PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
абстрактний
Індуковані кокаїном зміни в експресії генів викликають зміни в морфології і поведінці нейронів, які можуть спричинити залежність від кокаїну. Ми визначили істотну роль для диметилації гістонів 3 лізину 9 (H3K9) і лізиндиметилтрансферази G9a в структурованій і поведінковій пластичності, викликаної кокаїном. Повторне введення кокаїну знижувало глобальні рівні диметилювання H3K9 в nucleus accumbens. Tйого зниження метилювання гістонів було опосередковано через репресію G9a в цій області мозку, яка регулювалася індукованим кокаїном фактором транскрипції ΔFosB. Використовуючи умовний мутагенез і вірусно-опосередкований перенесення генів, ми виявили, що регуляція G9a збільшила дендритну пластичність нейронів nucleus accumbens і підвищила перевагу кокаїну, тим самим встановивши вирішальну роль метилювання гістонів у довгострокових діях кокаїну.
Вступ
Повторне опромінення кокаїну характеризується стійкими змінами в експресії генів і зміненою морфологією нейронів у ядрі accumbens (NAc), що є ключовим компонентом схеми винагороди мозку (1-2). Ремоделювання хроматину має важливе значення в аберантних змінах транскрипції в цій області мозку, що може вплинути на аспекти кокаїнової залежності (3-9). Кокаїнова регуляція структури хроматину в NAc призводить, частково, до прямих кокаїн-індукованих модифікацій ферментативного механізму хроматину, що призводить до змін ацетилювання і фосфорилювання гістонів (4, 7-9); однак роль ферментів, які контролюють метилювання гістонів, ще не досліджена.
Недавній загальнонаціональний аналіз промотора з використанням імунопреципітації хроматину, сполученого з мікрочіпами (ChIP-Chip), виявив змінені структури метилювання гистона H3 лізину 9 (H3K9) і 27 (H3K27) на специфічних промоторах гена NAc після повторного лікування кокаїном (6). Тому ми профілізували численні лізин-метилтрансферази (KMTs) і деметилази (KDMs), які, як відомо, контролюють метилювання H3K9 або H3K27 (Рис. 1A). Тільки два ферменти, G9a і GLP, демонстрували стійку регуляцію транскрипції 24 годин після повторного введення кокаїну, коли експресія обох генів була значно знижена. Оскільки G9a і GLP специфічно каталізують диметилювання H3K9 (H3K9me2), їх регулювання за допомогою кокаїну узгоджується зі зниженими глобальними рівнями euchromatic H3K9me2, що спостерігаються в цей момент часу (1B). Навпаки, глобальні рівні метилювання H3K27 залишалися незмінними при повторному впливі на кокаїн (Рис. S1 в підтримці онлайнового матеріалу). Завдяки високому рівню каталітичної активності пробірці та в природних умовах (10), ми мали намір далі дослідити функціональну значимість репресій G9a після повторного впливу кокаїну в NAc. Рівні білка G9a, подібно до рівнів його мРНК, були значно зменшені 24 годин після повторного введення кокаїну (S2). Незважаючи на те, що експресія мРНК G9a була знижена за допомогою 35% у NAc, імуногістохімічний аналіз виявив більш скромне зниження рівня 15% білка G9a, що відповідає зниженню рівня 21% H3K9me2 після повторного введення кокаїну (1B). Експресія мРНК G9a також знижувалася в цій області мозку за допомогою 20% після повторного самостійного введення кокаїну (S3).
Щоб визначити, чи корегуються зміни в евкроматичному H3K9me2 з змінами генома в експресії генів в NAc, ми використовували мікрочіповий аналіз для вивчення профілів експресії генів, викликаних випробувальною дозою кокаїну у тварин з історією попереднього опромінення кокаїном (див. Додаткові списки генів в Столи S1 – S3). Тварини, які отримували повторний кокаїн, демонстрували різко збільшену експресію гена 1 годину після виклику кокаїну в порівнянні з гострими тваринами (Рис. 1C). Це посилення експресії генів все ще відбувалося у відповідь на виклик кокаїну, отриманий після тижня 1 виведення з повторного кокаїну. Відповідно до попередніх звітів, невеликий відсоток генів (~ 10%) показали десенсибілізовані транскрипційні відповіді після повторного введення кокаїну (Рис. 1C; подивитися Таблиця S1) (5). Для безпосереднього вивчення ролі регуляції зниження G9a у посиленій експресії генів, що спостерігається після повторного кокаїну, миші отримували внутрішньо-NAc ін'єкції вірусів простого вірусу Herpes (HSV), що експресують або GFP, або повторний кокаїн, щоб визначити, чи є гіперекспресія G9a було достатньо для блокування повторного індукованого кокаїном посилення експресії генів. З набору 9 випадково вибраних генів, що демонструють підвищений рівень експресії після повторного кокаїну, ми спостерігали, що G12a значно знижує посилену експресію 9% цих генів (Таблиця S4).
