Регулювання стійкості DeltaFosB за допомогою фосфорилювання (2006)

J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.

Source

Кафедра психіатрії, Центр базової нейрології, Техаський університет Південно-Західного медичного центру, Даллас, Техас 75390-9070, США.

абстрактний

Коефіцієнт транскрипції DeltaFosB (також його також називають FosB2 або FosB [коротка форма]) є важливим посередником тривалої пластичності, викликаної в мозку хронічним впливом декількох типів психоактивних подразників, включаючи наркотики зловживання, стрес та електроконвульсивні напади . Відмітною особливістю DeltaFosB є те, що після її індукування він зберігається в мозку протягом відносно тривалих періодів часу за відсутності подальшого стимулювання. Однак механізми, що лежать в основі цієї уявної стабільності, залишаються невідомими. Тут ми демонструємо, що DeltaFosB є відносно стабільним фактором транскрипції, з періодом напіввиведення в культурі клітин приблизно 10 h. Крім того, ми показуємо, що DeltaFosB - це фосфопротеїн головного мозку і що фосфорилювання сильно збереженого залишку серину (Ser27) у DeltaFosB захищає його від протеасомальної деградації. Ми надаємо декілька доказів, що дозволяють припустити, що це фосфорилювання опосередковується казеїнкіназою 2. Ці дані є першим свідченням того, що DeltaFosB фосфорильовано, і демонструють, що фосфорилювання сприяє його стабільності, що є основою його здатності опосередковувати тривалі адаптації в мозку.

Вступ

Коефіцієнт транскрипції ΔFosB, також позначений FosB2 або FosB [коротка форма], являє собою C-кінцевий зрізаний варіант сплайсу негайного раннього гена fosb (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu і Nathans, 1991; Yen et al., 1991). Як і повнорозмірний FosB, ΔFosB має базовий домен, що зв'язує ДНК, і лейцинову блискавку, завдяки якій він димеризується з білками Jun, утворюючи комплекси фактора транскрипції активаторного білка-1 (AP-1), які регулюють експресію багатьох генів (Морган і Куран, 1995; Рільськи та Качмарек, 2004). Незважаючи на відсутність частини домену трансактивації, знайденої в кінці С FosB, ΔFosB функціонує як потужний активатор транскрипції, так і репресор в культивованих клітинах і в мозку (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu і Nathans, 1991; Chen et al., 1997; McClung і Nestler, 2003; Kumar et al., 2005).

ΔFosB індукується до високих рівнів у конкретному регіоні головного мозку після хронічного, але не гострого впливу різних психоактивних подразників, включаючи стрес, певні ураження, антипсихотичні та антидепресантні засоби, зловживання наркотиками та природні винагороди (Hope et al., 1994b; Hiroi і Graybiel, 1996; Moratalla et al., 1996; Бінг та ін., 1997; Mandelzys та ін., 1997; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Andersson et al., 2003; Colby et al., 2003; Пікман та ін., 2003; Perrotti et al., 2004; Zachariou et al., 2006). Індукція ΔFosB була пов'язана безпосередньо з функціональним впливом кількох цих подразників на мозок. Наполегливість ΔFosB навіть за відсутності додаткової стимуляції відрізняє його від усіх інших факторів транскрипції сімейства Fos, які індукуються швидко у відповідь на гострі подразники, знижуються до базового рівня протягом декількох годин і, як правило, демонструють десенсибілізацію після хронічної стимуляції (Hope et al., 1992; Daunais та ін., 1993; Персіко та ін., 1993; Hiroi і Graybiel, 1996; Perrotti et al., 2004). Це робить ΔFosB привабливим кандидатом для опосередкування деяких тривалих змін експресії генів, які лежать в основі стійких адаптацій нейронів, викликаних певними хронічними подразниками.

Оскільки тривала присутність ΔFosB відбувається за відсутності подальшої індукції його мРНК (Chen et al., 1995) ми припускали, що на відміну від повнорозмірних FosB та всіх інших білків сімейства Fos, які по суті нестабільні, ΔFosB може бути незвичайно стабільним фактором транскрипції (Hope et al., 1994b; Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001; McClung et al., 2004). Більше того, імуноблотінг-аналіз гострої та хронічно стимульованої тканини мозку припустив, що ΔFosB зміщується M_r (молекулярна маса) від ∼33 кДа в гострому стані до ∼35 – 37 кДа під час хронічного лікування (Hope et al., 1994a; Chen et al., 1995). Оскільки немає ніяких доказів існування додаткових мРНК, які могли б кодувати ці різні ізоформи, ми додатково припускали, що ΔFosB є посттрансляційно модифікованим і що, можливо, це сприяє його незвичній стабільності. На сьогодні, однак, не повідомлялося про біохімічний аналіз обороту або посттрансляційних модифікацій ΔFosB. Метою цього дослідження було визначити, чи є ΔFosB фосфопротеїном та чи грає фосфорилювання роль у його стабільності.

Попередній розділ Наступний розділ

Матеріали та методи

Клітинні лінії ссавців та структури ДНК.

Клітини PC12 (Clontech, Mountainview, Каліфорнія) культивували в ДМЕМ з високим вмістом глюкози, що містить l-глютамін (L-Gln) і доповнювали сичушною сироваткою великої рогатої худоби 5% (FBS), кінською сироваткою 10% (обидві з Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія) , 100 U / мл пеніциліну та 100 мкг / мл стрептоміцину (обидва від Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Клітини HeLa (American Type Culture Collection, Manassas, VA) культивували в DMEM з високим вмістом глюкози, що містить L-Gln, і доповнювали 10% FBS, пеніциліном та стрептоміцином. Обидві клітинні лінії підтримували при 37 ° C у вологому 5% CO₂ атмосферу.

Для тимчасових трансфекцій з ДНК клітини PC12 або HeLa висівали на пластини з шести лунками (покриті колагеном I для клітин PC12), щоб наступного дня досягти злиття 90 – 100%, а потім трансфікували за допомогою ліпофектаміну 2000 (Invitrogen). У деяких дослідах (див Фіг. 1 ⇓⇓⇓⇓⇓-7), ΔFosB тимчасово експресували в клітинах PC12 через зараження рекомбінантним вірусом простого герпесу (ВПГ).

КДНК ΔFosB і FosB були отримані з наших власних pTetop-конструкцій (Chen et al., 1997) і субклонований у вектор pcDNA3.1 (Invitrogen). Ці конструкції pcDNA3.1-ΔFosB / FosB використовували для експресії в клітинах ссавців і як шаблон для мутагенезу, спрямованого на сайт. Рекомбінантний HSV-ΔFosB готували, як описано раніше (Neve et al., 1997), і препарат мав титр ∼1 × 10⁸ пфу / мл

Імпульсно-погонні експерименти.

Приблизно 24 год після зараження / трансфекції клітини (PC12 або HeLa) у шести лункових планшетах промивали два-три рази 2 мл PBS та інкубували при 37 ° C протягом ∼1 год у 2 мл Cys / Met-без DMEM. (Invitrogen), доповнений 5% діалізованим FBS (Hyclone, Logan, UT) для виснаження внутрішньоклітинних пулів Met і Cys. Наприкінці цього періоду «голодування» додавали наркотики (якщо клітини лікували), а клітини мітили (імпульс) 12 – 25 μCi ³⁵S Мікс для маркування білка (PerkinElmer, Wellesley, MA) протягом ∼1 год при 37 ° C для позначення всіх знову синтезованих білків. Потім радіомарк видаляли промиванням клітин два-три рази 2 мл PBS, і ³⁵S-мічені білки супроводжувались (переслідували) шляхом заміни середовища на "холодну" (нерадіоактивну) середовище, доповнену 5% FBS, та збирання клітин у різні моменти часу. Обробку клітин підтримували протягом усієї погони. Всі дані цих експериментів показують однакові початкові кількості різних білків для оптимізації порівняння їх швидкості обороту.

Тварини та лікування хронічних електроконвульсивних припадків.

Дорослих щурів Спрега Даулі (200 – 300 г; Charles River Laboratories, Кінгстон, Річ) обробляли один раз на день електроконвульсивними судомами (ECS) протягом 7 – 9 d. ECS проводили, як описано раніше (Hope et al., 1994a) за допомогою Уго Базиле (Comerio VA, Італія) блок ECS з такими налаштуваннями: частота, імпульси 100 / s; пульс з, 0.5 мс; тривалість удару, 1.0 с; і струм, 75 мА. Шахрайських контрольних тварин обробляють паралельно, застосовуючи електроди для затискання вух без електричного струму.

³² P метаболічне маркування.

