PLoS Один. 2013 листопада 25; 8 (11): e81245. doi: 10.1371 / journal.pone.0081245.
Nishijima T, Kawakami M, Кіта I.
Source
Лабораторія поведінкової фізіології, Вища школа наук про здоров'я людини, Токіоський столичний університет, Токіо, Японія.
абстрактний
Фізичні вправи покращують численні аспекти функції гіпокампа. Відповідно до уявлення про те, що активність нейронів є ключовою для сприяння функціям нейронів, попередня література постійно демонструє, що гострі прийоми фізичних вправ викликають активацію нейрона в гіпокампі. Повторні активізуючі стимули призводять до накопичення фактора транскрипції ΔFosB, який опосередковує тривалу нейронну пластичність.
У цьому дослідженні ми перевірили гіпотезу, що тривалий добровільний біг на колесі викликає експресію ΔFosB у гіпокампі, та вивчили будь-які потенційні особливості регіону у підполях гіпокампа уздовж дорсо-вентральної осі. Мишей C57BL / 6 мишей містили з біговим колесом або без нього протягом 4 тижнів. Тривалий пробіг колеса значно підвищив імунореактивність FosB / ΔFosB у всіх вимірюваних гіппокампальних областях (тобто в підполях DG, CA1 та CA3 як спинного, так і вентрального гіпокампу). Результати підтвердили, що індукована колесом експресія регіональної експресії імунореактивності FosB / ΔFosB у корі, що дозволяє припустити, що рівномірне збільшення FosB / ΔFosB у гіпокампі не є неспецифічним наслідком бігу. Дані Вестерн-блот вказували на те, що підвищена імунореактивність гіпокампа FosB / ΔFosB в основному пояснюється підвищенням ΔFosB. Ці результати говорять про те, що тривалі фізичні вправи є потужним пусковим механізмом для індукції ΔFosB у всьому гіпокампі, що пояснює, чому фізичні вправи можуть покращити залежні як дорсальні, так і вентральні гіпокампу. Цікаво, що ми виявили, що експресія FosB / ΔFosB в ГД позитивно корелювалась із кількістю нейронів з подвійним кортином-імунореактивними (тобто незрілими).
Хоча механізми, за допомогою яких ΔFosB опосередковує нейрогенез, спричинений фізичними вправами, все ще не визначені, ці дані означають, що нейрогенез, спричинений фізичними вправами, залежить як мінімум від діяльності. У сукупності наші сучасні результати говорять про те, що ΔFosB - це нова молекулярна мішень, яка бере участь у регулюванні індукованої фізичними вправами пластичності гіпокампа.
Вступ
Вправа надає різноманітні переваги молекулярному, структурному та функціональному аспектам гіпокампу у гризунів [1,2], деякі з яких були підтримані дослідженнями на людях [3,4]. Однак механізми, що лежать в основі змін, спричинених фізичними вправами, зміни пластичності гіпокампа недостатньо вивчені. Попередня література послідовно демонструє, що фізичні вправи викликають активацію нейронів гіпокампа у гризунів. Імуногістохімічні дослідження з використанням c-Fos, маркера транзиторної нейрональної активації, продемонстрували, що як примусовий, так і добровільний біг збільшує експресію c-Fos у зубчастій звивині (DG), CA1 та CA3 підполях гіпокампу гризуна [5-7]. Крім того, попереднє дослідження з використанням лазерно-допплерівської флометрії (LDF) показало, що м'яка бігова доріжка збільшує регіональний мозковий кровотік (rCBF), альтернативний маркер активації нейронів, у підполі CA1 у щурів [8]. Імуногістохімічні дослідження дозволяють отримати детальний аналіз, що стосується конкретного регіону, після того, як фізичні вправи припиняються, тоді як LDF дозволяє здійснювати моніторинг rCBF в режимі реального часу під час тренування. Незважаючи на переваги та обмеження кожного дослідження, ці дослідження аналогічно продемонстрували вплив гострих навантажень на активність нейронів гіпокампи. Ці результати говорять про механізм, згідно з яким тривалі регулярні фізичні вправи сприяють пластичності гіпокампа, багаторазово викликаючи активацію нейронів [9].
