Nat Neurosci. Авторський рукопис; доступний у PMC 2016 Jan 15.
Опубліковано в остаточному форматі:
Nat Neurosci. 2014 травень; 17 (5): 704 – 709.
Опубліковано онлайн 2014 квітня 6. doi: 10.1038 / nn.3694
PMCID: PMC4714770
NIHMSID: NIHMS574802
Інго Віллен,1,2,3,* Лорен М. Бургено,1,2 Петро Олександрович Гроблевський,2 та Пол Е. М. Філіпс1,2
Остаточна редагована версія цієї статті видавця доступна за адресою Nat Neurosci
Див. Коментар “Втрата фазової дофамінової сигналізації: новий маркер залежності"в Nat Neurosci, том 17 на сторінці 644.
Див. Інші статті у PMC cite опублікованої статті.
абстрактний
Наркоманія - це нервово-психічний розлад, який відзначається ескалацією вживання наркотиків. Нейромедіація дофаміну в вентромедіальному стриатумі (ВМС) опосередковує гострий підсилюючий ефект зловживаних препаратів, але при тривалому застосуванні дорсолатеральний стриатум (DLS) бере на себе контроль над пошуком наркотиків. Ми вимірювали смугастий викид дофаміну під час режиму самовведення кокаїну, який спричинив ескалацію прийому наркотиків у щурів. Дивно, але ми виявили, що фазовий дофамін зменшився в обох регіонах, оскільки швидкість споживання кокаїну зростала; при цьому зменшення дофаміну у ВМС значно корелює зі швидкістю ескалації. Введення попередника дофаміну L-DOPA у дозі, яка поповнювала дофамінову сигналізацію у VMS, повертала ескалацію, тим самим демонструючи причинно-наслідковий зв’язок між зменшеною передачею дофаміну та надмірним вживанням наркотиків. Таким чином, ці дані разом дають механістичне та терапевтичне розуміння надмірного споживання наркотиків, яке виникає після тривалого вживання.
ВСТУП
Зловживання наркотиками тісно пов'язане з вивільненням дофаміну в стриатумі1,2. Однак зміни, пов'язані із вживанням наркотиків, у нейротрансмісії дофаміну різняться за тривалістю та субрегіоном3-5. Повільне підвищення внутрішньоклітинної концентрації дофаміну в вентрамедіальному стриатумі (ВМС), стимульоване багатьма зловживаннями наркотиками, включаючи кокаїн6, як передбачається, відображають зміцнюючі властивості лікарських засобів7, оскільки тварини регулюють свою швидкість самостійного введення кокаїну з метою підтримки підвищеного рівня навколишньої концентрації дофаміну8. У рамках VMS повідомлялося про перекриваються певні ролі дофамінової сигналізації в ядрі та оболонці субрегіонів ядерних ядер, але з акцентом на оболонку для опосередкування первинної винагороди за лікарський засіб та серцевину, що виступає субстратом для умовного посилення1. Дійсно, фазовий вивільнення дофаміну в ядрі, що накопичується в ядрі, триває протягом декількох секунд, обумовлюється поданням стимулів навколишнього середовища, які неодноразово поєднувалися з препаратом.9-12 і здатний контролювати пошук та прийом наркотиків9. Кодування таких умовних подразників вивільненням дофаміну виявляється також у сенсомоторних аспектах стриатуму (дорсолатеральний стриатум, DLS)13, смугастий субрегіон, який був пов'язаний з розвитком звичного та нав'язливого пошуку наркотиків14-16. Таким чином, прогресування прийому наркотиків за межі рекреаційного вживання вважається відображенням участі дофамінової сигналізації в різних смугастих субрегіонах.1,17, з акцентом переходу від лімбічної (VMS) до сенсомоторної (DLS) стриатуму під час розвитку усталеної поведінки, яка шукає наркотики1,18. Однак, невідомо, чи змінюється кодування дії, пов’язаної з наркотиками, або стимулів фазовими дофамінами, коли помірне поводження з прийомом наркотиків посилюється.
Парадигми гризунів, які вважаються найкращими моделями переходу від помірного вживання наркотиків до залежності, використовують тривалий доступ до наркотиків19,20, наприклад, розширення доступу з одного (короткий доступ, ShA) до шести годин (довгий доступ, LgA) на день протягом тижня21. Такий режим самовведення препарату здатний виробляти ескалацію21 та нав'язливий пошук наркотиків22, серед інших кардинальних симптомів, що характеризують залежність від речовин у людини23. Тут ми перевірили, як LgA до кокаїну впливає на регіональну динаміку фазової дофамінової сигналізації в смузі, який раніше характеризувався під час стабільного вживання наркотиків SHA13 щоб краще зрозуміти нейробіологічні механізми, що лежать в основі ескалації вживання наркотиків.
