PLoS Один. 2010; 5(10): e15401.
абстрактний
Завершення шаблону, можливість отримання повних пам’яток, ініційованих частковими сигналами, є критичною особливістю процесу пам’яті. Однак мало що відомо про молекулярні та клітинні механізми, що лежать в основі цього процесу. Для вивчення ролі дофаміну у відкликанні пам’яті ми проаналізували гетерозиготних мишей, що переносять дофамін, гетерозиготними (DAT)+/−), і виявили, що хоча ці миші мають нормальне навчання, консолідацію та відкликання пам’яті при повних умовах, вони виявляють специфічний дефіцит у завершенні схеми за умови часткового випробування. Ця форма дефіциту пригадування пам’яті у гетерозиготних мишах з нокаутом транспортера дофаміну може бути скасована низькою дозою галоперидолу антагоніста дофаміну, що додатково підтверджує, що неможливість відновлення структури пам'яті є результатом дисбалансу дофаміну. Отже, наші результати показують, що делікатний контроль рівня дофаміну мозку є критично важливим для завершення структури під час відкликання асоціативної пам'яті.
Вступ
Відкликання пам'яті передбачає рекапітуляцію раніше придбаної інформації [1], [2]. Залежно від стану відкликання, пошук пам’яті може відбуватися з більшістю або всіма раніше зустрічаними сигналами, пов’язаними з навчанням (наприклад, бачити людину і чути її голос одночасно, або переглядати рідне місто, яке не змінилося сильно тощо). З іншого боку, у багатьох випадках пошук пам'яті зазвичай відбувається, коли наявні лише підмножини початкових сигналів (наприклад, реконструкція старих карт вулиць рідного міста, коли лише кілька старих орієнтирів залишилися незмінними). Це відомо як завершення структури, в якій мозок реконструює та витягує цілі шаблони пам’яті з часткових зовнішніх сигналів або самостійно ініційованих внутрішніх процесів. В даний час мало відомо про фактичні молекулярні та клітинні механізми, що лежать в основі завершення структури виклику пам'яті. Однак нові дослідження показують, що моноамінна сигналізація може грати роль у пошуку пам'яті [3].
У цьому дослідженні ми вирішили вивчити, як модулюючий нейромедіатор дофамін відіграє роль у регулюванні завершення картини пам'яті під час часткового виклику сигналу. Дофамін - ключовий нейромедіатор, який може впливати на пізнання, емоції та рух. Ненормальна дофамінергічна передача пов'язана з низкою психічних та неврологічних порушень, включаючи дефіцит уваги та гіперактивність (СДУГ), шизофренію та хворобу Паркінсона [4]-[8]. Хоча дофамінергічні нейрони походять лише з вентральної тегментальної області та substantia nigra compacta, їхні виходи проектуються майже скрізь у мозку, включаючи префронтальну кору, медіальну скроневу долю та гіпокамп, регіони, які, як відомо, активуються під час ретриви пам'ятіl [3], [9]-[14].
Слід також зазначити, що дофамін вважався функціонально важливим для уваги та робочої пам’яті, опосередкованої вище областями мозку [15]-[18]і те, і інше, малося на увазі в процесі пошуку пам'яті в умовах часткової дії [19]. Як основний клітинний механізм припинення дофамінової сигналізації, транспортер дофаміну (DAT), розташований на нейрональних пресинаптичних терміналах, відновлює дофамін з синаптичної щілини назад у дофамінергічні нейрони. Таким чином, ДАТ є критичною молекулою для регулювання синаптичних рівнів дофаміну і, як наслідок, визначення часової тривалості дії дофаміну на локальні нервові ланцюги. Дійсно, генетичний нокаут гена транспортера дофаміну призводить до глибоких порушень. Гомозиготні миші DAT-KO страждають від явних порушень, включаючи затримку росту, стійку гіпоперактивність опорно-рухового апарату та багато інших порушень, включаючи дефіцит звикання та соціальну взаємодію, а також порушення рухливості кишечника, дихальний контроль тощо. [6], [20], [21]. Загальні дефекти гомозиготних мишей DAT-KO зробили менш придатним для дослідження ролі дофаміну в регуляції процесів пам'яті.