Коефіцієнт транскрипції ΔFosB, усічена ізоформа зрощення FosB повної довжини, індукується різними типами повторних подразників у конкретних областях мозку, де він поступово накопичується через свою унікальну стабільність (період напіввиведення тижнів) [10-12]. Зростаючий доказ свідчить про те, що підвищений рівень ΔFosB опосередковує тривалу нейронну та поведінкову пластичність, пов'язану з певними подразниками [11,13]. Наприклад, хронічне вживання таких наркотиків, як кокаїн та морфін, зазвичай збільшує експресію ΔFosB в ядрах ядер, що є одним з молекулярних механізмів, що лежать в основі підвищеної чутливості до цих наркотиків [11,14,15]. Sяк тільки до інших стимулів, включаючи дієту з високим вмістом жиру та сексуальний досвід [16,17], лтривалість добровільного бігу на колесі також підвищила імунореактивність FosB / ΔFosB у ядрах щурів, що дозволяє припустити, що добровільний біг є природною винагородою для гризунів [18,19]. Однак, наскільки нам відомо, жодна література не досліджувала, чи багаторазовий вплив фізичних вправ викликає експресію ΔFosB у гіпокампі. Оскільки вправа запускає нейрональну активацію в гіпокампі, ми припустили, що тривалий добровільний біг на колесі також викликає експресію ΔFosB у гіпокампі. Хоча точні механізми, за допомогою яких ΔFosB регулює пластичність гіпокампа, залишаються невизначеними, дослідження показали, що мишам не вистачає fosB ген виявляють порушення нейрогенезу гіпокампа і посилення депресивної поведінки [20,21]. IАле, як відомо, фізичні вправи посилюють нейрогенез і мають антидепресантні властивості [22-25]. IЯкщо наша гіпотеза є правильною, ΔFosB буде новою потенційною молекулярною цільовою опосередкованою пластикою гіпокампа, спричиненою фізичними вправами.
Гіпокамп має анатомічний та функціональний градієнт уздовж його поздовжньої (дорзо-вентральної) осі [26]. Спинний гіпокамп відіграє ключову роль у просторовому навчанні та пам’яті [27,28], тоді як вентральний гіпокамп переважно бере участь у регулюванні емоційної поведінки [29,30]. Крім того, дослідження показали, що фізіологічні стимули індукують різні структури експресії c-Fos у спинному та вентральному відділах гіпокампу [31-33]. Оскільки вправа покращує обидва спинні [34-37] та функції вентрального гіпокампу [24,25,38], важливо вивчити, чи спричиняє тривалий добровільний біг спричинення специфічної для регіону експресії ΔFosB в гіпокампі.
Основна гіпотеза цього дослідження полягала в тому, що тривалий добровільний біг колеса може викликати експресію ΔFosB в гіпокампі миші. Ця гіпотеза була досліджена імуногістохімією FosB / ΔFosB в дорсальному та вентральному підполях гіпокампа, DG, CA1 та CA3, з додатковим акцентом на виявленні специфічної для регіону індукції. Результати були підтверджені вестерн-блоттінгом, який використовувався для ідентифікації ізоформи fosB генні продукти, індуковані в гіпокампі. Ми також вивчали кору на предмет специфічної для регіону індукції FosB / ΔFosB, щоб виключити можливість тривалого фізичного навантаження неспецифічно підвищеної імунореактивності FosB / ΔFosB в мозку. Нарешті, кореляційна зв'язок між експресією FosB / ΔFosB та нейрогенезом була досліджена як перший крок у пошуку функціональних наслідків індукції, викликаної фізичними вправами, для регулювання пластичності гіпокампа.
Матеріали та методи
1: Заява про тварин та етику
Двадцять мишей C57BL / 6 (вік 8 тижнів) були придбані у комерційного селекціонера (SLC, Shizuoka, Японія). Десять мишей використовували для експерименту 1, а інші десять для експерименту 2. Мишей розміщували в контрольованих умовах температури (22 – 24 ° C) та світла (12 / 12-год цикл світла / темнота, світло в 0500), і їм забезпечували їжу та воду ad libitum. Усі експериментальні процедури були затверджені Комітетом з експериментальної етики на тваринах Токійського столичного університету.
У кожному експерименті після прибуття мишей були випадковим чином віднесені або до контрольної групи (Control, n = 5), або до запущеної групи (Runner, n = 5). Протягом першого тижня всіх мишей розміщували у стандартних пластикових клітках у групах (5 миші / клітка) для початкової акліматизації. Потім мишей Runner перевели в клітку, обладнану ходовим колесом (ENV-046, Med Associate Inc., Georgia, VT, США). Тому що, як відомо, соціальна ізоляція пригнічує нейрогенез, спричинений фізичними вправами, у гіпокампі [39], Мишей Runner розміщували у вигляді групи (5 мишей / клітку) протягом додаткових 4 тижнів. Кількість обертів коліс фіксували щоранку, а масу тіла (г) вимірювали щотижня.
