Дисфункція базальних ганглій сприяє фізичній бездіяльності при ожирінні (2016 р.)

Доступний онлайн 29 Грудень 2016

http://dx.doi.org/10.1016/j.cmet.2016.12.001

мелірування

• Ожиріння пов'язане з фізичною бездіяльністю

• Ожирілі миші мають меншу смугасте зв'язування D2R, що може пояснити їх бездіяльність

• Відновлення G_i сигналізація в iMSN врятує рівні фізичної активності ожирілих мишей

• Фізична бездіяльність - це скоріше наслідок, ніж причина збільшення ваги

Підсумки

Ожиріння пов'язане з фізичною бездіяльністю, що посилює наслідки набору здоров’я для здоров’я. Однак механізми, що опосередковують цю асоціацію, невідомі. Ми припускали, що дефіцит дофамінової сигналізації сприяє фізичній бездіяльності при ожирінні. Щоб дослідити це, ми кількісно визначили кілька аспектів сигналу дофаміну у худих та ожирілих мишей. Ми виявили, що зв'язування рецепторів типу D2 у стриатумі, але не зв'язування рецепторів типу D2 або рівнів допаміну, було знижено у ожирілих мишей. Генетичне видалення D1Rs зі стриантних середніх колючих нейронів було достатнім для зниження рухової активності у худих мишей, тоді як відновлення G_i сигналізація в цих нейронах підвищувала активність у ожирілих мишей. Дивно, хоча миші з низьким вмістом D2R були менш активними, вони не були більш вразливими до збільшення дієти, спричиненого дієтою, ніж контрольні миші. Ми робимо висновок, що дефіцит смугастої D2R сигналізації сприяє фізичній бездіяльності при ожирінні, але бездіяльність є скоріше наслідком, ніж причиною ожиріння.

Графічний конспект

Параметри малюнка

Ключові слова

ожиріння;
дофамін;
фізична активність;
вправа;
D2;
смугастий;
ожиріння;
втрата у вазі

Вступ

Ожиріння пов'язане з фізичною бездіяльністю (Браунсон та ін., 2005 та Еккекакіс та ін., 2016), який поєднує негативні наслідки для здоров'я діабету II типу та серцево-судинних захворювань (de Rezende et al., 2014 та Шарма та ін., 2015). Механізми, що лежать в основі цієї асоціації, невідомі, факт відображений у відсутності ефективних втручань щодо зміни рівнів фізичної активності у населення з ожирінням (Еккекакіс та ін., 2016). Цікаво, що ожиріння було пов’язане з змінами сигналізації смугастого дофаміну (DA), що призвело до гіпотез нагороди дисфункції при ожирінні (Блюм та ін., 2011, Кенні, 2011 та Volkow і Wise, 2005). Незважаючи на те, що смугастий ДА тісно пов'язаний з руховим викидом, мало досліджень досліджували, як індуковані дієтою дофамінергічні зміни можуть сприяти фізичній бездіяльності. Ми припускаємо, що смугаста сигналізація DA порушена при ожирінні і що це сприяє фізичній бездіяльності. Розуміння біологічних причин фізичної бездіяльності може призвести до ефективних втручань для підвищення активності та, тим самим, поліпшення здоров'я у людей з ожирінням.

Стрияльний DA критично бере участь у руховому управлінні. Це очевидно при рухових розладах, таких як хвороба Паркінсона, яка характеризується загибеллю дофамінергічних нейронів в середньому мозку і наслідком цього втратою смугастої ДА (Hornykiewicz, 2010). Дві популяції нейронів смугастої проекції, модульовані DA, відомі як прямі та опосередковані середні колючі нейрони (dMSN та iMSN) (Олександр і Пітер, 1990, DeLong, 1990 та Герфен та ін., 1990). dMSN виражають G_s-поєднаний D1-рецептор (D1R) і спрямовується на субстанцію і внутрішній сегмент блідості глобуса, тоді як iMSN виражають G_i-з'єднав D2R і висунувся на зовнішній сегмент pallidus глобуса (GPe) (Герфен та ін., 1990, Le Moine and Bloch, 1995 та Леві та ін., 1993). Генетичне усунення D2R з iMSN або оптогенетичне стимулювання iMSN є достатнім для зменшення руху (Кравіц та ін., 2010 та Лемос та ін., 2016). На основі зв’язків між дисфункцією D2R та ожирінням ми висунули гіпотезу, що ожиріння тварин змінили вихід iMSN, що призвело до фізичної бездіяльності.