Щоб ідентифікувати транскрипційні події, що опосередковують повторну індуковану кокаїном репресію експресії G9a, ми досліджували можливу роль ΔFosB, високостабільного продукту злиття безпосереднього раннього гена fosB. ΔFosB накопичується в NAc після багаторазового впливу кокаїну, де він був пов'язаний з підвищенням кокаїнової винагороди (11). ΔFosB може виступати або як активатор транскрипції, або як репресор, залежно від задіяного гена-мішені (3, 5, 6, 12). Використання біс-генетичного NSE-TA × tetOP-ΔFosB мишей, де експресія ΔFosB може бути индуцирована селективно в NAc і дорзальному стриатуме дорослих тварин (13), ми вивчили вплив експресії ΔFosB на регуляцію кокаїну H3K9me2 і KMTs в NAc. Перевитрата ΔFosB була достатньою для зниження рівнів обох H3K9me2 (1D) і вираз G9a (1E), тим самим імітуючи наслідки повторного кокаїну. На відміну від цього, ΔFosB не знижував експресію GLP в цій області мозку і не впливав на SUV39H1 і EZH2, головні триметилирующие ферменти для H3K9 і H3K27, відповідно (S4). Щоб підтвердити ці дані, використовуючи незалежну систему для переекспресії ΔFosB, дорослі миші дикого типу отримали двосторонні інтраоральні ін'єкції векторів Adeno-асоційованого вірусу (AAV), що експресують або GFP, або ΔFosB. Вірусно-опосередкована гіперекспресія ΔFosB знижувала рівень експресії G9a в цій області мозку (1E).
Таке виражене і специфічне регулювання G9a спонукало нас дослідити, чи зміна експресії G9a специфічно в нейронах NAc регулює поведінкові реакції на кокаїн. Миші Wildtype отримували внутрішньо-NAc-ін'єкції HSV-векторів, що експресують GFP або G9a, і потім аналізували з використанням незміщеної парадигми місцевих переваг кокаїну, що забезпечує непрямий показник винагороди за лікарський засіб. Надійна експресія вірусу G9a в нейронах NAc підтверджена після поведінкового тестування (Рис. 2A). Гіперэкспресія G9a значно знизила переваги кокаїну порівняно з тваринами, які перевиражали GFP (2B), а також збільшені рівні H3K9me2 у NAc (Рис. 2C). Надекспресія каталітично мертвого мутанта G9a (G9aH1093K) (14) не впливали на переваги кокаїну (2B) і не впливали на рівні H3K9me2 у цій області мозку (Рис. 2C).
Подальше вивчення ролі G9a в поведінкових ефектах кокаїну, а точніше, для імітації повторного кокаїн-індукованого придушення експресії G9a в NAc, дорослих G9afl / fl миші (14) отримували внутрішньо-NAc-ін'єкції AAV-векторів, що експресують рекомбиназу Cre або GFP в якості контролю. AAV-Cre нокдаун G9a в NAc, що підтверджено імуногістохімічно (S5), значно підвищили вплив кокаїну на експериментальні умови кондиціонування та знизили рівні H3K9me2 у NAc (2D, E). Комерційно доступний фармакологічний інгібітор G9a і GLP, BIX01294 (\ t15-16), використовували для визначення того, чи інгібування ферменту аналогічно впливає на поведінкові реакції на кокаїн. Дійсно, фармакологічне інгібування G9a і GLP значно збільшило переваги кокаїну і знизило H3K9me2 в NAc (2F, G).
Повторне введення кокаїну збільшує щільність дендритних шипів на середніх колючих нейронах NAc (17), процес, пов'язаний з функціональними змінами при збудливих глутаматергічних синапсах на ці нейрони (18-19) і сенсибілізовані поведінкові реакції на препарат (17, 20). Таким чином, ми припустили, що регуляція активності G9a в NAc шляхом повторного кокаїну може опосередковувати здатність кокаїну регулювати щільність дендритного хребта нейронів NAc. Використовуючи імунопреципітацію хроматину (ChIP) з антитілом проти G9a, ми визначили кілька передбачуваних мішеней генів G9a в NAc, кожен з яких раніше був залучений до індукованої кокаїном дендритної пластичності (Рис. 3A) (20-26). Ми виявили, що повторне введення кокаїну значно знизило зв'язування G9a, а також рівні H3K9me2 у цих промоторів генів (3B). На відміну від цього, гострий прийом кокаїну швидко набирав G9a до деяких з цих же промоторів генів, що відповідає підвищеній експресії G9a, що спостерігається в годині NAc 1 після гострої дози кокаїну (S6). Хоча зв'язування G9a у специфічних промоторах гена корелює зі змінами в його експресії, залишається неясним, чи опосередковуються подібні події зміненими глобальними рівнями G9a в NAc та / або відмінностями в наборі G9a після гострого проти повторне введення кокаїну.
