Достатність мезолімбічної стимуляції нейронів дофаміну для прогресування до наркоманії (2015)

Вступ

Залежність - це хвороба, яка розвивається в кілька етапів (Everitt et al., 2008, George et al., 2014). Діагноз ставлять, коли рекреаційне використання стає нав'язливим, зберігається, незважаючи на негативні наслідки. Хоча провідна гіпотеза наркоманії стверджує, що зловживання наркотиками викликає хворобу, оскільки надмірно підвищує концентрацію дофаміну (DA) у мозку, незрозуміло, чи достатньо активації цієї системи для переходу від рекреаційного вживання до наркоманії (Di Chiara and Бассарео, 2007, Волков і Моралес, 2015). Підтверджуючі докази гіпотези DA щодо посилення наркотиків накопичуються протягом декількох десятиліть і спираються на початковий ефект наркотиків. Наприклад, наркотичні речовини, що викликають залежність, знижують поріг внутрішньочерепної самостимуляції (ICSS) медіального пучка переднього мозку, клітковинного тракту, що містить, серед іншого, висхідну проекцію DA із середнього мозку (Stein, 1964, Crow, 1970, Kornetsky et al., 1979). Потім дослідження фармакології та уражень визначили мезокортиколімбічну систему DA як джерело цієї схеми (Wise and Bozarth, 1982). Наприкінці 1980-х прямий показник позаклітинної концентрації DA за допомогою мікродіалізу підтвердив, що наркотики, що викликають залежність, поділяли властивість викликати сплеск DA у NAc (Di Chiara and Imperato, 1988). Це призвело до пропозиції механістичної класифікації наркотиків, що викликають залежність (Lüscher and Ungless, 2006).

Значно менше відомо про те, як ці початкові наслідки вживання наркотиків полегшують перехід до звикання. Розглянуто незалежні від DA механізми, оскільки наркотичні речовини, що викликають залежність, мають інші фармакологічні цілі. Наприклад, кокаїн, крім інгібування транспортера DA (DAT), також зв'язується з SERT (транспортером серотоніну) та NET (транспортером норадреналіну), щоб зменшити зворотне захоплення серотоніну та норадреналіну, відповідно, збільшуючи концентрацію всіх основних моноамінів (Han та Гу, 2006, Тассін, 2008). Подібні занепокоєння можуть стосуватися інших психостимуляторів. Більше того, є твердження, що опіати, принаймні на початковій фазі, не є незалежними від DA (Badiani et al., 2011, Ting-A-Kee and van der Kooy, 2012). Гіпотеза DA також була оскаржена на основі генетичних моделей мишей, де після втручання в систему DA деякі форми поведінки, що адаптується до наркотиків, все ще були очевидними. Наприклад, миші-нокаутери DAT самостійно вводять кокаїн (Rocha et al., 1998) і скасовуючи синтез DA або фармакологічно (Pettit et al., 1984), або генетично (Hnasko et al., 2007) не змогли запобігти самостійному введенню наркотиків. або умовне перевагу місця. Хоча краща характеристика цих трансгенних мишей та генерування нокаутів подвійних моноамінових транспортерів вирішили деякі з цих питань (Rocha, 2003, Thomsen et al., 2009), достатність DA для спровокування основних особливостей наркоманії невідома. Тому, щоб обійти проблеми неспецифічності, ми вирішили дозволити мишам самостимулювати нейрони VTA DA, використовуючи оптогенетичний підхід.

Недавні дослідження показали, що активація нейронів DA в середньому мозку може викликати перевагу місця (Tsai et al., 2009) або посилити інструментальну поведінку (Adamantidis et al., 2011, Witten et al., 2011, Kim et al., 2012, Rossi et al., 2013, McDevitt et al., 2014, Ilango et al., 2014). Хоча ця селективна активація шляхів DA підтверджує дослідження внутрішньочерепної самостимуляції (ICSS), проведені більше 30 років тому для окреслення системи винагород (Fouriezos et al., 1978), вони не встигають продемонструвати індукцію адаптаційної поведінки на пізніх стадіях, яка не визначає залежність, а також не визначають основні нейронні адаптації. Тут ми використовували оптогенетичні маніпуляції не тільки для того, щоб забезпечити пряме тестування критерію достатності для фазової сигналізації DA при ініціюванні підкріплення, але і для тесту на перехід до звикання.