Цікаво, що гетерозиготні нокаутні миші (ДАТ)+/− мишей), які все ще володіють алелем функціонального гена DAT, здаються цілком нормальними в їх загальній грубій поведінці [6], [20], [21]. Таким чином, ДАТ+/− миші можуть надавати цінну модель для вивчення деяких делікатних, але важливих фенотипів, таких як процеси асоціативної пам'яті та пов'язані з ними механізми, регульовані дофамінергічною схемою. Тут ми використовували набір поведінкових парадигм для оцінки функціональних наслідків дисбалансу дофаміну від завершення структури під час виклику асоціативного запам'ятовування.
результати
Для дослідження ролі дофаміну в пошуку пам’яті ми використовували гетерозиготних мишей-нокаутів транспортерів дофаміну (DAT+/−). Ми використовували батарею основних поведінкових вимірювань для оцінки їх опорно-рухової активності у відкритому полі (Малюнок 1A), ротародні виступи (Рисунок 1B і 1C), і виявили, що ці гетерозиготні нокаутовані миші є абсолютно нормальними. Ми також підтвердили, що ДАТ+/− миші демонструють невідмінні показники рівня тривожності, виміряні підвищеним плюсом лабіринту (Малюнок 1D).
Крім того, ми оцінили основні функції навчання та пам'яті в DAT+/− мишей. По-перше, ми використовували тест розпізнавання нового об'єкта і спостерігали, що ці миші виявляли абсолютно нормальні поведінкові показники в тестах на утримання 1 дня, порівняно з контролем їх дикого типу (Малюнок 1E). Більше того, ці миші також демонструють нормальне утримання страху, що триває 1, що не відрізняється від контрольних мишей дикого типу (Малюнок 1F). Тому ці результати говорять про те, що ДАТ+/− у цих двох форм первинних тестів пам'яті миші мають нормальну функцію навчання та пам'яті.
Тест просторової опорної пам'яті раніше використовувався для оцінки завершення структури виклику пам'яті. Ми піддавали ДАТ+/− миші та засоби дикого типу для цього завдання. Використання протоколу просторової довідкової пам'яті, описаного раніше [22], ми тренували цих мишей у водному лабіринті прихованої платформи. Тренінг складався з чотирьох випробувань на день, з інтервалом між годинами між випробуваннями. Ми з’ясували, що і ДАТ+/− миші та миші дикого типу демонстрували порівнянне утворення та консолідацію пам’яті протягом денних сеансів 10 та з подібною швидкістю плавання (Малюнок 2A і 2B).
Далі ми вивчили їх пам'ять про приховане місце на платформі, використовуючи тест зонду (P1) на день 11, через день після завершення останнього тренінгу. Як вимірюється за допомогою заповнення квадрата, обидва DAT+/− миші та їх контрольні посліди змогли зосередити свій пошук у цільовому квадранті за наявності повних сигналів (Малюнок 3A). Більше того, ДАТ+/− миші також виявляли велику перевагу в зоні платформи фантома, і різниці в порівнянні з розміщеністю платформи управління не було (Малюнок 3B). Крім того, як очікувалося, обидва DAT+/− миші та посмішники дикого типу демонстрували значне збільшення кількості схрещувань (Малюнок 3C). Таким чином, усі ці вимірювання свідчать про те, що ДАТ+/− миші можуть нормально вчитися цій задачі та отримувати цю асоціативну пам’ять, як правило, у повних умовах.
Щоб визначити, чи важливий делікатний баланс дофаміну для заповнення структури в умовах часткової киї, наступного дня ми провели другий тест зонду (P2), видаливши три з чотирьох дистальних сигналів (день 12). Щоб уникнути можливого вимирання з попереднього сеансу відкликання, ще один блок (випробування 4) тренінгу був доставлений 1 годину після тесту P1 зонду. Під час цього випробування з частковим випробуванням зонду, поки контрольні миші продовжували концентрувати свій час пошуку в цільовому квадранті, а не в інших квадрантах, DAT+/− миші демонстрували лише ефективність на рівні шансів, виміряну цільовим розміщенням квадрантів (Малюнок 3D). Більше того, вимірювання заповненості площ фантомних платформ додатково підтвердило, що це ДАТ+/− миші були порушені при запам'ятанні місця на платформі (Малюнок 3E). Цей дефіцит пошуку виявився також відсутністю збільшення кількості перетинів платформи (Малюнок 3F), тоді як дикі типи смітників були повністю здатні виконувати часткове виклик пам'яті. Тому ці дані говорять про те, що ДАТ+/− миші мають дефіцит у виведенні просторових орієнтирів в умовах часткової дії.