На підставі регуляції G9a численними генами, пов'язаними з пластичністю, в NAc ми безпосередньо досліджували, чи достатньо підтримка експресії G9a в цій області мозку після повторного лікування кокаїном для блокування індукованої кокаїном дендритного формування хребта. Використання протоколу лікування кокаїну, продемонстрованого раніше, сприяє індукції дендритного хребта в NAc (20), ми досліджували щільність хребта у тварин, яким вводили HSV-GFP або HSV-G9a. У згоді з попередніми висновками, ми спостерігали значне збільшення щільності дендритного хребта в NAc після лікування кокаїном, ефект якого був повністю блокований гіперэкспресією G9a (Рис. 3C). Лише гіперекспресія G9a була недостатньою для зменшення щільності NAc дендритної хребта за відсутності кокаїну. Щоб доповнити ці дані, G9afl / fl миші, отримані внутрішньо-NAc-ін'єкціями HSV-Cre і щільності хребта, були кількісно визначені і порівняні з тваринами, які отримували HSV-GFP у відсутність кокаїну. Нокдаун експресії G9a значно збільшив щільність хребта на нейронах середніх комірців NAc (Рис. 3C).
Враховуючи докази того, що регуляція G9a в NAc після повторного кокаїну опосередкована ΔFosB, ми далі досліджували, чи цей фактор транскрипції також бере участь у регулюванні дендритних шипів NAc. Хоча ΔFosB раніше не був пов'язаний з такою дендритною пластичністю, деякі його цілі, включаючи субодиниці Cdk5 і NFκB, були настільки причетні (20-23), і персистуюча експресія ΔFosB в нейронах NAc корелює з підвищеною щільністю дендрити після повторного лікування кокаїном (27). По-перше, ми виявили, що індукція ΔFosB у бістрансгенних мишей у відсутності кокаїну, який знижує експресію G9a і H3K9me2 (1D, E), зниження зв'язування G9a з багатьма генами, пов'язаними з пластичністю, багато з яких також виявилися прямими цілями самого ΔFosB (3D) (3, 6). Далі ми показали, що надекспресія вірусу ΔFosB в NAc значно збільшила дендритну щільність хребта при базальних умовах, подібне до того, що спостерігається після повторного введення кокаїну (3E). І навпаки, гіперекспресія в NAc ΔJunD, домінантного негативного мутантного білка, який антагонізує транскрипційну активність ΔFosB, блокує здатність повторного кокаїну збільшувати формування дендритного хребта в NAc (Рис. 3C).
Наше спостереження, що ΔFosB регулює експресію G9a в NAc, і що ΔFosB і G9a регулюють деякі з тих же генів-мішеней, змусило нас вивчити інші взаємодії між ΔFosB і G9a. Після гострого кокаїну, коли рівні G9a були підвищені, зв'язування G9a з fosB ген збільшувався, а після повторного кокаїну, коли експресія G9a пригнічувалася, G9a зв'язувався з fosB ген зменшився (Рис. 3A). Такого зниження зв'язування G9a після повторного кокаїну не спостерігалося c-fos, де G9a зв'язування збільшується при повторному кокаїні (S7). Це узгоджується з тим, що, на відміну від fosB, c-fos пригнічується, не індукується, хронічним психостимулятором (5). Надмірна експресія ΔFosB в мишах, що мають трансгенний біс, була достатньою для істотного зниження зв'язування G9a з fosb ген (3D). Крім того, гіперекспресія G9a була достатньою для зменшення підвищеної експресії ΔFosB після повторного введення кокаїну (Таблиця S4). Ці дані свідчать про авторегуляторну петлю, при якій G9a спочатку обмежує індукцію ΔFosB гострим вживанням кокаїну. Однак, оскільки ΔFosB накопичується при повторному впливі на лікарський засіб, він пригнічує G9a і тим самим потенціює свою подальшу індукцію.
На закінчення, ми продемонстрували, що метилювання гистонового лізину в NAc критично бере участь у регуляції експресії генів нейронів у відповідь на кокаїн. Репресія G9a і H3K9me2 після повторного введення кокаїну сприяє перевазі кокаїну, частково, через активацію транскрипції численних генів, які, як відомо, регулюють аберантні форми дендритної пластичності. Отримання кращого розуміння генів, які регулюються за допомогою таких механізмів, покращить наші знання про складні біологічні основи наркоманії і може допомогти у розробці більш ефективних методів лікування залежних розладів.
Матеріали та методи
Тварини і процедури
Якщо не вказано інше, мишей розміщують від чотирьох до п'яти в клітці в колонії з циклом світлового / темного 12 (світло з 7: 00 до 7: 00 PM) при постійній температурі (23 ° C) з ad libitum доступ до води та їжі. Всі протоколи тварин були схвалені IACUC як на Південно-західному медичному центрі UT, так і на Медичній школі Mount Sinai.