Вражаюче спостереження за пізніми стадіями захворювання полягає в тому, що навіть при найзалежніших наркотиках лише частина споживачів стає залежною (Warner et al., 1995, O'Brien, 1997). Наркомани продовжуватимуть вживати наркотики, незважаючи на негативні наслідки (див. «Визначення наркоманії» Американського товариства наркоманів, DSM5, Американська психіатрична асоціація, 2013 р.), Як правило, пов’язаних із соціальними та психологічними поразками, які часто затримуються у часі. Подібним чином, у гризунів приблизно одна з п'яти тварин, які набувають самоконтролю кокаїну, врешті класифікуються як залежні (Deroche-Gamonet et al., 2004, Kasanetz et al., 2010; але див. George et al., 2014). Постійність прийому наркотиків, незважаючи на негативні наслідки, також може бути змодельована у гризунів шляхом введення простого аверсивного стимулу до графіка споживання. Хоча хвороба людини є більш складною, асоціювання покарання зі споживанням є прямолінійною моделлю основного компонента наркоманії.

Тут ми використовували легкий шоковий удар, щоб оцінити його наслідки для самостійного застосування кокаїну, сахарози та оптогенетичної самостимуляції. Далі ми досліджуємо, чи може самостимуляція нейронів DA викликати дві поведінки, пов'язані із залежністю - пов'язані з вживанням і примусовість, пов'язані з споживанням, незважаючи на негативні наслідки, і характеризують нейральну пластичність, пов'язану з цими поведінками.

результати

Для контролю активності нейронів DA ми вводили Cre-індукований адено-асоційований вірус (AAV) з подвійною флексированной інвертованою відкритою рамкою зчитування (DIO), що містить ChR2 злитий з посиленим жовтим флуоресцентним білком (eYFP) (Atasoy et al., 2008, Brown et al., 2010) у VTA мишей DAT-Cre. Крім того, оптичне волокно було розміщено для націлювання на VTA (ChR2См. Експериментальні процедури). Специфічність ChR2 експресія підтверджувалася спільною локалізацією eYFP з тирозин-гідроксилазою (TH), ферментом, необхідним для синтезу DA (Фігура 1А). 

По-перше, для встановлення протоколу лазерної стимуляції мишей поміщали в оперантну коробку, де вони могли натискати активний важіль, який запускав ряд лазерних стимуляцій, що змінювались (1, 2, 8, 32, 60 або 120 спалахів) кожного дві сесії. Для наслідування фазової схеми стрільби (Hyland et al., 2002, Mameli-Engvall et al., 2006, Zhang et al., 2009), як правило, індукованої природною винагородою (Schultz, 1998), ми використовували стимуляцію вибухом. Один сплеск складався з п’яти лазерних імпульсів по 4 мс при частоті 20 Гц і повторювався двічі на секунду. Ми виявили, що миші адаптували свою поведінку натискання на важіль як функцію сплесків за лазерну стимуляцію, таким чином контролюючи загальну кількість отриманих спалахів (Фігура 1Б). Ця поведінка нагадувала самостійне вживання наркотичних речовин, що викликають залежність, коли доза на інфузію змінювалася (Piazza et al., 2000). Для подальших експериментів ми вирішили вводити 30 сплесків на важелі важеля, даючи половину максимальної кількості сплесків (Фігура 1Б). Щоб імітувати затримку збільшення DA, яка зазвичай спостерігається при внутрішньовенному введенні ліків (Aragona et al., 2008), ми відклали лазерну стимуляцію на 5 с і додали блимаючий світловий сигнал на 10 с (Фігура 1С).

Протягом 12 днів поспіль мишам дозволялося самостимулювати максимум 80 разів за 2 години. Миші швидко збільшили швидкість лазерної стимуляції, досягнувши 80 лазерних стимуляцій (LS) до кінця першої години сеансу (Фігури 1D і 1E). Різниця між активним і неактивним важелем була швидко придбана, а кількість активних пресів збільшилося відповідно з збільшенням графіків фіксованого співвідношення (FR1, 2, 3) (Фігури 1F і 1G). У контрольних експериментах з використанням мишей DAT-Cre- або мишей, які експресували ChR2 в нейронах γ-аміномасляної кислоти (GABA) (миші GAD-Cre +, щоб призначати інгібуючі нейрони VTA), темпи самостимуляції були низькими і постійно зменшувалися сесій. Це також застосовувалося до двох тварин Cre +, де post hoc перевірка показала, що VTA не інфікована ChR2-eYFP (не показано). Крім того, не було виявлено дискримінації між активним і неактивним важелем (Цифри S1A і S1B).