Нарешті, ми запитали, чи можемо ми відновити завершення візерунка в цих DAT+/− мишей, використовуючи фармакологічні методи. Повідомлялося, що низька доза антагоніста дофаміну, галоперидол, може бути корисною для полегшення деяких порушень дофаміну. [20]. Обґрунтування полягає в тому, що низька доза галоперидолу може дещо послабити дію підвищеного дофаміну у гетерозиготних мишей, які мають недостатнє зворотне захоплення дофаміну через втрату одного алеля нормального гена транспортера дофаміну. Ми застосували той самий набір мишей до рятувального експерименту. У день 13 та день 14 ми піддавали вищевказаних мишей третьому досліджуваному зонду (P3) в умовах повного випробування та четвертому дослідженні зонду (P4) в умовах часткової киї. Знову ж таки, щоб протидіяти будь-якому вимиранню, яке могло статися під час випробування зонду, ми провели ще один блок (випробування 4) тренувальної 1 години після закінчення тесту зондування P2 або P3. Наші вимірювання зайнятості цільового квадранта на тесті зонда P3 показують, що і ДАТ+/− миші та контрольні посліди концентрували свій пошук у цільовому квадранті за наявності повних сигналів (Малюнок 4A). Крім того, про їх нормальне відкликання пам'яті знову було підтверджено вимірюванням зайнятості платформи (Малюнок 4B), а також кількість переїздів платформи (Малюнок 4C). Таким чином, ці миші-мутанти були повністю здатні витягувати просторову пам’ять у повних умовах.
У день 14 ми видалили три з чотирьох дистальних сигналів та провели четвертий дослідний зонд (P4) за умови часткової реакції. Ми вводили ДАТ+/− мишей внутрішньочеревно з низькою дозою галоперидолу (0.002 мг / кг маси тіла) 30 за хвилини до тестів на утримання. Смелярі дикого типу отримали ін'єкцію фізіологічного розчину в якості контролю. Ми виявили, що ДАТ+/− миші концентрували свій час пошуку в цільовому квадранті і демонстрували статистично подібні показники порівняно з аналогами дикого типу (Малюнок 4E). Крім того, вимірювання зайнятості фантомних майданчиків платформи додатково обгрунтувало, що ці ДАТ+/− миші можуть згадати місце розташування платформи (Малюнок 4F). Їх нормальне відкликання пам'яті знову було підтверджено збільшенням кількості перетинів платформи, що було на тому ж рівні, що і мишей дикого типу (Малюнок 4G). Таким чином, ці експерименти дозволяють припустити, що дефіцит завершення структури спочатку спостерігався в DAT+/− миші можуть бути викликані дисбалансом дофаміну.
Для того, щоб виключити можливість того, що результати для фенотипу, введеного галоперидолом у дослідженні зонду P4, були обумовлені перетренованістю під час повторних тестів зонду, ми використовували інший набір DAT+/− і контролювати послідовників та повторювати весь експеримент. Як і очікувалося, обидва DAT+/− миші та їхні миші дикого типу демонстрували хороші показники навчання протягом денних навчальних занять 10 (Малюнок 5A). У день 11 ми потім піддавали цих мишей тести на відкликання з повним накладом, немає значної різниці в результатах тестів на збереження пам'яті між DAT+/− мишей та контрольних послідов, які вимірюються за розмірами квадранта (Малюнок 5B), цільова заповнена квадрант (Малюнок 5C), а також кількість переїздів платформи (Малюнок 5D). Через годину після завершення тесту з повним випробуванням ми перевчили цих мишей ще одним блоком тренувань, щоб запобігти будь-якому ефекту вимирання. На день 12 цих мишей піддавали тестам на часткове випробовування. Низьку дозу галоперидолу (або фізіологічного розчину) для контролю вводили мишам внутрішньочеревно 30 за кілька хвилин до випробування з частковою реакцією. Ми виявили, що це лікування справді призводило до нормальних показників у мишей-мутантів. Мутантні та контрольні миші демонстрували порівнянні показники в розміщенності квадрантів (Малюнок 5E), цільова заповнена квадрант (Малюнок 5F), а також кількість переїздів платформи (Малюнок 5G). Вимірювання їх швидкості плавання також не виявило відмінностей (Фігура 5H). Отже, ці дані чітко продемонстрували, що врятований дефіцит пошуку часткового випробування в ДАТ+/− мишей галоперидолом не було обумовлено повторним тренуванням під час багаторазових випробувань.