Для маркування шматочків головного мозку щурів обезголовляли, мізки швидко розсікали, а лобові коркові зрізи 300 мкм готували за допомогою мікросхеми DSK (Тед Пелла, Реддінг, Каліфорнія). Зрізи інкубували всередині пластикових пробірок у 2 мл штучного CSF з дефіцитом фосфату (ACSF) і витримували при 30 ° C при постійному м'якому бульбашці з O₂/ СО₂ суміш (Hemmings та ін., 1989). Зрізи (два скибочки на пробірку) мітили 1.3 mCi протягом 8 – 10 h за наявності або відсутності окадаїнової кислоти (100 нг / мл). В кінці цієї інкубації зрізи промивали щонайменше три рази холодним ACSF, а потім гомогенізували ультразвуком у буфері 250 мкл холодного радіоімунопреципітаційного аналізу (RIPA) [PBS, pH 7.4, 150 мм NaCl, 1% (об / об ) Igepal, 0.5% (мас. / Об.) Дезоксихолат натрію, 0.1% (w / v) SDS, 1 мм EDTA], доповнений перед використанням SDS до 0.6%, коктейль з інгібітором протеази для клітин ссавців (застосовується при 5 мкл / мл; Sigma-Aldrich), коктейлі I та II інгібіторів фосфатази (використовуються в 1: 100; Sigma-Aldrich), 1 мм PMSF та 2% гліцерину. Потім гомогенати кип'ятили протягом 15 хв і очищали центрифугуванням при 15,000 × g протягом 15 хв. Концентрацію білка в отриманих супернатантах оцінювали, використовуючи аналіз білка BCA (Pierce, Holmdel, NJ).

Для ³²P маркування культивованих клітин, ∼24 год після зараження / трансфекції, клітини промивали два-три рази середовищем, що не містить фосфатів, та інкубували в цій середовищі протягом N1 год. Після цього періоду голодування, 0.2 – 0.3 mCi ³²PH₃PO₄ (PerkinElmer) додавали до кожної лунки, і клітини мітили на 4 – 12 h залежно від виду експерименту (див. рис. 1 – 7 для специфікацій). Потім клітини тричі промивали PBS і лізирували на льоду протягом 15 хв 50 мкл доповненого буфера RIPA. Лізати збирали шляхом вискоблювання і пропускали 10 разів через голку 25 ga для зсуву ДНК, кип'ятили протягом 10 хв і центрифугували при 15,000 об / хв протягом 15 – 30 хв при 4 ° C. Очищені лізати (супернатанти) переносили в нову пробірку і проводили аналіз білка BCA (Pierce). Всі фігури цих експериментів показують однакові кількості загального білого типу (WT) та білків S27A ΔFosB для оптимізації порівняння їх відносного рівня фосфорилювання.

Хімічні засоби та способи лікування клітинної культури.

Окадаєву кислоту (OA; Sigma-Aldrich) розчиняли в етанолі і використовували в кінцевій концентрації 100 нг / мл. 5,6-дихлор-1-β-d-рибофуранозил-бензимідазол (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) розчиняли в диметилсульфоксиді (DMSO; Sigma-Aldrich) і використовували в культурі клітин при кінцевій концентрації 50 мкм. Спермін (Sigma-Aldrich) розчиняли у воді і використовували в кінцевій концентрації 200 мкм. Кальфостин-С (Biomol) розчиняли в DMSO і використовували при 0.2 мкм, тоді як форбол 12-міристат 13-ацетат (PMA; Promega, Madison, WI) розчиняли в DMSO і використовували при 0.1 мкм. інгібіторний пептид, пов'язаний з миристоилированним аутокамідом-2 (m-AIP; Biomol), розчиняли у воді та використовували у кінцевій концентрації 1 та 10 мкм. Інгібітори протеїнкінази широкого спектру дії H-7 та H-8 (Biomol) розчиняли у воді та використовували у кінцевій концентрації 150 та 200 мкм відповідно. MG132 (Calbiochem, Сан-Дієго, Каліфорнія) та епоксоміцин (Peptides International, Louisville, KY) розчиняли в ДМСО та використовували у кінцевій концентрації 12.5 та 7.5 мкм відповідно. У всіх експериментах DMSO (носій) додавали до клітин у міру необхідності для підтримки постійної кількості ДМСО протягом лікування. Для ³²Експерименти з маркуванням лікарські засоби додавали безпосередньо перед міткою та зберігали протягом решти періоду маркування. Для експериментів із проведенням пульсу наркотики додавались під час голодування Циса / Мета, що зберігався протягом періоду маркування, а потім знову додавались у середовище погоні. Інгібітори протеасоми шипляться кожні 3 – 4 год протягом усієї погони, щоб компенсувати швидкий оборот цих пептидів.

Імуноосадження ΔFosB, імуноблотінг та авторадиографія.

Для імунопреципітації лізати розбавляли 1: 5 звичайною RIPA, щоб знизити концентрацію SDS до 0.1%, перш ніж приступити до імунопреципітації (IP). Для обмеження неспецифічного зв'язування лізати спочатку очищали шляхом імунопреципітації з неімунним IgG та білком G-сефарози (Sigma-Aldrich) протягом щонайменше 4 год. Потім ΔFosB імунопреципітували з очищених лізатів, використовуючи козяче поліклональне антитіло, яке розпізнає внутрішній епітоп, присутній як у FosB, так і ΔFosB (SC-48G; Біотехнологія Санта-Крус, Санта-Крус, Каліфорнія) при 0.5 – 1 мкг IgG на білок білка 10 (50 – 300 мкг загального білка) загальним об'ємом 0.5 мл. ІР обережно перемішували при температурі 4 ° C на роторі принаймні 8 год, а потім додавали 15 мкл білка G-Sepharose і ІР перемішували щонайменше ще 4 год. IP-файли гранулювали за допомогою спінінгу на 3000 × g протягом 3 – 5 хв при 4 ° C, тричі промивали 0.5 мл холодної простої RIPA та два рази холодним PBS, що містить 0.1% Tween 20. Потім ІР ресуспендували в 0.5 мл холодного PBS, переносили, гранулювали в нову пробірку, а імунопреципітовані білки потім элюировали додаванням 15 – 25 мкл 2 × зменшення буфера зразка білка Laemmli. Цей протокол IP призвів до специфічного та ефективного осадження практично всього ΔFosB в лізаті. Імунопреципітовані білки піддавали SDS-PAGE, завантажуючи весь IP на критерий гелю 12.5% Tris-HCl (Bio-Rad, Hercules, CA), а потім переносили на PVDF або нітроцелюлозу. Після перенесення мембрану сушили на повітрі та ³²П- і ³⁵S-радіоактивно мічені білкові смуги спостерігали за допомогою авторадиографії за допомогою авторадиографической плівки Kodak (Rochester, NY), а також за допомогою фосфоритування з використанням PhosphorImager Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Загальний (нефосфорильований та фосфорильований) ΔFosB у клітинних лізатах або гомогенатах мозку був виявлений імуноблотуванням або імунопреципійованого білка (використовуючи ту саму мембрану, яка використовується для виявлення ³²P-мічений білок) або в рівній кількості білка лізату / гомогенату піддають SDS-PAGE і переносять на PVDF або нітроцелюлозу. Мембрану спочатку блокували, інкубуючи її з жирним сухим молоком 1% (мас. / Об.) (Bio-Rad) в PBS, доповненому 0.1% (об. / Об.) Tween 20 (Sigma) протягом 1 год при температурі 25 ° C. Потім мембрану імуноблотували протягом ночі при 4 ° C за допомогою власного кроликового анти-FosB поліклонального антитіла, що генерується проти амінокислот 1 – 16 FosB / ΔFosB (використовується в 1: 10,000). Після первинної інкубації мембрани промивали чотири рази протягом 5 хв з блокуючим буфером, а потім інкубували при 25 ° C протягом N1 год з козячим анти-кролячим IgG, кон'югованим з пероксидазою хрону (використовується в 1: 5000 для блокування буфера, з Vector Лабораторії, Берлінгам, Каліфорнія). Потім мембрани промивали тричі протягом 10 хв з блокуючим буфером і один раз протягом 5 хв з PBS. Загальні білкові смуги ΔFosB візуалізували на плівці Kodak MR шляхом посиленої хемілюмінесценції (Pierce) та / або виявленням флуоресценції за допомогою реагентів ECL-Plus (Amersham Biosciences) та Storm PhosphorImager.

Надмірна експресія та очищення рекомбінантних ΔFosB від клітин комах.