Ми спостерігали, що миші DAT-Cre + натискали частіше на активний важіль, ніж це потрібно для лазерної стимуляції. Насправді, такі «безладні» активні натискання на важіль становили більше 30% від усіх активних натискань на важіль (Рисунок S2А) і відбувалися, коли сеанси прогресували, в основному між появою кий і лазерної стимуляції (Цифри S2B і S2C). Ця сингулярна поведінка розвивається під час придбання і може відображати імпульсивні відповіді.

Взяті разом, активність вибуху в нейронах ДТА ДА сильно посилює реакцію важеля.

Оклюзія самостимуляції нейрону VTA DA нейроном кокаїном

Щоб перевірити, чи залежить самостимуляція нейрону VTA DA на тих самих мозкових ланцюгах, на які націлені наркотичні речовини для посилення поведінки, ми вводили кокаїн внутрішньочеревно (ip) безпосередньо перед сеансами самостимуляції (вільний доступ до лазера протягом 45 хв, Фігура 2А). На початковому рівні добре навчені тварини натискали приблизно 400 разів, щоб отримати 85 LS за 45 хв за графіком FR3. Після ін'єкції кокаїну ефективність значно знизилась залежно від дози приблизно до 30 LS для 100 важелів пресів з найвищою дозою (Фігура 2Б). Цей прикус був найбільш вираженим протягом перших 30 хв сеансу, що відображає фармакокінетику препарату (Фігура 2В). Цей експеримент вказує на те, що підкріплення оптогенетичною самостимуляцією та підкріпленням кокаїном є часткою нейронних ланцюгів.

Для подальшого порівняння оптогенетичної самостимуляції із наркотиками, що викликають залежність, ми далі запитали, чи миші не повернуться до самостимуляції нейронів VTA DA після декількох тижнів відміни. Оскільки пошук наркотиків, пов’язаний з києм, є усталеною моделлю рецидиву (Epstein et al., 2006, Soria et al., 2008, Bossert et al., 2013), ми повернули мишей назад в оперантну камеру через 30 днів після останнього само- сеанс стимуляції, де активне натискання важеля тепер спрацьовує світло сигналу без лазерна стимуляція (Фігура 3А). Надійна поведінка, пов'язана з чутливим зв'язком, продемонстрована високою швидкістю активних пресів для важелів, виявилася лише у мишей з експресією eYFP-ChR2 у нейронах VTA DA (миші DAT-Cre +, але не миші DAT-Cre−, Фігура 3B).

Попередні дослідження показали причинно-наслідковий зв'язок між рецидивом, пов'язаним з києм, та синаптичною пластичністю, викликаною кокаїном у підтипі нейронів NAc, що експресують DA D1R (Pascoli, Terrier et al., 2014). Тому, щоб оцінити цю синаптичну пластичність, ми генерували мишей DAT-Cre, схрещених з Drd1a-tdTomato мишей для ідентифікації середнього розміру колючих нейронів (MSN) підтипу в NAc. Замість того, щоб шукати тест, було підготовлено зрізи NAc, де D1R-MSN були червоними, контрастуючи з зеленими волокнами з нейронів VTA DA, інфікованих flox-ChR2-eYFP (Фігура 3В). Записи патч-затискачів у цілих клітинах ex vivo виявили залежність напруги випрямляючої напруги для викликаних AMPAR постсинаптичних струмів (AMPAR-EPSC) та підвищений коефіцієнт AMPAR / NMDAR (Фігури 3D і 3E), у D1R-MSN, але не в D2R-MSN. Подібні висновки, отримані раніше після відмови від самоконтролю кокаїну, показали, що вказують на комбіновану вставку GluA2, що не має, і GluA2, що містить AMPAR, при окремих входах на D1R-MSN (Pascoli, Terrier et al., 2014).

