Cdk5 Phosphorylates Допамін D2 рецептор і послаблює передачу сигналу (2013)

Коментарі: Виявляється, щоб показати, що Cdk5 викликає зниження регуляції рецепторів дофамінових D2. Дивно, але фактор перекладу дельтафосб індукує продукцію Cdk5.

Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) PLOS ОДИН 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

абстрактний

Рецептор D2 дофаміну (DRD2) є ключовим рецептором, який опосередковує пов'язані з дофаміном функції мозку, такі як настрій, винагорода і емоції. Циклинзависимая кіназа 5 (Cdk5) являє собою пролін-спрямовану серин / треонін кіназу, функція якої залучена в схему винагороди мозку. У цьому дослідженні ми виявили, що сериновий залишок 321 (S321) в третьому внутрішньоклітинному циклі DRD2 (D2i3) є новим регуляторним ділянкою Cdk5. Cdk5-залежне фосфорилювання S321 в D2i3 спостерігалося в пробірці і системи клітинної культури.

Далі ми спостерігали, що фосфорилювання S321 погіршує агоніст-стимульовану експресію поверхні DRD2 і знижує зв'язування G-білка з DRD2. Більш того, шлях низхідного цАМФ був уражений гетерологічною системою і в первинних нейрональних культурах від ембріонів нокаутів p35, ймовірно, внаслідок зниженої інгібуючої активності DRD2. Ці результати показують, що фосфорилювання S5, опосередкованого Cdk321, інгібує функцію DRD2, забезпечуючи новий механізм регулювання сигналізації дофаміну.

цифри

Зразок цитирования: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) Cdk5 Фосфорилированний рецептор дофаміну D2 і послаблює сигналізацію нижче по потоку. PLOS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Редактор: Джеймс Портер, Університет Північної Дакоти, Сполучені Штати Америки

Отримано: Травень 20, 2013; Прийнято: Листопад 14, 2013; Опубліковано: 31 Грудня, 2013

Авторське право: © 2013 Jeong et al. Це стаття з відкритим доступом, яка поширюється за умовами Ліцензія Creative Commons Attribution, що дозволяє необмежене використання, розповсюдження та відтворення на будь-якому носії, за умови, що автор і джерело кредитуються.

Фінансування: Ця робота була підтримана грантами (NRF-2012R1A2A2A01012923 і NRF-2012R1A4A1028200) від уряду Кореї (MSIP), а також підтримано в рамках програми міжнародної співпраці, керованої NRF Кореї (2012K2A1A2033117) і Корейського інституту досліджень мозку (KBRI) Програма фундаментальних досліджень MSIP (2031-415). SKP була одержувачем 2004 та 2006 Національного Альянсу з досліджень з питань шизофренії та депресії (NARSAD). Спонсори не мали жодної ролі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, рішенні щодо публікації або підготовці рукопису.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що конкурентних інтересів немає.

Вступ

Допамінова сигналізація бере участь у різних функціях мозку, включаючи координацію рухів, контроль настрою і механізми винагороди [1]. Основний компонент сигналізації дофаміну у хребетних проявляють колючі нейрони (MSN), що вибірково експресують підгрупу дофамінових рецепторів і отримують допамінергічний вхід, головним чином, з вентральної зони (VTA) і substantia nigra (SN).) [2]. Рецептори дофаміну є рецепторами G-білка (GPCR) з сімома трансмембранними доменами і складаються з двох підтипів, D1-подібні і D2-подібні рецептори, які опосередковують взаємні дії в сигналізації дофаміну [1]. Наприклад, дофамінові D1-подібні рецептори (D1, D5) активують аденилилциклазу через Gαs і підвищення внутрішньоклітинного рівня цАМФ, але дофамінові D2-подібні рецептори (D2, D3, D4) інгібують аденілілциклазу через Gαi і зниження внутрішньоклітинного рівня цАМФ [1], [3].

Серед рецепторів дофаміну рецептор D2 (DRD2) бере участь у патофізіології декількох основних психічних розладів, включаючи шизофренію і наркоманію [4], таким чином, що багато антипсихотичні препарати щонайменше частково цільові DRD2. Відомо також, що активність DRD2 добре корелює з поведінковими наслідками зловживання наркотичними засобами на тваринних моделях [5]. Антидепресанти і ефективність стабілізатора настрою також були пов'язані зі змінами експресії клітинної поверхні DRD2 або внутрішньоклітинної сигналізації нижче за течією, опосередкованої PKA, ERK і GSK3 [1], [4], [6]. Незважаючи на ці критичні ролі для DRD2 в мозку, детальні регуляторні механізми, які надають неоднорідність і складність властивостям DRD2, не повністю зрозумілі.

Збігаються рядки доказів вказують на те, що в тонку настройку активності DRD2 беруть участь численні посттрансляційні модифікації. Екстенсивне глікозилювання DRD2 було виявлено на ранніх дослідженнях фотоаффинного мічення [7]і утворення дисульфідних зв'язків в DRD2 також було визначено як важливу модифікацію зв'язування ліганду [8]. Крім того, сайти фосфорилювання DRD2 були спочатку ідентифіковані пробірці аналіз з радіоізотопами, що забезпечує шляхи для різних регуляторних шляхів, опосередкованих різними кіназами [9]. Дійсно, протеїнкіназа C (PKC) регулює DRD2-опосередковану мобілізацію внутрішньоклітинного кальцію і модулює взаємодію DRD2 з цитоскелетними білками [10]. Фосфорилювання за допомогою GPCR кінази 2 (GRK2) регулює індуковані агоністом структури ресенсибілізації DRD2 [11].

Циклинзависимая кіназа 5 (Cdk5) є пролін-спрямованою серин / треонін кіназою, що володіє переважною активністю, обумовленою специфічною для мозку експресією її основних активаторів, p35 і p39 [12]. Cdk5 бере участь у різних нейрональних процесах, включаючи нейрональну міграцію та керівництво аксоном, а миші Cdk5 та p35 null показують дефекти кортикального розшарування [13]. Нещодавно було показано, що фосфорилювання WAVE1 і ефексину Cdk5 регулює морфогенез дендритного хребта [14]. Крім того, Cdk5 також регулює рівні експресії поверхні NMDA-рецептора, NR2B і NR2A-опосередкованих NMDA струмів [15], [16]. Примітно, що багато доказів свідчать про тісний зв'язок між Cdk5 і системою дофаміну. Cdk5 фосфорилирует тирозин гідроксилазу (TH), регулюючи його стабільність, і таким чином підтримуючи допамінергічний гомеостаз [17]. У постсинаптичних нейронах, коли залишок T75 дофаміну і регульованого циклічного AMP фосфопротеїну-32kD (DARPP-32) фосфорилюється Cdk5, він може інгібувати активність PKA і таким чином антагонізувати PKA-опосередковану дофаміном сигналізацію [18]. Цікаво, що коли кокаїн, непрямий агоніст дофамінових рецепторів, призначається хронічно у щурів, рівень мРНК і білка Cdk5 збільшується в середніх колючих нейронах [19]. У сукупності Cdk5, здається, бере участь у синаптичних адаптаціях, викликаних медикаментами. У цьому дослідженні ми показуємо функціональну взаємодію DRD2 і Cdk5, що додатково розширює роль Cdk5 в сигналізації дофаміну.