ΔFosB був надмірно експресований у клітинах комах Sf9 як N-кінцевий білок-heksa-His-мічений (N-His (6) ΔFosB), використовуючи систему експресії Bac-to-Bac (Invitrogen) та дотримуючись інструкцій виробника. Якщо коротко, кДНК ΔFosB (залишки 2 – 237), що передує N-кінцевій мітці афінності MGHHHHHHAG, була субклонирована в вектор pFASTBacTM1, який використовувався для генерування рекомбінантного бакуловируса. Клітини Sf9 були інфіковані рекомбінантним вірусом, і N-His (6) ΔFosB очищали від клітинних лізатів декількома хроматографічними етапами, включаючи афінну хроматографію, використовуючи нікелеву колонку (Qiagen, Valencia, Каліфорнія), аніонний обмін за допомогою колонки моно-Q (Amersham Біознавство) та виключення розмірів за допомогою гель-фільтрувальної колонки (Amersham Biosciences).

В пробірці дослідження фосфорилювання.

В пробірці Реакції фосфорилювання для перебігу часу та стехіометричного аналізу проводили в об'ємі 30 мкл, що містить субстрат 10 мкм (N-His (6) ΔFosB або субстрат з позитивним контролем), 250 мкм АТФ і 1 μCi / мкл [γ-³²P] ATP, буфер, що постачається виробником кінази, і одна з наступних кіназ: CK2 (20 нг / мкл; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 нг / мкл; Upstate), PKC (1.6 нг / мкл; Calbiochem) або p70S6K (2.5 mU / мкл; Upstate). Реакції часового курсу проводили шляхом видалення аликвоти 5 мкл з реакційного розчину у визначені часові моменти та додавання рівного обсягу 4 × зменшення буфера зразка білка Laemmli. Кінетичні параметри Майкеліса-Ментена для реакції CK2 визначалися в емпірично визначених лінійних стаціонарних умовах. Ці реакції проводили протягом 15 хв в об'ємі 10 мкл, що містить фермент 2 нг / мкл, 250 мкм АТФ, 1 мкCi / мкл [γ-³²P] концентрації АТФ та N-His (6) ΔFosB, що змінюються від 2.5 – 30 мкм. Всі реакції проводили при температурі 30 ° C на водяній бані. Після SDS-PAGE та фарбування гелю Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad) гель висушували та ³²Включення P-фосфатів оцінювали методом фосфоризування (див. Нижче, Кількісне визначення даних, розрахунки та статистичні дані).

Двовимірна карта фосфопептидів та аналіз фосфоамінокислот.

Обидва ці аналізи проводили, як описано в Плоє і Данн (2000). Коротко, сухі фрагменти гелю, що містять ³²P-мічений ΔFosB (або від пробірці реакції або з імунопреципітатів метаболічно мічених клітин), висікали, регідратували, промивали та піддавали триптичному розщепленню. Супернатант, що містить продукти триптичного травлення, ліофілізували і ліофілат промивали кілька разів і ресуспендували в 10 мкл буфера електрофорезу, pH 1.9. Зразок (3 мкл) був помічений на пластинці целюлозної тонкошарової хроматографії (TLC) (Analtech, Newark, DE) і відокремлений в одному вимірі за допомогою електрофорезу, а інший - за допомогою висхідної ТШХ. Отримані фосфопептидні карти візуалізували за допомогою авторадіографії та фосфоризування. Для аналізу фосфоамінокислот 2 мкл триптичних дайджестів, які були ресуспендовані в буфері електрофорезу, далі розщеплювали гідролізом HCl при 105 ° C протягом 25 м хв у 3 м HCl під N₂ атмосфера. Реакцію зупиняли шестикратним розведенням у воді, і суміш ліофілізували. Ліофілат ресуспендували в буфері електрофорезу 5 мкл, рН 1.9, і помітили на целюлозній TLC-планшеті разом зі стандартами фосфо-Сер, -Тр та -Тір. Електрофорез проводили на половині довжини пластини TLC, використовуючи буфер електрофорезу, pH 1.9, після чого пластину переносили в буфер pH 3.5, і електрофорез проводили до завершення. Нормативи фосфоамінокислоти візуалізували шляхом обприскування пластини ТШХ розчином нінгідрину 1% (об. / Об.) В ацетоні та ³²Зразки амінокислот, помічені P, візуалізувались як авторадіографією, так і фосфоримуванням.

siRNA-індукований CK2α збивання.

Ми використовували метод перешкод РНК для вибіркового збиття рівнів CK2 (Ді Майра та ін., 2005). Клітини PC12 висівали на покриті колагеном I-шести лунки, щоб досягти злиття ∼70 – 80% на наступний день, коли вони були тимчасово трансфіковані 20 нм (кінцева концентрація) або нецільової siRNA, або siRNA, спрямованої на мРНК каталітичного α-субодиниця щура CK2, використовуючи 5 мкл трансфекційного агента SilentFectin (Bio-Rad) та дотримуючись інструкцій виробника. Приблизно через 24 год пізніше клітини були транзитно трансфіковані плазмідою ΔFosB, як зазначено вище. Приблизно 24 год пізніше (∼48 год після трансфекції siRNA) клітини піддавали або ³²P метаболічне маркування або аналіз імпульсу, як описано вище. Наступні чотири CK2α міРНК були використані з аналогічними результатами: 5'P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 ', 5'P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3', 5'P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUU3 ', 5'P-AAAUCCCUG ACAUCAUAUUUU3' (Dharmacon, Lafayette, CO). Як негативний контроль ми використовували Глушник негативний контроль #3 siRNA від Ambion (Austin, TX). Ступінь збиття CK2 контролювали за допомогою імуноблоттінгу, використовуючи поліклональне антитіло анти-CK2 (каталог # 06-873 від Upstate) протягом ночі при розведенні 1: 1000. β-тубулін використовували в якості контролю навантаження і виявляли моноклональним антитілом (каталог № 05-661 з Upstate) протягом ночі при розведенні 1: 20,000.

Сайт-орієнтований мутагенез.

Мутація Ser27 до Ala або Asp була здійснена за допомогою набору для швидкого зміни сайтів для мутагенезу (Stratagene, La Jolla, Каліфорнія) та дотримуючись інструкцій виробника. Для введення мутацій Ser27 у білок ΔFosB миші використовувались такі праймери мутагенезу. Ser27 до Ala: (зворотний праймер) 5´GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGAGGG3 ′. Ser27 до Asp (передній праймер) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 '. Мутовані основи виділені жирним шрифтом, а кодон Ser27 - курсивом.

Біоінформатика.

Шукали потенційні сайти фосфорилювання та кінази для ΔFosB шляхом подання послідовності білка миші до спеціалізованих баз даних, включаючи ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost та ін., 2004) та NetPhosK (Блом та ін., 2004).

Кількісне визначення даних, розрахунки та статистика.

Кількість білка, присутнього в мембрані PVDF або нітроцелюлози, було кількісно визначено за допомогою Storm PhosphorImager та супровідного програмного забезпечення ImageQuant (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics). У дослідженнях клітинної культури та фосфорилювання шматочків мозку отримані значення для ³²P-мічений білок потім ділили на значення, отримані для загальної ΔFosB, і виражали у співвідношенні. В пробірці дослідження фосфорилювання, кількість ³²P-мічений ΔFosB на моль ΔFosB (стехіометрія) розраховували, як описано раніше (Сахін та ін., 2004). Всі вимірювання проводилися в межах лінійності використовуваного приладу. Кінетичні параметри обчислювались, використовуючи модель Майкласа-Ментена V = V_Макс[S] / ([S]+K_M) і V_Макс = k₂[E_{Усього:}]. Період напіввиведення (t_1/2) ΔFosB та FosB оцінювали з графіків імпульсної гонитви (використовуючи нелінійну регресію, яка найкраще відповідала точкам даних) і відповідають часу, за який кількість білка, що залишився, становить 50% від вихідного. На всіх малюнках наведені результати є репрезентативними принаймні для двох-трьох незалежних експериментів. У всіх графіках наведені дані є середніми значеннями ± SEM (3 ≤ n ≤16). Статистичну значимість відмінностей оцінювали за допомогою непарного t тест, виправлений на кілька порівнянь, і зірочки вказують p ≤ 0.05.