Самостимуляція, незважаючи на покарання

Вживання речовин, незважаючи на негативні наслідки, є ще однією з найважливіших визначальних ознак наркоманії (див. Визначення DSM5, Американська психіатрична асоціація, 2013). Встановлені моделі щурів (Deroche-Gamonet et al., 2004, Pelloux et al., 2007, Pelloux et al., 2015, Chen et al., 2013), де електричний удар, введений у графік самоконтролю кокаїну, пригнічує кокаїн споживання у деяких тварин. Після 12 днів первинного опромінення (придбання) мишам було дозволено провести три додаткові сеанси при FR3, але зі зменшеним обмеженням сеансу (максимум 60 хв або 40 нагород). Ці три сеанси послужили базовим для наступних чотирьох сеансів, коли кожна третя лазерна стимуляція була поєднана з ударом стопи (500 мс; 0.2 мА), передбаченим новим сигналом (Фігура 4А). Інтенсивність і тривалість стоп-шоку регулювали, щоб повністю придушити важіль натискання на винагороду сахарози (див. Також дані нижче). Розклад покарання призвів до двох протилежних поведінкових реакцій (Фігура 4B). Деякі миші швидко перестали відповідати, коли було введено покарання (так зване «чутливе»), тоді як інші продовжували реагувати на отримання максимальної кількості лазерних стимуляцій і можуть вважатися «стійкими» до покарання. Два скупчення тварин повністю виникли в кінці чотирьох сесій покарання (Фігура 4В). "Резистентні миші" підтримували кількість лазерних стимуляцій (менше 20% зниження), тоді як "чутливі миші" знижували самостимуляцію більш ніж на 80%. За цими критеріями не можна було призначити лише одну тварину (сірі крапки). Це спостереження демонструє, що примусова активність вибуху, викликана самостимуляцією нейронів VTA DA, є достатньою, щоб викликати наполегливість споживання, незважаючи на негативні наслідки у фракції мишей. В якості контролю у незалежній групі мишей, які мали встановлену резистентність або чутливість до покарання, пов'язаного з самостимуляцією, оцінювали ноцицепцію, використовуючи аналіз хвостами. Не було виявлено ніякої різниці в латентності виведення хвоста, зануреного в гарячу воду, між чутливим і стійким (Рисунок S3).

Далі ми попросили, post hoc, чи могла будь-яка особливість під час фази придбання самостимуляції спрогнозувати стійкість до покарання. Чутливі і резистентні миші робили однакову кількість активних і неактивних натискань важеля під час сеансів базової лінії, і всі миші досягали максимуму 80 LS (Цифри S4А та S4B) за аналогічний проміжок часу (Цифри S4A і S4C). У той час як частка безладної активної преси знову не відрізнялася в двох підгрупах (Фігури 4D і S4D), кількість марних натискань на важіль до початку лазерної стимуляції стала значно вищою у резистентних мишей до кінця сеансів придбання (Фігури 4Е і S4Д). Оскільки така поведінка розвивається під час придбання, вона може сприяти, поряд із вродженою імпульсивністю (Economidou et al., 2009, Broos et al., 2012, Jentsch et al., 2014), у встановленні стійкості до покарання. Крім того, на 11 день було проведено дослідження з прогресивним співвідношенням для кількісної оцінки мотивації для оптогенетичної стимуляції (Richardson and Roberts, 1996). Стійкі миші демонстрували точку зупинку, яка статистично не відрізнялася від чутливих мишей (Рисунок S4F).

Опір покаранню за кокаїн, але не для сахарози

Щоб перевірити, чи може парадигма споживання, незважаючи на шкідливі наслідки, разом із імпульсним натисканням важеля також передбачити примусовий прийом наркотику, що викликає залежність, нова когорта мишей пройшла 12 днів самоконтролю кокаїну. Експериментальні параметри для придбання кокаїну для самоконтролю встановлювали максимум до 80 вливань кокаїну протягом 4 годин під час придбання та до 40 вливань протягом 2 годин протягом трьох базових сесій, що передували чотирьом покаранням (Фігури 5А і S5А). Знову ж таки, дві групи з'явилися після спаровування винагороди кокаїном з електричними шоками. Дійсно, 5 з мишей 22 були класифіковані як резистентні (менше 20% зниження порівняно з базовою лінією), тоді як 17 кваліфіковано як чутливе (більше 80% зниження) і одна тварина впало між ними (інфузії 13 на день 19) (Фігура 5B). Потім ми шукали поведінкові предиктори опору покаранню. Між цими двома групами кількість інфузій, швидкість інфузії та кількість активних або неактивних важеля преси не відрізнялися (Цифри S5B – S5D), а точки розриву були подібними (Рисунок S5Е). Відрізнялася еволюція розподілу в часі марних натискань на активний важіль. Протягом перших чотирьох сеансів безладні натискні важелі регулярно зменшувалися протягом періодів часу як у резистентних, так і в чутливих мишах, а в кінці придбання тільки чутливі миші підтримували таку поведінку (Фігури 5С і 5D і S5F). Навпаки, стійкі миші мали тенденцію збільшувати загальну кількість безперспективних пресівФігури 5С і S5D), особливо в останній чверті періоду тайм-ауту (Фігура 5D). Хоча якісно подібне спостереження, проведене раніше за допомогою оптикогенної стимуляції нейронів ДА (див. Вище), кластеризація марних пресів протягом раннього періоду вимкнення не спостерігалася з кокаїном, швидше за все, через більш повільну кінетику, з якою препарат підвищений рівень DA. Тим не менш, подібні висновки можна зробити, виходячи з цієї особливої ​​еволюції марного розподілу натискань на важіль протягом короткого періоду часу, що передує «внутрішньому виявленню напруги DA». Наші спостереження дозволяють припустити, що розподіл марних активних пресів передбачає використання наркотиків незважаючи на негативні наслідки.