РЕЗУЛЬТАТИ
Самців-щурів Wistar, що містять внутрішньовенні катетери, навчали самостійно вводити кокаїн під час щоденних сеансів SHA, а після їх придбання було переведено на сеанси LgA в камерах, оснащених двома портами, що вводять нос. Ніс поштовхом до активного порту викликав вливання кокаїну (0.5 мг / кг / інфузія) та 20-s подання стимулу світлого тону за фіксованим інтервалом (FI) 20 графіком посилення. Відповіді у другому (неактивному) порту, що просунувся носом, або в активному порту під час подання стимулу (тайм-аут 20-s), не мали програмованих наслідків. Для цілей звітності реакції на тик носа в активному порту поза періодом очікування (тобто ті, що викликали вливання кокаїну) називаються «активними носовими засобами», а ті, що знаходяться в неактивному порту поза тимчасовим періодом, як «неактивні ніс тикає ». Кількість активних притискань до носа значно перевищила неактивні носові судини (основний ефект носового порту: F(1, 23) = 383.226, P <0.001; Рис. 1) протягом кожного тижня (P <0.001). Після переходу з ША на LgA споживання кокаїну з часом значно зросло (основний ефект тижня: F(3, 69) = 25.504, P <0.001; Рис. 1), про що послідовно повідомляють багато інших24.
Для оцінки тривалої динаміки передачі дофаміну одночасно проводились поздовжні нейрохімічні записи в ядрі ядерного ядра ВМС та в ДЛС при хронічно імплантованих мікросенсорах25 з використанням циклічної вольтаметрії швидкого сканування (див. див Додатковий рис. 1 для гістологічної верифікації розміщення електродів). У перший тиждень LgA ми спостерігали тимчасове підвищення концентрації позаклітинного дофаміну в VMS після активних реакцій (P <0.001; Рис. 2a). Ця картина активації знизилася під час LgA, де вивільнення дофаміну на третьому тижні було значно меншим, ніж у першому (P <0.001) і другий (P = 0.030) тижнів (основний ефект тижня: F(2,72) = 10.230, P <0.001; 2b). Фазовий вивільнення дофаміну в DLS з'явився на другому тижні (P = 0.006; Рис. 2c), але відсутній на третьому тижні LgA (основний ефект тижня: F(2,51) = 3.474, P = 0.039; Активна взаємодія тикачів × тиждень: F(2,51) = 4.021, P = 0.024; Рис. 2c, d). Ці дані показують, що фазові сигнали дофаміну у VMS та DLS виникають послідовно на різних стадіях прийому наркотиків, аналогічно тому, про що ми повідомляли для режиму ShA13. Однак ця сигналізація зменшилася в обох регіонах протягом LgA, період, протягом якого відомо, що фармакокінетика внутрішньовенно введеного кокаїну не змінюється26,27.
Щоб перевірити взаємозв'язок між втратою дофамінової сигналізації та ескалацією споживання наркотиків, ми скористалися індивідуальними відмінностями у сприйнятливості до ескалації самостійного введення лікарських засобів під час режиму LgA шляхом поділу тварин на дві групи залежно від того, чи виявляли вони значну ескалацію на основі лінійної регресія споживання наркотиків протягом сеансів LgA чи ні (Рис. 3a, b). Валідація цього поділу тварин показала, що неескаліровані тварини не показали значного збільшення активних носових пульсів протягом трьох тижнів LgA (головний ефект тижня: F(2,18) = 0.633, P = 0.542; 3b, зліва), тоді як ескалація щурів значно збільшила їх споживання (головний ефект тижня: F(2,26) = 14.826, P <0.001; 3b, правильно; прийом × тиждень взаємодії: F(2,44) = 4.674, P = 0.014), роблячи більш активні тики в носі, ніж тварини без ескалації протягом третього тижня LgA (t(22) = 2.307, P = 0.031; 3b). Зокрема, ескалація тварин виявила підвищену мотивацію до отримання кокаїну, як показано у завданні прогресивного співвідношення (P = 0.028; Додатковий рис. 2). У ескалаційних щурів спостерігалося значне зниження вивільнення дофаміну у VMS (головний ефект тижня: F(2,51) = 15.507, P <0.001; Рис. 3c, правильно, і Додатковий рис. 3a). Однак вивільнення допаміну VMS було стабільним у щурів, які не ескалірували (головний ефект тижня: F(2,18) = 0.057, P = 0.945; Рис. 3c, зліва і Додатковий рис. 4a) присвоєння значно більшої кількості фазового дофаміну на третьому тижні порівняно з ескалаційними щурами (основний ефект від прийому: F(1,69) = 6.444, P = 0. 013; Рис. 3d, зліва; прийом × тиждень взаємодії: F(1,70) = 4.303, P = 0.042). Ця різниця у вивільненні дофаміну між ескалаційними та неескалаційними щурами була очевидною протягом усіх шести годин самовведення (т(43) = 2.599, P = 0.013). Важливо, що ця різниця не була наслідком загального зниження функцій дофаміну у ескалаційних тварин, оскільки вивільнення дофаміну після інфузій кокаїну, спричинених експериментаторами, не відрізнялося між тваринами, які не ескалірували та ескалірували (P = 0. 605; Додатковий рис. 5a).