2: Експеримент 1. Імуногістохімічне дослідження експресії FosB / ΔFosB та нейрогенез гіпокампи
2.1: Перфузія та обробка тканин
Вранці (0900 – 1100) після останнього дня періоду запуску мишей глибоко знеболили пентобарбіталом натрію та транскардіально просякли холодним сольовим розчином. Головний мозок був швидко видалений і після фіксації протягом ночі в 4% параформальдегіду в фізіологічному розчині, захищеному фосфатом 0.1 M (PBS, pH 7.4). Потім мозок кріозахищений 30% сахарозою в PBS і заморожують до подальшої обробки. Корональні відділи головного мозку (40 мкм) півсфери були отримані за допомогою заморожуючого мікротома та зібрані в PBS з 0.01% азидом натрію.
2.2: Імуногістохімія
Один з шести серій секцій було вибрано випадковим чином для імунофарбування FosB / ΔFosB. Суміжний ряд використовувався для маркування дубкортину (DCX), маркера незрілих нейронів, перевіреного для оцінки нейрогенезу [40,41]. Після гасіння ендогенної активності пероксидази 1% H2O2 у PBS вільно плаваючі ділянки попередньо інкубували блокуючим розчином, що містить нормальну кінську сироватку 10% у PBS протягом 2 год. Після полоскань в PBS, зрізи інкубували з кролячим поліклональним антитілом пан-FosB (1: 1000, sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, США), розведеним у PBS з 0.5% Triton X-100 та 0.5% BSA (PBST -BSA) протягом 24 год при 4 ° C. Іншу серію секцій інкубували з козячим поліклональним антитілом DCX (1: 500, sc-8066, Santa Cruz) у PBST-BSA протягом 48 год при температурі 4 ° C. Розрізи далі інкубували з відповідним біотінільованим вторинним антитілом (анти-кролячий IgG, 1: 1000, AP182B; анти-козячий IgG, 1: 1000, AP180B, обидва антитіла EMD Millipore, Billerica, MA, США) у PBST-BSA протягом 2 год при кімнатній температурі. Потім зрізи обробляли комплексом авідін-біотин-пероксидази (Vectastain ABC peroxidase kit, Vector Laboratories Inc, Берлінгем, Каліфорнія, США) протягом 90 хв, дотримуючись інструкцій виробника. Нарешті візуалізували антигени за допомогою 0.02% 3,3-диаминобензидина (DAB) у 0.1 M Tris-HCl (pH 7.6), що містить 0.01% H2O2. Для імунофарбування FosB / ΔFosB реакцію посилювали сульфатом амонію нікелю. Для фарбування DCX клітинні ядра протиставляли фарбуванню Nissl. Секції були встановлені на покриті желатином гірки та були розміщені кришки.
2.3: Кількісне визначення імунореактивності FosB / ΔFosB з використанням порогу зображення
Антитіло пан-FosB, використовуване в цьому дослідженні, було піднято проти внутрішньої області, спільної між N-кінцевою областю FosB та ΔFosB, так що не може розрізняти дві ізоформи. Тому імунофарбовані структури були описані як імунореактивні ядра FosB / ΔFosB (FosB / ΔFosB-ir). Для неупередженого сліпого кількісного визначення слайди перед кодуванням кодували. Атлас мозку миші [42] було використано для визначення розташування таких регіонів, що цікавлять (ROI): гранулярний клітинний шар (GCL) DG (секції 3), пірамідальний клітинний шар CA1 (секції 3) та CA3 (секції 2 – 3) у спинному гіпокампі (закритий до -2.2 мм від брегми); DG (секції 2), CA1 (секції 2) і CA3 (секції 2) у вентральному гіпокампі (закритий на -3.4 мм від брегми) (малюнок 4, зліва). Каудальні відділи містять як дорсальну, так і вентральну частини гіпокампу, але вентральна частина була цільовою. У ГД лопатки для протипірамідальної (DGsp) та інфрапірамідальної (DGip) аналізували окремо. Моторна кора (секції 2 – 3, закрита на -0.6 мм від брегми), соматосенсорна кора ствола (секції 2 – 3, закрита до -0.6 мм від брегми), візуальна кора (секції 3, закрита на -2.9 мм від мм також були проаналізовані слухова кора (секції 3, закриті до -2.9 мм від брегми) та нюхова цибулина (секції 3, закриті до + 4.3 мм від брегми) (малюнок 6, зліва).