Обговорення
Хоча, як відомо, система дофаміну має вирішальне значення для регуляції багатьох когнітивних процесів [8], [16]-[18], [23]-[25], наше теперішнє дослідження вперше свідчить про те, що дисбаланс дофаміну внаслідок втрати одного алеля нормального гена транспортера дофаміну спричинив специфічний дефіцит у завершенні структури під час асоціативного відкликання просторової пам'яті. Цей дефіцит виклику пам’яті очевидний лише в умовах частково-просторової сигналізації, але не в умовах повного виклику. Більше того, цей дефіцит виклику пам'яті відображає дуже специфічну форму дефіциту пам’яті, оскільки широкі аспекти основної поведінки (рухоме відкрите поле, ротарод та тривога) та інші форми пам’яті, такі як умовний контекст страхування та розпізнавання нових об’єктів, залишаються нормальними.
Існує кілька потенційних молекул та клітинних сценаріїв, які можуть спільно сприяти спостережуваному просторовому дефіциту відкликання з частковою києю, серед яких вважається, що дофамін є основною молекулою-кандидатом, що лежить в основі цього процесу пам'яті, тому що увага та робоча пам'ять, в першу чергу, контролюються Повідомляється, що сигнали дофаміну є критичними для відновлення просторової пам'яті [15]-[18], [26]. Добре відомо, що дофамінергічні нейрони, що походять тільки з вентральної тегментальної області та substantia nigra compacta, проектуються майже скрізь у мозок, включаючи префронтальну кору, медіальну скроневу долю та гіпокамп [5], [19], [27]-[28], регіони, які, як відомо, активуються під час пошуку пам'яті, а також у процесі уваги [3], [9]-[14], [29], [30]. З огляду на широкі докази того, що дофамін має важливе значення для уваги та робочої пам’яті [15]-[18] і що, як вважається, генетичний поліморфізм гена DAT пов'язаний із СДУГ [31]-[33]можливо, що і увага, і робоча пам'ять можуть відігравати певну роль у завершенні пошуку пам’яті в умовах часткової черги за допомогою DAT-опосередкованого регулювання допаміну. Таким чином, дефіцит заповнення картини пам'яті, спостерігається у гетерозиготних мишей-мутантів DAT, може бути зумовлений нездатністю миші задовольнити підвищені вимоги уваги під час часткового виклику пам'яті на основі киї внаслідок порушення синаптичного дофаміну.
Ми виявили, що дисбаланс дофаміну призводить до дефіциту відновлення пам’яті також з огляду на клінічну деменцію, яка спостерігається у пацієнтів Паркінсона. Зазвичай такі пацієнти зберігають здатність до навчання, закріплення та зберігання нової пам’яті, але вони сильно порушені у відновленні пам’яті, особливо під частковими зовнішніми підказками або самостійним ініційованим відкликанням [34], [35]. Цей дефіцит особливо глибокий, коли явних сигналів немає [8], [23], [34]-[36], тим самим додатково вказуючи на те, що дофамін може бути залучений до процесу відкликання пам'яті. Такі типи дефіциту пам'яті у пацієнтів з Паркінсоном суворо контрастують з дефіцитом пам'яті в інших нейромедіаторних системах [37] або рання деменція у пацієнтів з Альцгеймером, які, як правило, порушені у навчанні та закріпленні нових спогадів, зберігаючи здатність згадувати старі спогади [34], [35]. Це ілюструє необхідність розробки різних терапевтичних стратегій через різну вразливість для розрізнення молекулярних і тимчасових процесів у схемах пам'яті.