На відміну від підтримуваного фазового вивільнення дофаміну у ВМС неескалаційних щурів, ми раніше повідомляли, що спостерігалось зменшення вивільнення дофаміну у тварин, які три тижні обмежували доступ кокаїну (ША) лише на одну годину на сеанс щодня13. Тому ми провели додатковий аналіз даних, отриманих від цих щурів ShA, щоб дозволити детальну характеристику взаємозв'язку між функцією дофаміну та споживанням наркотиків серед тварин, які зазнали самоадміну кокаїну SHA або LgA. Хоча не спостерігалось значного збільшення середнього споживання наркотиків серед тварин під час ША, існували індивідуальні відмінності з підгруппою тварин (6 16), що демонструвало значне ескалацію споживання наркотиків протягом трьох тижнів самостійного введення кокаїну SHA. Цікаво, що фазовий дофамін VMS на третьому тижні самостійного введення кокаїну SHA у групі тварин, які підтримували стабільне споживання наркотиків (тобто не виявляли значного зростання), не суттєво відрізнявся від кількості неескалірованих тварин на третьому тижні LgA (P = 0.741; Додатковий рис. 5b). У тварин із SHA, які збільшували споживання наркотиків, спостерігалися більш низькі показники споживання наркотиків (32.7 ± 3.9 проти інфузій 43.9 ± 3.1 протягом першої години, P = 0.017) та менш ослаблений вивільнення дофаміну (P = 0.049; Додатковий рис. 5b), ніж тварини, які збільшували своє споживання в умовах LgA. Тим не менш, спостерігалася незначна тенденція до зниження дофаміну VMS порівняно з їх неескалаційними аналогами (P = 0.094) і не спостерігалося значної взаємодії для вивільнення дофаміну в часі між щурами ShA та LgA, що наростають (відсутність взаємодії схеми прийому ×: F(1,57) = 0.111 P = 0.740; Додатковий рис. 5b). Враховуючи ці індивідуальні відмінності, ми провели регресійний аналіз для всіх щурів ShA та LgA, щоб перевірити наявність прямої залежності між рівнем дофаміну та ступенем ескалації, і виявили значну негативну кореляцію (щури ShA та LgA, об'єднані разом; r = −0.628 , P = 0.005) з найбільшою ескалацією у тварин, які мали найменший вивільнення дофаміну за тиждень 3 (Рис. 3e, зліва). Отже, ослаблення дофамінової сигналізації у ВМС передбачає ескалацію режимів самоуправління лікарськими засобами через схеми доступу до лікарських засобів LgA та ShA. Ці дані підкреслюють, що аспект германії, пов’язаний із змінами вивільнення дофаміну, полягає в тому, чи ескалація тварин чи ні, а не режим самовведення, якому вони були схильні сам по собі. Аналогічно, ми виявляємо, що ескалація у всіх щурів є важливим провісником підвищеної мотивації кокаїну (P = 0.037, Додатковий рис. 6a), але схема LgA / ShA не є, як оцінено в графіку прогресивного співвідношення (P = 0.340, Додатковий рис. 6b).
На відміну від ВМС, вивільнення дофаміну, залежне від реакції, у DLS не відрізнялося між ескалаційними та неескалаційними LgA тваринами (головний ефект прийому: F(1,48) = 0.472, P = 0. 496; Рис. 3d, правильно і Додаткові фіг. 3b та 4b), а також не було суттєвого зв'язку між нахилом ескалації та вивільненням дофаміну через тварин, які зазнали самоадміну кокаїну SHA або LgA (r = −0.112, P = 0.649; Рис. 3e, правильно). Таким чином, хоча дофамін у VMS корелює з ескалацією прийому наркотиків, аналогічної кореляції не спостерігалось у DLS, області мозку, яка була широко пов'язана з розширеним самовведенням ліків.1,14,16,18.
Враховуючи цю провокаційну кореляцію між нейрохімією та поведінкою, ми висунули гіпотезу, що зниження фазової дофамінової сигналізації є причиною спричинення ескалації прийому наркотиків, подібного до збільшення прийому ліків, вироблених антагоністами дофамінових рецепторів.28-30, і таким чином відновлення може призвести до ескалації ескалації (Рис. 4a). Тому ми лікували ескалаційних тварин (P = 0.024; 4b) з L-DOPA до початку сеансу починають збільшувати фазовий вивільнення дофаміну31. Залежно від дози L-DOPA (0, 10, 30 та 90 мг / кг, внутрішньовенно) зменшено споживання кокаїну (основний ефект L-DOPA: F(3,53) = 5.053, P = 0.004; 4b), з 30 мг / кг, що повертає споживання до попередньо ескалаційного рівня. Важливо, що доза L-DOPA 30 мг / кг була достатньою для повного відновлення фазової дофамінової сигналізації у VMS (див. Додатковий рис. 7 для запису сайтів) під час прийому наркотиків (F(2,8) = 6.316, P = 0.023; Рис. 4c), ефект спостерігається також протягом шести годин самоуправління (F(2,8) = 7.610, P = 0.0141). Таким чином, кількість фазового вивільнення дофаміну у VMS передбачувало кількість споживання наркотиків під час сеансу самоприйняття кокаїну (r = −0.525, P = 0.046; Рис. 4d). Цей поведінковий ефект L-DOPA не може бути пояснений змінами фармакологічної відповіді на кокаїн, оскільки повільні зміни концентрації дофаміну VMS після вливання контингенту наркотиків не були змінені лікуванням L-DOPA і, по суті, не відрізнялися між до- ескалація, ескалація та ескалація станів, оброблених L-DOPA (F(2,8) = 0.020, P = 0.980; Додатковий рис. 8). Крім того, ефект L-DOPA на споживання наркотиків спостерігався також тоді, коли L-DOPA місцево вливали у ВМС (див. Додатковий рис. 9 для інфузійних місць) ескалаційних щурів до сеансу (t(7) = 6.517, P <0.001; Рис. 4e). У сукупності цей набір досліджень демонструє, що разова доза L-DOPA, що вводиться перед доступом до наркотиків, є ефективною для відновлення дофамінової сигналізації та нормалізації вживання кокаїну до попередньо ескалаційного стану.