Нарешті, ми повторили експеримент з мишами, що годувалися ad libitum, які могли вдатися до преси для винагороди сахарози. Як тільки було введено покарання, всі миші припинили самостійне введення сахарози (Фігура 5E), демонструючи, що цей графік пригнічує прийом несуттєвої природної винагороди, але допускає виявлення компульсивного споживання звикання або сильної стимуляції нейронів DA.

Взяті разом, ці результати демонструють, що самостимуляція VTA DA є достатньою для індукції компульсивності, як показано стійкістю до покарання у підмножині мишей (68%). Аналогічно, після кокаїну SA деякі миші стали стійкими до покарання (23%), що ніколи не було після сахарози SA (Фігура 5F).

Щоб визначити область мозку, яка може контролювати рішення про наполегливе самоврядування, незважаючи на негативні наслідки, ми спочатку відстежили загальну «нейрональну активність», підрахувавши кількість нейронів, у яких сеанс покарання спричинив експресію безпосереднього раннього гена cFos у 15 різних регіонах. Мишей внутрішньосерцево перфузували PFA через 90 хв після закінчення останньої сесії покарання. До контрольних груп входили наївні тварини, а також миші, підтягнуті до чутливих або стійких мишей, щоб контролювати можливий незрозумілий ефект від кількості отриманих шоків.

У той час як у більшості вибраних областей кількість cFos-позитивних нейронів була найвищою у зрізах стійких мишей порівняно з наївними зрізами мишей, з'явилися два типи відповідей, з яких прикладом є попередня кора (PL) і латеральна OFC. У PL ми виявили аналогічне збільшення cFos-позитивних клітин у резистентних мишей та їх контрольованих яйцеклітин, тоді як у OFC це збільшення було видно лише у резистентних, а не у відповідних яйках мишах (Фігури 6A і 6B). Для кількісної оцінки цієї різниці всі дані спочатку нормалізувалися до рівнів експресії у наївних тварин. Потім коефіцієнт обчислювався між резистентними над чутливими, розділеними на упряжених до резистентних над ямом до чутливих (Ratio_cfos = (R / S) / (YR / YS), Фігура 6Б). Ця процедура ідентифікувала зону кори, OFC та VTA як області, які активуються у стійких, але не у чутливих мишей, і де була незначна різниця в обох групах контрольних каркасів (насправді подібні низькі cFos-позитивні нейрони в рифлених) . Знаходження VTA не дивно, оскільки це область нейронів, стимульованих лазером. Це відповідає попередньому звіту, який показує, що стимуляція ChR2 ініціює активацію cFos (Lobo et al., 2010, Van den Oever et al., 2013). Низький коефіцієнт_cfos був виявлений в областях, де активація була схожою на чутливі і стійкі (такі як CeA і PAG). Співвідношення_cfos було також низьким, коли активація була паралельна високій різниці у контрольованих комахами (наприклад, PL, Фігура 6C для узагальненого співвідношення_cfos даних). Таким чином, аналогічна експресія cFos у стійких і в'язких резистентних мишах була, швидше за все, обумовлена ​​кількістю шокових ударів і мало мала відношення до резистентності до покарання. Взяті разом високе співвідношення_cfos в OFC припускає, що нейронна активність в цьому регіоні пов'язана з опором покаранню і, таким чином, може сприяти переходу до залежності.