Цифрові зображення (пікселі 2070 × 1548) кожного ROI були зроблені за допомогою оптичного мікроскопа (BX-51, Olympus, Токіо, Японія), оснащеного CCD камерою (DP-73, Olympus) та програмним забезпеченням для візуалізації (cellSens, Olympus). об'єктивне збільшення кришталиків становило 10 × для ROI гіпокампа і 4 × для коркових ROI. З метою виявлення імунореактивності FosB / ΔFosB від помірної до сильної (Рисунок 1D – G), використовуючи заздалегідь кілька розділів, обидва параметри зйомки зображення (інтенсивність світла, розмір зупинки поля, час експозиції та баланс білого) та порогові рівні для кожного з RGB-компонентів були оптимізовані для ROI гіпокампа та корка. Наступний аналіз потім проводили в оптимізованих умовах (1). ROI були обрані полігоном неправильної форми (Малюнок 1A, B) (2). Зображення було порогове, що перетворило ядра FosB / ΔFosB-ir у червоний колір (Малюнок 1C-G) (3). Потім% ROI автоматично розраховувались так:% ROI = (перетворена площа (червоним кольором) / загальна площа ROI) × 100.
Для підтвердження цього порогового аналізу зображення області 20 були випадковим чином обрані з різних областей мозку з різними розмірами регіонів. Крім кількісного визначення порогу зображення, кількість ядер FosB / ΔFosB-ir в межах вибраних областей підраховували вручну, а щільність ядер FosB / ΔFosB-ir отримували шляхом ділення кількості ядер FosB / ΔFosB-ir на вимірювані площа (мм)2).
2.4: кількісне визначення DCX-ir незрілих нейронів у зубчастій звивині
Незрілі нейрони DCX-ir у мишей DG Runner були рясними і перекриваються, що ускладнювало точне підрахунок дискретного числа DCX-ir сома за допомогою оптичного мікроскопа. Однак у попередньому дослідженні аналіз Шолла для морфологічної оцінки показав, що кожен нейрон DCX-ir має в середньому по одному дендриту при вимірюванні в межах 40 мкм соми [43]. Тому був розроблений наступний оригінальний аналіз, який дав змогу визначити специфічне для регіону кількісне визначення нейронів DCX-ir.
- (1) Зображення GCL проектувалося на дисплеї комп'ютера за допомогою програмного забезпечення для зображень та об'єктива 40 × (2). На живому зображенні уздовж середини GCL було проведено відрізок лінії (150 ± 0.1 мкм) (малюнок 2) (3). Змінюючи фокусну глибину, кількість підрахунків лінійних відрізків DCX-ir підраховували (4). ROI (спинний DGsp, dDGsp; спинний DGip, dDGip; вентральний DGsp, vDGsp; вентральний DGip, vDGip) відповідав регіонам, де аналізувалася імунореактивність FosB / ΔFosB (5). У кожній ROI, сегменти ліній 2 – 3 малювали на секцію, а кількість перетинів усереднювали за розділами 2 – 3 на мишу. Оскільки товщина GCL становить приблизно 60 – 80 мкм, кількість перетинів має відображати кількість нейронів DCX-ir в межах аналізованої області.
3. Експеримент 2. Ідентифікація ізоформи FosB / ΔFosB, викликаної ходом колеса
3.1: Перфузія та обробка тканин
Додаткову когорту мишей обробляли, як описано вище, в експерименті 1. Після тижневого втручання 4 мишам транскардіально переливали холодним сольовим розчином під глибокою анестезією. Гіпокамп швидко розсікали і заморожували рідким азотом і зберігали при -80 ° C. Гіпокампи кожної миші гомогенізували в буфері RIPA (150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl рН 7.6, 1% NP-40, 1% дезоксихолат натрію, 0.1% SDS, #8990, Thermo Scientific, IL, США), що містить протеазу інгібітори (cOmplete Mini, Roche, Manheim, Німеччина). Лізати центрифугували протягом 15 хв при 5000 об / хв при 4 ° C і супернатанти збирали. Концентрації білка вимірювали за допомогою набору для аналізу білка BCA (#23227, Thermo Scientific, IL, США).
3.2: Вестерн-блот
Рівні кількості білка (30 мкг / смуга) електрофорезували на поліакриламідному гелі 10%, потім переносили на мембрану PVDF (Immun-Blot, 0.2 мкм, Bio-Rad, MD, США). Неспецифічне зв'язування блокували попередньою інкубацією мембрани протягом 1 h в TBST (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl рН 7.5, 0.1% Tween-20), що містить 3% BSA. Мембрану інкубували з антитілом пан-FosB (1: 1000), яке використовували вище для імуногістохімії, розчиненим у TBST, що містить 3% BSA. Після промивання TBST мембрану інкубували з HRP-кон'югованим анти-кролячим IgG-антитілом (1: 5000 в TBST, NA934, GE Healthcare, Бакінгемшир, Великобританія) протягом 1 год при кімнатній температурі. Після промивання TBST білкові смуги візуалізували інкубацією з посиленою хемілюмінесценцією (Western Lightning Plus-ECL, PerkinElmer, MA, США) та фіксували за допомогою зображення Image Quant LAS 4000 mini (GE Healthcare, Бакінгемшир, Великобританія). Потім мембрану повторно досліджували антитілом анти-гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (GAPDH) (#2275, 1: 5000 в TBS-T, Тревіген, штат Мердент, США) в якості контролю навантаження. Оптичну щільність білкових смуг кількісно визначали за допомогою Image-J та нормалізували до рівня GAPDH.