Далі ми перевірили, чи ефективне використання L-DOPA для зменшення ескалаційного споживання лікарських засобів у більш тривалих режимах дозування, що більше стосується клінічних застосувань. По-перше, ми провели експерименти із введенням повторної інфузії L-DOPA протягом днів поспіль під час індукції ескалації. Тварин були навчені стабільно самостійно вводити кокаїн, а потім або переходили на LgA, або залишалися на SHA, протягом якого протягом двох тижнів їм вводили L-DOPA (30 мг / кг, внутрішньовенно) або фізіологічний розчин (Рис. 5a). L-DOPA суттєво впливав на прийом лікарських препаратів в залежності від режиму (основний ефект від лікування: F(1,53) = 9.297, P = 0.004; Основний ефект режиму: F(1,53) = 5.968, P = 0.018; Рис. 5a) із зменшенням споживання кокаїну у тварин LgA (P = 0.004), але не тварини ShA (P = 0.170; Рис. 5a) і без впливу на неактивні тики в ніс (LgA, P = 0.202; ША, P = 0.101; дані не відображаються). Тому лікування L-DOPA було ефективним для запобігання ескалації споживання наркотиків під час LgA. Однак після припинення лікування цей ефект не зникав (P = 0.789; Рис. 5a). По-друге, ми неодноразово вводили L-DOPA протягом днів поспіль тваринам із встановленим збільшенням споживання наркотиків. Тварин навчали стабільно самостійно вводити кокаїн і згодом або переходили на LgA, або залишалися на SHA протягом трьох тижнів. Потім цих тварин лікували L-DOPA або фізіологічним розчином до сеансів самостійного введення на третьому тижні (5b). Навчені LgA тварини показали значне збільшення споживання кокаїну протягом перших двох тижнів порівняно з дресированими SHA тваринами (головний ефект схеми: F(1,51) = 15.706, P <0.001; дані не відображаються). Лікування L-DOPA дало специфічний для режиму ефект (основний ефект лікування: F(1,51) = 5.303, P = 0.025; Основний ефект режиму: F(1,51) = 11.884, P = 0.001; 5b), зменшення споживання кокаїну у тварин LgA (P = 0.048), але не тварини ShA (P = 0.210; 5b) без впливу неактивного реагування (LgA, P = 0.641; ША, P = 0.664). Важливо, що диференціальний вплив L-DOPA на активні носові судини був більш сильним, коли тварини групувались у ескалацію та неескалацію замість ShA та LgA (ескалація тварин, P = 0.005; неескаліровані тварини, P = 0.421; Рис. 5c), що вказує на те, що L-DOPA переважно зменшує споживання кокаїну, а не впливає на споживання наркотиків сам по собі, взаємодія, яка розвивалася протягом днів (прийом × лікування (день 1)): F(1,51) = 0.562, P = 0.457; але прийом × лікування (день 5) взаємодія: F(1,51) = 4.091, P = 0.048). Важливо, що ці відмінності між ескалаційними та неескалаційними субпопуляціями, а також деескалаційні наслідки гострого та хронічно введеного L-ДОФА спостерігаються також протягом усіх шести годин самовведення (Додатковий рис. 10). Разом ці дані демонструють, що фазове вивільнення дофаміну зменшується у тварин, які збільшують споживання кокаїну, і відновлення його при повторному введенні попередника дофаміну, L-ДОФА, запобігає та скасовує цю ескалацію, забезпечуючи докази того, що зменшення дофаміну призводить до ескалації самоприйняття наркотиків.