Для виявлення субстрату підвищеної нейрональної активності в OFC у мишей, які протистоять покаранню, ми підготували зрізи PL і L-OFC через 24 години після останнього сеансу покарання для тестування на внутрішню збудливість. Дві області були обрані через їх дуже чіткий характер експресії c-Fos у попередніх експериментах. Збудливість нейронів визначали кількісно, ​​підраховуючи кількість потенціалів дії (AP), спричинених введенням все більшої кількості струму (від 0 до 600 пА) в цілоклітинних записах. Ці записи виявили стійку гіпозбудливість у пірамідних нейронах PL стійких мишей (та їх контрольний контроль) у порівнянні з чутливими або наївними мишами (Фігура 7А). Потенціал мембрани спокою (РМП) зареєстрованих нейронів не відрізнявся між експериментальними групами (Фігура 7B). Ці результати свідчать про те, що збудливість нейронів у ПЛ безпосередньо корелює з кількістю отриманих шоків і, можливо, не з рішенням протистояти покаранню. Це, швидше за все, відображає адаптацію негативного зворотного зв'язку, викликану збудженням нейронів, викликаним шоком ноги напередодні. Навпаки, нейрони з L-OFC були більш збудливими тільки у резистентних мишей. Збудливість нейронів у мишених яєць не відрізнялася від збудливості нейронів від наївних мишей, виключаючи сам ефект стопного шоку (Фігури 7C і 7D). Ця підвищена активність OFC нейронів, ймовірно, лежить в основі cFos вираження і може призвести до опору покаранню.

Щоб перевірити причинно-наслідковий зв'язок між підвищеною збудливістю нейронів OFC та стійкістю до покарання, ми виразили інгібуючий DREADD (дизайнерські рецептори, що активуються виключно дизайнерськими препаратами: CamKIIα-hM4D) у пірамідальних нейронах OFC мишей DAT-Cre + (Фігура 8А). При гострих зрізах з OFC, застосування ванни CNO (клозапін-N-оксид) індукувало повільний зовнішній струм, швидше за все, опосередкований каналами GIRK, що було скасовано барієм (Ba)²⁺), неспецифічний блокатор калієвих каналів (Фігура 8B). CNO також змістив криву вводу / виходу вправо (Фігура 8В). Миші DAT-Cre +, інфіковані AAV1 / CamKIIα-hM4D-mCherry в OFC (Фігура 8Г) придбала парадигму самостимуляції нейронів DA, ​​за якою слідували два послідовні блоки із графіком покарань, перший у присутності CNO та другий без CNO. Два блоки були перервані на 6 днів без покарання (Фігура 8Е). Наприкінці першого блоку покарання в присутності CNO тільки 5 мишей 16 були стійкими (Фігура 8F, ліва панель). На відміну від інгібування OFC, протягом другого періоду покарання 14 з 16 класифікувалися як «стійкі» (Фігури 8F, права панель і 8G). Іншими словами, частка резистентних мишей була значно нижчою в присутності CNO порівняно з першою когортами мишей 34, які раніше тестувалися в тих же умовах (порівняння між групами, Фігура 8H) і став схожим на першу когорту без CNO (порівняння в межах групи). Нарешті, для дев'яти мишей, які змінювалися від чутливих до стійких, CNO не змінював латентність хвоста-плівки при зануренні в гарячу воду (Фігура 8I).

У сукупності цей експеримент демонструє, що активність пірамідних нейронів OFC призводить до рішення продовжити самостимуляцію, незважаючи на негативні наслідки, що є ключовою особливістю переходу до наркоманії у гризунів.

Обговорення 

Нещодавно запропонована модель наркоманії виділяє три етапи прогресування захворювання: спорадичне рекреаційне вживання наркотиків, за яким слідує посилене, стійке, ескалаційне вживання наркотиків і, врешті-решт, компульсивне вживання, пов’язане з втратою контролю (Piazza and Deroche-Gamonet, 2013; але див. Джордж та ін., 2014). Наше дослідження демонструє, що стимуляція нейронів VTA DA є достатньою, щоб керувати цим прогресуванням з відносно швидким часовим ходом.

Шляхом імітації природного режиму спалаху, ефективно виділення DA викликається в цільових регіонах VTA, таких як NAc (Bass et al., 2010). Тому рівні DA в NAc, ймовірно, регулюють самостимуляцію, подібно до того, як гризуни самостійно вводять наступну інфузію кокаїну або героїну, як тільки концентрація DA знижується нижче порогової (Wise et al., 1995). Це також підтверджується нашими спостереженнями, що кокаїн, введений внутрішньовенно, може закрити самостимуляцію. Таким чином, самостимуляція нейронів DA дуже нагадує самовведення лікарських засобів, хоча його кінетика, безумовно, швидша, ніж будь-яка фармакологічна речовина, включаючи кокаїн, як передбачається різною швидкістю відповідей, що спостерігається у цьому дослідженні.