Матеріали та методи

антитіла

Проти кролячі сироватки піднімали проти пептидів, що містять фосфо-серин 321 (pS321) третьої внутрішньоклітинної петлі DRD2 (D2i3). Фосфопептид, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), використовували для отримання кон'югованої з пептидом колонки для афінної очистки (20401, PIERCE). Анти-pS321 антитіло збагачувалося системою афінної очистки згідно з інструкцією виробника. Очищене фосфо-антитіло зберігали в PBS з 0.1% азиду натрію і 0.1% желатину. Анти-мишаче анти-Cdk5 антитіло (sc-249) і анти-кроляче анти-p35 антитіло (sc-820) використовували для вестерн-блот і иммуноцитохимии Cdk5 / p35. Анти-мишаче анти-GFP антитіло (sc-9996) використовували для иммунопреципитации і вестерн-блот DRD2-GFP. Анти-кроляче анти-FLAG антитіло (sc-807), анти-кроляче анти-HA антитіло (sc-805), анти-мишаче анти-GST антитіло (sc-138), і анти-мишаче анти-GAPDH антитіло (sc- 32293) були придбані у біотехнологій Santa Cruz.

Звірята

Миша p35 нокауту була добрий подарунок від доктора Katsuhiko Mikoshiba в RIKEN Brain Science Institute в Японії і використовується для первинної культури нейронів. Грунтові набори для генотипування були 5′-GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5′-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC і 5′-TCCATCT GCACGAGACTAGT, як описано раніше [20]. Мишей ICR і щурів Sprague Dawley використовували для приготування лізату мозку. Всі процедури для тварин були схвалені Комітетом з питань догляду та використання тварин для вивчення тварин і техніки Поханг.

Конструкти плазміди

Використовували довгу ізоформу людського DRD2 в плазмидном векторі EGFP-N1 і третю внутрішньоклітинну петлю DRD2 (амінокислотні залишки 212 – 373, включаючи додаткові амінокислотні залишки 29, унікальні для довгої ізоформи DRD2) у плазмідному векторі pFLAG-CMV-2. Людський Cdk5 був вставлений в плазмідний вектор pCMV-HA, і людський p35 був вставлений в плазмідний вектор pcDNA 3.1. Людський Cdk5 вставляли під промотор цитомегаловірусу (CMV) разом з людським p35 у векторі pCDNA 3.1, щоб створити конструкцію з подвійною експресією (Cdk5 / p35) для імуноцитохімічного аналізу рецепторів інтерналізації [35S] -GTPγS-зв'язування, аналіз на зв'язування з радіолігандами та імуноферментний аналіз cAMP.

У пробірці Аналіз кінази

IP-пов'язаний пробірці Аналіз кінази проводили наступним чином. Один цілий мозок миші лізували в буфері для лізису еритроцитів 3 mL (ELB) (50 mM Tris (рН 8.0), 250 mM NaCl, 5 мМ EDTA, 0.1% NP-40) штрихами 20 гомогенізатора Dounce для отримання гомогенізованих лізатів головного мозку . Лізати інкубували на льоду протягом 30 хв, обробляли ультразвуком і центрифугували на 16,000 × g для 10 хв. Супернатанти иммунопреципитировали анти-кролячим анти-p35 антитілом, щоб отримати активний комплекс Cdk5 / p35. Комплекс Cdk5 / p35 і очищений злитий білок GST змішували з аденозиновим 5′-трипосфатом, [γ-32P] (NEG-502H, PerkinElmer) та інкубували в буфері кінази (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl2, 0.2 mM DTT) за 1 год при кімнатній температурі [18], [21]. Очищений комплекс Cdk5 / p25 (14 – 516, Millipore) також використовувався для пробірці аналіз кінази, як описано вище. Буфер для завантаження зразків 2 × додавали до реакційної суміші і кип'ятили при 100 ° C. Потім зразки піддавали SDS-PAGE і висушений гель оцінювали за допомогою авторадіографії.

Рідинна хроматографія (LC) -масова спектрометрія (MS) / MS-аналіз

Рекомбінантний білок GST-D2i3 аналізували за допомогою РХ-МС / МС, наступного за IP-зв'язаним пробірці аналіз кінази. Ми провели пептидну ідентифікацію даних LC-MS / MS, використовуючи X !! Tandem (версія Dec-01-2008). Кожен файл даних RAW спочатку був перетворений у mzXML за допомогою транс-протеомного конвеєра (TPP; версія 4.3). Сканування MS / MS у перетворених mzXMLs потім піддавали пошуку щодо бази даних послідовності білків UniProt (випуск 2010_07), включаючи послідовність GST-D2i3 з використанням X !! Tandem. Допуск був встановлений на 3 Da для іонів-попередників і 2 Da для фрагментарних іонів. Використовували специфічність ферменту до трипсину. Варіанти змінної модифікації використовували для карбамідометилювання цистеїну (57.021 Da), окислення метіоніну (15.995 Da), гідролізу аспарагіну (0.987 Da) і фосфорилювання серину (79.966 Da).

Імунопреципітація

Імунопреципітацію проводили на клітинних лізатах в буфері для ELIS-лізису. Анти-GFP антитіло додавали до лізатів і інкубували протягом 3 год при 4 ° C. Иммунокомплекси очищали з використанням агарози білка-A. Осад інкубували з SDS-зразком завантаження буфера для 30 хв при 37 ° C, і піддавали SDS-PAGE і вестерн-блотах.

GST Pull-down Assay

10 мкг очищеного GST і GST-D2i3 інкубували з лизатом мозку щурів протягом 1.5 год при 4 ° C. Додавали 30 мкл гранул глутатіон (GSH), кон'югованих з сефарозою 4B (17-0756-01, GE Healthcare), врівноважену буфером для лізису, і інкубували протягом додаткового часу 1 h. Бусинки збирали центрифугуванням при 2,000 ×g і промивають буфером для лізису разів 4 [22], [23]. Осад аналізували вестерн-блоттінгом з використанням анти-Cdk5 і анти-p35 антитіл.

Імуноцитохімія

Трансфіковані клітини НЕК 293 і стриральні нейрони, культивовані на покривних клітинах, промивали один раз забуферизованим фосфатним сольовим розчином (PBS) і фіксували зануренням у холодний 4% параформальдегід / PBS протягом 30 хв. Первинне антитіло розбавляли в блокуючому розчині (2% кінської сироватки і 1% Triton X-100 в PBS). В якості вторинних антитіл використовували анти-миші антитіла (A647, Invitrogen) і AlexFluor-20990-кон'юговані анти-кролячі антитіла (A568, Invitrogen). Hoechst використовували для фарбування ядра. Зображення були отримані конфокальної мікроскопією (Olympus, FluoView-11011).