Наша демонстрація того, що завершення структури можна повністю врятувати за допомогою ін'єкції галоперіодолу під час відкликання, посилює уявлення про роль збалансованого рівня дофаміну в пошуку пам'яті. Цей фармакологічний рятувальний експеримент надає додаткові докази тимчасової специфіки, що спричиняє частковий дефіцит виклику на основі киї. Слід зазначити, що дофамінові дисфункції при ДАТ+/− мишей та пацієнтів з Паркінсоном сильно відрізняються один від одного, проте обидва призводять до дефіциту пошуку. Ця спільність забезпечує колективну підтримку думки про те, що делікатний баланс дофамінової системи має вирішальне значення для пошуку пам’яті, а дисбаланс у будь-якому напрямку (вгору чи вниз) може спричинити дефіцит завершення структури пам'яті під час виклику. Важливо, що ми хочемо зазначити, що наш нинішній аналіз не слід тлумачити як доказ використання мишей-мутантів DAT як моделі хвороби Паркінсона. З іншої сторони, в природних умовах Вимірювання дофаміну у гомозиготних мишах DAT виводить значне зниження вивільнення дофаміну, викликане стимуляцією сплеску [38]-[40]. Це вказує на те, що здатність перекладати нейронну активність увірвалася в сигнали дофаміну в різних областях мозку нокаутованих мишей може бути дефіцитною. Можливо, що зменшення співвідношення дофаміну може призвести до змінених фізіологічних змін у формах випалу всередині нейронних ланцюгів, що беруть участь в обробці пам'яті. В даний час невідомо, чи відбувається подібне зміна також у гетерозиготних мишей з гетерозиготними ДАТ або у пацієнтів із хворобою Паркінсона.
Хоча про нейронні ланцюги, що активуються під час відкликання просторової пам’яті, мало відомо, але ймовірно, що він набирає кілька областей, включаючи префронтальну кору, медіальну скроневу кору та гіпокамп. Це добре вписується в анатомічні докази того, що дофамінергічні виходи з тегментальної області вентрали сильно випромінюються до вентральної зони CA1 та енторинної кори[13], [28]. Цей цикл префронтально-гіппокампа-VTA може зіграти вирішальну роль для створення контекстної знайомства, що, в свою чергу, сприяє завершенню візерунка під час часткового виклику просторової пам’яті на основі киї за допомогою полегшення уваги, регульованої дофаміном [3], [14], [26], [28]. У наступних дослідженнях буде важливо детальніше визначити анатомічні локуси, з яких походить спостережуваний дефіцит завершення структури. Було б особливо цікаво досліджувати місця кандидатури, такі як передня черепна кора, скронева кора та гіпокамп, використовуючи фармакологічні, генетичні та широкомасштабні методи in vivo запису. [11], [41]-[44]. Також важливо оцінити, чи сприяє генетична компенсація або повільні зміни в мутантному мозку спостережуваному дефіциту виклику. Також є вказівки на те, що інші нейромедіаторні системи також можуть бути критично залучені до регуляції пошуку пам'яті [3], [37], [45], [46], і було б дуже цікаво вивчити та порівняти їхні динамічні взаємодії між частковим завершенням візерунка, виконаним за допомогою киї, та повним пошуком пам’яті на основі кий. На закінчення, наше дослідження припускає, що делікатний баланс рівнів дофаміну має вирішальне значення для завершення структури під час асоціативного відкликання просторової пам'яті.
Матеріали та методи
Етичні твердження
Всі роботи на тваринах, описані в дослідженні, проводилися відповідно до керівних принципів NIH та затверджені Інституційним комітетом IACUC при Медичному коледжі Джорджії (номер затвердження AUP: BR07-11-001).
Виробництво та генотипізація мишей-мутантів
Миші DAT були щедрим подарунком лабораторії доктора Сяосі Чжуанга з Чиказького університету. Розведення та генотипізація гетерозиготних мишей з гетерозиготними ДАТ такі ж, як описано [6]. Для наших експериментів миші і самці, і самки однаково використовувались у співвідношенні 1![[співвідношення]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif){kind=small}
1. ПЛР для ДАТ+/− мишей супроводжували протокол, як описано [6]. Всі миші підтримувались у стандартних умовах (23.1 ° C, 50.5% вологості) у тваринництві Медичного коледжу Джорджії. Всі експерименти проводилися в звукоізольованій і спеціалізованій кімнаті для поведінки. Усі експериментатори були сліпими до генотипу окремої тварини.