Для експериментів з кокаїном [иммуногистохимитрия, вестерн-блоттінг, кількісна ПЛР (qPCR), аналіз мікрочіпів і імунопреципітація хроматину (ChIP)], використовували мишей C8BL / 10J / 57J чоловічої статі C6BL / 7J. Тварини отримували щоденні ін'єкції або "фізіологічним розчином" (6 лікування фізіологічним розчином, ip), "гострим" кокаїном (лікування 20 фізіологічним розчином + 1 лікування 7 мг / кг кокаїн-HCl, ip) або "повторним" кокаїном (лікування 20 1 мг / кг) кокаїн-HCl, ip). Мишей вбивали або в 24 годину, або в 15 годин після кінцевої обробки. Для досліджень мікрочіпів тварини отримували щоденне лікування «сольовим розчином» (лікування 14 фізіологічним розчином, ip), «гострим» кокаїном (лікування 1 фізіологічним розчином + лікування 20 мг / кг кокаїн-HCl, ip), «повторний + гострий» кокаїн ( Лікування 7 фізіологічним розчином + 8 лікування 20 мг / кг кокаїн-HCl, ip) або «повторне зняття + гострий» кокаїн (лікування 7 20 мг / кг кокаїн-HCl + лікування 7 фізіологічний розчин + 1 лікування 20 мг / кг кокаїн-HCl, ip) і були забиті 1 годину після остаточної обробки. У поведінкових експериментах мишей одноразово розміщували після операції і обробляли 10 мг / кг кокаїну-HCl, ip, як описано нижче. Для аналізу дендритного хребта та валідації мікрочіпів після інфекції HSV-GFP та HSV-G9a-GFP мишей лікували «фізіологічним розчином» (лікування 5 фізіологічним розчином, ip) або «повторним кокаїном» (5 лікування 20 мг / кг кокаїн-HCl, ip ) протягом 3 днів, оскільки цей протокол ін'єкції раніше демонстрував збільшення щільності хребта на нейронах nucleus accumbens (NAc) протягом терміну експресії трансгена вірусу простого герпесу (HSV) (HSV) (Додатковий код S1). Мишей, що використовувалися для аналізу дендритного хребта, забивали 4 годин після останньої обробки.
Щоб індукувати локальну делецію транскрипту G9a, обмеженого нейронами NAc, ми використовували мутантних мишей, гомозиготних для флокезированного алелю G9a, які були детально описані в іншому місці (S2). Cre-індукована рекомбінація продукує екзон 22 до сплайсингу 25 поза рамки, що призводить до безглуздого розпаду мутованого транскрипту. Ми використовували G9a мишей, які повністю були перекреслені до мишей C57BL / 6J. Мишей стеротаксично вводили в NAc з Адено-асоційованим вірусом (AAV) векторами (серотип 2), що експресують GFP або Cre-GFP між віком 7 і 10 тижнів. Іммуногістохімічний аналіз використовували для перевірки ефективності Cre-опосередкованої рекомбінації (див Додаткова Рис. S5). Ми використовували AAV ін'єктовані тварини 21 днів після операції, тому що рекомбінація у G9a мишей, які були флоксированними, була стабільною і максимальною в цей час, відповідно до опублікованих звітів (S3-S4). Експерименти з гіперекспресією G9a і ΔJunD аналогічно проводили з використанням векторів вірусу HSV, що експресують або GFP, дикий тип G9a-GFP, каталітично мертвий G9aH1093K-GFP або ΔJunD-GFP (див. S2 для деталей щодо розробки конструкцій G9a). Мишей з експресією HSV використовували 3 днів після операції, оскільки гіперекспресія була максимальною в цей момент часу, як спостерігається за допомогою імуногістохімії. Внаслідок перехідної природи експресії HSV і значно більш стабільного характеру експресії AAV, HSV-вектори використовувалися в експериментах, що вимагали швидкої, короткочасної експресії трансгену, тоді як AAV-вектори використовувалися в експериментах, що вимагали тривалих періодів експресії трансгену. У великих попередніх дослідженнях було показано, що обидва вектори інфікують лише тіла нейрональних клітин в області ін'єкційного мозку без будь-яких інфекцій афферентних або еферентних нейронів.
Для поведінкових експериментів з використанням фармакологічного інгібітора G9a / GLP, BIX01294 (25 ng / мкл), мишей стеротаксично імплантують двома підшкірними міні-насосами, а також двосторонніми канюлями керівництва в NAc. Міні-насоси активували 12 годин перед імплантацією, ініціюючи безперервну доставку (0.25 мкл / год) або носія (5 гідроксипропіл β-циклодекстрин) або препарат протягом 14 днів, протягом яких проводили поведінкові оцінки.