Тут ми розглянули декілька аспектів сигналізації DA у худих та дієтичних індукованих мишей. Зв'язування D2R знижувалось у ожирілих мишей, тоді як рівні зв'язування D1R та позаклітинний DA залишалися незмінними. Ожирілі миші також виявляли перебої в смугастій стрільбі і мали зменшений рух. Генетичне усунення D2R з iMSN знижувало активність у худих мишей, тоді як відновлення G_i сигналізація в iMSN збільшує активність у ожирілих мишей. Ці результати встановлюють, що D2R сигналізація в iMSN може двосторонньо модулювати фізичні навантаження. Потім ми запитали, чи були миші з низьким рівнем сигналу D2R більш вразливі до збільшення ваги на дієті з високим вмістом жиру, через їх низьку активність. Для цього ми вивчили приріст ваги щодо природних варіацій зв'язування D2R серед мишей, а також у мишей з генетичною елімінацією смугастих D2R. Хоча миші з низьким рівнем D2R мали низький рівень фізичної активності, вони набирали вагу з тією ж швидкістю, що і миші з неушкодженими D2R. Це суперечить сильній причинно-наслідковій залежності між фізичною активністю та збільшенням ваги. Ми робимо висновок, що порушення сигналізації D2R сприяють фізичній активності при ожирінні, але що бездіяльність не обов'язково призводить до збільшення ваги.

результати

Ожиріння, спричинене дієтою, асоціювалося з фізичною бездіяльністю

Самців мишей C57BL6 / J (3–4 місяці) годували або стандартною чау-їжею (нежирною, n = 8), або дієтою з високим вмістом жиру (ожирінням, n = 8) протягом 18 тижнів (Рисунок S1А). Починаючи з 2-го тижня і зберігаючись до 18-го тижня, ожирілі миші мали значно вищу масу тіла та масу жиру, ніж худі миші (р <0.0001; Фігури 1А і S1Б). Постільна маса суттєво не змінена (Рисунок S1В). Ми вимірювали рівні активності у відкритому полі кожні 2 тижні протягом 18 тижнів (Ethovision; Noldus Information Technologies). Повні миші мали нижчу активність, ніж худі миші, починаючи з 4-го тижня і зберігаючись до 18-го тижня (р <0.0001; Фігури 1B і 1C). На 18 тижні ожирілі миші проводили менше часу в русі (p = 0.005), мали менше рухів (p = 0.0003) і мали менші швидкості під час руху (p = 0.0002; Фігура 1Г) відносно худих мишей. Вирощування та догляд не були суттєво змінені (Фігура 1Г). Повні миші також бігали менше, ніж худі миші, коли їм надавали доступ до ходових коліс у домашній клітці (p = 0.0005; Фігура 1Д). Ми перевірили, чи дефіцит руху корелює з збільшенням ваги в ожирінні. Хоча збільшення ваги було пов’язане з споживанням калорій в раціоні з високим вмістом жирів (Фігура 1F) вона не була пов'язана з рівнями руху у відкритому полі або з витраченою енергією під час дієти з високим вмістом жиру (Фігури 1G і 1H). Цікаво, що ці самі кореляції мали місце, коли ми вивчали споживання їжі на першому тижні експерименту (Фігури 1I – 1K), що вказує на те, що початковий рівень споживання дієти з високим вмістом жиру (але не руху та витрат енергії) передбачив подальше збільшення ваги.