ОБГОВОРЕННЯ
У цьому дослідженні ми досліджували фазовий вивільнення дофаміну у VMS та DLS під час ескалації прийому ліків, явище, яке моделює ключовий діагностичний критерій залежності від наркотиків.21,23. Наші дані показують, що ескалація пов'язана зі зниженням дофамінової сигналізації як у VMS, так і DLS, при цьому зниження дофаміну у VMS значно корелює зі швидкістю ескалації. Цей ефект виявляється вибірковим для фазового дофаміну, оскільки порівнянні зміни у тонічному дофаміні не спостерігалися в поточному дослідженні в попередній роботі з використанням тієї ж схеми у щурів27 або пов'язані з ними парадигми самоуправління у приматів, що не належать людині32,33. Було зареєстровано ряд повідомлень про зниження фазової дофамінової функції під час відміни наркотиків (тестували між годинами 18 та семи днями з часу останнього сеансу самостійного введення), що пов'язано зі зниженою чутливістю до кокаїну34-37. Хоча ми спостерігали подібне зниження дофамінової відповіді на кокаїн між щурами ShA та LgA (Додатковий рис. 5a), цей ефект не виявився пов'язаним з ескалацією, оскільки нейрохімічна реакція на кокаїн, що не перебуває в умовах контингенту, не відрізняється між щурами, які ескалірували, та тими, хто цього не зробив (відсутність режиму прийому × режим взаємодії: F(1,34) = 1.964 P = 0.170; Додатковий рис. 5a). Аналогічно, пікові зміни концентрації доніміну в тоніці до 90 секунд після контингенту кокаїну, імовірно, внаслідок фармакологічних дій кокаїну, не відрізнялися між попередньо ескальованим та ескалаційним станом у тих самих тварин (Додатковий рис. 8). Таким чином, єдиним аспектом передачі дофаміну, який ми спостерігали, який передбачив ескалацію прийому наркотиків, була фазова реакція, що виникала одразу після активного поштовху в ніс, що є умовною реакцією насамперед на ознаки, пов'язані з наркотиками9,11,13. Цей нейрохімічний відповідь зменшився у тварин, які посилили прийом наркотиків, що нагадує нормальний процес навчання, коли вивільнення дофаміну у ВМС, спричинене стимулом, пов’язаним із винагородою, зменшується, коли цей стимул тимчасово прогнозується38,39. Однак ослаблення вивільнення дофаміну під час самостійного введення відбувається набагато пізніше в процесі навчання, ніж можна було б очікувати для навчання у надзвичайних ситуаціях, довго після придбання встановленого прийому наркотиків. Більше того, у тварин, які не збільшують прийом наркотиків, ослаблення фазового вивільнення дофаміну не відбувається, навіть якщо ці тварини проявляють асимптотичну дискримінаційну інструментальну поведінку.
За вартістю, наші спостереження щодо зменшення вивільнення дофаміну в міру прогресування вживання наркотиків суперечать декільком сучасним теоріям залежності. Теорії, зосереджені на процесах стимулювальної сенсибілізації, спричинених наркотиками, постулюють підвищенням реактивності системи дофаміну VMS при повторному впливі на наркотики зловживань, що опосередковує сенсибілізовану реакцію на вплив наркотиків та випробувань40, явище, яке є особливо надійним після LgA41. Концептуалізація ролі відхиленого навчання та формування звичок у наркоманії свідчать про те, що поява дофамінової сигналізації в DLS все більше бере на себе контроль над пошуком наркотиків1,14,16. Більше того, видатні обчислювальні моделі звикання конкретно спричиняють посилення сигналу дофаміну до засобів, пов'язаних з наркотиками, як рушійної сили до залежності42,43. І навпаки, наші висновки виявляються більш узгодженими з гіпотезою про виснаження дофаміну залежністю, запропонованою Dackis and Gold44та пов'язані з ними теорії опонента21 які підкреслюють пригнічення, спричинене зловживанням наркотиками, процеси, пов'язані з винагородою. Таке придушення було висунуто гіпотезою, щоб викликати компенсаторну саморегуляцію вживання наркотиків для підтримки бажаного рівня наркотичного сп’яніння21. Зокрема, люди і тварини компенсують знижені одиничні дози кокаїну при збільшенні реакції45,46. Цей процес регулюється передачею дофаміну у VMS8 і, отже, зниження передачі дофаміну (наприклад, за допомогою антагонізму рецепторів дофаміну) викликає збільшення швидкості споживання наркотиків28,29. Таким чином, зниження дофамінової сигналізації, яке ми спостерігали під час LgA, може стимулювати компенсаторну регуляцію прийому наркотиків для досягнення бажаного рівня інтоксикації. На підтвердження цієї гіпотези зниження дофаміну у ВМС було найбільш вираженим у тварин, у яких спостерігається більша ескалація прийому наркотиків.
Таким чином, ми обґрунтували, що відновлення передачі дофаміну зменшить ескалацію. Дійсно, введення L-DOPA було ефективним як для запобігання, так і для зменшення ескалації прийому ліків. Помітно, що вплив L-DOPA на вживання наркотиків не припиняється після припинення лікування, що дозволяє припустити, що це не запобігає основній нейроадаптації. Отже, наші дані свідчать про те, що ескалація опосередковується процесом, який виявляється через зниження фазового дофаміну під час прийому ліків. Ці дані дають механістичну інформацію щодо використання L-DOPA в клінічному лікуванні зловживання психостимуляторами, стратегії, яка мала певні перспективні, але загалом неоднозначні результати у невеликій кількості останніх клінічних випробувань47. Зокрема, оскільки L-DOPA зменшив ескалацію вживання наркотиків, не створюючи абстиненції, ми вважаємо, що він краще підходить для підходу до зменшення шкоди і, зокрема, дозволяє наркоманам відновити ступінь контролю над вживанням наркотиків під час вступу в програми поведінкової терапії. В цілому, наші результати виявляють зменшення фазового вивільнення дофаміну, яке відбувається під час тривалого доступу до наркотиків, що опосередковує перехід від рекреаційного до неконтрольованого вживання наркотиків.