Для експериментів з переекспресією ΔFosB [вестерн-блот, qPCR, і ChIP], чоловічий бітсгенний NSE-TA × tetOP-ΔFosB використовували мишей (10 тиждень), за яким у відсутності похідного тетрацикліну доксицикліну (8 тижнями доксицикліну), тварини демонстрували міцну стриатинову обмежену конститутивну експресію ΔFosB (S5). Перена експресію ΔFosB у цих мишей підтверджували за допомогою qPCR. Щоб підтвердити висновки за допомогою NSE-TA × tetOP-ΔFosB миші, дикого типу 8-тижневих C57BL / 6J самців мишей були стеротаксично вводяться внутрішньо-NAc з AAV-векторами, що експресують або GFP, або ΔFosB-GFP. AAV-вектори використовувалися в даному випадку для забезпечення максимальної експресії ΔFosB на 8 тижнів після операції, що дозволяє здійснювати пряме порівняння між вірусно інфікованими і біс-трансгенними мишами ΔFosB, що перенапружують. Надекспресія вірусу була підтверджена за допомогою qPCR у 8 тижнях після операції (штампи 15-калібрувальні NAc були розсічені під місцем ін'єкції). Миші AAV-GFP і AAV-ΔFosB-GFP, які не використовувалися для qPCR, лікували фізіологічним розчином (лікування 14 фізіологічним розчином, ip) або повторним кокаїном (14 лікування 30 мг / кг кокаїн-HCl, ip), починаючи з 6 тижнів після операція. 4 днів після остаточної обробки, мозок фіксувався з 4% параформальдегідом, секціонований на вибратоме і використовувався для аналізу дендритного хребта.
Вестерн-блот-аналіз
Штампи NAc калібру 14 були взяті з корональних зрізів 1 мм, отриманих з використанням матриці головного мозку миші з нержавіючої сталі, і були оброблені ультразвуком у буфері для лізису ХНУМХ M HEPES (1% SDS), що містять інгібітори протеази і фосфатази. 1-Зразки 30 мкг загального білка електрофорезували на гелях 18% SDS. Білки переносили на мембрани PVDF і інкубували або з анти-H3K9me2 (мишачим моноклональним, 1: 500), анти-β-тубулином (мишачим моноклональним, 1: 60,000), анти-тотальним гистоном H3 (кроляча поліклональна, 1: 5,000), анти-GFP (використовується для верифікації рівної вірусної експресії в перфорованій тканині) (поліклональні кролики, 1: 1000), анти-H3K27me3 (поліклональні кролики, 1: 500) або анти-актинові антитіла (мишачі моноклональні, 1: 60,000) протягом ночі 4 ° C (всі мембрани блокувалися в молоці 5% або 5% альбуміну бичачої сироватки). Мембрани потім інкубували з міченими пероксидазою вторинними антитілами (1: 15,000-1: 60,000 залежно від використовуваного первинного антитіла) і смуги візуалізували за допомогою субстрату SuperSignal West Dura. Смуги кількісно визначали за допомогою програм NIH Image J і смуги H3K9me2 нормалізували або до актину, або до β-тубуліну, і до сумарного гистона H3 для контролю за рівною навантаженням. Повторний кокаїн не впливав на рівні актину (S8) або сумарне гістоне 3 (S1) в NAc. Крім того, інфекція HSV-G9a-GFP та HSV-G9aH1093K-GFP не впливала на загальний рівень β-тубуліну в NAc (S8).
Імуногістохімія
Мишей седировали летальною дозою хлоралгідрату і перфузировали 4% параформальдегідом перед тим, як аналізувати за допомогою одноразової або подвійної імуногістохімії, як описано раніше (S6). Коротко, після фіксованого мозку інкубували при кімнатній температурі протягом ночі у сахарозі 30%, перш ніж розділити їх на 35 мкм (мозок, використаний для аналізу дендритного хребта, розділяли на вібратомі на секціях 100 мкм у відсутності 30% сахарози). Вільно плаваючі ділянки NAc промивали 1X PBS, блокували (3% нормальної сироватки осла, 0.1% tritonX, 1X PBS) і пізніше інкубували з анти-GFP (курячий поліклональ, 1: 8000) та / або анти-G9a (поліклональні кролики) , 1: 500) антитіла в блокуючому розчині. Зрізи, проаналізовані на дендритні шипи, інкубували з кролячим поліклональним анти-GFP антитілом при 1: 200. Після інкубації протягом ночі ділянки NAc промивали 3 раз для 10 хвилин з 1X PBS, з подальшою інкубацією з Cy2 та / або Cy3 флуоресцентно-пов'язаними вторинними антитілами в блокувальному розчині 1X PBS протягом годин 2. Секції, що використовуються для морфологічних досліджень, інкубували у вторинних антитілах протягом ночі при кімнатній температурі. Ядерне спільне фарбування було досягнуто шляхом інкубування ділянок в 1X PBS, що містять DAPI (1: 50,000) протягом 10 хвилин. Зразки знову промивали, після чого проводять дегідратацію етанолу і кріплення з DPX. Всі зрізи знімали за допомогою конфокальної мікроскопії.
Виділення РНК і qPCR
Двосторонні пуансони NAc 14-го калібру гомогенізували в Тризолі та обробляли відповідно до інструкцій виробника. РНК очищали колонками RNAesy Micro, і спектроскопія підтвердила, що раціони РНК 260/280 та 260/230 були> 1.8. Потім РНК транскрибували зворотним шляхом за допомогою набору Bio-Rad iScript. кДНК визначали кількісно за допомогою qPCR, використовуючи SYBR Green. Кожну реакцію проводили у двох примірниках або в трьох примірниках та аналізували за методом ΔΔCt, як описано раніше, використовуючи гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназу (GAPDH) як контроль нормалізації (S7). Подивитися Додаткова таблиця S5 для послідовностей праймерів мРНК.