4: Статистичний аналіз
Зміни маси тіла миші аналізували двосторонніми повторними мірами ANOVA (група × час). Непарний t-тест був використаний для визначення статистичних відмінностей між групами (Control vs. Runner). Кореляційний аналіз Пірсона був використаний для підтвердження аналізу імунореактивності FosB / ΔFosB (ручне підрахунок проти порогу зображення) та для вивчення зв’язку між рівнем експресії FosB / ΔFosB та кількістю перетинів DCX в ГД. Дані були представлені як середнє значення ± SEM. Поріг статистичної значущості був встановлений на рівні P < 0.05.
результати
1: маса тіла та дистанція бігу в експериментах 1 та 2
Зміни у вазі тіла мишей Control та Runner в експериментах 1 та 2 об'єднані та показані у малюнок 3. Двосторонній повторний захід ANOVA вказував на значну взаємодію (група × час, F(4, 72) = 13.6, P <0.001) та основний ефект групи F(1, 18) = 6.07, P <0.05), що вказує на значно нижчу масу тіла у мишей-бігунів. Відстань пробігу на клітку показано в Таблиця 1. Хоча точна дистанція бігу кожної миші була невизначеною, оскільки мишей розміщували разом, регулярні спостереження підтверджували, що всі миші часто виконували біг колесом. Миші Runner в експерименті 2 бігали довше, ніж у експерименті 1, але середнє пробіг (м / день / клітка) було послідовним протягом кожного експерименту.
2: Валідація кількісної оцінки імунореактивності FosB / ΔFosB з використанням порогу зображення
Існувала значна кореляція між областю FosB / ΔFosB-ir, отриманою шляхом порогу зображення та щільністю ядер FosB / ΔFosB-ir, отриманими вручну підрахунком (r = 0.941, P <00001, малюнок 4).
3: імунореактивність FosB / ΔFosB в гіпокампі
Репрезентативні зображення імунофарбування FosB / ΔFosB в дорсальному та вентральному підполях гіпокампа були показані на малюнок 5. У всіх аналізованих ROI імунореактивність FosB / ΔFosB у мишей Runner (малюнок 5, правильно) був якісно вищий, ніж у контрольних мишей (малюнок 5, центр). У мишей Runner кількісний аналіз показав значне збільшення площі FosB / ΔFosB-ir в обох спинах (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.01; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05) та вентральні гіпокампальні підполя (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.05; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05; малюнок 6).
4: імунореактивність FosB / ΔFosB в корі
Представницькі зображення імунофарбування FosB / ΔFosB в кортикальних ROI показані на малюнок 7. Кількісний аналіз виявив залежні від регіону зміни імунореактивності FosB / ΔFosB при тривалому запуску (малюнок 8). У мишей Runner область FosB / ΔFosB-ir була значно вище в руховій корі (P <0.05) та соматосенсорної кори бочки (P <0.05), але не в зоровій корі (P = 0.662) або нюхова цибулина (P = 0.523). У слуховій корі область FosB / ΔFosB-ir прагнула до збільшення мишей Runner (P = 0.105).
5: нейрогенез
Репрезентативні зображення імунофарбування DCX показані на малюнок 9. У спинному гіпокампі, імунореактивність DCX у мишей Runner (малюнок 9, справа) була якісно вища порівняно з контрольними мишами (малюнок 9, зліва). Порівняно з дорсальним гіпокампом, імунореактивність DCX у вентральному гіпокампі була слабкішою як у мишей Control, так і у Runner. У мишей Runner кількість схрещувань була значно більшою у dDGsp (P <0.01) та dDGip (P <0.01; малюнок 10). У вентральному гіпокампі кількість схрещувань у мишей Runner, як правило, збільшувалася, але суттєвих відмінностей між групами не було (vDGsp, P = 0.101; vDGip, P = 0.257; малюнок 10).