Аналіз інтерналізації рецепторів

24 год після трансфекції, клітини обробляли 1 мкМ хинпиролом (Q102, Sigma) за хвНМХ хв і 30 хв при 90 ° С. Клітини повторно суспендували в холодному PBS, і для кожної реакції використовували аликвоти 37 мкл. Лікарські обробки проводили при кімнатній температурі протягом 2 год при наступних концентраціях; 200 nM [3Н] -спиперон (NET-565, PerkinElmer), 3 мкМ сульпирид (895, TOCRIS), 10 мкМ галоперидол (H1512, Sigma). Гідрофобний3Н] -спіперон використовували для позначення загальних експресованих рецепторів, а гідрофільний сульпірид використовували для заміни мембранозних рецепторів3H] -сигн. Мембранно-асоційовані рецепторні сигнали обчислювали шляхом вирахування внутрішньоклітинних рецепторних значень від загальних експресованих значень рецептора. Клітини фільтрували на фільтрі GF / B (Millipore) і промивали 3 разів промивним буфером (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Фільтри висушували, а залишкову радіоактивність вимірювали за допомогою рідинного сцинтиляційного лічильника [24].

Приготування клітинної мембрани

Конфлюентні клітини в культуральних посудинах 100 мм після трансфекції промивали крижаним PBS і збирали в буфері 1 мл HME (25 мМ HEPES (рН 7.5), 2 мМ MgCl2, 1 mM ЕДТА). Гомогенізовані лізати центрифугували з 500 × g протягом 15 хв і супернатанти потім центрифугували з 36,000 × g протягом 30 хв. Для аналізу використовували гранули, повторно суспендовані в буфері HME.

[35S] -GTPγS Аналіз на зв'язування

Фракції клітинної мембрани попередньо інкубували з квинпиролом 1 µM ​​(Q102, Sigma) в буфері для аналізу (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl)2, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA і 0.01 mM ВВП) за 10 хв. [35S] -GTPγS (NET-030H, PerkinElmer) додавали до кінцевої концентрації 3 nM в 30 мкл і далі інкубували протягом 90 хв. 170 мкл охолодженого льодом буфера (10 мМ Tris-HCl (рН 8.0), 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2і 0.1 mM GTP), щоб зупинити реакцію. Мембрани фільтрували на фільтрі GF / B (Millipore) і промивали 3 разів промивним буфером (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Фільтри висушували і вимірювали радіоактивність за допомогою сцинтиляційного лічильника [25], [26].

Аналіз зв'язування з радіолігандами

Готові клітинні мембрани інкубували з 0.01 nM [3Н] -спіперон (NET-565, PerkinElmer) і зростаючі концентрації кінпіролу (Q102, Sigma) для 30 хв в аналітичному буфері (25 мМ HEPES (рН 7.5), 1.5 мМ MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM ЕДТА). Мембрани фільтрували на фільтрі GF / B (Millipore) і промивали 3 разів промивним буфером (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Реакцію припиняли швидкою фільтрацією через фільтри GF / C. Залишкову радіоактивність вимірювали за допомогою рідинного сцинтиляційного лічильника [27]-[29].

cAMP Ферментний иммуноанализ

Трансфіковані клітини HEK 293 попередньо обробляли 10 µM ​​rolipram (R6520, Sigma) для 1 h, а потім обробляли 0.1 µM ​​форсколіном (F6886, Sigma) і зростаючими концентраціями quinpirole (Q102, Sigma) для 30 min. Первинні культивовані нейрони стритату обробляли роліпрамом 10 µM ​​для 1 h, а потім допаміном 1 µM ​​для 1 h [22]. Клітинні лізати готували з рівнями ХНУМХ М HCl, і рівні цАМФ були виявлені за допомогою набору імуноферментних аналізів cAMP (Sapphire Bioscience) згідно інструкції виробника.

Нейрон первинного культивування страату

Стриатную область виділяли з ембріонального мозку миші (E15). Розсічена тканина дисоціювали в мінімально необхідних середовищах (MEM) (11095, Invitrogen), що містить 0.25% трипсину (T4549-100, Sigma) і 0.1% DNase I протягом 6 хв при 37 ° C. Клітини повторно суспендували в покривних середовищах (MEM з 0.01 M HEPES (pH 7.4) і 10% (об / об) кінської сироватки (16050-122, GIBCO)). Нейрони культивували протягом 7 днів пробірці (DIV 7) в MEM з добавкою B27 (17504-044, Invitrogen) перед застосуванням до иммуноанализам ферменту цАМФ.

результати

Cdk5 Фосфорилати Серин 321 в третьому внутрішньоклітинному циклі DRD2 пробірці

Для ідентифікації нових субстратів Cdk5 ми здійснили систематичний пошук з використанням (S / T) PX (K / H / R) як консенсусної послідовності розпізнавання Cdk5 [30] і ідентифіковано DRD2 як субстрат-кандидат. Консенсусна послідовність, включаючи серин 321, розташована в третій внутрішньоклітинної петлі DRD2 (D2i3), де задіяні різні регуляторні механізми [3], [10], [11]. Послідовність еволюційно зберігається в DRD2 у хребетних, що означає функціональну важливість залишку (Рис. 1A).

слайдами

Малюнок 1. Cdk5 фосфорилирует серин 321 в третій внутрішньоклітинної петлі DRD2 in vitro.

(A) Вирівнювання амінокислотної послідовності, що показує консервативні ділянки DRD2 від різних видів (заштриховані). Потенційний сайт фосфорилювання Cdk5 позначений зірочкою. (B) IP-пов'язані пробірці аналіз кінази з рекомбінантними мутантними білками GST-D2i3 і GST-D2i3. Для реакцій кінази використовували комплекс Cdk5 / p35, збагачений екстрактом мозку миші за допомогою імунопреципітації анти-p35. Авторадіограф фосфорильованих білків показаний разом з блискучим блакитним забарвленням Кумасі того ж гелю. Стрілка вказує радіоактивний сигнал, відповідний GST-D2i3s, а відкрита стрілка показує радіоактивні сигнали від p35. (С) MS / MS спектр фосфорильованого пептидного фрагмента D2i3. Теоретичні структури фрагментації показані нижче спектру. Серед усіх іонів фрагментів виявлені y- і b-іони позначені в спектрі. Вони6 і y7 іони сильно вказують на фосфорилювання серину 321. (D) В пробірці аналіз кінази з очищеним комплексом Cdk5 / GST-p25 з використанням мутантних білків GST-D2i3 і GST-D2i3. Фосфорильовані білки були показані в авторадиографе, поряд з блискучим блакитним забарвленням Кумасси. Стрілка вказує радіоактивний сигнал, відповідний GST-D2i3, а відкрита стрілка показує радіоактивні сигнали від GST-p25.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Щоб оцінити здатність Cdk5 до фосфорилювання D2i3, ми виконали IP-зв'язок пробірці аналізи кіназ з використанням активного комплексу Cdk5 / p35, збагаченого лізатом мозку миші, шляхом імунопреципітації p35 з очищеними рекомбінантними білками GST-D2i3 (амінокислотні залишки 212 – 373) як субстратів. Ми спостерігали сигнали фосфорилювання в очищених білках GST-D2i3 і GST-D2i3 S297A, але сигнал значно знижувався за допомогою GST-D2i3 S321A (1B). Для подальшого підтвердження фосфорилювання серину 321 в GST-D2i3, ми провели LC-MS / MS аналіз зразків з IP-пов'язаних пробірці аналізів кіназ з використанням LTQ XL мас-спектрометрії. Послідовно відновлювали фосфопептиди, відповідні масі фосфо-серинових пептидів 321 (Рис. 1C). Враховуючи, що дані, залежні від даних при аналізі LC-MS / MS, виявляють тенденцію до виявлення рясних білків у зразку [31]Ці дані дозволяють припустити, що сериновий залишок 321 є домінуючим сайтом фосфорилювання Cdk5 в області D2i3. Щоб довести пряме фосфорилювання серину 321 в GST-D2i3 по Cdk5, пробірці Проводили аналіз кінази з використанням очищеного комплексу Cdk5 / GST-p25 з очищеними рекомбінантними білками GST-D2i3. Ми ідентифікували значний сигнал фосфорилювання в GST-D2i3, який відсутній в GST-D2i3 S321A (1D). Взяті разом ці результати показують, що залишок D2i3 S321 є переважною мішенню для фосфорилювання, опосередкованого Cdk5.