Методи
Звірята
Дорослих щурів Wistar з річки Чарльз (Холлістер, Каліфорнія, США) вагою між 300g та 400g розміщували окремо і утримували на темному циклі світла 12-h / 12-h (увімкнено в 0700) з контрольованою температурою та вологістю їжі та вода доступна ad libitum. Все використання тварин було схвалено Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Вашингтону, а хірургічні процедури проводилися в асептичних умовах. Для експериментів з вольтаметрією 50 тваринам, які перенесли хірургічну операцію, з яких 29 протягом експериментів підтримував прохідність катетера, мав принаймні один функціональний та гістологічно підтверджений електрод та проходив критерії поведінки (див. Нижче). Для фармакологічного експерименту 28 щурів 32, які перенесли імплантацію катетера, підтримували прохідність внутрішньовенного катетера та використовувались у дослідженні. Тварин врівноважувалося в експериментальні групи, виходячи зі ступеня їх самостійного введення під час перед експериментальної підготовки ША. Розміри зразків аналогічні тим, про які повідомлялося в попередніх публікаціях13.
Стереотаксична хірургія
Щурів знеболювали ізофлураном, поміщали в стереотаксичний каркас, вводили нестероїдний протизапальний карпрофен (5 мг / кг, підшкірно) і поміщали на ізотермічну прокладку для підтримки температури тіла. На шкіру голови було обмазано спиртом і бетадином, обмазали сумішшю лідокаїну (0.5 мг / кг) і бупівакаїну (0.5 мг / кг) і розрізали для опромінення черепа. У черепах було просвердлено отвори, а тверду мозкову оболонку очистили для націлювання на DLS (1.2-мм спереду, 3.1-мм бічний і 4.8-мм вентрал до Брегми48) і ядро приєднується до ядра VMS (1.3-мм передня частина, 1.3-мм бічна і 7.2-мм вентральна до Брегми). Один мікроелектрод з вуглецевого волокна, виготовлений в будинку25 був розміщений у VMS та інший у DLS, і в окрему частину переднього мозку імплантували опорний електрод Ag / AgCl. В іншому наборі тварин, направляючі канюлі (26 калібрувальник; Plastics One, Roanoke, VA, США), закупорені «манекенними» канюлями однакової довжини, були двосторонньо імплантовані для націлювання на VMS. Електроди та направляючі канюлі були закріплені краніопластичним цементом, кріпленим до черепа гвинтами. Після операції щурам вводили нестероїдний протизапальний карпрофен тривалої дії (5 мг / кг, підшкірно) і поміщали на ізотермічну прокладку для підтримки температури тіла до амбулаторного лікування. Усі тварини були імплантовані внутрішньовенними катетерами під час окремої операції через тиждень.
Імплантація внутрішньовенних катетерів
Щурів знеболювали ізофлураном, вводили нестероїдний протизапальний карпрофен (5 мг / кг, підшкірно) і поміщали на ізотермічну прокладку для підтримки температури тіла. Катетери були виготовлені з силастичних трубок із зовнішнім діаметром 0.6 мм і прикріплені до “маточини” на одному кінці (дистально від введення вен; Plastics One, VA, США) для підключення до інфузійного насоса. Катетери вводили підшкірно через розріз на спині між плечима до передньої частини тіла і закріплювали в правій яремній вені за допомогою кремнієвої гумової кульки біля проксимального кінця катетера. Оптимальне розташування катетера було перевірено шляхом введення в нього крові з негативним тиском. Потім концентратор був закріплений шматочком тефлонової сітки, пришитою до навколишніх тканин, і розрізи були закриті, залишаючи ступицю, що виступала зі спини щура. Потім катетер промивали розчином гепарину (80 ОД / мл у фізіологічному розчині) і заповнювали в’язким розчином полівінілпіролідону (ПВП) та гепарину (1000 ОД / мл). Ступиця катетера була закрита коротким обтиснутим шматочком поліетиленової трубки, а розчин PVP залишався в катетері для забезпечення прохідності. Після хірургічного втручання щурам дозволялося відновлюватися щонайменше п’ять днів.