Аналіз мікрочіпів ДНК
Чотири групи (3 незалежні біологічні реплікати на групу) були використані для дослідження мікрочіпів, що складали мікрочипи 12. 1 годину після останньої ін'єкції кокаїну, тварин швидко обезголовлювали і мізки видаляли і поміщали на лід. Диссекції NAc були взяті з використанням ігольчастого пуансона 15 і швидко були заморожені на сухому льоду до вилучення РНК. Двосторонні штампи об'єднували з чотирьох тварин на кожну повторну, загальною кількістю мишей 12 на групу. Виділення РНК, обробка мікрочіпів і аналіз даних виконували, як описано раніше (S8). Коротко, РНК виділяли та очищали, як описано вище, і перевіряли її якість за допомогою біоаналізатора Agilent. Зворотну транскрипцію, ампліфікацію, мічення та гібридизацію до масивів Illumina MouseWG-6 v2.0 проводили із застосуванням стандартних процедур ядром мікрочипів UT Southwestern. Сирі дані віднімали у фоновому режимі та нормалізували квантилі за допомогою програмного забезпечення Beadstudio. Нормалізовані дані аналізували за допомогою програмного забезпечення GeneSpring, а генерували списки, використовуючи критерії значимості 1.3-кратного відсікання змін у поєднанні з нестримним граничним значенням p <0.05.
Ми зберігаємо високий ступінь довіри до цих даних з кількох причин. По-перше, всі тварини були оброблені, оброблені і вбиті одночасно, при тих же умовах. Крім того, всю РНК і обробку масиву виконували одночасно. По-друге, ми виконали триразові масиви та об'єднали декілька тварин на зразок масиву, тим самим мінімізуючи відмінності через індивідуальну мінливість та збільшення статистичної потужності (S9). По-третє, критерії аналізу даних, які використовуються для нашого дослідження, рекомендовані проектом з контролю якості MicroArray, оскільки ці критерії були підтверджені, щоб забезпечити високий ступінь відтворюваності міжвузля та відтворюваності між і внутрішньоплатформенним (S10-S11).
Побудова вірусних векторів
Через обмеження розміру вставки вірусного вектора, кодують послідовності G9a (G9a) або каталітично мертвого G9a (G9aH1093K) субдискретизировали в бицистронную плазміду p1005 + HSV, що експресує GFP під контролем промотора раннього цитомегаловірусу людини (CMV) (G9a розмір вставки становив ~ 3.96 kb, що перевищує максимальний розмір вставки для AAV-2 векторів). Промоутер IE4 / 5 запускає вираз G9a. Фрагменти субклонировали в бицистронную плазміду p1005 + HSV через тугі кінцеві лігації з обробленими Klenow PmeI і EcoRI перетравленим G9a (з pcDNA3.1) і CX, обробленим p1005 + після перетравлення EcoRI. Для продукування HSV-ΔJunD-GFP кодує послідовність ΔJunD, фланкированной сайтами рестрикції EcoRI, генерували за допомогою ПЛР з використанням праймерних олігонуклеотидів, що містять сайт EcoRI. Потім продукт ПЛР лігувати в сайт EcoRI вектора p1005 +. Локальна експресія Cre-рекомбинази в нейронах NAc досягалася за допомогою вірусно-опосередкованої доставки генів з використанням AAV-вектора, як описано (S12). GFP або N-кінцеве злиття GFP з Cre субклонировали в рекомбінантний вектор AAV-2, що містить промотор CMV, з послідовністю акцептора донора зрощування і сигналом полиаденилирования. Всі векторні інсерції були підтверджені дидезокси-секвенуванням. Вірусні вектори отримували з використанням методу потрійної трансфекції, без допомоги, як описано раніше (S13). Очищений вірус зберігали при -80 ° C. Якість вірусу оцінювали за інфекційним титром, оціненим у клітинах HEK293. Віруси AAV-ΔFosB-GFP отримували аналогічно. Для HSV-Cre, експресія Cre була обумовлена промотором IRES, на відміну від промотору IE4 / 5, з метою мінімізації експресії Cre і запобігання нейрональної токсичності (див. S14 для вірусної конструкції). У всіх випадках гіперэкспресія вірусу була підтверджена пробірці та у природніх умовах, за допомогою qPCR, і віруси були імуногістохімічно підтверджені для відображення NAc-обмеженої експресії після операції.