Cdk5 Фосфорилати Серин 321 в третьому внутрішньоклітинному циклі DRD2 в клітинах

Для ідентифікації фосфорилювання серину 321, ми підняли антитіло, специфічне для фосфо-серину 321 (pS321). Зразки з IP-пов'язаних пробірці Аналіз кінази аналізували вестерн-блоттінгом з використанням антитіла проти pS321. Блоти показали чітку смугу в кіназній реакції, яка залежала від GST-D2i3 (Рис. 2A). Для перевірки потенційного фосфорилювання серину 321 в DRD2 за допомогою Cdk5 в клітинах, імунопреципітати анти-GFP з клітин HEK 293, що експресують DRD2-GFP і DRD2 S321A-GFP з або без HA-Cdk5 і p35, аналізували за допомогою вестерн-блот з використанням анти-GFP і антитіла проти pS321. Характерні розмиті смуги сигналів анти-GFP-антитілами, які, як відомо, обумовлені надмірним глікозилюванням DRD2, спостерігаються тільки в присутності DRD2-GFP, і анти-pS321 антитіла виявляють подібні сигнали DRD2 тільки з співвідношенням Cdk5 / p35 (2B) [7]. Для подальшої перевірки генерували фосфорилювання серину 321 за допомогою Cdk5, D2i3 (FLAG-D2i3) і мутантної форми D2i3 (FLAG-D2i3 S321A). FLAG-D2i3 і FLAG-D2i3 S321A, экспрессированние або без HA-Cdk5 і p35 в клітинах НЕК 293, аналізували за допомогою аналізу зсуву мобільності SDS-гелю. Значний Cdk5-залежний зсув мобільності спостерігався для FLAG-D2i3, але не для FLAG-D2i3 S321A (Рис. 2C). Ми також оцінювали рівень фосфорилювання DRD2 у Ser321 при стимуляції агоністів. Клітини HEK 293, що експресують комплекс DRD2-GFP і Cdk5 / p35, стимулювали квинпиролом, і иммунопреципитати анти-GFP з клітинних лізатів аналізували вестерн-блоттінгом з використанням антитіл проти GFP і анти-pS321. Ми виявили, що фосфорилювання DRD5 на Ser2, опосередкований Cdk321, не зазнав впливу стимуляції агоністом, який відрізняється від фосфорилювання, опосередкованого GRK- і PKC (2D) [32], [33]. Разом ці результати вказують на те, що Cdk5 може фосфорилировать сериновий 321 залишок DRD2 в клітинному середовищі.

слайдами

Малюнок 2. Cdk5 фосфорилює серин 321 в третій внутрішньоклітинної петлі DRD2 в клітинах.

Фосфорилювання серину 5, опосередкованого Cdk321, аналізували за допомогою антитіла проти pS321. (A) Зразки з IP-пов'язаних пробірці Аналіз кінази з використанням білків GST-D2i3 аналізували Вестерн-блоттінгом (WB) з зазначеними антитілами. Стрілки вказують на GST-D2i3s. (B) DRD2-GFP і DRD2 S321A-GFP экспрессировали з або без HA-Cdk5 і p35 в клітинах HEK 293. Иммунопреципитати анти-GFP аналізували вестерн-блоттінгом з використанням антитіл проти GFP і анти-pS321. Скоба вказує на сигнали DRD2, а відкрита стрілка вказує на неспецифічні сигнали від імунопреципітатів анти-GFP. '% input' -% об'єму загального лізату для IP-реакції. Слабкі ендогенні сигнали Cdk5 були позначені зірочками. (C) Аналіз зміщення рухливості гелю. Клітини НЕК 293, трансфицированние як зазначено, аналізували вестерн-блоттінгом. (D) Трансфектированние клітини НЕК 293 обробляли квинпиролом і иммунопреципитатами анти-GFP аналізували вестерн-блоттінгом з анти-GFP і анти-pS321 антитілами. Відкрита стрілка вказує на неспецифічні сигнали від імунопреципітатів анти-GFP.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Комплекс Cdk5 / p35 і DRD2 є фізично пов'язаними

Ми досліджували потенційну фізичну взаємодію між комплексом Cdk5 / p35 і DRD2, оскільки відомо, що багато субстратів Cdk5 фізично пов'язані з комплексом Cdk5 / p35 [23], [34], [35]. По-перше, виконувався спадний експеримент GST. Очищений рекомбінантний білок GST-D2i3 інкубували з лизатом головного мозку щура, а GST-випадаючий преципітат аналізували на вестерн-блот. Як показано на рис Рис. 3A, ендогенні Cdk5 і p35 були ідентифіковані у випадаючих осадах, що вказує на фізичну взаємодію між DRD2 і комплексом Cdk5 / p35 (Рис. 3A). Більш того, HA-Cdk5 і p35 були виявлені в імунопреципітатах анти-GFP з клітинних лізатів HEK 293, що експресують DRD2-GFP і Cdk5 / p35 (3B). Крім того, ми проводили імуноцитохімічні аналізи і спостерігали, що DRD2-GFP, HA-Cdk5 і p35 демонструють значні сигнали спільної локалізації на мембранозній області клітин HEK 293 (Рис. 3C, верхні панелі). Ми також досліджували спільну локалізацію DRD2 та Cdk5 / p35 в контексті нейронів. Послідовно DRD2-GFP також показав значну ко-локалізацію з ендогенними Cdk5 і p35 в культивованих стриральних нейронах (DIV7), додатково підтримуючи функціональні зв'язки між DRD2 і Cdk5 / p35 (Рис. 3C, нижні панелі). Результати вказують на те, що DRD2 і Cdk5 / p35 можуть утворювати комплекс і таким чином підтримують уявлення про те, що DRD2 є фізіологічним субстратом Cdk5.

слайдами

Малюнок 3. Cdk5 / p35 може утворювати комплекс з DRD2.