Хоча ми селективно націлювали DA-нейрони VTA, їх оптогенетична самостимуляція може мати активовані групи клітин з різними фізіологічними функціями. Наприклад, нещодавно було припущено, що деякі нейрони DA кодують аверсивні подразники (Lammel et al., 2012, Gunaydin et al., 2014). Ці клітини проектуються на mPFC, тоді як нейрони VTA DA, що проектуються на бічну оболонку NAc, опосередковують позитивне підкріплення (Lammel et al., 2012). Цікаво було б оцінити самостимуляцію та прогресування за допомогою селективного націлювання (Gunaydin et al., 2014). Оскільки наша маніпуляція активувала всі нейрони VTA DA, подібно до того, як кокаїн діє на всі нейрони, що експресують DAT, можна подумати, що деякі нейрони DA сприятимуть навчанню підкріплення, в той час як інші нейрони DA сприятимуть навчанню відвертості. Чистий ефект все одно буде підкріпленням поведінки; однак, "нейрони відвертості" можуть сприяти індукції процесу опонента (Koob, 2013, Wise and Koob, 2014).

Після вимушеного утримання, повторного впливу на контекст, викликаного пошуком самостимуляції, встановленої гризунової моделі рецидиву наркотиків. Примітно, що основна нервова пластика не відрізняється від тієї, що спостерігається після відмови від самоконтролю кокаїном (Pascoli, Terrier et al., 2014). Це додає до дослідження, яке раніше повідомляло про однакову синаптичну пластичність нейронів VTA DA, викликану одним сеансом оптичної стимуляції або першим введенням наркотику, що викликає залежність (Brown et al., 2010). З'являється модель синаптичних адаптацій, що є адаптивною поведінкою, спільною для всіх наркотиків, що викликають залежність.

Яскравою особливістю нашого дослідження є роздвоєність у відповіді на аверсивний стимул, який є досить сильним, щоб порушити споживання несуттєвої природної винагороди у всіх тварин. У наших умовах стійкі миші не виявляли значно вищої мотивації до самостійної доставки винагороди, що контрастує з дослідженням кокаїну на щурах (Pelloux et al., 2007). Проте поведінковим предиктором стійкості до покарання у мишей було марне натискання важеля протягом 5 с до початку стимуляції нейрону DA. Отже, неможливість дочекатися доставки винагороди може розглядатися як маркер імпульсивності (Dalley et al., 2011, Olmstead, 2006, Everitt et al., 2008, Winstanley, 2011, Leyton and Vezina, 2014). Нас заінтригувало спостереження, що імпульсивний прийом розвивався лише після декількох сеансів самостимуляції. Це підвищує ймовірність того, що стійкість до покарання (і, як наслідок, вразливість до залежності) може бути не повністю вродженою, але розвивається на початкових етапах до залежності. Якщо це так, то роздвоєність, що спостерігається нами та іншими (Deroche-Gamonet et al., 2004), може визначатися не лише генетичними факторами. Це також може пояснити, що подібна частка особин потрапляє в залежність від генетично відносно однорідних штамів мишей і генетично, безумовно, більш різноманітних людських популяцій.

Якщо стійкість до покарання виявляє індивідуальну вразливість до залежності, яка, за оцінками, досягає 20% у людей навіть з кокаїном (Warner et al., 1995, O'Brien, 1997, George et al., 2014), то тут набагато більша частка може відображати силу прямої та селективної стимуляції нейрону DA. Іншими словами, селективна стимуляція нейронів DA може викликати набагато більше звикання, ніж будь-який наркотик. Це можна пояснити неселективною дією фармакологічних речовин. У випадку з кокаїном, наприклад, моноаміни, крім DA, насправді можуть затримати індукцію звикання. Дійсно, серотонін може протистояти залежній від DA адаптаційній поведінці, такій як реагування на умовну винагороду, самостимуляцію та умовні переваги місця (Wang et al., 1995, Fletcher and Korth, 1999, Fletcher et al., 2002), сприяючи асоціації сигналів до аверсивних подразників (Bauer, 2015, Hindi Attar et al., 2012). Альтернативно, різниця може полягати у різниці кінетики між оптогенетичною самостимуляцією та фармакологічною індукцією збільшення позаклітинного DA. Такі варіації потенції звикання можуть також існувати серед різних наркотиків, що зловживають (George et al., 2014).