Попередній розділ Наступний розділ

результати

ΔFosB - незвичайно стабільний фактор транскрипції

Хоча ми раніше припускали, що ΔFosB є відносно стабільним фактором транскрипції (Nestler et al., 2001), прямий аналіз профілю обороту білка на сьогодні не проводився. Щоб вирішити це питання, ми провели експерименти з імпульсною гонитвою за допомогою клітин PC12, які широко використовувались як нейроноподібні клітинні лінії, в яких ΔFosB експресувався тимчасово через зараження рекомбінантним вірусом простого герпесу (HSV-ΔFosB). Нещодавно синтезовані білки були метаболічно марковані ³⁵S-Met / Cys та схема деградації ³⁵S-мічений ΔFosB (³⁵S-ΔFosB) контролювали шляхом імунопреципітації його з лізатів клітин, отриманих у різні моменти часу після видалення радіоактивно мічених амінокислот. Аналіз імунопреципітатів за допомогою SDS-PAGE та авторадиографії показали, що період напіввиведення ΔFosB в клітинах PC12 становить ∼10 h (Рис. 1). Ці результати показують, що період напіввиведення ΔFosB вище, ніж у більшості індукованих факторів транскрипції (див. Обговорення), включаючи повнорозмірний FosB, період напіввиведення в культурі клітин якого, як повідомляється, становить ∼90 хв (Dobrazanski et al., 1991; Carle et al. 2004). Крім того, варто зазначити, що деградація ΔFosB не відповідає кривій експоненціальної деградації першого ступеня, а швидше двофазна, починаючи з більш повільної швидкості деградації. Це говорить про існування більше одного виду ΔFosB та / або більше одного шляху деградації.

Переглянути більшу версію:

Завантажте у вигляді слайда PowerPoint

Малюнок 1.

ΔFosB - незвичайно стабільний фактор транскрипції. Період напіввиведення ΔFosB становить ∼10 год у культурі клітин. ΔFosB експресували в клітинах PC12 або інфікуванням HSV-ΔFosB, або транзиторною трансфекцією плазмідою, що містить ΔFosB, і клітини піддавали експериментам з імпульсним переслідуванням, як описано в «Матеріали та методи». Еквівалентні результати були отримані незалежно від методу, який застосовувався для перепресування ΔFosB. На малюнку показаний часовий хід (і репрезентативна авторадиограма) деградації ΔFosB. Наведені графіки даних є середнім ± SEM принаймні 15 окремих точок даних, отриманих щонайменше з п'яти незалежних експериментів. Для порівняння вказується повідомлення про період напіввиведення повнорозмірного FosB.

ΔFosB - це фосфопротеїн головного мозку

Ми висунули гіпотезу, що посттрансляційна модифікація ΔFosB може сприяти його видимій стабільності. Оскільки показано, що фосфорилювання модулює активність транскрипційних факторів багатьма способами, включаючи їх стабільність (огляд див. Desterro та ін., 2000; Вітмарш і Девіс, 2000), ми дослідили, чи є ΔFosB фосфопротеїном. З цією метою експресію ΔFosB індукували в мозку щурів за допомогою хронічного ECS, лікування, яке, як відомо, викликало високий рівень ΔFosB, особливо у лобовій корі (Hope et al., 1994a). Через день після останнього лікування ECS, коли рівень ΔFosB залишається високим, готували тонкі лобні коркові зрізи та метаболічно маркували ³²Р-ортофосфат. Паралельний набір зрізів не був радіомарк, і вони використовувались для виявлення загальних рівнів ΔFosB. Після імунопреципітації специфічним антитілом проти FosB / ΔFosB та відділення імунопреципітованих білків SDS-PAGE, фосфорильованим ³²P-мічений ΔFosB був виявлений за допомогою авторадіографії, тоді як загальний ΔFosB був виявлений імуноблотуванням. Цей аналіз показав, що ΔFosB фосфорилюється в головному мозку, про що свідчить специфіка ³²P-мічена смуга ∼35 kDa присутня в хронічно оброблених зразках мозку, але практично не виявляється в підроблених контрольних групах (Рис. 2A). Це узгоджується з тим, що за відсутності хронічної стимуляції базальні рівні ΔFosB дуже низькі. Специфічність реакції імуноосадження ілюструється відсутністю сигналу в неімунному осаді IgG.

Переглянути більшу версію:

Завантажте у вигляді слайда PowerPoint

Малюнок 2.

ΔFosB - це фосфопротеїн головного мозку. A, ΔFosB фосфорилюється в мозку. Ендогенний ΔFosB був індукований у мозку щурів хронічним лікуванням ECS, як описано в «Матеріали та методи». Лобові коркові зрізи були метаболічно марковані ³²PH₃PO₄ протягом декількох годин. Після гомогенізації зрізів ΔFosB імунопреципітували і фосфорилювали ΔFosB (³²P-ΔFosB) було виявлено за допомогою авторадиографии (верхня панель). Загальний ΔFosB у нерадіоактивних імунопреципітатах був виявлений імуноблотуванням (нижня панель). Як негативний контроль показано імунопреципітат шахрайської тварини та неімунний IgG. B, Сайти кандидата фосфорилювання та кінази з відповідними показниками прогнозування для білкової послідовності ΔFosB миші були отримані шляхом біоінформаційного аналізу. Кандидатські сайти з більш високими показниками прогнозування виділяються в послідовності білків і перераховані в таблиці. ДНК-зв'язуючий (основний) домен та лейцинова блискавка виділені жирним шрифтом у білковій послідовності. C, D, Фосфорилювання ΔFosB збільшується за рахунок інгібітора фосфатази Ser / Thr OA. C, ³²Рівень P-ΔFosB в імунопреципітатах з лобових коркових зрізів, позначених у відсутності (Ctr) або наявності 100 нг / мл ОА (графік та верхня панель), виявляли за допомогою авторадиографії. На нижній панелі показано загальний ΔFosB, виявлений у імунопреципітатах з не маркованих фрагментів шляхом імуноблотування. D, Клітини PC12 були інфіковані HSV-ΔFosB або HSV-LacZ (вектор) і метаболічно мічені ³²PH₃PO₄ за відсутності (Ctr) або наявності 100 нг / мл ОА. ³²Рівень P-ΔFosB в імунопреципітатах визначали за допомогою авторадиографии (графік, верхня панель). На нижній панелі показано загальний ΔFosB, виявлений у клітинних лізатах імуноблотуванням.

Як перший крок до з'ясування того, які кінази та сайти беруть участь у фосфорилюванні ΔFosB, ми піддавали його амінокислотній послідовності декільком біоінформатичним аналізам. Це виявило, що, хоча ΔFosB не містить сайтів-кандидатів для фосфорилювання тиру, він містить декілька сайтів консенсусу кінази Ser / Thr, включаючи три сайти CaMKII, три сайти CK2 та два сайти PKC з дуже високими показниками прогнозування фосфорилювання (Рис. 2B). Якщо, як передбачено біоінформатикою, ΔFosB фосфорилюється лише на залишках Ser або Thr, то його фосфорилювання має бути значно модульоване активністю фосфатаз Ser / Thr. Щоб перевірити цю гіпотезу, ми позначили фронтальні коркові зрізи ³²Р-ортофосфат у присутності або відсутності OA, інгібітора протеїну фосфатази Ser / Thr. Як показано в малюнок 2C, OA спричинило значне (∼2.5-кратне) збільшення у ³²P-ΔFosB. Це також спричинило невелике збільшення загального рівня ΔFosB, що узгоджується з попередніми повідомленнями, що пов'язують канцерогенні ефекти ОА зі здатністю індукувати декілька негайних ранніх генів, включаючи білки Fos (Miller et al., 1998; Choe et al., 2004). Чистий результат - значне загальне збільшення рівня фосфорильованої ΔFosB (60%).

Потім ми дослідили, чи в клітинах PC12, які піддаються експериментальній маніпуляції, ΔFosB показав фосфорилювання, подібне до того, що спостерігається в мозку. Ми експресували ΔFosB в клітинах PC12 через зараження HSV-ΔFosB і метаболічно мітили клітини ³²Р-ортофосфат у присутності або відсутності ОА. Успішна експресія та імунопреципітація білка з клітин, інфікованих HSV-ΔFosB, показана присутністю обох в імуноблоті (Рис. 2D, нижня панель) та авторадиограф (верхня панель) смуги ∼35 kDa, відсутні у заражених вектором клітинах. Як спостерігали в головному мозку, ОА спричинило невелике збільшення загального рівня ΔFosB, але значно більше (приблизно вдвічі) ³²P-ΔFosB, що призводить до значного (∼50%) чистого збільшення фосфорилювання ΔFosB. Крім того, згідно з біоінформатичними прогнозами, лікування клітин PC12 інгібітором тирфосфатази не призвело до значних змін у ³²Р-ΔFosB рівні (дані не показані). Разом ці результати виявили, що ΔFosB фосфорилюється на залишках Ser та / або Thr в мозку та в клітинах PC12, і підтвердив, що останні є хорошою системою клітинної культури, в якій надалі вивчають профілі фосфорилювання та деградації ΔFosB.

