K, Martin BR, Mechoulam R, Pertwee RG. Міжнародний союз фармакології. XXVII. Класифікація канабіноїдних рецепторів. Фармакологічний огляд. 2002;54: 161-202.
  • Huestis MA, Gorelick DA, Heishman SJ, Preston KL, Nelson RA, Moolchan ET, Frank RA. Блокада ефектів копченої марихуани за допомогою селективного антагоніста канабіноїдних рецепторів SR1 CB141716. Арка. Психіатрія. 2001;58: 322-328. [PubMed]
  • Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, молодший, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Чжан YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, DJ Surmeier, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ. Експресія фактора транскрипції deltaFosB в мозку контролює чутливість до кокаїну. Природа. 1999;401: 272-276. [PubMed]
  • Koob GF, Volkow ND. Нейроциркулярная залежність. Neuropsychopharmacology. 2010;35: 217-238. [PMC безкоштовна стаття] [PubMed]
  • Lamarque S, Taghzouti K, Simon H. Хронічне лікування дельтою (9) -тетрагідроканабінолом посилює локомоторну реакцію на амфетамін та героїн. Наслідки для вразливості до наркоманії. Нейрофармакологія. 2001;41: 118-129. [PubMed]
  • Мальдонадо Р, Вальверде О, Беррендеро Ф. Залучення ендоканабіноїдної системи до наркоманії. Тенденції неврозу. 2006;29: 225-232. [PubMed]
  • Mansour A, Fox CA, Thompson RC, Akil H, Watson SJ. експресія мРНК mu-опіоїдного рецептора в ЦНС щура: порівняння з зв'язуванням mu-рецепторів. Мозок Рес. 1994;643: 245-265. [PubMed]
  • Matthes HWD, Maldonado R, Simonin F, Valverde O, Slowe S, Kitchen I, Befort K, Dierich A, LeMeur M, Dolle P, Tzavara E, Hanoune J, Roques BP, Kieffer BL. Втрата анальгезії, викликаної морфіном, ефектом нагороди та симптомами відміни у мишей, яким не вистачає гена µ-опіоїдного рецептора. Природа. 1996;383: 819-823. [PubMed]
  • McClung CA, Nestler EJ. Регулювання експресії генів та винагороди кокаїну CREB та DeltaFosB. Nat. Neurosci. 2003;6: 1208-1215. [PubMed]
  • McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: молекулярний перемикач для тривалої адаптації в мозку. Мозок Рез. Мол. Мозок Рез. 2004;132: 146-154. [PubMed]
  • Muller DL, Unterwald EM. Рецептори дофамінів D1 модулюють індукцію deltaFosB в стриатуме щура після періодичного введення морфіну. J. Pharmacol. Експ. Ther. 2005;314: 148-154. [PubMed]
  • Nestler EJ. Огляд. Транскрипційні механізми наркоманії: роль DeltaFosB. Філос. Транс. R. Soc. Лонд. B. Biol. Sci. 2008;363: 3245-3255. [PMC безкоштовна стаття] [PubMed]
  • Nestler EJ, Kelz MB, Chen J. DeltaFosB: молекулярний медіатор довгострокової нейронної та поведінкової пластичності. Мозок Рес. 1999;835: 10-17. [PubMed]
  • Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Фармакологічні дослідження регуляції хронічної індукції антигену, пов'язаної з FOS, кокаїном в стриатуме і nucleus accumbens. J. Pharmacol. Експ. Ther. 1995;275: 1671-1680. [PubMed]
  • Пікман МК, Колбі С, Перротті Л. І., Текумалла П, Карле Т, Улері П, Чао Дж, Думан С, Штеффен С, Монтегіа Л, Аллен МР, запас JL, Думан Р.С., МакНіш Дж. , Schaeffer E. Індуцибельна, специфічна для мозку область специфічна експресія домінуючого негативного мутанта c-Jun у трансгенних мишах зменшує чутливість до кокаїну. Мозок Рес. 2003;970: 73-86. [PubMed]
  • Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Відмінні закономірності індукції DeltaFosB в мозку наркотичними засобами. Синапс. 2008;62: 358-369. [PMC безкоштовна стаття] [PubMed]
  • Robbe D, Alonso G, Duchamp F, Bockaert J, Manzoni OJ. Локалізація та механізми дії канабіноїдних рецепторів на глутаматергічні синапси ядра миші. J. Neurosci. 2001;21: 109-116. [PubMed]
  • Аналіз Саломона Ю. Аденілатциклази. Adv. Циклічний нуклеотид Res. 1979;10: 35-55. [PubMed]
  • Selley DE, Sim LJ, Xiao R, Li Q, Childers SR. Му-опіоїдний рецептор [35S] GTPγS-зв'язування у таламусі щурів та культивованих клітинних ліній: механізми трансдукції сигналів, що лежать в основі ефективності агоніста. Моль Фармакол. 1997;51: 87-96. [PubMed]
  • Trigo JM, Martin-Garcia E, Berrendero F, Robledo P, Maldonado R. Ендогенна опіоїдна система: поширений субстрат у наркоманії. Залежні від алкоголю препарати. 2010;108: 183-194. [PubMed]
  • Unterwald EM, Knapp C, Zukin RS. Нейроанатомічна локалізація опиоїдних рецепторів κ1 і κ2 у мозку щурів та морських свинок. Мозок Рес. 1991;562: 57-65. [PubMed]
  • Vaccarino FJ, Bloom FE, Koob GF. Блокада ядерних рецепторів опіату послаблює внутрішньовенну винагороду героїну у щура. Психофармакологія (Берл) 1985;86: 37-42. [PubMed]
  • Vigano D, Rubino T, Vaccani A, Bianchessi S, Marmorato P, Castiglioni C, Parolaro D. Молекулярні механізми, що беруть участь в асиметричній взаємодії канабіноїдної та опіоїдної систем. Психофармакологія (Берл) 2005;182: 527-536. [PubMed]
  • Захаріу V, Боланос С.А., Селлі Д.Е., Теобальд Д., Кесіді М.П., ​​Кельз М.Б., Шоу-Лучман Т, Бертон О, Сім-Селлі Л.Я., Ділеон Р.Я., Кумар А., Нестлер Е.Я. Істотну роль відіграє DeltaFosB в ядрі accumbens в дії морфіну. Nat. Neurosci. 2006;9: 205-211. [PubMed]
  • Zangen A, Solinas M, Ikemoto S, Goldberg SR, Wise RA. Два сайти мозку за винагороду канабіноїдом. J. Neurosci. 2006;26: 4901-4907. [PubMed]
  • Чжу Дж, Лу LY, Лі JG, Chen C, Лю-Chen LY. Активація агоністами клонованого каппа-опіоїдного рецептора людини посилює зв'язування [35S] GTPγS з мембранами: визначення потенцій та ефективності лігандів. J. Pharmacol. Експ. Ther. 1997;282: 676-684. [PubMed]
  • Циммер А, Вальєнт Е, Коніг М, Циммер А. М., Робледо Р, Ган Н, Вальверде О, Мальдонадо Р. Відсутність десфорних ефектів дельти -9-тетрагідроканабінолу у мишей з дефіцитом динорфіну. J. Neurosci. 2001;21: 9499-9505. [PubMed]
  • Zimmer A, Zimmer AM, Hohmann AG, Herkenham M, Bonner TI. Підвищена смертність, гіпоактивність та гіпоалгезія у нокаутованих мишей каннабіноїдів CB1. Proc. Natl. Акад. Sci. США 1999;96: 5780-5785. [PMC безкоштовна стаття] [PubMed]