Source
Інститут Натана Клайн, Оранжбург, Нью-Йорк, 10962, США. [захищено електронною поштою]
абстрактний
Діти та підлітки все частіше піддаються впливу психостимуляторів, як незаконно, так і для лікування загальних нервово-психічних станів, таких як розлад дефіциту уваги з гіперактивністю та без неї. Незважаючи на широке використання психомоторних стимуляторів у молодших вікових групах, мало що відомо про хронічну молекулярну нейроадаптивну реакцію на ці засоби у незрілому мозку. Тут ми демонструємо, що після хронічного прийому психостимуляторів кокаїн та амфетамін, коефіцієнт транскрипції DeltaFosB є нерегульованою в ядрах акаундів періадолесцентний мишей але не в період після відлучення або дорослого мишей. Індукція DeltaFosB також зустрічається виключно у хвостатих зубців періадолесцентний мишей після амфетамін адміністрація. Ці результати демонструють унікальну пластичність в мозку підлітків критичної молекули, яка регулює психостимулюючу дію і припускають, що ці нейроадаптивні зміни можуть бути залучені до посередництва підвищена адиктивні тенденції у підлітка відносно дорослого.
Вступ
Психостимулятори застосовуються при лікуванні поширених дитячих розладів, таких як розлад гіперактивності з дефіцитом уваги. Крім того, зловживання стимуляторами, у тому числі амфетаміном та кокаїном, є поширеним серед підлітків, віком, у якому є дані про посилення звикання до дорослих відносно дорослих (Estroff та ін., 1989; Майерс і Андерсон, 1991). Незважаючи на дані, що вказують на поведінково-регульовані ефекти поведінки, мало що відомо про молекулярні нейроадаптивні реакції у незрілому мозку, що виникають під час прийому цих засобів. Кокаїн та амфетамін можуть частково впливати на зміни поведінки завдяки стимуляції дофаміну D1рецепторів і підвищується рівень факторів транскрипції, включаючи ΔFosB, в дорсальному стриатумі (тобто, хвостатій штаммі) і вентральному стриатумі (тобто, ядерних прихильниках) (Chen et al., 1997). Підвищення рівня ΔFosB, можливо, завдяки стабілізації білкових продуктів, зберігається протягом декількох тижнів після хронічного впливу кокаїну чи амфетаміну і регулюється хоча б частково шляхом трансдукції сигналу дофаміну (Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001).
Центральна дофамінергічна система молодих тварин знаходиться в надто великому потоці внаслідок зміни рівня критичних молекул під час нормального розвитку, включаючи дофамін D1рецептор DARPP-32 (фосфопротеїн, регульований дофаміном і цАМФ; Mr 32 kDa) і cAMP (Ерліх та ін., 1990;Teicher et al., 1993; Perrone-Capano та ін., 1996; Tarazi et al., 1999;Андерсен, 2002). Опромінення в цей період психостимуляторів, які посилюють дофамінергічну нейротрансмісію, може, таким чином, спричинити кількісно та / або якісно різні молекулярні реакції, включаючи зміни в експресії ΔFosB. Для перевірки гіпотези про існування залежної від віку нейроадаптивних реакцій під час хронічного впливу психостимуляторів, у серійних експериментах були проаналізовані три групи мишей: дорослі (60, старий на початку ін'єкцій), періадолесцентний (33, старий на початку ін'єкцій), та після відлучення (24 р. старий при початку ін'єкції). Це перше безпосереднє порівняння молекулярних нейроадаптивних реакцій на хронічну психостимуляцію в цих трьох вікових групах. Ми виявили, що після ідентичних парадигм лікування периадолесцентні миші виявляють посилену регуляцію ΔFosB у відповідь як на кокаїн, так і на амфетамін.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
Введення тваринам та наркотиків. Мишей CD-1 мишей (Charles River Laboratories, Кінгстон, Нью-Йорк) розміщували на циклі 12 год світло / темно (6: 00 AM до 6: 00 PM) з ad libitumдоступ до їжі та води. Тваринам дозволяли розміщуватись до кімнати для тварин як мінімум 10 d до початку ін'єкцій. З тваринами оброблялися два слідчі, які виконували всі ін’єкції в одній кімнаті, в якій розміщували тварин. Всі тварини були відлучені у віці 21 d. Ін'єкції починалися з 24 (після відлучення), 33 (в періодолецензії) або 60 (у дорослих) віку. Тварини отримували кокаїн 20 мг / кг (Sigma, Сент-Луїс, Міссурі), амфетамін 5 мг / кг (Sigma) або рівний об'єм фізіологічного розчину внутрішньочеревно між 4: 00 та 5: 00 PM щодня протягом 7 d. Тварин було вбито обезголовленням після короткого опромінення СО2 при 10: 00 AM на наступний день після остаточної ін'єкції. Мозок був негайно вилучений з черепа, і хвостаті зубці та ядерні корінці швидко розсікалися на льоду. Усі розсічення проводили з коронкових зрізів мозку одним дослідником, а білкові екстракти готували із свіжої тканини без заморожування. Усі процедури на тваринах були затверджені Інституційним комітетом з догляду за тваринами та їх використанням та відповідали Національному інституту здоров'я Посібник з догляду та використання лабораторних тварин.