Стереотаксична хірургія
Під анестезією з кетаміном (100 мг / кг) / ксилазин (10 мг / кг) миші поміщали в стереотаксичний інструмент малого тварини, і поверхню черепа виявляли. Тридцять три шприцеві голки були використані для двостороннього вливання 0.5 мкл вірусу в NAc під кутом 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) зі швидкістю 0.1 мкл / хв. Тваринам, які отримували ін'єкції HSV, дозволяли відновлюватися протягом 2 днів після операції, тоді як мишам, що використовувалися для поведінкового тестування, отримували вектори AAV, дозволяли відновлюватися протягом 20 днів перед тим, як піддаватися кондиціонуванню. Ці часи узгоджуються з періодами максимальної експресії трансгену, опосередкованої вірусом, для двох векторів. Для інфузій BIX01294 кожен з двох міні-насосів розташовувався підшкірно на спині миші. Розміщення канюлей досягалися шляхом буріння двох маленьких черепних отворів над NAc і шляхом доставки канюлі з брегми (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4). Мишам дозволяли відновитися після операції 4 до 5 днів перед початком процедури кондиціонування місця кокаїну, як описано нижче.
Умовні переваги місця
Процедуру кондиціонування місця проводили, як описано раніше, з наступними модифікаціями (S7). Коротко кажучи, через 3 дні після внутрішньо NAc інфузій HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP або HSV-GFP мишей поміщали в кондиціонуючі камери, які складаються з трьох різних середовищ. Мишей, які продемонстрували значну перевагу будь-якій з двох кондиціонуючих камер, виключили з дослідження (<10% усіх тварин). Потім групи кондиціонування були збалансовані з урахуванням будь-якого упередження камери, яке все ще може існувати. На наступні дні тваринам вводили фізіологічний розчин і утримували в одній камері вдень на 30 хвилин, а потім вводили кокаїн (10 мг / кг, в / в) і утримували протягом 30 хвилин у другій камері ввечері протягом 2 днів (дві сольовий розчин і дві кокаїнові пари). У день тесту мишей знову поміщали в апарат без обробки на 20 хвилин і тестували, щоб оцінити, якій стороні вони віддають перевагу. Реакції опорно-рухового апарату на кокаїн оцінювали за допомогою розривів променів у спарених кокаїном камерах для забезпечення ефективності лікування наркотиками. Для експериментів AAV та BIX01294 CPP використовували дещо модифікований протокол. Тваринам знову вводили або фізіологічний розчин, або кокаїн (10 мг / кг, внутрішньовенно) і обмежувались у певних камерах протягом 30-хвилинних сеансів, але замість цього проводили кондиціонування лише один раз на день протягом 4 днів, після чого проводили тест на 5-й день (тварин кондиціонували ввечері і кондиціонуючі процедури чергували). Для всіх груп оцінювали базовий рух у відповідь на фізіологічний розчин, щоб переконатись, що лікування вірусів або інгібіторів не впливає на рух.
Внутрішньовенне самоврядування кокаїну
Були отримані самці підлітків щурів Long-Evans, які зважували 230 – 250 g на початку експерименту. Вони розміщувалися в середовищі з регульованою вологістю і температурою на зворотному циклі світлового / темрявого 12 (світло вимикається при 9: 00 am) ad libitum доступ до їжі та води. Щурам давали можливість акліматизуватися в їхньому новому середовищі і обробляли щодня протягом 1 тиждень до початку експерименту. Всі процедури були проведені відповідно до Настанови Національного інституту охорони здоров'я для догляду та використання лабораторних тварин і були схвалені Комітетом з догляду та використання тварин у горі Сінай. Обладнання самоуправління було оснащене інфрачервоними променями для вимірювання поведінки рухового апарату. Самостійне введення здійснювалося, як описано раніше (S15-S16) з катетерами, імплантованими в праву яремну вену під анестезією ізофлураном (2.4–2.7%). Катетери промивали 0.1 мл сольового розчину, що містить 10 U гепарину та ампіциліну (50 мг / кг). Після тижня відновлення після хірургічного втручання розпочалось навчання самоврядуванню під час темної фази циклу світло / темно. Тваринам дозволявся 3-годинний щоденний доступ до кокаїну (0.75 мг / кг / інфузія) за графіком посилення із фіксованим співвідношенням 1 (FR1), де 1 активний важільний прес приводив до одноразової інфузії препарату. Щури стабілізували споживання кокаїну через 6 днів (<15% коливання частоти відповіді протягом 3 днів поспіль, принаймні 75% відповідали на посилений важіль). Через 24 години після останнього сеансу самоврядування щурів швидко обезголовили, мозок швидко видалили та обробили для виділення РНК та qPCR.