Фігура 1.

Хронічна дієта з високим вмістом жиру призвела до фізичної бездіяльності

(A) Мишей, які годували дієтою з високим вмістом жиру, важили більше, ніж мишей, що годували стандартним чау, починаючи з тижня 2 і продовжуючи тиждень 18 (F_(18,252) = 62.43, р <0.0001).

(B і C) (B) Приклад трекових графіків активності у відкритому полі, що показують, що (C) миші з ожирінням знизили фізичну активність порівняно з худими мишами, починаючи з тижня 4 і продовжуючи до 18 тижня (F_(10,140) = 4.83, р <0.0001).

(D) Після 18 тижнів дієти з високим вмістом жиру у мишей із ожирінням зменшився час на пересування (t₍₁₄₎ = 3.32, p = 0.005), зменшена частота руху (t₍₁₄₎ = 4.74, p = 0.0003) та зменшення швидкості під час руху (t₍₁₄₎ = 4.69, p = 0.0002) відносно пісних елементів управління. Повні миші також продемонстрували тенденцію до зменшення вирощування (р = 0.07).

(E) Коли їм надавали доступ до бігового колеса в клітці будинку, у ожирілих мишей було менше обертів колеса відносно худих мишей (т₍₁₄₎ = 4.55, р = 0.0005).

(F – H) Загальний приріст ваги сформував значну кореляцію з (F) спожитою енергією протягом експерименту (r = 0.74, p = 0.04), але не (G) витратами енергії (r = 0.52, p = 0.19) ні (H) швидкість відкритого поля (r = 0.19, p = 0.65).

(I – K) Загальний приріст ваги сформував значну кореляцію із (I) середнім споживанням енергії протягом першого тижня (r = 0.88, p = 0.004), але не (J) витратами енергії (r = −0.19, p = 0.66) , ані (K) швидкість відкритого поля (r = 0.36, p = 0.38).

Статистичний аналіз. (A і C) Двосторонній повторний захід ANOVA з подальшим тестуванням після спеціальної перевірки з помилковою швидкістю виявлення Бенджаміні-Хохберга; (D і E) непарний тест Стьюдента; (F – H) лінійна регресія; ^*р <0.05, ^**р <0.01, ^***p <0.0001 проти худих. (I – K) лінійна регресія; ^***p <0.001 порівняно з худими мишами.

Параметри малюнка

Ожиріння асоціювалося зі зменшенням зв'язування дофаміну D2R

Для виявлення механізмів, що лежать в основі фізичної бездіяльності, ми кількісно визначили кілька аспектів сигналізації DA у худих та ожирілих мишей. Відповідно до попередніх повідомлень про гризунів, зв'язування D2R-рецепторів (за допомогою авторадиографии з ³H-спіперон, який надалі називали зв'язуванням D2R), був нижчим у мишей із ожирінням порівняно з худими мишами (р <0.0001; Фігури 2A і 2B), знахідка, яка була значущою у всіх трьох підпровідних смугах (дорсомедіальний: p = 0.004; дорсолатеральний: p <0.0001; вентральний: p <0.001; Цифри S2A і S2B). Однак зв'язування D2R не корелювало з жировими відкладеннями в худій або ожиріній групі (р> 0.55 для обох; Фігура 2C), припускаючи, що, хоча зв'язування D2R і зберігання жиру змінені хронічною дієтою з високим вмістом жиру, ці змінні можуть не бути причинно пов'язаними між собою.

Фігура 2.

Дієта з високим вмістом жиру з порушеннями смугастого дофаміну D2R

(A) Зображення смугастого зв'язування D2R, виміряні через ³Н-спіперонова авторадиография.