Кокаїнне самоврядування
Сеанси самостійного введення проводилися між 0900 та 1700 год. Щури навчилися самостійно вводити кокаїн (Сігма, Сент-Луїс, штат Міссурі, США) у модульній операційній палаті (Med Associates, VT, США), оснащеній двома пристроями для реагування на носі (порт із вбудованими фарами), розташованими на сусідніх панелях тієї ж стіни, домашнє світло та динаміки для забезпечення чистого тону та білого шуму. Камера операнту розміщувалася в звукозаглушеній зовнішній камері. Щури (місяці 3 – 4) пройшли навчання для отримання кокаїну після реакції оператора на графік посилення FI20. Носовий тиск в активному порту (на противагу між тваринами) призвів до негайної внутрішньовенної інфузії кокаїну (0.5 мг / кг протягом приблизно десяти секунд) у поєднанні з 20-секундною презентацією аудіовізуального подразника (освітлення світла всередині носа тріскання порту і тону; умовний стимул, CS). Під час презентації CS був накладений другий тайм-аут 20, під час якого носовий пульс не призвів до подальшої інфузії наркотиків чи будь-яких інших запрограмованих наслідків. Доступність ліків під час сеансу позначалася білим шумом та освітленням будинку. Для контролю специфічності відповіді, носовий супровід другого (неактивного) порту контролювався, але ніколи не був посилений. Після попередніх тренувань з критерієм п’ять і більше активних відповідей на сеанс на дві послідовні сесії для включення в дослідження щурам отримували щоденний доступ до кокаїну протягом однієї години на день (короткий доступ; ША) протягом одного тижня, а потім шести годин на день (тривалий доступ; LgA) протягом трьох тижнів (п’ять днів на тиждень). Кількість сеансів для досягнення критерію варіювала між тваринами від двох до п’яти сеансів. Результати поведінки від раніше повідомленої контрольної групи13 були використані в якості базової лінії для порівняння поведінкових даних у щурів, які піддавались самоконтролю кокаїну LgA, та щурів, які пройшли підготовку за режимом ShA в рівній кількості днів.
Після трьох тижнів SHA або LgA самоконтролю кокаїну FI20 підгрупа щурів пройшла тестування на прогресивне співвідношення. Ці сеанси були ідентичними сеансам FI20, за винятком того, що тваринам під час сеансу потрібно було виконувати все більшу кількість оперативних відповідей на послідовні вливання кокаїну. Операційна вимога для кожного випробування (T) було закругленим цілим числом 1.4(T - 1) важільні преси, починаючи з 1 важільного преса (тобто, 1, 1, 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 20, 28, 40, 56, 79, 111, 155, 217, 304, 426) . Ця потреба в роботі стає настільки високою, що з часом тварини перестають реагувати і досягають "точки перерви". Точка перерви була оперативно визначена як загальна кількість вливань, отриманих до тридцятихвилинного періоду, протягом якого не вводилися вливання.
Прийом L-ДОФА / бенсеразиду
L-DOPA (L-3,4-дигідроксифенілаланін) вводився у поєднанні з інгібітором декарбоксилази декарбоксилази DOPA периферично діючим бенсеразидом для зменшення периферичного руйнування L-DOPA (обидва з Sigma, St. Louis, MO, США). Обидва препарати розчиняли у фізіологічному розчині та вводили внутрішньовенно в обсязі 1 мл / кг маси тіла. L-DOPA вводили 30 за хвилину до початку сеансу при 0, 10, 30 або 90 мг / кг, тоді як бенсеразид вводили послідовно при 2 мг / кг незалежно від введеної дози L-DOPA. У першому наборі досліджень (відповідь на дозу) щурів обробляли L-DOPA протягом одного дня (Рис. 4). Жодна з застосованих доз L-DOPA не гальмувала загальної ефективності або не викликала дискінезії. Щоб уникнути потенційно незрозумілих наслідків повторного введення L-DOPA, щурів проводили без лікування L-DOPA після «сеансів L-DOPA». У другому наборі досліджень тварин лікували цими L-ДОФА перед кожним сеансом самостійного введення протягом періоду до двох тижнів (Рис. 5). У третьому наборі досліджень, щури, у яких виявлено ескалацію самокашлю кокаїну під час LgA, ефекти двосторонньої інфузії L-DOPA (25 – 50 мкг, розчинених у 0.5 мкл ACSF у кожну півкулю; 0.25 мкл / хв; Sigma, St. Луїс, штат Міссурі, США) та ACSF щодо ВМС щодо поведінки щодо вживання наркотиків. У дні інфузії манекенну канюлю замінювали на інфузійною канюлею калібру 33, яка виступала на 1.0 мм за межі направляючої канюлі. Настої давали за десять хвилин до початку сеансу. Після вливання канюлі залишали на місці дві хвилини перед видаленням, щоб дозволити дифузію препарату.