Аналіз Вестерн-блот. Для вестерн-блот-аналізів, однакові кількості білка (40 мкг для хвостатих хвостів і 20 мкг для нуклеїнових ядер) з кожного зразка завантажували в кожну смугу гелю 10% SDS-поліакриламіду після вимірювання концентрації білка за допомогою аналізу BCA (Pierce, Рокфорд, Іллінойс). Рівне завантаження білка було також підтверджено візуалізацією загального білка Ponceau Red після перенесення на нітроцелюлозу та / або промокання антиактиновим антитілом (1: 500; Sigma). Антисерум, пов'язаний з Fos, антиген (FRA), який розпізнає ізоформи ΔFosB, був щедро наданий доктором М. Ядаролою (Національний інститут здоров’я, м. Бетесда, штат Мерседес) та використовувався в концентрації 1: 4000. Попередні дослідження (Chen et al., 1997; Hiroi et al., 1997), включаючи преасорбцію антисеруми FRA з М-пептидним імуногеном, продемонстрували специфічність цього антисеру. Моноклональне антитіло DARPP-32 5a, що використовується в 1: 10,000, було щедро надано Drs. Х'ю Хеммінгс та Пол Грінґард (Університет Рокфеллера, Нью-Йорк, Нью-Йорк). Антитіло допамінового транспортера (DAT) було похідним Хімікон (Темекуела, Каліфорнія). Плями реагували з системою хемілюмінесценції NEN-DuPont (Бостон, Массачусетс) та опромінювали плівкою. Денситометричні значення імунореактивності ΔFosB були отримані з використанням ScanAnalysis для Apple (Biosoft, Ferguson, MO). Статистичну значущість визначали за допомогою одностороннього ANOVA, за яким далі Постфактум Багаторазовий тест порівняння Тукі або непарний двосторонній тест студента t тест, як зазначено на рисунках легенд. Для експериментів з медикаментозним лікуванням аналіз кожної вікової групи проводили на окремому промені, і, отже, кожній фізіологічній групі довільно присвоювали значення 100% для порівняння між віковими групами. Для досліджень на онтогенез зразки всіх вікових груп аналізували разом на одному плямі.
РЕЗУЛЬТАТИ
Індукція ΔFosB після кокаїну та амфетаміну відбувається в ядрах лише періадолесцентних мишей
Експресію ΔFosB вимірювали в ядрах ярусів та хвостатих мишей після відлучення, періадолесценту та дорослих мишей після 7 d введення амфетаміну чи кокаїну. Ядро ярусу - це область мозку, яка вважається найбільш критичною для опосередкування корисних ефектів психостимуляторів. Імунореактивність ΔFosB (35 kDa) була вибірково індукована в ядрах ядер періадолесцентних тварин після хронічного введення амфетаміну (рис. 1 A) або кокаїну (рис. 1 B). На відміну від цього, рівні ΔFosB (35 kDa) не були істотно змінені в ядрах ядер після відлучення або дорослих тварин (рис.1 A,B). У хвостатих пацієнтів рівень ΔFosB (35 kDa) також був значно регульований після хронічного введення амфетаміну лише у періадолесцентних тварин (рис.2 A). Усі три вікові групи показали значне збільшення експресії ΔFosB (35 kDa) у хвостатих пацієнтів після хронічного введення кокаїну (рис.2 B). Однак величина індукції була найбільшою у періадолесцентних тварин, особливо порівняно з після відлучення (рис. 2 B). Інші ізоформи FRA та Fos не змінювались у всіх вікових групах (дані не показані).