CK2, але не PKC або CaMKII фосфорилює ΔFosB пробірці

Як описано вище, аналіз послідовності амінокислот ΔFosB показав високі показники прогнозування сайтів фосфорилювання CK2, PKC та CaMKII. Щоб визначити, яка з цих кіназ може фосфорилювати ΔFosB, ми провели ряд пробірці реакції фосфорилювання з використанням очищених кіназ та очищеної рекомбінантної ΔFosB. Як показано в малюнок 3Aз трьох кандидатських кіназ лише CK2 фосфорилював ΔFosB суттєво. Крім того, кілька інших кіназ були протестовані (наприклад, GSK3 та p70S6K), але не вдалося значно фосфорилювати ΔFosB (дані не показані). Додаткова характеристика реакції CK2 методом часового курсу показала, що ця кіназа може каталізувати включення mol0.5 моль фосфату на моль ΔFosB (Рис. 3B). Те, що CK2 може фосфорилювати ΔFosB пробірці значна стехіометрія (∼50%) говорить про фізіологічно відповідну реакцію. Потім ми вивчали кінетику цієї реакції шляхом інкубації CK2 у присутності зростаючої кількості очищеного ΔFosB, і ми визначили, що CK2 фосфорилює ΔFosB з a V_Макс 5.8 пмоль · хв^-1 · Мкг^-1 ферменту, а K_M 18.4 мкм, а k_як з 0.2 / с (Рис. 3C). Значення, отримані для цих кінетичних параметрів, надалі підтверджують фізіологічну значимість цієї реакції. Наприклад, K_M CK2 для DARPP32, одного з найвідоміших субстратів, становить 3.4 мкм, і k_як становить ∼0.3 / с (Жиро та ін., 1989); то K_M для діапазонів ATP від ∼10 – 40 мкм (Cochet та ін., 1983; Silva-Neto та ін., 2002), а значення для казеїну становить від ∼10 – 50 мкм (Meggio та ін., 1977; Pyerin та ін., 1987). Ці дані разом указують на те, що ΔFosB є добросовісним субстратом для CK2 пробірці.

Переглянути більшу версію:

Завантажте у вигляді слайда PowerPoint

Малюнок 3.

CK2, але не PKC або CaMKII фосфорилює ΔFosB пробірці. Авторадіограф (верхня панель) показує фосфорильований продукт, а забарвлений Кумассі гель (нижня панель) показує загальний ΔFosB, присутній у реакції. A, Очищеному рекомбінантному ΔFosB піддавали пробірці фосфорилювання різними кандидатними кіназами (три з них показані). B, Часовий хід і стехіометричний аналіз показують, що CK2 може фосфорилювати ΔFosB пробірці зі стехіометрією ∼50%. CКінетичний аналіз реакції CK2 виявив, що ΔFosB є добросовісною пробірці субстрат. Лінеаризація реакції показана на подвійному зворотному діаграмі (знизу), але кінетичні параметри були виведені з кривої Майкеліса-Ментена (вгорі).

CK2 модулює фосфорилювання та стабільність ΔFosB в інтактних клітинах

Для оцінки фізіологічної відповідності CK2-опосередкованого фосфорилювання ΔFosB нами було проведено порівняльне картографування фосфопептидів з використанням пробірці фосфорильований і PC12-клітинно-фосфорильований ΔFosB. Після SDS-PAGE та елюювання гелю ³²P-ΔFosB (від пробірці реакції або з імунопреципітату ³²P-мічені клітини) білок засвоювали трипсином, а отримані фосфопептиди піддавали двовимірному поділу. Цей аналіз показав, що основний фосфопептид із реакції CK2 поєднується з одним з двох основних фосфопептидів з ΔFosB, фосфорильованих у клітинах PC12 (Рис. 4A), тоді як фосфопептиди, отримані в результаті реакції PKC або CaMKII (дані не показані), не мали. На карті був присутній другий фосфопептид ΔFosB з клітин PC12, але через неможливість жодної з кіназ ми перевірили генерувати подібний фосфопептид пробірціВ даний час ми не знаємо, чи містить цей другий фосфопептид сайт фосфорилювання, відмінний від іншого фосфопептиду, чи він являє собою окремий триптичний пептид, що містить той самий сайт фосфорилювання.

Переглянути більшу версію:

Завантажте у вигляді слайда PowerPoint

Малюнок 4.

CK2 модулює фосфорилювання та стабільність ΔFosB в інтактних клітинах. ACK2, але не PKC, схоже, фосфорилює ΔFosB у клітинах. Двовимірні фосфопептидні карти ΔFosB, фосфорильовані CK2 або PKC пробірці або інтактними клітинами PC12. Стрілки показують комбіграцію CK2-фосфорильованого пептиду, але не PKC-фосфорильованого, з одним із фосфопептидів ΔFosB, отриманих із клітин PC12. B, Фосфорилювання ΔFosB у клітинах PC12 збільшується при обробці клітин потужним сперміном активатора CK2 (SP) та зменшується при лікуванні DRB-інгібітором CK2. Навпаки, на фосфорилювання ΔFosB в клітинах PC12 не впливало лікування активатором PKC (PMA) або специфічним для PKC інгібітором кальфостином-C (Calph). Показані репрезентативна авторадиограма (верхня панель) та імуноблот (нижня панель). C – F, Вплив активності CK2 на стабільність ΔFosB. На малюнках показано часовий хід (і репрезентативна авторадиограма) деградації ΔFosB. Клітини PC12, що минуло експресують ΔFosB, піддавали експериментам з імпульсною гонитвою, проведеним у відсутності або наявності DRB-інгібітора CK2 (C), спермін активатора CK2 (D), або інгібітор кінази широкого спектра дії H-8 (E), який використовувався для контролю за неспецифічними ефектами ДРБ. F, Вплив збивання каталітичної субодиниці CK2 на стабільність ΔFosB. Клітини PC12 трансфікували або ненаціленою siRNA (Ctr), або siRNA, орієнтованою на щура CK2α, і 24 h пізніше трансфікували плазмідою ΔFosB. На верхній панелі зображені імуноблоти цільноклітинні лізати, що показують вплив siRNA CK2 на рівень білка CK2 та ΔFosB. Відповідний імуноблот для β-тубуліну показаний як контроль навантаження.

Для подальшого вирішення фізіологічної актуальності CK2 як кінази ΔFosB, ми лікували клітини PC12, що експресують ΔFosB, двома препаратами, що модулюють активність CK2. Як показано в малюнок 4B, Фосфорилювання ΔFosB знижувалося обробкою клітин PC12 клітковиннопроникним інгібітором CK2 DRB (Meggio та ін., 1990; Szyszka та ін., 1995), і збільшується при лікуванні сперміном поліаміну, як відомо, є потужним активатором CK2 (Cochet and Chambaz, 1983; Meggio та ін., 1983). На відміну від цього, лікування клітин PC12 інгібітором PKC кальфостином-C (Kobayashi et al., 1989; Tamaoki та ін., 1990) або активатор ПКК РМА (Шмідт і Гекер, 1975; Бех та ін., 1989) не призвели до значних змін фосфорилювання ΔFosB. У випадку ПМА незначне (і не суттєве) збільшення ³²P-ΔFosB можна пояснити збільшенням загального рівня ΔFosB, спричиненим цим препаратом; насправді повідомлялося, що ефіри форболу викликають експресію кількох білків сімейства Fos, включаючи FosB (Йоза та ін., 1992; Suh et al., 2004). Крім того, обробка клітин специфічним для клітини проникним інгібітором CaMKII m-AIP (Ісіда і Фуджісава, 1995; Stevens et al., 1999) також не призвело до зниження фосфорилювання ΔFosB (дані не показані). Разом ці результати узгоджуються з нашими пробірці Отримані дані свідчать про те, що в інтактних клітинах ΔFosB, ймовірно, фосфорилюється CK2, але не PKC або CaMKII. Той факт, що інгібування CK2 не повністю запобігає фосфорилюванню ΔFosB, свідчить про існування додаткових ділянок фосфорилювання в білку.