6: Кореляція між експресією FosB / ΔFosB та нейрогенезом
Був проведений кореляційний аналіз між областю FosB / ΔFosB-ir та кількістю переходів DCX (малюнок 11). Оскільки кожен набір даних (наприклад, спинний DGsp у контрольних мишей) складається лише з пар 5, аналіз вперше проводили з усіма парами 40. Інтригуюче виявилася значна кореляція між областю FosB / ΔFosB-ir та кількістю переходів DCX (r = 0.885, P <0.0001). Крім того, також виявлено суттєві кореляційні зв'язки при спинному ДГ (r = 0.762, P <0.05) і черевний DG (r = 0.816, P <0.01) аналізували окремо.
7: Ідентифікація ізоформи FosB / ΔFosB, індукованої тривалим запуском
Нарешті, для виявлення ізоформи fosB Генні продукти, індуковані в гіпокампі у відповідь на тривалий перебіг, гіпокампи з додаткової когорти мишей піддавали вестерн-блоттінгу з використанням того ж пан-FosB-антитіла. Кілька смуг 35 – 37 kDa, що представляють собою модифіковані ізоформи ΔFosB [44], були значно збільшені у мишей Runner та Control (малюнок 12, P <0.01). З іншого боку, ізоформу FosB 48 кДа не можна було виявити в жодній групі. Інша смуга, слабо помітна вище 25 кДа, ймовірно, являє собою ізоформу Δ2ΔFosB (27 кДа). Були ще дві смуги, вище 50 кДа і 37 кДа, які, швидше за все, були пов'язані з неспецифічним зв'язуванням. При кількісному визначенні відмінностей у цих не-ΔFosB смугах між групами не виявлено (дані не показані).
Обговорення
Підсумовуючи це, в цьому дослідженні вперше було проведено імуногістохімічний аналіз для дослідження 1), чи довгостроковий добровільний біг колесом викликає експресію FosB / ΔFosB у гіпокампі; і 2) чи існує відповідна для регіону відповідь уздовж його дорзо-вентральної осі.
Чотири тижні добровільного керування колесом викликали значне підвищення імунореактивності FosB / ΔFosB у всіх проаналізованих регіонах гіпокампа (тобто підполях DG, CA1 та CA3 обох спинних та вентральних ділянок гіпокампу). Ми підтвердили, що основна ізоформа 35 – 37kDa ΔFosB fosB генний продукт, що накопичується у відповідь на тривалий перебіг. Ці результати чітко підтверджують гіпотезу про те, що тривалі регулярні заняття спортом є потужним пусковим механізмом індукції ΔFosB у всьому гіпокампі, і що його індукція може бути новим молекулярним механізмом, завдяки якому вправа впливає на різні типи спинних та / або вентральних функцій гіпокампу.
1: Валідація та обмеження кількісного визначення імунореактивності FosB / ΔFosB з використанням порогу зображення
У цьому дослідженні було прийнято метод порогового зображення, широко застосовуваний у імуногістохімічних дослідженнях для підрахунку кількості клітин-мішеней та для оцінки клітинної морфології для конкретного регіонального кількісного визначення імунореактивності FosB / ΔFosB [15,45,46]. Продемонстровано значну кореляцію між рівнями імунореактивності FosB / ΔFosB, кількісно визначеними порогом зображення та ручним підрахунком (малюнок 4). Однак, оскільки щільність та перекриття перешкоджали підрахунку кількості ядер FosB / ΔFosB-ir у дуже щільних областях, продемонстрована кореляція передбачає лише точність методу порогового зображення, коли області FosB / ΔFosB-ir становлять <~ 40% від загальної рентабельності інвестицій площі. Тому необхідна ретельна інтерпретація для районів FosB / ΔFosB-ir> 40% загальної площі рентабельності інвестицій.
Зокрема, в мишах DG Runner (малюнок 4), Експресія FosB / ΔFosB була сильно індукована ходом колеса, і більшість ядер FosB / ΔFosB-ir перекривалися. У цих областях підвищена індукція експресії FosB / ΔFosB призводить до більшої заниження рівня експресії, незалежно від використовуваного методу кількісного визначення (порог зображення або ручне підрахунок). Однак, незважаючи на ризик недооцінки, важливо відзначити, що дане дослідження успішно продемонструвало значне збільшення площі FosB / ΔFosB-ir у DG мишей. Це говорить про те, що методологічні обмеження не ставлять під загрозу наші висновки. Натомість потенційна недооцінка підвищує надійність висновку, що тривалий біг підвищував імунореактивність FosB / ΔFosB у гіпокампі.