(A) GST-розкривний аналіз з використанням очищеного рекомбінантного білка GST-D2i3 з екстрактом мозку щура. GST випадають преципітати піддавали Вестерн-блот аналізу. "Бісер" вказує на випав осад без білків GST. (B) Иммунопреципитация комплексу DRD2 і Cdk5 / p35. Анти-GFP IP з лізатів трансфекованих клітин піддавали Вестерн-блот аналізу. Скоба вказує на сигнали DRD2, а відкрита стрілка вказує на неспецифічні сигнали від імунопреципітатів анти-GFP. У правій частині зображено також перекрита блот для входів. (C) Імуноцитохімічні аналізи DRD2 і Cdk5 / p35. Клітини НЕК 293, що експресують DRD2-GFP і Cdk5 / p35, фарбували анти-Cdk5 і анти-p35 антитілами (верхні панелі). DRD2-GFP експресувався окремо в культивованих стриральних нейронах і фарбувався анти-Cdk5 і анти-p35 антитілами (Нижні панелі). Hoechst використовували для фарбування ядра. Штрих масштабування - 5 µm. Всі зображення були отримані за допомогою конфокальної мікроскопії (Olympus, FluoView-1000).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Фосфорилювання Cdk5 фосфорилювання активності рецепторів DRD2

Повідомлялося, що фосфорилювання модулює критичні властивості GPCR, такі як зв'язування G-білка, інтерналізація рецепторів, внутрішньоклітинна локалізація і зв'язок з білками-модуляторами [9], [11], [24]. Індукування рецепторів гоніста є критичним регуляторним процесом трансдукції сигналу. Ми досліджували Cdk5-опосередковану модуляцію інтерналізації DRD2. Клітини НЕК 293, що експресують DRD2-GFP і DRD2 S321A-GFP з або без Cdk5 / p35, інкубували з квинпиролом 1 µM ​​для індукування індукції DRD2, стимульованої агоністом (Рис. 4A). [3H] -спіперонові сигнали клітин, що експресують DRD2-GFP, були значно знижені при лікуванні хінпіролом min 30 і відновлені за 90 хв. Цікаво, [3H] -спіперонові сигнали клітин, що експресують DRD2-GFP і Cdk5 / p35, також знижували при хінпірольному лікуванні 30 min, але не відновлювали за 90 хв (Рис. 4A, другий розділ). З іншого боку, [3H] -спиперон-сигнали клітин, що експресують DRD2 S321A-GFP, зменшували при 30 хв і відновлювали в 90 хв, незалежно від спів-експресії з Cdk5 / p35. Попередні дослідження показали, що інтерналізована DRD2 відновлюється назад до плазматичної мембрани при тривалій стимуляції агоністів. [11]. TВиявляється, фосфорилювання DRD5, опосередковане Cdk2, бере участь в процесах ресенсибілізації після індукування DRD2 агоніста.

слайдами

Малюнок 4. Фосфорилювання, опосередковане Cdk5, послаблює експресію поверхні DRD2 і передачу сигналів нижче.

(A) Вираз поверхні DRD2, виміряний [3H] -спиперон-зв'язуючий аналіз. Трансфіковані клітини HEK293 стимулювали квинтипиролом 1 µM ​​протягом зазначеного часу і збирали, а потім 3 nM [3H] -спіперон лікування протягом 3 год. Вимірювали радіоактивність та обчислювали поверхневі сигнали. Стовпчики помилок представляють середнє значення ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; Одностороння ANOVA з тестом Dunnett post hoc: порівняйте всі стовпці проти контрольної колонки). (B) [35S] -GTPγS аналіз зв'язування. Клітинні мембрани готували з клітин, трансфекованих, як зазначено. Мембранні препарати інкубували з квинпиролом 1 µM ​​з наступним 3 nM [35S] -GTPγS протягом 90 хв. Стовпчики помилок представляють середнє значення ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; Одностороння ANOVA з тестом Bonferroni post hoc: порівняйте всі пари стовпців). (C) Квінпірол-конкуруючий [3H] -спиперон-зв'язуючий аналіз. Мембранні препарати з трансфікованих клітин інкубували з 0.01 nM [3H] -спіперон та збільшення концентрації квінпіролу протягом 30 хв. Нелінійна регресія була отримана за допомогою GraphPad. Смужки помилок вказують середнє значення ± SE (n = 3). (D) імуноферментні аналізи цАМФ у трансфікованих клітинах HEK 293. Трансфіковані клітини попередньо обробляли 10 мкМ роліпрамом протягом 1 год, а потім обробляли 0.1 мкМ форсколіном та збільшували концентрації квінпіролу протягом 30 хв. Нелінійна регресія була отримана за допомогою GraphPad. Смуги помилок представляють середнє значення ± SE (n = 4; ** p <0.01; двосторонній t-тести). (E) Культивовані нейрони стриата з дикого типу та ембріонів нокауту p35 (DIV 7) обробляли роліпрамом 10 µM ​​для 1 h з подальшим допаміном 1 µM ​​для 1 h. Смуги помилок означають середнє значення ± SE (n = 4; **p<0.01; двохвостий t-тести).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Далі ми оцінювали потенційну зміну стимульованого агоністом зв'язування G-білка з DRD2, пов'язаним з фосфорилюванням, опосередкованим Cdk5, з використанням [35S] -GTPγS аналіз зв'язування [25], [26]. DRD2-GFP і DRD2 S321A-GFP з або без Cdk5 / p35 експресувалися в клітинах НЕК 293. Мембрани готували і стимулювали квинпіролом 1 µM ​​і далі дозволяли [35S] -GTPγS включення. Мембрани клітин, що експресують DRD2-GFP і Cdk5 / p35, показали значне погіршення35S] -GTPγS зв'язування порівняно з усіма іншими клітинними мембранами (4B). Ці результати вказують на те, що фосфорилювання, опосередковане Cdk5, регулює зв'язування агоніст-стимульованого білка G з DRD2.

Крім того, конкуруючий3H] -спиперонових аналізів зв'язування проводили для дослідження будь-якої потенційної зміни агоніст-афінності при DRD2 за допомогою фосфорилювання, опосередкованого Cdk5. Конкурентне прив'язка3H] -спіперон при лікуванні зростаючих концентрацій хінпіролу до препаратів мембран з трансфектованих. Конкуруюча зв'язування квинпирола і [3H] -спіперон на DRD2-GFP і DRD2 S321A-GFP зробив подібний logKi значення (-9.789 для DRD2-GFP; -9.691 для DRD2 S321A-GFP), що вказує на те, що афінність ліганду до DRD2 не зазнає значного впливу фосфорилювання, опосередкованого Cdk5 при DRD2 (Рис. 4C).