Хоча ми не можемо офіційно виключити відмінності у вивільнення DA та / або відносного сигналізації, щоб сприяти встановленню стійкості до покарання, цей сценарій малоймовірний, оскільки гістологічна перевірка інфекції тварин, включених у дослідження, показала eYFP-ChR2 вираження у всій ВТА. Більш того, протокол оптикогенної стимуляції, призначений для насичення вивільнення DA, призвів до самостимуляції, яка завершилася унімодально розподіленими значеннями точки розриву, що відображає мотивацію стимулювання.

Ще одним дивовижним результатом є те, що кількість ударів електричним ногою корелювало із збудливістю нейронів у ФЛ. Зниження збудливості пірамідних нейронів та збільшення співвідношення AMPAR / NMDAR у пірамідних нейронах тих самих клітин спостерігали у «залежних щурів», однак ці дослідження не контролювали вплив електричних ударів як таких (Kasanetz et al., 2010, Kasanetz та ін., 2013, Chen et al., 2013). Отже, недисоціація може пояснюватися подвійною роллю mPFC як у процесі прийняття рішень, так і в інтеграції страху (Peters et al., 2009). І навпаки, зміна збудливості пірамідних нейронів в інфралімбічній корі корелює з ударами стопи (Santini et al., 2008). Ці докази не виключають можливості того, що mPFC відіграє помітну роль у вирішенні питання про вживання. Однак наш аналіз cFos та спостереження за власною збудливістю вказують на OFC та поширювальну кору. Крім того, інгібування нейрональної збудливості в OFC з DREADD запобігало стійкості до покарання. Цей причинно-наслідковий зв’язок є важливим кроком у розумінні клітинних механізмів, відповідальних за перехід до звикання. Потрібні подальші дослідження, щоб перевірити, чи стосується це також усього спектру наркотиків, що викликають залежність.

Наші висновки узгоджуються з спостереженнями, що порушення функції OFC може погіршити процес прийняття рішень з урахуванням витрат і вигод (Seo and Lee, 2010, Walton et al., 2010, Fellows, 2011) і може спричинити компульсивну поведінку (Burguière et al., 2013 ). У людей зловживання наркотиками пов’язане з порушенням прийняття рішень та зміною функції OFC (Lucantonio et al., 2012, Gowin et al., 2013). У сукупності активність нейронів OFC постає ключовим фактором, що визначає перехід до компульсивного вживання наркотиків (Everitt et al., 2007). Це не виключає ролі викликаної наркотиками пластичності при збудливих афферентах на МСН, що спостерігається тут та в інших дослідженнях (Kasanetz et al., 2010). Буде цікаво оцінити, чи впливають маніпуляції, спрямовані на контроль збудливості OFC, на мотивацію у наркоманів.

Тут ми пропонуємо самостимуляцію нейронів DA як потужну модель для вивчення стадій, що ведуть до звикання. Ми відтворюємо основні компоненти наркоманії, такі як рецидив, синаптична пластичність та стійкість споживання, незважаючи на негативні наслідки. Хоча модель, безумовно, не підходить для вивчення ефектів, характерних для даного препарату (наприклад, порівняння опіоїдів із психостимуляторами), вона має ряд переваг. Це забезпечує точний часовий контроль доставки винагороди, він дуже конкретно активує лише нейрони VTA DA, і, нарешті, що не менш важливо, дає можливість вивчати мишей набагато довший час, ніж при самовведенні ліків. Зосередившись на визначенні спільності наркотиків, що викликають залежність, надія полягає в тому, щоб розкрити нервові механізми, що лежать в основі також залежних від речовин форм звикання (Alavi et al., 2012, Robbins and Clark, 2015), і таким чином внести свій внесок у загальну теорію захворювання. Моделі оптогенетичних захворювань, таким чином, дозволяють вирішальний крок для глибокого розуміння дисфункції нейронів, що виникає на пізніх стадіях наркоманії, і допоможуть новим, раціональним методам лікування захворювання, яке в даний час не виліковується.

VP, JT і AH проводили поведінкові експерименти, в той час як В.П. виконував електрофізіологічні записи і координував аналіз. Дослідження було розроблено та написано всіма авторами.

Робота була підтримана грантами від Швейцарського національного фонду та просунутим грантом ERC (MeSSI), Carigest SA, Академічним товариством Женеви та Фондом Privée des Hopitaux Universitaires de Genève. JT - студент MD-PhD, який сплачує Швейцарська Конфедерація.

Документ S1. Додаткові експериментальні процедури та малюнки S1 – S6

Таблиця S1. Статистичні аналізи