Імунореактивність ΔFosB в ядрі накопичується після введення хронічного психостимулятора. Мишам CD-1 вводили один раз на день фізіологічний розчин, амфетамін або кокаїн для 7 d, починаючи з дня 24 (P24; після відлучення), день 33 (P33; періадолесцентно) або денний 60 (Для дорослих). Рівні імунореактивності ΔFosB (35 kDa) в ядрах ядер показані після хронічного амфетаміну (A) або кокаїну (B) адміністрація. Репрезентативні імуноблоти з фізіологічного розчинуS), амфетамін- (A) та кокаїну (C) введена після відлучення (P24), періадолесцентний (P33), а дорослі миші показані на верхні панелі. Нижні панелі показують середнє ± SEM відсоток базальної експресії ΔFosB. n значення для кожної групи відображаються в бари. Значне збільшення ΔFosB було виявлено в ядрах ядер лише періадолесцентних мишей. *p <0.05; **p <0.01 (Студентський t тест; фізіологічний розчин проти препарату).
Імунореактивність ΔFosB у хвостатих хворобах після введення хронічного психостимулятора. Мишам CD-1 вводили один раз на день фізіологічний розчин, амфетамін або кокаїн для 7 d, починаючи з дня 24 (P24; після відлучення), день 33 (P33; періадолесцентно) або денний 60 (Для дорослих). Рівні імунореактивності ΔFosB (35 kDa) у хвостатих пацієнтів показані після хронічного амфетаміну (A) або кокаїну (B) адміністрація. Репрезентативні імуноблоти з фізіологічного розчинуS), амфетамін- (A) та кокаїну (C) вводили періадолесцентних мишей (P33) показані вверхні панелі. Нижні панелі показують середнє ± SEM відсоток базальної експресії ΔFosB. n значення для кожної групи відображаються в бари. Значне підвищення імунореактивності ΔFosB, спричинене амфетаміном, було виявлено у хвостатих пацієнтів лише періадолесцентних мишей (A). Хронічне введення кокаїну призвело до збільшення ΔFosB у всіх трьох вікових групах (B). *p <0.05; **p <0.01 (Студентський t тест; фізіологічний розчин проти препарату).
Рівень DAT і DARPP-32 не змінюється після хронічного кокаїну або амфетаміну
Кілька ключових молекул, експресованих дофамінергічними та / або дофаміноцептивними нейронами, включаючи DARPP-32, D1 рецептор дофаміну та ДАТ сприяють гострим та хронічним реакціям на психостимулятори (Moratalla et al., 1996; Fienberg та ін., 1998; Сора та ін., 1998; Гайнетдінов та ін., 2001). Дані з DARPP-32, D1 рецепторні та нульові та збиті DAT миші вказують на складний взаємозв'язок між їх рівнями, регуляцію дофамінергічної активності та реакцію на психостимулятори. Насправді індукція ΔFosB не відбувається у нульових мишей DARPP-32, які отримують хронічний кокаїн (Fienberg та ін., 1998). Однак у дорослих мишей вплив 7 d кокаїну 20 мг / кг не змінює загальних рівнів DARPP-32 (Fienberg та ін., 1998). Раніше не повідомлялося про регуляцію білка DAT у мишей, підданих хронічному впливу психостимуляторів, хоча про зміни в радіоліганді, що зв'язується з транспортером дофаміну після впливу психостимуляторів, повідомлялося у деяких видів (Letchworth et al., 2001). Тут ми виміряли рівні DARPP-32 і білка DAT, щоб визначити, чи змінюється експресія цих білків після хронічного введення психостимулятора в будь-якому з трьох віків мишей. Наші результати свідчать про те, що не відбулося суттєвих змін рівнів загального DARPP-32 або DAT у всьому хвостовому віці або ядрах після хронічного введення кокаїну або амфетаміну в будь-якій з трьох вікових груп (табл. 1).