Фосфорилювання, що опосередковується Cdk5, регулює сигнальний шлях DRD2-cAMP

Далі ми досліджували, чи впливає модифікація DRD2 на Cdk5 на шляхи передачі сигналів вниз. Ми контролювали DRD2-опосередковане інгібування форсколин-стимульованої продукції цАМФ аденілциклазою в клітинах, що експресують DRD2-GFP і DRD2 S321A-GFP з використанням імуноферментного аналізу. Клітини, що експресують DRD2, показали зниження рівнів цАМФ у відповідь на квинпирол залежним від дози способом. Примітно, що спільна експресія Cdk5 / p35 значно знижувала максимальне інгібування утворення цАМФ (4D, ліва панель). З іншого боку, у клітинах, що експресують DRD2 S321A-GFP, утворення цАМФ ефективно інгібувалися у відповідь на клінічне лікування незалежно від експресії Cdk5 / p35 (Мал. 4D, права панель). Ці результати вказують на те, що фосфорилювання DRD5, опосередкованого Cdk2, послаблює інгібіторну активність DRD2 на низхідному шляху передачі сигналів cAMP. Для подальшого підтвердження явищ у більш фізіологічно значущих умовах ми використовували первинні культивовані нейрони з ембріонів нокауту, дефіцитних до p35, істотного активатора Cdk5. Первинні культивовані стриатические нейрони обробляли дофаміном 1 µM ​​і аналізували за допомогою імуноферментного аналізу cAMP. Нейрони з мишей, що нокаутують p35, демонстрували знижені рівні цАМФ порівняно з нейронами дикого типу при стимулюванні дофаміном (4E). TМи також зробили висновок, що фосфорилювання DRD5, опосередкованого Cdk2, призводить до зниження інгібіторного тону на шляху цАМФ, який здійснюється DRD2.

Обговорення

Ми ідентифікували DRD2 як новий субстрат Cdk5. Виявляється, фосфорилювання знижує експресію поверхні DRD2, впливаючи на долю DRD2 після інтерналізації рецептора, знижуючи тим самим DRD2 Gi-з'єднання і низхідний шлях cAMP. Оскільки залишок фосфорилювання S321 існує як в довгих, так і в коротких ізоформах DRD2, механізм, запропонований у цьому дослідженні, може бути загальним режимом регулювання в сигналізації, що опосередковується DRD2..

DRD2 в середніх колючих нейронах не тільки розглядався як основний підтип допамінових рецепторів, але також був визнаний за сприйнятливість до змін у доступності у відповідь на екологічні подразники. Інтенсифікована агоністом десенсибілізація і ресенсибілізація DRD2 були широко вивчені [11], [24]. Зокрема, ряд досліджень показав, що вплив хронічного впливу психостимулятора, такого як кокаїн і амфетамін, які підвищують позаклітинний рівень дофаміну в стриатальному синапсі, супроводжуються динамічними змінами DRD2 постсинаптично [36]. Дійсно, відомо, що хронічні користувачі кокаїну мають знижений рівень DRD2 у смуговій області, а наявність DRD2 в nucleus accumbens (NAcc) демонструє негативну кореляцію з пошуком ліків та підкріпленням у мишей і приматів. [37]-[39]. Ці результати показують, що функціональність DRD2 є дуже сприйнятливою до адаптивної або компенсаторної регуляції у відповідь на різні стимули, включаючи хронічне вплив на лікарські засоби. Наші результати показують, що залишок S321 в третій внутрішньоклітинної петлі DRD2 може бути фосфорилирован Cdk5, що призводить до зниження інгібуючого впливу DRD2 на шлях cAMP. Ця взаємодія пропонує новий регуляторний механізм, пов'язаний з Cdk5 в дофамінорецептивних нейронах, які можуть бути пов'язані з динамічним характером доступності поверхні DRD2.

Слід зазначити, що Cdk5, як відомо, є ключовим компонентом в опосередкуванні адаптивних змін нейронального середовища. Наприклад, структурні та функціональні зміни дендритних шипів у нейронах лімбічної схеми є одним з наслідків повторного впливу психостимулятора [40]. Ці зміни супроводжуються різними молекулярними змінами, включаючи індукцію елемента-зв'язуючого білка цАМФ-реакції (CREB) і ΔFosB, фактори транскрипції, які демонструють стійке підвищення регуляції у відповідь на хронічне введення кокаїну [41], [42]. Важливо, що Cdk5 є мішенню ΔFosB [19], і багато критичних компонентів, що беруть участь у динаміці дендритного хребта, такі як PSD-95, активована киназа p21 (PAK), β-катенін і спинофилин, як субстрати Cdk5 [43]-[46]. Послідовно, генетичні або фармакологічні маніпуляції активністю Cdk5 викликають зміни дендротичної морфології хребта і поведінкових реакцій на кокаїн, що передбачає критичні ролі Cdk5 в молекулярних і морфологічних змінах мезолімбічних схем дофаміну [47], [48]. Наші результати, що показують, що DRD2 є новою метою Cdk5, надає додаткове уявлення про адаптаційні зміни дофамінової системи у відповідь на хронічне вплив на лікарський засіб через подальшу ΔFosB-опосередковану регуляцію Cdk5 може викликати тонічне збільшення фосфорилювання DRD2 . Крім того, як відомо, DRD2 впливає на численні клітинні процеси, включаючи регулювання шляхів сАМР і MAP кіназ і транскрипційних подій нижче за течією. [42], [49]. Таким чином, результати цього дослідження можуть не тільки відобразити пряме регулювання DRD2 за допомогою Cdk5, але також забезпечити нове розуміння адаптивних реакцій дофамінової системи на хронічне вплив на лікарські засоби.

Внески автора

Задуманий і спроектований експерименти: JJ YUP DH SKP. Виконані експерименти: JJ YUP DKK YK. Проаналізовано дані: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Внесені реагенти / матеріали / інструменти аналізу: YHS. Написав папір: JJ SKP.