Далі ми дослідили, чи грає CK2 роль у обороті ΔFosB і, таким чином, у його стабільності. З цією метою ми провели експерименти з імпульсною гонитвою, використовуючи клітини, що експресують ΔFosB PC12, обробляють або інгібітором CK2, або активатором CK2, що використовується в дослідженні фосфорилювання. Як показано в малюнок 4C, обробка клітин інгібітором CK2 DRB суттєво вплинула на швидкість обороту ΔFosB, що підтверджується зміною форми кривої її деградації, від двофазної до кривої, ближчої до експоненціальної розпаду. І навпаки, наявність сперміну активатора CK2 спричинило значне зниження швидкості деградації ΔFosB, що призвело до накопичення білка протягом перших годин погоні (Рис. 4D).

Як і у випадку з багатьма активаторами та інгібіторами кінази, спермін та DRB можуть мати метаболічний вплив поза модуляцією активності CK2. Насправді, показано, що DRB інгібує кіназу асоційованого фактора транскрипції IIH (TFIIH) (Янкулов та ін., 1995), що призводить до інгібування транскрипції, опосередкованої II РНК-полімеразою. Оскільки цей ефект міг би вплинути на стабільність ΔFosB, ми проаналізували дію інгібітора кінази широкого спектру H-8 (Хідака і Кобаяші, 1992) на оборот ΔFosB при концентрації (200 мкм), яка, як відомо, інгібує кіназу, пов'язану з TFIIH, але не CK2 (Янкулов та ін., 1995). Як показано в малюнок 4E, лікування H-8 не впливало на швидкість обороту ΔFosB. Аналогічні результати були отримані з H-7, іншим інгібітором кінази широкого спектру дії, застосовуваним у концентрації, яка інгібує TFIIH-асоційовану кіназу, але не CK2 (дані не показані). Ці дані надалі підтверджують інтерпретацію, що зниження стійкості ΔFosB, спричинене DRB, швидше за все, пояснюється пригніченням CK2.

Для подальшого встановлення ролі CK2 у обороті ΔFosB, ми дослідили наслідки збиття CK2 через siRNA. Ми виконували ці експерименти, використовуючи клітини PC12, які вперше були заражені контрольною (нецілевою) siRNA або siRNA, яка націлена на мРНК каталітичної субодиниці щура CK2 (CK2α) і 24 h, пізніше трансфікованих ΔFosB. Як показано в малюнок 4F, трансфекція сиРНК CK2α ефективно та конкретно збила рівні білка CK2α, не впливаючи на рівні ΔFosB (верхня панель). Імпульсний аналіз погоні показав, що збиття CK2 призвело до значного збільшення швидкості обороту ΔFosB, про що свідчить швидша деградація білка. Той факт, що інгібування активності CK2 (чи то через лікування DRB чи siRNA) збільшує оборот ΔFosB і призводить до зникнення компонента двофазної кривої у повільному темпі, тоді як активація CK2 посилює повільну фазу кривої, забезпечує сильну підтримку ідея, що CK2 відіграє певну роль у регулюванні стабільності ΔFosB.

CK2 фосфорилює ΔFosB на Ser27

Для початку ідентифікації сайтів на ΔFosB, фосфорильованого CK2, ми провели фосфо-амінокислотний аналіз рекомбінантного ΔFosB, фосфорильованого CK2 пробірці і фосфорильованого ΔFosB у клітинах PC12. Ці експерименти показали, що в обох випадках виявлена лише фосфо-амінокислота - фосфо-сер (Рис. 5A). Цей висновок разом із стехіометрією, отриманою для CK2 пробірці реакція фосфорилювання (∼50%) (Рис. 3B) та наявність лише однієї значної плями на карті фосфопептидів CK2 (Рис. 4A) припускає, що фосфорилювання CK2 ΔFosB, ймовірно, обмежене одним сериновим залишком. Цей висновок узгоджується з аналізом сайту фосфорилювання консенсусу (Рис. 2B), який передбачив лише один кандидат серин, тобто Ser27, для CK2. Таксономічний аналіз показав, що Ser27 дуже зберігається завдяки еволюції серед членів сім'ї Фос (Рис. 5B), припускаючи, що він може нести важливу фізіологічну функцію.

Переглянути більшу версію:

Завантажте у вигляді слайда PowerPoint

Малюнок 5.

CK2 Фосфорилює ΔFosB на Ser27. A, Аналіз фосфоамінокислоти CK2-фосфорильованого (пробірці) і PC12 клітини-фосфорильовані ΔFosB, показуючи, що в обох випадках основним залишком фосфорильованого залишку є серин. BМіжвидовий аналіз послідовності амінокислот FosB / ΔFosB виявив високу збереженість Ser27 серед членів сім'ї Фос від людини до зебрафи (темна родзинка) Однак кислотний залишок у положенні + 3, який необхідний для консенсусного сайту CK2, не зберігається (світле виділення). C, Клітини HeLa минущо трансфікували або диким типом ΔFosB (WT), або ΔFosB, що містить точкову мутацію для заміни Ser27 на Ala (S27A). Клітини були метаболічно мічені ³²PH₃PO₄ і обробляють носієм або сперміном (SP) для активації CK2. Показані репрезентативна авторадиограма (верхня панель) та імуноблот (нижня панель) отриманих імунопреципітатів ΔFosB. Показано імунопреципітат макетно-трансфікованих клітин (вектор).

Щоб визначити, чи є Ser27 фосфорильованим у ΔFosB, ми мутували цей залишок до Ala та аналізували наслідки для фосфорилюючого статусу білка. З цією метою ми використовували клітини HeLa (які можна трансфікувати з більшою ефективністю) для тимчасової експресії або WT, або S27A мутанта ΔFosB. Приблизно 24 год після трансфекції клітини метаболічно мітили ³²Готували Р-ортофосфат і цільноклітинні лізати. Після імуноосадження та SDS-PAGE, ³²P-ΔFosB виявляли за допомогою авторадіографії, а загальний ΔFosB - імуноблотуванням. Як показано в малюнок 5C (нижня панель), ΔFosB не був виявлений у трансфікованих вектором клітинах, тоді як клітини, трансфіковані або мутантами WT, або S27A мутантами ΔFosB, успішно експресували білок. Ми виявили, що мутація S27A викликала значне (∼30%) зниження у ³²Р-ΔFosB рівні (Рис. 5C, верхня панель та графік), що вказує, що у живих клітинах ΔFosB фосфорилюється на Ser27. Намагаючись встановити, чи дійсно в клітинах Ser27 фосфорилюється CK2, ми порівняли здатність сперміну активатора CK2 модулювати фосфорилювання WT та S27A ΔFosB. Як ми вже спостерігали в клітинах PC12 (Рис. 4B), обробка клітин HeLa сперміном значно підвищила фосфорилювання білка WT. Той факт, що цей ефект був значно зменшений мутацією S27A (Рис. 5C) підтримує інтерпретацію, що Ser27 в ΔFosB є фізіологічним субстратом для CK2.

Фосфорилювання Ser27 регулює стабільність ΔFosB

Встановивши, що стабільність ΔFosB знижується при гальмуванні CK2 та посиленні при активації CK2 (Рис. 4), і що CK2 фосфорилює ΔFosB на Ser27 (Рис. 5) ми прогнозували, що запобігання фосфорилювання цього сайту повинно дестабілізувати білок. Імпульсні експерименти, проведені з клітинами HeLa, що експресують мутант WT або S27A мутантами ΔFosB, показали, що, як було передбачено, мутація S27A призводила до значного збільшення швидкості деградації ΔFosB та супутнього зниження періоду напіввиведення білка. (Рис. 6A). Потім ми дослідили, чи існує цей регуляторний механізм у більш нейроноподібній лінії клітин PC12. Ці експерименти показали, що, як ми спостерігали в клітинах HeLa, точкова мутація S27A спричиняє різке зниження періоду напіввиведення ΔFosB в клітинах PC12 (від ∼11 до ∼4 год) (Рис. 6B). Той факт, що ця дестабілізація є подібною до тієї, що викликана гальмуванням або збиванням CK2 (Рис. 4) надає додаткову підтримку ідеї про те, що опосередковане CK2 фосфорилювання Ser27 регулює стабільність ΔFosB. Додаткові докази регуляторної ролі фосфорилювання Ser27 у обороті білка ΔFosB були отримані за допомогою фосфоміметичного Ser27 до мутації Asp (S27D). Мутація S27D вважається фосфоміметичною, оскільки вона розміщує велику негативно заряджену (карбоксильну) групу в амінокислоті 27 і тим самим частково імітує фосфорилювання Ser27. Як показано в малюнок 6C, мутація S27D викликала протилежний ефект мутації S27A і призвела до білка, значно стабільнішого, ніж білок WT. Аналогічно ефекту, отриманому після активації CK2 (Рис. 4D), мутація S27D призвела до накопичення і, таким чином, підвищила рівень ΔFosB протягом перших годин погоні.