Відносні значення денситометрії для DARPP-32 і DAT у амфетаміну та кокаїну, оброблених P24, P33 та дорослими мишами щодо контрольних, сольових значень, довільно встановлюють на 100%
Базові рівні ΔFosB регулюються розвитком
Ми дослідили онтогенез ΔFosB, оскільки дорослі миші з генетично виробленою підвищеною експресією ΔFosB у стриатумі мають підвищену поведінкову реакцію на психостимулятори (Kelz et al., 1999). Ми виявили, що базові рівні ΔFosB були значно нижчими у молодших тварин порівняно з дорослими як у хвостатих, так і в ядерних ядрах (рис.3 A). Рівні функціональних маркерів дофамінової системи, включаючи DARPP-32 (Ерліх та ін., 1990), DAT (Perrone-Capano та ін., 1996) та дофамінові рецептори (Teicher et al., 1993; Tarazi et al., 1999) також регулюються розвитком. Попередні звіти у мишей CD-1 вказують на пік смугастої DARPP-32 у післяпологовий день 28 (P28) (Ерліх та ін., 1990). У щурячих хвостатих хвостів і ядерних прихильників, D1пік рівнів рецепторів від P28 до P40 (Teicher et al., 1993; Tarazi et al., 1999), але подібних досліджень на мишах не проводили. На противагу цьому, тут ми виявили, що рівень білка DAT у хвостатих хвостах та ядрах ядер був постійним між постнатальним днем 24 та дорослим віком (рис. 3 B). Таким чином, відносні співвідношення між D1 рецептори, DAT, DARPP-32 і ΔFosB відрізняються між віковими групами, що потенційно призводить до відмінностей у D1 активність рецепторів, яка може впливати на ступінь індукції ΔFosB.
Експресія розвитку ΔFosB і DAT. A, Імунореактивність ΔFosB (35 – 37 kDa) у хвостатих і ядерних середовищ наївних мишей CD-1 як функція віку. Представницькі імуноблоти показані в верхні панелі.Нижні панелі показують засоби ± SEM трьох мишей на групу. *p <0.05, дорослий проти Р24; #p <0.05, дорослий проти Р36 (тест множинного порівняння Тукі після ANOVA). B, Денситометричні значення імунореактивності DAT у хвостатих хвостатих та ядерних місцях для наївних мишей CD-1 як функція віку. Рівень ДАТ не відрізнявся серед трьох вікових груп.
ОБГОВОРЕННЯ
Поведінкові ефекти психомоторних стимуляторів залежать від віку. Адиктивні тенденції найбільш високі в підлітковому віці, коли вживання заборонених речовин посилюється (Estroff та ін., 1989; Майерс і Андерсон, 1991). Насправді, молодші діти часто стають дисфоричними, коли потрапляють до психостимуляторів, тоді як підлітки та дорослі відчувають ейфорію (Rapoport et al., 1980). У моделях гризунів деякі дослідження припускають, що тварини, що мають парадолеску, мають більш високий рівень активності (Спис і гальмо, 1983) та змінені реакції на психостимулятори щодо молодших та старших тварин. Таким чином, вони виявляють менше опорно-рухової стимуляції та новизни, які шукають у відповідь на гостре введення низькодозових психостимуляторів щодо відлучення та дорослих тварин, але підвищують гіперактивність після лікування високими дозами. При хронічному введенні сенсибілізація до руху кокаїну більша у периадолесцентних щурів порівняно з дорослими, тоді як сенсибілізація до стереотипії нижча. Також дані мікродіалізу виявили різницю між періадолесцентними та дорослими щурами щодо сенсибілізації до вивільнення амфетаміну дофаміну (Laviola et al., 1995; Adriani et al., 1998; Адріані і Лавіола, 2000;Laviola et al., 2001). Однак існують суперечливі дослідження щодо тривалої реакційної здатності до кокаїну після введення метилфенідату у підлітків щурів (Брендон та ін., 2001; Andersen et al., 2002). Ці два останні доповіді підкреслюють труднощі порівняння досліджень при використанні різних експериментальних парадигм. Спроби порівняння поведінкових досліджень у молодих тварин додатково збиваються з використанням різних видів та штамів.