(B) Стриятичне зв'язування D2R знижувалось у ожиріння відносно худорлявих мишей (t₍₂₅₎ = 5.02, р <0.0001).

(C) Зв’язування D2R через смужку не корелювало з відсотком жиру в організмі худих (p = 0.95) або мишей з ожирінням (p = 0.56).

(D – F) (D) Стрійкове зв'язування D1R (t₍₂₄₎ = 1.31, p = 0.20), (E) загальний вміст дофаміну (DA; t₍₁₃₎ = 0.85, p = 0.41) та щільність (F) тирозингідроксилази (TH) (t₍₁₄₎ = 0.48, p = 0.64) не відрізнялися між групами дієт.

Статистичний аналіз. Середнє значення для окремих мишей; n = 8–19 мишей / група; T-тест Стьюдента (B і D – F) або лінійна регресія (C); ^*р <0.01.

Параметри малюнка

Ми намагалися визначити механізм, що лежить в основі зниження опосередкованої ожирінням зменшення зв'язування D2R. Для цього ми шукали відмінності в Drd2 мРНК (за допомогою гібридизації in situ) і виявила її незмінною у всіх трьох стриатальних підрозділах (дорсомедіальний: p = 0.92; дорсолатеральний: p = 0.90; вентральний: p = 0.34; Рисунок S2В). Ми провели вестерн-блотінг для кількісного визначення загального рівня білка D2R і не відзначили жодної зміни в смугах 50- або 70-кДа, які, як вважалося, представляють різні стани глікозилювання D2R (обидва р> 0.95, Цифри S2D і S2E) (Джонсон і Кенні, 2010). Нарешті, ми оцінили маркери метаболічної дисфункції у худих та ожирілих мишей, щоб побачити, чи можуть вони бути пов’язані зі зниженням D2R, як повідомлялося раніше (Данн та ін., 2012). Миші з ожирінням мали вищий рівень холестерину натще (p <0.0001), лептину (p <0.0001), глюкози (p = 0.0002), інсуліну (p = 0.001) та оцінки гомеостатичної моделі на основі резистентності (HOMA-IR) (p <0.001) , але не тригліцериди або вільні жирні кислоти (Цифри S1D – S1J). Однак жоден із цих факторів не співвідносився зі зв'язуванням D2R у ожирілих мишей (дані не показані).

D1R-подібне зв'язування (за допомогою авторадиографии з ³H-SCH23390, надалі називаний зв'язуванням D1R) не відрізнявся між ожирілими та худими мишами (p = 0.20; Фігура 2Г). Також не виявлено відмінностей у вмісті DA в стриатах, виміряних за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) в штрихах тканини смуг (p = 0.41; Фігура 2E), або імуномічення маркування тирозингідроксилази (р = 0.64; Фігура 2Ж). У світлі багаторазових повідомлень про відмінності базальної DA у ожирілих мишей (Карлін та ін., 2013, Девіс та ін., 2008, Вучетич та ін., 2012 та Ванг та ін., 2014), ми далі вивчали цю точку, використовуючи мікродіаліз без чистого потоку (нові миші, n = 6 на групу). Ми знову не спостерігали відмінностей у позаклітинному DA (p = 0.99) або будь-якому з двох його метаболітів, 3,4-дигідроксифенілоцтової кислоти (DOPAC) (p = 0.85) та гомованілінової кислоти (HVA) (p = 0.68, Рисунок S3) за допомогою цього методу, що вказує на те, що ожиріння не було пов'язане зі зниженням позаклітинного тону DA в цих експериментах.