Завдання на розпізнавання роману-об’єкта
Протокол експерименту був таким самим, як описано раніше [37], [47]. Коротко кажучи, мишей окремо розміщували в коробці з відкритим полем (високі 20 × 20 × 10) протягом 3 днів. Під час навчальних занять два нові предмети були розміщені у відкритому полі, і тварині було дозволено досліджувати протягом 15 хв. Час, витрачений на вивчення кожного об’єкта, було зафіксовано. Під час одногодинних тестів на відкликання тварину було поміщено назад у ту саму скриньку, в якій один із знайомих предметів під час тренування був замінений новим предметом, і йому дозволяли вільно досліджувати протягом 15 хв. Індекс уподобань, відношення часу, витраченого на вивчення будь-якого з двох об'єктів (тренувальне заняття) або нового (сесія утримання), загального часу, витраченого на вивчення обох об'єктів, використовувався для вимірювання пам'яті розпізнавання.
Тести з відкритим полем та рота-стрижнем
Протоколи були такими ж, як описано [48]. Для вимірювання активності у відкритому полі мишей поміщали у відкрите поле, виготовлене з чорної скриньки 14 × 14 дюймів. Поле було позначене маленькими квадратними сітками 2 × 2 дюймів (квадрати 7 - квадрати 7 із загальним квадратом 49). Активність на відкритому полі тварин визначалася кількістю схрещувань, які миші пройшли протягом періоду 3. Для вимірювання тесту Рота-стрижня мишей поміщали на прискорюючий обертовий деревний стрижень. Стрижень завдовжки 12 і діаметром 1 дюйма. Початкова швидкість обертання була при 4 об / хв, а потім стабільно прискорювалася до 40 об / хв. Ефективність вимірювалася кількістю часу (у секундах), який мишам вдалося залишитися на обертовому стрижні протягом п’ятихвилинних або одночасових тестів на відкликання.
Підвищені тести плюс лабіринт
Протоколи були такими ж, як описано [49]. Піднятий плюс лабіринт виконаний з нержавіючої сталі, яка пофарбована в матовий чорний колір, і складається з чотирьох кронштейнів (два відкритих без стінок і два закритих стінами висоти 15.25 см) довжиною 30 см і шириною 5 см. Кожна рука лабіринту кріпиться до міцних металевих ніжок таким чином, щоб вона була піднята на 40 см над столом, на якому вона спирається. Активність була зафіксована цифровою камерою (Logitech Camera, модель № N231), розміщеною 130 см над лабіринтом. Випробування проходили при слабкому світлі (одна лампочка 40-W і одна м'яка біла лампочка 60-W, обидві під кутом для створення непрямого освітлення на лабіринті) під час світлової фази циркадного циклу (між 0900 год і 1400 год). Лабіринт очищали 5% оцтовою кислотою між тестами. Білий шум (30 dB) маскує сторонні фонові шуми. У день випробування тварин заносили до кімнати для випробувань у їхні домашні клітки, а потім кожну пару тварин вилучали із своєї домашньої клітки та поміщали в окрему клітку для тримання на 5 хв перед тим, як їх помістити на лабіринт. Тварин розміщували індивідуально в центрі лабіринту, при цьому положення голови було врівноважене між мишами, і поведінку фіксували протягом 5 хв. час, проведений на відкритій і закритій руці (коли всі чотири лапи гризуна знаходяться на відкритій чи закритій руці) записували та аналізували.
Контекстне кондиціонування страху
Кондиціонування страху проводили, як описано раніше [45]. Експеримент був проведений в системі кондиціонування страху, камері, розташованій у звукоослабленій коробці з будинковим світлом на стелі та сіткою з нержавіючої сталі (Coulbourn Instruments, Whitehall, PA). Підлогу сітки було підключено до ударного генератора, і слуховий сигнал походив від гучномовця, прикріпленого до стінки камери. Усі стимули контролювалися автоматично за допомогою персонального комп’ютера з програмою Graphic State. Перед камерою було розміщено відеокамеру, щоб записати поведінку. Мишей обробляли протягом 3 днів, а потім обитали до тренувальної камери протягом 5 хв. Використовуваний умовний подразник (CS) являв собою звук 85 дБ при 2.8 кГц, тоді як безумовний стимул (США) - це суцільний скремтований удар стопи при 0.8 mA протягом 2 s. Після одного одночасного закінчення розбору CS / US, тварина залишалося в камері ще протягом 30 s для вимірювання негайного заморожування. Під час тесту на утримання кожну мишу поміщали назад у ту саму камеру, і реакції заморожування реєстрували протягом хв 5 (контекстна відповідь на заморожування). Всі тести були зняті на відео під червоним світлом. Загальний час заморожування вимірювали як показник пам'яті страху. Морозильна поведінка була визначена як повна відсутність руху, виключаючи дихання. Поведінка заморожування була оцінена програмним забезпеченням (Coulbourn Instruments) та перетворена на реакцію на заморожування [реакція на заморожування 
= (загальний час заморожування / загальний час тестування) × 100%].