Переглянути більшу версію:

Завантажте у вигляді слайда PowerPoint

Малюнок 6.

Фосфорилювання Ser27 регулює стабільність ΔFosB. A, C, Імпульсно-погонний аналіз, що показує вплив фосфорилювання Ser27 на швидкість обороту ΔFosB. Показані профіль деградації та розрахунковий період напіввиведення дикого типу ΔFosB (WT), мутант Ser27 до Ala (S27A) та фосфоміметичний мутант Ser27 to Asp (S27D). Такі ж результати були отримані в клітинах HeLa (A) і комірки PC12 (B, C).

Фосфорилювання Ser27 стабілізує ΔFosB, запобігаючи його протеасомну деградацію

Для початку з'ясування механізму, за допомогою якого фосфорилювання Ser27 стабілізує ΔFosB, ми вивчили здатність інгібіторів протеасоми MG132 (Palombella та ін., 1994; Цубукі та ін., 1996) та епоксоміцин (Ганада та ін., 1992; Kim et al., 1999) для модуляції швидкості деградації WT і S27A мутанта ΔFosB. Експерименти з імпульсною гонитвою проводили з використанням клітин PC12, заражених рекомбінантним ВПГ, що експресує або WT, або S27A ΔFosB, і обробляли або DMSO, або одним з двох інгібіторів протеасоми. Ці експерименти показали, що хоча швидкість деградації білка WT є відносно нечутливою до наявності будь-якого з двох інгібіторів протеасоми (Рис. 7A), що мутант S27A чутливий до цих препаратів (Рис. 7B). Це вказує на те, що, на відміну від білка WT, мутант S27A є мішенню протеасомальної деградації. Дійсно, обробка клітин або MG132, або епоксоміцином повністю відмінила вплив мутації S27A на швидкість деградації ΔFosB, що підтверджується збільшенням періоду напіввиведення мутанта S27A від ∼4 до ∼9 h для MG132 та до ∼ 12 год для епоксоміцину (Рис. 7B). Разом ці результати свідчать про те, що фосфорилювання ΔFosB на Ser27 захищає білок від протеазомальної деградації і тому має важливе значення для його незвичної стійкості.

Переглянути більшу версію:

Завантажте у вигляді слайда PowerPoint

Малюнок 7.

Фосфорилювання Ser27 стабілізує ΔFosB, запобігаючи його протеасомну деградацію. A, B, Імпульсний аналіз погоні з інфікованими ВПГ клітинами PC12, що показує профіль деградації та прогнозований період напіввиведення дикого типу ΔFosB (A) або S27A ΔFosB (B) за відсутності або наявності будь-якого з двох інгібіторів протеасоми [MG132 та епоксоміцину (Epoxo)]. Зверніть увагу на той факт, що жоден препарат не має істотного впливу на оборот дикого типу ΔFosB, тоді як обробка клітин інгібітором протеасоми призводила до стабілізації S27A ΔFosB. C, Модель ролі фосфорилювання Ser27 у здатності ΔFosB опосередковувати довготривалу пластичність мозку. Після індукування частина ΔFosB стабілізується в мозку за допомогою CK2-опосередкованого фосфорилювання S27. Це призводить до її накопичення, що, в свою чергу, призводить до тривалих змін експресії генів. Ці стійкі зміни експресії генів сприяють стабільній адаптації до поведінки. І навпаки, дефосфорилювання S27 фосфатазами Ser / Thr PP1 та / або PP2A призводить до дестабілізації білка та його переробки протеасомною технікою.

Попередній розділ Наступний розділ

Обговорення

У цьому дослідженні ми показуємо, що ΔFosB має період напіввиведення ∼10 h у клітинній культурі, що робить його стабільним порівняно з повнорозмірним FosB та більшістю інших індуцибельних факторів транскрипції, період напіввиведення в культурі клітин може бути таким же коротким за кілька хвилин і рідко перевищують 3 год (Ханн та Айзенман, 1984; Dobrazanski et al., 1991; Робертс та Уайтлау, 1999; Ferrara та ін., 2003; Хірата та ін., 2004). Крім того, ми виявляємо, що ΔFosB фосфорилюється в мозку і що його фосфорилювання чутливе до інгібітора PP1 / PP2A окадаїнової кислоти. Наші дослідження клітинної культури демонструють, що стабільність ΔFosB модулюється CK2, і більш висока активність CK2 стабілізує білок. Нарешті, наші висновки дозволяють припустити, що CK2 фосфорилює ΔFosB на високозбереженому N кінцевому серині (S27) і демонструє, що фосфорилювання S27 захищає ΔFosB від протеасомної деградації. Тому ми пропонуємо модель, згідно з якою фосфорилювання ΔFosB на S27 CK2 є критичним регуляторним механізмом обороту ΔFosB (Рис. 7C). Така опосередкована фосфориляцією стабілізація ΔFosB є функціонально важливою, оскільки показано, що підвищений рівень ΔFosB в окремих областях мозку безпосередньо регулює численні гени нейронів в природних умовах та чинити сильні поведінкові ефекти у тваринних моделей декількох нервово-психічних розладів (див. Вступ).

Хоча фосфорилювання є швидким і оборотним способом регулювання транскрипційної активності певних факторів транскрипції, таких як CREB (зв'язуючий білок елемента відповіді cAMP) (Bohmann, 1990) модулювання деградації факторів транскрипції забезпечує ще більш потужну (менш легко оборотну) форму регулювання (Desterro та ін., 2000). До факторів транскрипції, функціональна активність яких регулюється на рівні їх деградації, включає NFκB (Desterro та ін., 2000), c-Myc (Sears et al., 1999) та c-Fos (Ferrara та ін., 2003), серед інших. У багатьох випадках фосфорилювання є ключовим регулятором стабільності фактора транскрипції, як це було показано для c-Fos (Оказакі та Сагата, 1995; Цурумі та ін., 1995), Пов'язаний з Fos антиген-1 (Fra-1) (Флакон і Маршалл, 2003), Fra-2 (Manabe та ін., 2001), c-червень (Fuchs et al., 1996), Черв (Fuchs et al., 1997), ATF2 (Fuchs et al., 2000) та p53 (Buschmann та ін., 2001). Таким чином, наші дослідження додають ΔFosB до цього переліку факторів транскрипції, функціональна активність яких регулюється завдяки його фосфорильованій стійкості.

CK2 - це всюдисуща і активна в дію кіназа Ser / Thr, яка має> 300 передбачуваних субстратів, ідентифікованих до цього часу і бере участь у багатьох біологічних процесах, включаючи загибель та виживання клітин (Літчфілд, 2003; Unger та ін., 2004), реакції клітинного стресу (Yanagawa та ін., 1997; Като та ін., 2003), відновлення ДНК та ремоделювання хроматину (Barz та ін., 2003; Крон та ін., 2003). Більше третини передбачуваних субстратів CK2 - це білки, які беруть участь у регуляції експресії генів (Меггіо і Пінна, 2003). Фактично, CK2 був показаний як чільна ядерна кіназа (Крек та ін., 1992) (для огляду, див Yu et al., 2001) та взаємодіяти з доменами bZIP декількох факторів транскрипції (Ямагучі та ін., 1998). Показано, що фосфорилювання, опосередковане CK2, також модулює деградацію (або посилюючи, або зменшуючи) багатьох білків, включаючи IkB (Schwarz та ін., 1996), PTEN (Торрес і Пулідо, 2001), лінзовий коннексин (Yin et al., 2000), асоційований з хроматином білок HMG1 (Wisniewski та ін., 1999) та кілька факторів транскрипції, таких як HMGB (Stemmer et al., 2002), Myf-5 (Winter et al., 1997) і c-Myc (Channavajhala і Seldin, 2002). CK2 є найпоширенішим у мозку (Alcazar та ін., 1988; Жиро та ін., 1990), і його діяльність була пов'язана з багатьма аспектами функції мозку, включаючи виживання нейронів (Boehning та ін., 2003), диференціація (Nuthall та ін., 2004), функція іонного каналу (Джонс і Якель, 2003; Bildl та ін., 2004), а також довгострокове потенціювання та пластичність нейронів (Діаз-Нідо та ін., 1992; Ліберман і Моді, 1999; Рейхардт та ін., 2003).