Смужні стрільби, пов'язані з рухом, були порушені у ожирілих мишей

Ми провели електрофізіологію in vivo, щоб вивчити, як зменшене зв’язування D2R поперечно-смугастого типу може змінити вироблення смугастих нейронів і, таким чином, сприяти зменшенню руху. Ми реєстрували з дорсомедіального смугастого худих і ожирілих мишей (n = 3 миші на групу, гістологія у Фігура 3F). Хоча миші з ожирінням рухались менше в цілому, швидкість виконуваних рухів не відрізнялася між цими групами (p = 0.55; Фігура 3A), що дозволяє нам порівняти стрільбу, пов’язану з рухом, між худими та ожирілими мишами. Базальний коефіцієнт підйому кількох одиниць не відрізнявся між худими та ожирілими мишами (худі, 2.1 ± 0.4 Гц; ожиріння, 2.0 ± 0.7 Гц; р = 0.93). Однак поширеність одиниць, що активуються рухом (Фігура 3B) був помітно нижчим у мишей із ожирінням (p <0.0001; Фігура 3В). Це не залежало від нашого статистичного визначення "активованих рухом" одиниць, оскільки ми також спостерігали зменшення стрибків навколо рухів середньої реакції всіх зареєстрованих одиниць у ожирілих та худих мишей (взаємодія ANOVA, p <0.0002; Фігури 3D і 3E). Ми робимо висновок, що загальний коефіцієнт шипування в стриатумі не відрізнявся, але організація шипів навколо руху була порушена у ожирілих мишей.

Фігура 3.

Стрільба, пов'язана з рухом у Стріатумі, була порушена у ожирілих мишей

(A) Рух події мали однакову швидкість у худих та ожирілих мишей.

(B) Приклади стрільби, що активується рухом, і невідповідальна стрілянина в нейронах стриату.

(D) Середня стрілянина, пов'язана з рухом усіх зареєстрованих нейронів.

(E) Стрільба, пов'язана з рухом, була значно нижчою після дієти (дієта × взаємодія з рухом, F_(1,171) = 14.77, р <0.0002).

(F) Схематичні (адаптовано з Франклін і Паксінос, 1997), що ілюструє розміщення електродного масиву у мишей, що страждають від ожиріння та ожиріння (n = 3 кожна).

Статистичний аналіз. (C) Точний тест Фішера. (D і E) Двосторонній повторний захід ANOVA.

Параметри малюнка

Інгібування вихідних даних відновлених рівнів iMSN у ожирілих мишей

Щоб перевірити, чи може зменшення виходу iMSN збільшувати рух у ожирілих мишей, ми використовували стратегію, залежну від Cre-рекомбінази (Cre), щоб виразити інгібуючу G_i-поєднаний модифікований дизайнерський рецептор опіоїдних рецепторів каппа, ексклюзивно активований конструкторськими лікарськими засобами (KOR-DREADD) у iMSN жирних мишей (Фігура 4А). Хоча миша аденозинового рецептора 2A Cre (A2A-Cre) була попередньо підтверджена імунофарбуванням, щоб продемонструвати, що експресія Cre є специфічною для смугастих iMSN (Cui та ін., 2013 та Лемос та ін., 2016), ми провели додаткову перевірку цієї лінії з подвійною флуоресцентною гібридизацією in situ. Майже всі нейрони (98.7% ± 0.6% з 1,301 підрахованих нейронів) експресували обидва Кре та Drd2 мРНК, тоді як дуже мало (1.3% ± 0.6%) експресувало будь-яку Кре or Drd2 мРНК, але не обидва, що підтверджує, що лінія A2A-Cre вірно орієнтується на iMSN ( Рисунок S4).

Фігура 4.

DREADD-опосередковане інгібування відновлених фізичних навантажень iMSN у ожирілих мишей

(A) Фотографія виразу KOR-DREADD та схематична (адаптована з Франклін і Паксінос, 1997) ілюстрування вірусних місць ін'єкції всіх KOR-DREADD у мишей A2A-Cre; непрозорість показує кількість вірусів, що експресують мишей, у певному місці.

(B) Ожирілі миші рухалися більше при введенні SalB порівняно з DMSO (t₍₇₎ = 3.056, р = 0.02).