Миша стає все більш важливою моделлю тварин у дослідженні використання та зловживання психостимуляторами, і це перший систематичний аналіз молекулярних нейроадаптивних реакцій у трьох різних віках розвитку миші чи будь-якого іншого виду. Попередні дослідження, з яких ми отримали наші парадигми лікування, показали збільшення ΔFosB в ізольованому спинному та вентральному стриатумі дорослих щурів дикого типу після хронічного введення кокаїну та амфетаміну (Hope et al., 1994; Nye et al., 1995; Turgeon et al., 1997), але лише у поєднаному спинному та вентральному стриатумі або ізольованому дорзальному стриатумі дорослих мишей дикого типу після хронічного кокаїну (Fienberg та ін., 1998; Zachariou et al., 2001).
Зараз ми демонструємо просторову та кількісну різницю індукованих психостимулятором ΔFosB у мишей після відлучення, періадолесценту та дорослих. Спостереження за посиленою реакцією у періадолесцентних тварин порівняно з дорослими та після відлучення посилюється тим, що реакція аналогічна у мишей, які отримували кокаїн та амфетамін. Психостимулятори кокаїн та амфетамін підвищують синаптичний дофамін, а також серотонін та норадреналін, але за різними механізмами. Кокаїн зв’язується з транспортерами плазмолеми дофаміну, серотоніну та норадреналіну та інгібує їх повторне захоплення у пресинаптичні термінали. Навпаки, амфетамін сприяє вивільненню цих передавачів. Селективна індукція ΔFosB у ядрах, що охоплює лише періадолецентуючу вікову групу після введення стимулятора 7 d, та відносно підвищена індукція ΔFosB у хвостатих хворобах може бути нейробіологічним представленням або причиною раніше відзначеної підвищеної тенденції до зловживання психостимуляторами в цьому вікова група (Estroff та ін., 1989; Майерс і Андерсон, 1991) та інші тривалі зміни в експресії генів, які відрізняються між віковими групами (Andersen et al., 2002). Крім того, ці відмінності можуть бути суттєво регульовані зміною розвитку рівнів ключових молекул, включаючи сам ΔFosB. Потенційні наслідки відмінностей у вихідних рівнях ΔFosB між віковими групами аналогічні тому, що пропонується щодо відмінностей між штамами щурів (Haile et al., 2001). Насправді ми передбачаємо, що подібні відмінності штамів будуть виявлені серед інбредних мишей. Можливо також, що миші різного віку демонструватимуть різні молекулярні адаптації в інших областях мозку, окрім ядерних ядер. Додатковий аналіз з використанням периадолесцентних мишей з генно-інженерними змінами в рівнях ключових молекул та одночасними поведінковими спостереженнями надалі перевірять ці гіпотези.
Виноски
- Отриманий 8 Квітня 2002.
- Отримано версію Серпень 6, 2002.
- Прийняті Серпень 8, 2002.
Цю роботу підтримали Національний інститут охорони здоров’я / Національний інститут неврологічних розладів та інсульту, що надає NS41871 (МЕЕ та ЄВС) та Національний інститут з дотації зловживання наркотиками P30-DA13429 (EMU).
Листування слід адресувати доктору Мішель Ерлі Ерліху, Університету Томаса Джефферсона, Кертісу 310, 1025 Walnut Street, Філадельфії, Пенсільванія 19107. Електронна пошта: [захищено електронною поштою].
- Авторське право © 2002 Товариство неврології
;