посилання

  1. 1. Missale C, Nash SR, Robinson SW, Jaber M, Caron MG (1998) Допамінові рецептори: від структури до функції. Physiol Rev 78: 189 – 225.
  2. 2. Мудрі RA (2002) Схеми винагороди мозку: ідеї від неспотворених стимулів. Нейрон 36: 229 – 240. doi: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00965-0
  3. Переглянути статтю
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. Переглянути статтю
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. Переглянути статтю
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. Переглянути статтю
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. Переглянути статтю
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. Переглянути статтю
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. Переглянути статтю
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. Переглянути статтю
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. Переглянути статтю
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. Переглянути статтю
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. Переглянути статтю
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. Переглянути статтю
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. Переглянути статтю
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. Переглянути статтю
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. Переглянути статтю
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. Переглянути статтю
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. Переглянути статтю
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. Переглянути статтю
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. Переглянути статтю
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. Переглянути статтю
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. Переглянути статтю
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. Переглянути статтю
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. Переглянути статтю
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. Переглянути статтю
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. Переглянути статтю
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. Переглянути статтю
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. Переглянути статтю
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. Переглянути статтю
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. Переглянути статтю
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. Переглянути статтю
  91. PubMed / NCBI
  92. Google Scholar
  93. Переглянути статтю
  94. PubMed / NCBI
  95. Google Scholar
  96. Переглянути статтю
  97. PubMed / NCBI
  98. Google Scholar
  99. Переглянути статтю
  100. PubMed / NCBI
  101. Google Scholar
  102. Переглянути статтю
  103. PubMed / NCBI
  104. Google Scholar
  105. Переглянути статтю
  106. PubMed / NCBI
  107. Google Scholar
  108. Переглянути статтю
  109. PubMed / NCBI
  110. Google Scholar
  111. Переглянути статтю
  112. PubMed / NCBI
  113. Google Scholar
  114. Переглянути статтю
  115. PubMed / NCBI
  116. Google Scholar
  117. Переглянути статтю
  118. PubMed / NCBI
  119. Google Scholar
  120. Переглянути статтю
  121. PubMed / NCBI
  122. Google Scholar
  123. Переглянути статтю
  124. PubMed / NCBI
  125. Google Scholar
  126. Переглянути статтю
  127. PubMed / NCBI
  128. Google Scholar
  129. Переглянути статтю
  130. PubMed / NCBI
  131. Google Scholar
  132. Переглянути статтю
  133. PubMed / NCBI
  134. Google Scholar
  135. Переглянути статтю
  136. PubMed / NCBI
  137. Google Scholar
  138. Переглянути статтю
  139. PubMed / NCBI
  140. Google Scholar
  141. Переглянути статтю
  142. PubMed / NCBI
  143. Google Scholar
  144. 3. Neve KA, Seamans JK, сигналізація дофамінових рецепторів Trantham-Davidson H (2004). J Прийом сигналу передачі Res 24: 165 – 205. doi: 10.1081 / lrst-200029981
  145. 4. Amar S, Shaltiel G, Mann L, Shamir A, Dean B, et al. (2008) Можливе залучення сигнальних компонентів D2 пост-допаміну в патофізіологію шизофренії. Int J Neuropsychopharmacol 11: 197 – 205. doi: 10.1017 / s1461145707007948
  146. 5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, et al. (2002) Роль дофамінових D2-рецепторів у самоконтролі кокаїну: дослідження з мутантними мишами рецептора D2 і новими антагоністами рецепторів D2. J Neurosci 22: 2977 – 2988.
  147. 6. Lee S, Jeong J, Park YU, Kwak Y, Lee SA, et al. (2012) Валпроат змінює передачу дофаміну в поєднанні з індукцією експресії білка Par-4. PLoS Один 7: e45618. doi: 10.1371 / journal.pone.0045618
  148. 7. Fishburn CS, Elazar Z, Fuchs S (1995) Диференціальне глікозилювання та внутрішньоклітинний трафік для довгих і коротких ізоформ дофамінового рецептора D2. J Biol Chem 270: 29819 – 29824. doi: 10.1074 / jbc.270.50.29819
  149. 8. Читач Т.А., Моліна-Хольгадо Е, Ліма Л., Буліанн С., Дьюар К.М. (1992) Специфічне зв'язування [3H] раклоприду з неостриатними рецепторами D2: роль дисульфідних і сульфгідрильних груп. Neurochem Res 17: 749 – 759. doi: 10.1007 / bf00969008
  150. 9. Ng GY, O'Dowd BF, Caron M, Dennis M, Brann MR, et al. (1994) Фосфорилювання і пальмитоилирование людського рецептора дофаміну D2L в клітинах Sf9. J Neurochem 63: 1589 – 1595. doi: 10.1046 / j.1471-4159.1994.63051589.x
  151. 10. Li M, Bermak JC, Wang ZW, Zhou QY (2000) Модуляція сигналізації рецептора дофаміну D (2) за допомогою актин-зв'язуючого білка (ABP-280). Mol Pharmacol 57: 446 – 452.
  152. 11. Cho D, Zheng M, Min C, Ma L, Kurose H, et al. (2010) Індукований агоністом ендоцитоз і фосфорилювання рецептора опосередковують ресенсибілізацію рецепторів дофамінових D (2). Моль ендокринол 24: 574 – 586. doi: 10.1210 / me.2009-0369
  153. 12. Tsai LH, Delalle I, Caviness VS Jr, Chae T, Harlow E (1994) p35 є нервово-специфічною регуляторною субодиницею циклін-залежної кінази 5. Природа 371: 419 – 423. doi: 10.1038 / 371419a0
  154. 13. Дхаван Р, Цай ЛХ (2001) Десятиліття CDK5. Nat Rev Mol Cell Cell Biol 2: 749 – 759. doi: 10.1038 / 35096019
  155. 14. Fu AK, Ip NY (2007) Циклинзависимая кіназа 5 пов'язує позаклітинні сигнали з актиновим цитоскелетом під час розвитку дендритного хребта. Cell Adh Migr 1: 110 – 112. doi: 10.4161 / cam.1.2.4617
  156. 15. Wang J, Liu S, Fu Y, Wang JH, Lu Y (2003) активація Cdk5 індукує гипокампальную загибель клітин CA1 шляхом безпосереднього фосфорилювання рецепторів NMDA. Nat Neurosci 6: 1039 – 1047. doi: 10.1038 / nn1119
  157. 16. Zhang S, Edelmann L, Liu J, Crandall JE, Morabito MA (2008) Cdk5 регулює фосфорилювання тирозину 1472 NR2B і поверхневу експресію NMDA рецепторів. J Neurosci 28: 415 – 424. doi: 10.1523 / jneurosci.1900-07.2008
  158. 17. Moy LY, Tsai LH (2004) Циклин-залежну кіназу 5 фосфорилює серин 31 тирозингидроксилази і регулює її стабільність. J Biol Chem 279: 54487 – 54493. doi: 10.1074 / jbc.m406636200
  159. 18. Bibb JA, Snyder GL, Nishi A, Yan Z, Meijer L, et al. (1999) Фосфорилювання DARPP-32 за допомогою Cdk5 модулює сигналізацію дофаміну в нейронах. Природа 402: 669 – 671.