2: рівномірна індукція ΔFosB всередині гіпокампу шляхом тривалого бігу
Гіпокамп має анатомічні та функціональні градієнти вздовж його поздовжньої осі [26], тому для цього дослідження імунореактивність FosB / ΔFosB у дорсальній та вентральній частині гіпокампу аналізували окремо. Дані продемонстрували, що тривалий запуск рівномірно збільшував експресію FosB / ΔFosB у всіх вимірюваних ROI гіпокампа. Ця рівномірна індукція імунореактивності FosB / ΔFosB може бути специфічно обумовлена системними метаболічними змінами, пов'язаними з тривалим запуском. Однак важливо зауважити, що в корі було покращено специфічне для регіону підвищення імунореактивності FosB / ΔFosB. Цей результат підтверджується останніми даними, що показують, що гострий біг бігової доріжки збільшив регіональний мозковий кровотік у гіпокампі, але не в нюховій цибулині [8]. Крім того, Rhodes et al. (2003) продемонстрував, що дні 7 добровільного руху колесом викликали експресію c-Fos в DG та CA2 / 3 гіпокампу (CA1 не вимірювали) та в сенсорній корі, але не у зоровій корі [47]. У сукупності ці дослідження дозволяють припустити, що рівномірна індукція експресії FosB / ΔFosB у гіпокампі не є неспецифічним наслідком тривалого запуску. Цікаво, що Хоулі та ін. нещодавно повідомляв, що хронічний непередбачуваний стрес посилював експресію FosB / ΔFosB в дорсальному відділі, але не у вентральному, ГД гіпокампу щурів [48]. При подальшому дослідженні, чіткі закономірності індукції FosB / ΔFosB, такі як ті, що викликаються фізичними вправами або стресом, нададуть постійне розуміння впливу, що залежить від стимулу на гіпокамп.
Відомо, що первинне антитіло пан-FosB, що використовується в цьому дослідженні, розпізнає всі ізоформи білків FosB. За допомогою вестерн-блот-аналізу ми виявили, що єдиними ізоформами, які збільшувалися в гіпокампі після тривалого запуску, були модифіковані ізоформи ΔFosB (35 – 37 kDa), єдині стабільні ізоформи серед білків сімейства Фос [11]. Цей висновок відповідає попередній роботі з використанням антитіла пан-Фос для демонстрації того, що 35 – 37 kDa ΔFosB є переважаючим білком сімейства Fos, індукованим у лобовій корі хронічним стресом [44]. Отже, збільшення імунореактивності гіпокампа FosB / ΔFosB, викликане тут тривалим запуском, швидше за все, відображає рівень ΔFosB.
Менш відомо про специфічні для регіону ефекти фізичних вправ на молекулярні та структурні аспекти гіпокампу. Однак численні поведінкові дослідження свідчать про великий потенціал для покращених фізичними вправами поліпшення як спинного, так і вентрального функцій гіпокампа. Було продемонстровано вправи для поліпшення просторового навчання та пам'яті [34-38] і просторова та контекстуальна обробка в основному залежить від дорсального гіпокампу [27,28]. На відміну від фізичних вправ також відомо, що вони володіють анксіолітичними та антидепресантними властивостями [24,25,38] і ці емоційні реакції переважно регулюються вентральним гіпокампом [29,30]. Рівномірна індукція ΔFosB при тривалому запущенні, що спостерігається в цьому дослідженні, говорить про те, що певна форма нейропластичних змін відбулася протягом усього гіпокампу. Це пояснило б, чому фізичні вправи можуть впливати як на дорсальну, так і на вентральну функції гіпокампу.
3: Специфічний для регіону аналіз нейрогенезу, спричиненого фізичними вправами
Функціональна дисоціація нейрогенезу між спинним та вентральним гіпокампом також приділяє все більше уваги [49]. У цьому дослідженні, використовуючи морфологічні характеристики DCX-ir незрілих нейронів [43], ми підрахували кількість перетинів між дендрітами DCX-ir та відрізком лінії, проведеним по середині GCL. Це вимірювання не забезпечило загальну кількість нейронів DCX-ir в ГД, але воно дало змогу визначити конкретні регіони, необхідні для проведення кореляційного аналізу з даними експресії FosB / ΔFosB (див. Нижче). Після тривалого запуску кількість нейронів DCX-ir значно зросла в дорсальній, але не в вентральній, DG. Це говорить про те, що фізичні вправи можуть стимулювати нейрогенез яскравіше в спинному відділі порівняно з вентральною частиною ГД. Однак попередні дослідження повідомляли про суперечливі результати, коли колесо, що рухається, посилило нейрогенез як в спинному, так і в вентральному відділі [50,51]. У цьому дослідженні кількість DCX-ir перетинів у вентральній ДГ, як правило, збільшувалась із бігом, хоча невеликий розмір вибірки (миші 5 на групу) може обмежувати можливість виявлення статистично значущої різниці між групами. Тому, ймовірно, передчасно виключити ймовірність того, що добровільний біг за кермом може стимулювати вентральний нейрогенез гіпокампи. Необхідні подальші детальні дослідження, щоб зрозуміти регіональну специфіку нейрогенезу, спричиненого фізичними вправами, щодо його багатоступеневого процесу (проліферація клітин, диференціація, міграція та виживання).