Тести просторової довідкової пам'яті
Тест просторової орієнтації пам’яті був водним лабіринтом прихованої платформи. Ми дотримувались протоколу, як описано раніше Nakazawa et al. [22]. Тренінг складався з чотирьох випробувань на день, з однією годиною між випробуваннями. Рух мишей відстежували за допомогою відеокамери та вимірювали за допомогою програмного забезпечення (Noldul Information Technology, Нідерланди). Всі зафіксовані та проаналізовані затримки втечі на платформу, а також заселеність квадрата та перетин платформи. Басейн має діаметр 118 см, а платформа - діаметр 9.5 см. Проведено чотири зондові тести. Перший тест зондування (P1) був проведений на наступний день після останнього тренінгу за умовами повного дня (День 11). Другий тест зонду (P2) проводився в день 12 в умовах часткової киї (шляхом видалення трьох з чотирьох візуальних сигналів, вивішених на стіні чорної завіси). Для ДАТ+/− мишей, ми провели третій дослідний зонд (P3) на день 13 в умовах повного випробування і четвертий випробування зонду (P4) на день 14 в умовах часткової киї. Ще один блок (випробування 4) навчання був доставлений 1 годину після тестів P1, P2 та P3 відповідно, щоб протидіяти будь-якому вимирання, що могло статися під час випробування зонду. Крім того, для виключення ефекту сполуки, ймовірного перетренованості перед P4 (тест зонду з частковою кишкою та ін'єкцією галоперидолу), ми піддавали іншій групі ДАТ+/− мишей, а також їх контрольних послідовників дикого типу до двох додаткових випробувань зонду (випробування P3 'і P4'). Тест зондування P3 'був проведений через день після останнього тренінгу за умовами повного дня (10 день). Тест зонду P4 'проводився 11 дня в умовах часткової киї. Під час всіх наших тестів на зонд, платформу було видалено, а мишам було дозволено плавати в басейні стільки ж часу, скільки було використано під час тренувань (60 сек). Час, проведений у кожному квадранті, було зафіксовано. Для відновлення рівня дофаміну [6], [20], [21], миші від DAT+/− і контрольній групі все ін'єктували внутрішньочеревно або галоперидолом (0.002 мг / кг маси тіла), або фізіологічним розчином за 30 хвилин до випробувань зонду Р4 та Р4 '.
Аналіз даних
Для врахування взаємозв'язків між тваринами між повторними вимірюваннями використовували лінійні змішані моделі для оцінки поведінкових показників у водному лабіринті Морріса, розпізнаванні нових об'єктів, умовному контексті страхування та тестах рота-стрижня. Метод Тукі-Крамера був використаний для визначення значущості таких поведінкових вимірювань між ДАТ+/− мишей і контрольних одноплідників. У відкритих тестах та на підвищених тестах плюс лабіринт для визначення ефектів генотипу використовували односторонній ANOVA та пост-спец тест Даннета. Безперервні змінні представлені як середнє значення та стандартна помилка середнього значення (SEM). Дані аналізували за допомогою SPSS версії 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Відмінності вважали суттєвими, коли Р <0.05.
Подяки
Ми дякуємо доктору Сяосі Чжуану з Чиказького університету за надання ДАТ+/− Миші з KO та Brianna Klein для технічної допомоги для експериментів.
Виноски
Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що конкурентних інтересів немає.
Фінансування: Це дослідження було підтримано коштами NIMH (MH060236), NIA (AG024022, AG034663 & AG025918), USAMRA00002, Грузинського науково-дослідного альянсу та Комісії з науки і технологій муніципалітету Шанхаю (10140900500) (всі JZT). Національний науковий фонд Китаю (81000592), Комісія з науки і технологій муніципалітету Шанхая (10DZ2272200, 09DZ2200900, 10PJ1407500 та 10JC1411200), Шанхайська муніципальна освітня комісія (11ZZ103) до FL та XMS. Фінансисти не мали жодної ролі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису.
;