Вольтаметричні вимірювання та аналіз
Для виявлення дофаміну за допомогою швидкого сканування циклічної вольтамметрії під час експериментальних сеансів (записи, проведені протягом двох сеансів на тиждень), хронічно імплантовані мікросенсори з вуглепластикових волокон були підключені до встановленого на голові вольтамперметричного підсилювача, поєднаного із системою збору даних та аналізу даних, керованої ПК. (National Instruments, TX, США) через електричний поворот (Med Associates, VT, США), який був встановлений над випробувальною камерою. Вольтаметричні сканування повторювали кожні 100 мс для досягнення швидкості вибірки 10 Гц. Під час кожного вольтаметричного сканування потенціал на електроді з вуглецевого волокна лінійно збільшувався від −0.4 V проти Ag / AgCl до + 1.3 V (анодна розгортка) і назад (катодна розгортка) при 400 V / s (загальний час сканування 8.5-мс) ) і проводиться при −0.4 V між скануваннями. Коли дофамін присутній на поверхні електрода, він під час анодної розгортки окислюється, утворюючи дофамін-о-хінон (пікова реакція виявлена приблизно у + 0.7 V), який відновлюється назад до дофаміну в катодній зачистці (пікова реакція виявлена при приблизно −0.3 V). Витікаючий потік електронів вимірюється як струм і прямо пропорційний кількості молекул, які піддаються електролізу. Вольтамметричні дані фільтрували смугу пропускання при 0.025 - 2,000 Гц. Ток, який віднімається в часі, струм, який розв'язується в часі, отриманий при кожному скануванні, забезпечував хімічну ознаку аналізованого речовини, що дозволяє розділяти дофамін з інших речовин49. Дофамін виділяли з вольтамметричного сигналу за допомогою хіміометричного аналізу за допомогою стандартного навчального набору25 на основі електрично стимульованого вивільнення дофаміну, виявленого хронічно імплантованими електродами. Концентрацію дофаміну оцінювали на основі середньої чутливості електродів після імплантації25. Перед аналізом середньої концентрації всі дані згладжувались з точкою 5 в межах пробного середнього показника. Концентрацію дофаміну в середньому проводили протягом семи секунд (приблизна тривалість спостережуваного фазового сигналу) після реакції оператора (післявідповіді) або непередбачуваного подання КС і порівнювали із середньою концентрацією за дві секунди до операнта відповідь (базовий рівень). КС була представлена безперервно під час кожного запису сеансів, що проводились на другому та третьому тижнях (двічі на сеанс протягом 20 секунд кожен), але не протягом першого тижня, щоб уникнути втручання в асоціативну умову між доставкою ліків та сигналом протягом періоду де, мабуть, ця асоціація ще розвивалася.
Статистичний аналіз
Індивідуальні електрохімічні сигнали були усереднені протягом сеансу самоуправління, а потім для тварин і тижнів, щоб збільшити статистичну потужність. Сигнали порівнювали, використовуючи багатоваріантні ANOVA з реакцією, область мозку, споживання кокаїну та тиждень як фактори. Для порівняння з електрохімічними даними, поведінкові дані також поширювались на тижні. Для експериментів з L-DOPA, поведінкові дані (в середньому по днях, якщо їх застосовують протягом днів поспіль) відповідного лікування препаратом (без лікування, дози L-ДОФА або транспортного засобу) аналізували з використанням багатоваріантних ANOVA з лікуванням наркотиками, режимом тренувань, прийомом кокаїну, і тиждень як фактори. У разі значних основних ефектів або взаємодій були проведені спеціальні аналізи та P значення коригували відповідно до методу корекції Холма-Бонферроні для багаторазового тестування50. Сюжети були зроблені за допомогою призми (GraphPad Software, La Jolla, Каліфорнія, США). Статистичний аналіз проводили за допомогою SPSS, версії 17.0 (Чикаго, Іллінойс, США) та Prism. Дані підходять для параметричного статистичного аналізу. Збір та аналіз даних не виконувались сліпо до умов експериментів.
Гістологічна верифікація місць запису
По завершенні експериментів тваринам знеболювали внутрішньочеревну ін'єкцію кетаміну (100 мг / кг) та ксилазину (20 мг / кг). У тварин з електродними імплантатами місця запису були відзначені електролітичним ураженням (300 V) перед транскардіальною перфузією з фізіологічним розчином, а потім 4% -параформальдегід. Мозок витягували і після фіксації в параформальдегіду протягом двадцяти чотирьох годин, а потім швидко заморожували в ізопентановій ванні, нарізали кріостатом (корональні відрізки 50-мкм, −20 ° C) і фарбували крезовим фіолетом, щоб допомогти у візуалізації анатомічні структури та електродизовані місця ураження чи інфузії.
Додатковий матеріал
1
8
9
10
11
2
3
4
5
6
7
Подяки
Ми дякуємо Скотту Нг-Евансу, Крістіні Екерс Санфорд, Чаду Зієцу, Ніколь Мюррей та Даніелю Хадді за технічну підтримку, а також Моніці Арнольд та Джеремі Кларк за корисні відгуки. Цю роботу підтримали Німецький науково-дослідний фонд (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG) Грант WI 3643 / 1-1 (IW), нагороди Інституту алкоголізму та наркотиків (PEMP) та Проституту Вашингтонського університету (PEMP) та Національних інститутів медичних грантів T32-DA027858 (LMB), F32-DA033004 (PAG), P01-DA015916 (PEMP), R21-DA021793 (PEMP) та R01-DA027858 (PEMP).
Виноски
Авторські внески
IW та PEMP розробили дослідження, IW, LMB та PAG проводили дослідження, а IW аналізував дані; IW та PEMP написали статтю.
інформація про автора
Автори не оголошують конфлікту інтересів.
посилання