Хроматинова імунопреципітація (ChIP)
Свіжі пуансони NAc були зшиті формальдегідом і підготовлені для ЧИП, як описано раніше (S17-S18) з незначними змінами. Коротко, штампи NAc на копії 4 14 на одну тварину (тварини 5, об'єднані на зразок) збирали, зшивали з 1% формальдегідом і гасили гліцином 2 M перед заморожуванням при -80 ° C. 1 день до обробки ультразвуком зразка, овець анти-кролика / миша (залежно від осадження антитіла) магнітні кульки IgG були приготовані інкубуванням відповідних магнітних кульок або з анти-G9a (кролячий поліклональний сорт ChIP) або анти-H3K9me2 (мишачий моноклональний ChIP клас) антитіла протягом ночі при 4 ° C при постійному обертанні в блочному розчині. Обробка ультразвуком тканин і зсув хроматину здійснювали, як описано раніше (S17). Після обробки ультразвуком рівні концентрації хроматину переносили на нові пробірки і ~ 5% кінцевих продуктів зберігали для того, щоб слугувати контрольним входом. Після ретельного промивання і ресуспендирования кон'югованих сумішей бісеру / антитіла до кожного зразка хроматину додавали рівні об'єми сумішей антитіл / бісер (~ 7.5 мкг антитіло / зразок) і інкубували протягом ~ 16 годин при постійному обертанні при 4 ° C. Зразки додатково промивали і зворотно зшивали на 65 ° C протягом ночі перед очищенням ДНК з використанням набору для очищення PCR. Після очищення ДНК зразки піддавали qPCR і нормалізували на відповідні "вхідні" контролі, як описано раніше (S17). Нормальні імунопреципітації IgG миші з використанням мишачого поліклонального анти-IgG антитіла також проводили для контролю для відповідного збагачення ампліфікації сигналу. Аденінфосфорибозилтрансферазу (АПРТ) використовували в якості негативного контролю для експериментів з надмірною експресією кокаїну і ΔFosB. Подивитися Додаткова таблиця S5 для промоторних послідовностей праймера.
Аналіз дендритного хребта
Для вивчення ролі G9a в регуляції морфології нейронів in vivo ми використовували методи, описані раніше з такими модифікаціями (S1). Три дні після ін'єкції HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (всі віруси використовувалися у мишей дикого типу C57Bl / 6J) або HSV-Cre-GFP (використовували в G9afl / fl мишей), коли вірусна експресія була максимальною, мишей перфузировали, мозок криопротектировали і пізніше секціонували на 100 мкМ на вибратоме. Зрізи потім імуноокрашивали, використовуючи антитіло проти GFP, як описано вище (див. Імуногістохімія). Щоб оцінити вплив гіперэкспресії G9a та нокауту на номери хребта, а також вплив надекспресії ΔJunD, ми виміряли кількість шипиків приблизно на невритах 1 – 2 на нейрон, що дорівнює щонайменше 299 μm вторинних дендритів з GFP-експресуючого NAc середовища. колючі нейрони (MSN). Враховуючи, що MSN є морфологічно відмінними від інших популяцій нейронів у NAc, а також попередні повідомлення, які вказують, що HSV в першу чергу заражає DARPP-32, що експресують нейрони в цій області мозку (S19), ми впевнені, що в цих дослідженнях MSN оцінювалися виключно. Для кожної тварини ми досліджували нейрони 6 – 8 у тварин 3 – 4 на групу (групи 7), після чого було отримано середнє значення для кожної тварини для статистичного аналізу. Експерименти, призначені для вивчення впливу надекспресії ΔFosB на щільність хребта NAc, були проведені аналогічно описаному вище, за винятком того, що AAV-вектори використовувалися для експресії GFP або ΔFosB-GFP протягом тривалих періодів часу (8 тижнів). Всі зображення ВПГ були взяті з використанням конфокального мікроскопа з нафтовим зануренням 100X (AAV-зображення були захоплені з використанням нафтового занурення 63X). Зображення були отримані з набором отворів у довільній одиниці 1 і розміром кадру 1024 × 1024. Дендритну довжину вимірювали за допомогою програмного забезпечення NIH Image J, і номери хребта підраховували сліпим первинним експериментатором, оскільки слайди кодували до експериментального сканування. Розраховано середню кількість шипів на 10 мкм дендриту.
Статистичний аналіз
Одно- та двосторонні ANOVAs були проведені для визначення значущості для кондиційного місця перевагу і дендритного аналізу хребта з більш ніж двох груп. Т-тести Стьюдента використовували для інших порівнянь, включаючи qPCR, вестерн-блот, аналіз дендритного хребта, порівнюючи HSV-GFP з HSV-Cre в G9afl / fl мишей, аналізи мікрочипів (див. вище) та експерименти з імунопреципітацією хроматину. Заплановані студентські t-тести використовувались після двостороннього ANOVA-аналізу дендритної щільності хребта після надмірної експресії ΔFosB з підтвердженням значущих основних ефектів лікування наркотиками та вірусу. Усі значення, включені до легенд рисунків, представляють середнє значення ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Детальний статистичний аналіз для Фіг. 1-3 в основному тексті наведені в: Детальна цифра Легенди, що включають статистику.
Виноски
Я підтверджую, що жоден з матеріалів, що входять до рукопису, не має права Істотна роль гістону метилтрансферази G9a у пластиці, індукованій кокаїном раніше були опубліковані або розглядаються в іншому місці, в тому числі в Інтернеті.
Всі роботи, пов'язані з використанням тварин, проводилися відповідно до інституційних та IACUC керівних принципів як на Університеті Техаського південно-західного медичного центру, так і на Медичній школі Mount Sinai.
Посилання та примітки
;