  160. 19. Bibb JA, Chen J, Тейлор JR, Svenningsson P, Nishi А, та ін. (2001) Ефекти хронічного впливу на кокаїн регулюються нейрональним білком Cdk5. Природа 410: 376 – 380.
  161. 20. Ohshima T, Ogawa M, Veeranna, Hirasawa M, Longenecker G, et al. (2001) Синергічні внески циклін-залежної кінази 5 / p35 і Reelin / Dab1 до позиціонування кортикальних нейронів у розвивається мозку миші. Proc Natl Acad Sci США 98: 2764 – 2769. doi: 10.1073 / pnas.051628498
  162. 21. Morabito MA, Sheng M, Tsai LH (2004) Циклин-залежну кіназу 5 фосфорилирует N-кінцевий домен постсинаптичного білка щільності PSD-95 в нейронах. J Neurosci 24: 865 – 876. doi: 10.1523 / jneurosci.4582-03.2004
  163. 22. Park SK, Nguyen MD, Fischer A, Luke MP, Affar el B, et al. (2005) Par-4 пов'язує дофамінову сигналізацію і депресію. Клітинка 122: 275 – 287. doi: 10.1016 / j.cell.2005.05.031
  164. 23. Niethammer M, Smith DS, Ayala R, Peng J, Ko J, et al. (2000) NUDEL є новим субстратом Cdk5, який асоціюється з LIS1 і цитоплазматичним динеїном. Нейрон 28: 697 – 711. doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 00147-1
  165. 24. Kim KM, Valenzano KJ, Robinson SR, Yao WD, Barak LS, et al. (2001) Диференціальна регуляція рецепторів дофамінових D2 і D3 допомогою G-білкових рецепторів кіназ і бета-арестинов. J Biol Chem 276: 37409 – 37414. doi: 10.1074 / jbc.m106728200
  166. 25. Waldhoer M, Bofill-Cardona E, Milligan G, Freissmuth M, Nanoff C (1998) Диференціальне роз'єднання аденозину A1 і дофамінових рецепторів D2 сураміном і дидеметилированним сураміном (NF037). Mol Pharmacol 53: 808 – 818.
  167. 26. Bofill-Cardona E, Kudlacek O, Yang Q, Ahorn H, Freissmuth M, et al. (2000) Зв'язування кальмодуліну з D2-дофаміновим рецептором знижує сигналізацію рецептора шляхом зупинки перемикача активації G-білка. J Biol Chem 275: 32672 – 32680. doi: 10.1074 / jbc.m002780200
  168. 27. Список SJ, Seeman P (1981) Роздільна здатність дофамінових і серотонінових рецепторних компонентів зв'язування спіперона [3H] з ділянками головного мозку щурів. Proc Natl Acad Sci США 78: 2620 – 2624. doi: 10.1073 / pnas.78.4.2620
  169. 28. Гарднер Б. Дія агоніста дивовижної ПГ (1998) при D2 (довгих) допамінових рецепторах: зв'язування лігандів і функціональні аналізи. Br J Pharmacol 124: 978 – 984. doi: 10.1038 / sj.bjp.0701926
  170. 29. Seeman P, Tallerico T, Ko F (2003) Допамін витісняє [3H] домперидон з високоафінних сайтів дофамінового рецептора D2, але не [3H] раклоприд або [3H] спіперон в ізотонічному середовищі. Synapse 49: 209 – 215. doi: 10.1002 / syn.10232
  171. 30. Obenauer JC, Cantley LC, Yaffe MB (2003) Scansite 2.0: Прогнозування взаємодії клітинної сигналізації з використанням коротких мотивів послідовності. Нуклеїнові кислоти Res 31: 3635 – 3641. doi: 10.1093 / nar / gkg584
  172. 31. Лю Х, Садигов Р. Г., Йетс Дж. Р. 3rd (2004) Модель випадкової вибірки та оцінки відносної кількості білка в протеоміці дробовика. 76: 4193 – 4201. doi: 10.1021 / ac0498563
  173. 32. Ito K, Haga T, Lameh J, Sadee W (1999) Секвестрація рецепторів дофамінових D2 залежить від коекспресії G-білок-пов'язаних рецепторних кіназ 2 або 5. Eur J Biochem 260: 112 – 119. doi: 10.1046 / j.1432-1327.1999.00125.x
  174. 33. Namkung Y, Sibley DR (2004) Протеїнкіназа C опосередковує фосфорилювання, десенсибілізацію і торгівлю рецептором дофаміну D2. J Biol Chem 279: 49533 – 49541. doi: 10.1074 / jbc.m408319200
  175. 34. Wong AS, Lee RH, Cheung AY, Yeung PK, Chung SK, et al. (2011) Фосфорилювання ендофіліну B5, опосередковане Cdk1, необхідно для індукованої аутофагії в моделях хвороби Паркінсона. Nat Cell Biol 13: 568 – 579. doi: 10.1038 / ncb2217
  176. 35. Kesavapany S, Lau KF, McLoughlin DM, Brownlees J, Ackerley S, et al. (2001) p35 / cdk5 пов'язує і фосфорилирует бета-катенін і регулює взаємодію бета-катенін / пресенілін-1. Eur J Neurosci 13: 241 – 247. doi: 10.1046 / j.1460-9568.2001.01376.x
  177. 36. Kuhar MJ, Ritz MC, Boja JW (1991) Допамінова гіпотеза про підсилюючі властивості кокаїну. Тенденції Neurosci 14: 299 – 302. doi: 10.1016 / 0166-2236 (91) 90141-g
  178. 37. Volkow ND, Fowler JS, Wolf AP, Schlyer D, Shiue CY, et al. (1990) Вплив хронічного зловживання кокаїном на постсинаптичні дофамінові рецептори. Am J Psychiatry 147: 719 – 724.
  179. 38. Dalley JW, Fryer TD, Brichard L, Robinson ES, Theobald DE et al. (2007) Рецептори Nucleus accumbens D2 / 3 спрогнозують імпульсивність і підсилення кокаїну. Наука 315: 1267 – 1270. doi: 10.1126 / science.1137073
  180. 39. Надер М.А., Морган D, Gage HD, Nader SH, Calhoun TL, et al. (2006) Візуалізація PET з дофамінових рецепторів D2 під час хронічного самоконтролю кокаїну у мавп. Nat Neurosci 9: 1050 – 1056. doi: 10.1038 / nn1737
  181. 40. Робінсон Т.Е., Колб Б. (1997) Стійкі структурні модифікації в ядрі accumbens і нейронах префронтального кори головного мозку, отримані попереднім досвідом роботи з амфетаміном. J Neurosci 17: 8491 – 8497.
  182. 41. Робінсон Т.Е., Колб Б. (1999) Зміни в морфології дендритів і дендритних шипів в nucleus accumbens і префронтальній корі після повторного лікування амфетаміном або кокаїном. Eur J Neurosci 11: 1598 – 1604. doi: 10.1046 / j.1460-9568.1999.00576.x
  183. 42. McClung CA, Nestler EJ (2003) Регулювання експресії генів та винагороди кокаїну від CREB та DeltaFosB. Nat Neurosci 6: 1208 – 1215. doi: 10.1038 / nn1143
  184. 43. Feng J, Yan Z, Ferreira A, Tomizawa K, Liauw JA, et al. (2000) Спинофілін регулює формування і функцію дендритних шипів. Proc Natl Acad Sci США 97: 9287 – 9292. doi: 10.1073 / pnas.97.16.9287
  185. 44. Prange O, Murphy TH (2001) Модульний транспорт кластерів постсинаптичної щільності 95 і асоціація зі стабільними попередниками хребта під час раннього розвитку кортикальних нейронів. J Neurosci 21: 9325 – 9333.
  186. 45. Мурасе С, Моссер Е, Шуман Е.М. (2002) Деполяризація диски бета-Катеніна в нейрональні шипи, що сприяють змінам синаптичної структури і функції. Нейрон 35: 91 – 105. doi: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00764-x
  187. 46. Hayashi ML, Choi SY, Rao BS, Jung HY, Lee HK, et al. (2004) Змінена морфологія кортикального синапсу і порушення консолідації пам'яті у специфічних до головного мозку домінантно-негативних ПАА-трансгенних мишах. Нейрон 42: 773 – 787. doi: 10.1016 / j.neuron.2004.05.003
  188. 47. Benavides DR, Quinn JJ, Zhong P, Hawasli AH, DiLeone RJ, et al. (2007) Cdk5 модулює згортання кокаїну, мотивацію і збудливість стриарних нейронів. J Neurosci 27: 12967 – 12976. doi: 10.1523 / jneurosci.4061-07.2007
  189. 48. Meyer DA, Richer E, Benkovic SA, Hayashi K, Kansy JW, et al. (2008) Стриатальная дисрегуляція Cdk5 змінює локомоторні реакції на кокаїн, рухове навчання і дендритну морфологію. Proc Natl Acad Sci США 105: 18561 – 18566. doi: 10.1073 / pnas.0806078105
  190. 49. Impey S, Obrietan K, Storm DR (1999) Створення нових зв'язків: роль сигналізації ERK / MAP кінази в нейрональній пластичності. Нейрон 23: 11 – 14. doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 80747-3