Незважаючи на це зростаючі докази ролі CK2 у регуляції функції нейронів, мало що відомо про те, що контролює його активність. Вважається, що CK2 є конститутивно активним, регулюючи його здатність фосфорилювати специфічні субстрати, в основному покладаючись на зміни внутрішньоклітинної локалізації (наприклад, цитозол проти ядра) (Ахмед і Тауфік, 1994; Yu et al., 1999). Ця інформація викликає важливе питання щодо того, які сигнали потрібні для індукції накопичення ΔFosB в мозку після хронічної стимуляції (Рис. 7C). Однією з вимог є повторна активація fosB ген та індукція мРНК ΔFosB (Chen et al., 1995). Наші дані свідчать про те, що фосфорилювання KFosB CK2 є критично важливим для його стабільності, що дозволяє припустити, що для тривалого впливу ΔFosB на експресію гена може знадобитися другий сигнал, а саме сигнал, який стимулює фосфорилювання білка CK2. Це може включати активацію CK2 деяким невідомим механізмом або його транслокацію до ядра. Альтернативно, фосфорилювання CK2 ΔFosB може бути конститутивним, таким, що як білок ΔFosB перекладається у відповідь на кожен подразник, частина його фосфорилюється і тим самим стабілізується, так що при повторній стимуляції він накопичується до високого рівня в уражених нейронах.

Наші результати показують, що CK2 і S27, ймовірно, не є єдиною кіназою та ділянкою, відповідальною за фосфорилювання ΔFosB, оскільки ні інгібування CK2, ні мутація S27A не змогли повністю запобігти фосфорилюванню ΔFosB. Таким же чином, той факт, що мутація S27A призводить до зниження 30% зниження фосфо-ΔFosB, стверджує, що S27 є основним місцем фосфорилювання білка. Ми, однак, досліджуємо інші кінози та сайти фосфорилювання на ΔFosB. Зрештою, важливим буде також аналіз фосфорилювання S27 та будь-яких інших ділянок фосфорилювання в ΔFosB у мозку в природних умовах після різних видів хронічної стимуляції, наприклад, шляхом використання мас-спектрометрії або фосфоспецифічних антитіл.

Як згадувалося вище, S27 в ΔFosB дуже зберігається протягом еволюції та серед інших білків сімейства Fos. Однак сайт консенсусу для CK2 не такий: як показано в малюнок 5B, тільки FosB / ΔFosB (і ксенолог Zebrafish), але не c-Fos або Fra-2, мають кислотний залишок при + 3, ключовий детермінант фосфорилювання CK2 (Марин та ін., 1986; Meggio та ін., 1994). Таким чином, відсутність фосфорилювання CK2 на S27 може пояснити, чому інші білки сімейства Фос не такі стабільні, як ΔFosB. Однак це не пояснює, чому повнорозмірний FosB, який має той самий сайт консенсусу CK2, як ΔFosB, не є аналогічно стабілізованим. Ми не знаємо, чи повнорозмірний FosB фосфорилюється CK2 на цьому збереженому залишку. Єдині звіти FosB (Скіннер та ін., 1997) та c-Fos (Оказакі та Сагата, 1995; Chen et al., 1996) фосфорилювання описують ділянки в С-кінцевій області цих білків, яка відсутня в ΔFosB. Потенційне фосфорилювання повнорозмірних білків FosB та інших білків сімейства Fos за допомогою CK2 вимагає прямого дослідження. Однак, навіть якщо вони фосфорильовані, відомо, що інші білки сімейства Fos містять мотиви на своїх C-термінах, які спрямовані на білки для швидкої деградації (Papavassiliou та ін., 1992; Jariel-Encontre та ін., 1997; Acquaviva та ін., 2002). Наприклад, було показано, що розтягнення ∼21 залишків, присутніх у кінцевому вікні С усіх білків сімейства Fos, але відсутні у ΔFosB, діє як дестабілізуючий домен для c-Fos (Acquaviva та ін., 2001). Ми виявили, що хоча ця послідовність аналогічно дестабілізує повноформатний FosB (Carle et al., 2004), відсутність цього домену в ΔFosB не повністю пояснює його стабілізацію. Швидше за все, поєднання відсутності цього термінального домену С та фосфорилювання Ser27, здається, повністю пояснює приблизно п’ятикратну різницю стійкості між ΔFosB та FosB.

Хоча деградація білків сімейства Фос є складною і не повністю зрозумілою, протеасомна деградація, здається, є головним шляхом, який бере участь (Сальват та ін., 1999; Acquaviva та ін., 2002; Ferrara та ін., 2003). Тут представлені дані, в яких протеасомальні інгібітори не суттєво змінюють швидкість деградації ΔFosB, стверджують, що, на відміну від інших білків сімейства Fos, ΔFosB ухиляється від протеасоми 26S, і це відіграє центральну роль у її стабілізації. Тому ми пропонуємо схему, згідно з якою підвищену стабільність ΔFosB можна віднести до поєднання двох основних факторів: (1) відсутності С-кінцевого дестабілізуючого домену та (2) фосфорилювання S27 за допомогою CK2.

Підсумовуючи це, це дослідження дає механістичне розуміння того, чому ΔFosB, продукт гена негайного раннього раннього періоду fosB, є, на відміну від усіх інших членів сім'ї Фос, відносно довгоживучим білком. Хоча, як вважається, інші білки сімейства Fos опосередковують швидку, але минущу трансляцію стимуляції транскрипції (Морган і Куран, 1995), відносна стабільність ΔFosB надає йому здатності опосередковувати триваліші зміни транскрипції, викликані хронічною стимуляцією. Це підтверджує думку, що ΔFosB функціонує як стійкий молекулярний перемикач у мозку, поступово перетворюючи гострі реакції в хронічні адаптації. Ідентифікація фосфорилювання Ser27 як центрального механізму стабільності ΔFosB відкриває нові шляхи розробки засобів регулювання функції ΔFosB і тим самим модулює його тривалий вплив на нейронну та поведінкову пластичність.

Попередній розділ Наступний розділ

Виноски

Отримано листопад 21, 2005.
Редакція отримала лютий 21, 2006.
Прийнято квітня 2, 2006.

Ця робота була підтримана Національним альянсом за дослідження шизофренії та депресії молодим слідчим ПГУ, Національним інститутом зловживання наркотиками (NIDA), Національною науково-дослідною службою ПГУ, та грантами Національного інституту психічного здоров’я та NIDA EJN We подякуйте доктору Джеймсу Біббу за допомогу у справі пробірці аналізи фосфорилювання, доктор Мін-Ху Хан за допомогу в приготуванні мозкових зрізів, які використовуються для метаболічного маркування, та доктор Рахаель Нев за допомогу в упаковці рекомбінантних ВПГ.
Поточна адреса Г. Руденка: Інститут наук про життя та Факультет фармакології Мічиганського університету, проспект Вашингтон 210, №3163А, Ен-Арбор, штат Мічіган 48109-2216.
Кореспонденцію слід адресувати Еріку Дж. Нестлеру, 5323 бульвару Гаррі Хайнса, Даллас, TX 75390-9070. Електронна пошта: [захищено електронною поштою]

Попередній розділ

посилання

Acquaviva C, Brockly F, Ferrara P, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) Ідентифікація мотива трипептиду С-кінцевого, що бере участь у контролі швидкої протеасомальної деградації прото-онкопротеїну c-Fos під час фазового переходу G (0) -to-S. онкоген 20:7563–7572.

абстрактний

Вступ

Матеріали та методи

Клітинні лінії ссавців та структури ДНК.

Імпульсно-погонні експерименти.

Тварини та лікування хронічних електроконвульсивних припадків.

32 P метаболічне маркування.

Хімічні засоби та способи лікування клітинної культури.

Імуноосадження ΔFosB, імуноблотінг та авторадиографія.

Надмірна експресія та очищення рекомбінантних ΔFosB від клітин комах.

В пробірці дослідження фосфорилювання.

Двовимірна карта фосфопептидів та аналіз фосфоамінокислот.

siRNA-індукований CK2α збивання.

Сайт-орієнтований мутагенез.

Біоінформатика.

Кількісне визначення даних, розрахунки та статистика.

результати

ΔFosB - незвичайно стабільний фактор транскрипції

ΔFosB - це фосфопротеїн головного мозку

CK2, але не PKC або CaMKII фосфорилює ΔFosB пробірці

CK2 модулює фосфорилювання та стабільність ΔFosB в інтактних клітинах

CK2 фосфорилює ΔFosB на Ser27

Фосфорилювання Ser27 регулює стабільність ΔFosB

Фосфорилювання Ser27 стабілізує ΔFosB, запобігаючи його протеасомну деградацію

Обговорення

Виноски

посилання

Статті з посиланням на цю статтю

Швидкі посилання

³² P метаболічне маркування.