4: Функціональні наслідки індукції ΔFosB, спричиненої фізичними вправами, для регулювання пластичності гіпокампа
Нарешті, як перший крок у визнанні функціональних наслідків індукції, викликаної фізичними вправами в гіпокампі, ми дослідили взаємозв'язок імунореактивності FosB / ΔFosB до перетинів DCX-ir як в дорсальній, так і в вентральній DG і виявили значну позитивну кореляцію між дві змінні. Хоча точні механізми, за допомогою яких ΔFosB регулює викликаний фізичними вправами нейрогенез, залишаються невизначеними, недавнє дослідження показало, що fosB-невільні миші, яким не вистачає FosB, ΔFosB і Δ2ΔFosB (всі fosB продукти), виявляли дефіцит базового нейрогенезу гіпокампа, включаючи зменшення проліферації клітин нейронів-попередників, посилення ектопічної міграції нейронів новонароджених та аномальні структури ДГ [20]. Однак цих змін в Росії не спостерігалося fosB(д / д) мишей, яким не вистачає FosB, але не ΔFosB / Δ2ΔFosB. Цікаво, що в fosB-невільні миші, експресія деяких генів, пов'язаних з нейрогенезом, в т.ч. VGF (Індукований фактор росту нервів VGF) та гал (Препропептид Галаніна) був регульований [20]. Оскільки VGF та GAL є секреторними молекулами, одна з пропозицій, яка є обіцяною, вважає, що нейрони, що експресують ΔFosB, можуть регулювати нейрогенез за допомогою аутокринної / паракринної активності [20].
Додатково слід зазначити, що область, де ΔFosB індукується, просторово перекривається з областю, де нейрогенна активність висока. Цей висновок говорить про те, що нейрогенез, спричинений фізичними вправами, залежить від мінімальної активності. Нейрональна активація є ключовою для підтримання та покращення функціонування центральної нервової системи [9], через механізми, що включають експресію та вивільнення нейтротрофічного фактора, що походить від мозку (BDNF) [52,53], поглинання сироваткового інсуліноподібного фактора росту-1 (IGF-1) через гематоенцефалічний бар'єр [54,55], придушення апоптозу [56] та регуляція мітохондріальної моторики [57]. Отже, дане дослідження дозволяє припустити, що тривалі вправи викликали повторну активацію нейронів, що виявляється у підвищеній експресії ΔFosB, що сприяє підвищенню пластичності гіпокампа, можливо завдяки цим численним механізмам, описаним вище.
У цьому дослідженні було оцінено лише нейрогенез, спричинений фізичними вправами, та його зв'язок із експресією FosB / ΔFosB в ГД. Однак імунореактивність FosB / ΔFosB також була індукована у підполях CA1 та CA3. У той час як необхідні подальші дослідження, щоб отримати більше розуміння функціональних ролей експресії ΔFosB, викликаної фізичними вправами, у цих підполях, попередня література пропонує перспективну можливість. Гуан та ін. (2011) продемонстрував, що специфічна абляція циклін-залежної кінази 5 (Cdk5) у пірамідальних нейронах CA1 або CA3 порушує консолідацію або пошук пам'яті відповідно [58]. Цікаво, що Cdk5 є цільовою ланкою ΔFosB [59] та бере участь у регулюванні синаптичної пластичності [60]. Тому експресія ΔFosB, викликана фізичними вправами, може бути залучена до регулювання синаптичної пластичності за допомогою активації Cdk5 у підполях CA1 та CA3.
Висновок
Хоча, як відомо, гострі прийоми фізичних навантажень викликають експресію негайних білків раннього гена в гіпокампі, це дослідження дає перші докази того, що тривалі регулярні фізичні вправи значно індукують експресію ΔFosB у всьому гіпокампі. Чтрівномірна індукція ΔFosB підтримує сучасне розуміння того, що фізичні вправи - це ефективне немедикаментозне втручання, здатне покращити кілька функцій гіпокампа. Поряд із значною кореляцією між експресією FosB / ΔFosB та нейрогенезом, ці дані є провокаційними та вказують на необхідність подальших досліджень, що визначають роль ΔFosB в опосередкуванні впливу фізичних вправ на функцію гіпокампа, включаючи нейрогенез.
Заява про фінансування
посилання