(C – G) Після введення SalB, страждаючі ожирінням миші показали несуттєві зміни (C) частоти рухів, (D) середньої тривалості руху та (E) швидкості руху, порівняно з прийомом DMSO. (F) Введення Sal-B збільшило частоту вирощування (t₍₇₎ = 3.116, p = 0.02), але (G) не суттєво змінив частоту догляду.

(H) Худіші миші рухалися більше при введенні SalB порівняно з DMSO (t₍₉₎ = 3.3, р = 0.01).

(I) SalB не впливав на рух у мишей дикого типу, які не експресували KOR-DREADD (p = 0.77).

Статистичний аналіз. (B – I) парні тести Стьюдента t; середнє з окремими мишами; n = 6–10 мишей / група.

Параметри малюнка

Ін'єкції агоніста KOR-DREADD сальвінорін-B (SalB) збільшили відстань, яку пройшли миші з ожирінням, експресуючи KOR-DREADD (p = 0.02; Фігура 4Б). SalB також збільшив частоту вирощування (p = 0.02; Фігура 4F) і спричинив тенденцію до збільшення частоти (t₍₇₎ = 1.64, p = 0.12), але не тривалість або швидкість руху (Фігури 4C – 4E). Ін'єкції SalB також збільшували рух у худих мишей (p = 0.01; Фігура 4H), але не у мишей дикого типу, які не експресували KOR-DREADD (p = 0.73; Фігура 4Я). Ми робимо висновок, що зниження випуску iMSN є достатнім для підвищення рівня руху як худих, так і ожирілих тварин.

Низькі рівні D2R не схиляють тварин до майбутнього набору ваги

Нарешті, ми вивчили, чи можуть раніше існувати відмінності в сигналізації D2R схильні окремі миші до ожиріння, спричиненого дієтою. Для вирішення цього питання ми виконали мікропозитронну емісійну томографію (мікро-ПЕТ) ¹⁸F-fallypride для визначення базової доступності D2R перед впливом дієти з високим вмістом жиру (Фігура 5А). Ми відзначили високий рівень дисперсії потенціалу зв'язування D2R серед мишей, як показали інші (Константинеску та ін., 2011). Індивідуальні відмінності у доступності D2R позитивно корелювали з рухом у відкритому полі (p = 0.045; Фігура 5Б), що відповідає ролі D2R у русі. Після мікро-ПЕТ-сканування тварин протягом 18 тижнів дотримувались дієти з високим вмістом жиру, щоб перевірити, чи миші з низьким рівнем D2R будуть вразливішими до збільшення ваги, спричиненого дієтою. Дивно, але ми виявили тенденцію до позитивний взаємозв'язок між початковою доступністю D2R та приростом ваги протягом цього експерименту (p = 0.10; Фігура 5В). Хоча ця кореляція не була суттєвою, вона аргументує гіпотезу, що низька доступність D2R або низька фізична бездіяльність роблять тварин більш вразливими до збільшення ваги. Це також відповідало нашим висновкам, що ні базальна активність на відкритому полі, ні активність на відкритому полі протягом усього експерименту не корелювали із збільшенням ваги (Фігури 1F – 1K).

Фігура 5.

Базальне прив'язування D2R не прогнозувало майбутнє збільшення ваги

(A) Приклад кривих доступності мікро-ПЕТ D2R в стриатумі та мозочку з використанням ¹⁸F-fallypride.

(B і C) (B) Потенціал зв'язування корелював з базальним рухом відкритого поля (r = 0.56, p = 0.045) і (C) прагнув до позитивного взаємозв'язку із збільшенням ваги, спричиненим дієтою з високим вмістом жиру (r = 0.50, p = 0.10, n = 12–14 мишей).

(D) Репрезентативна D2R авторадиографія у мишей з неушкодженими D2Rs (вгорі) та iMSN-Drd2-КО мишей (знизу).

(E і F) (E) iMSN-Drd2-КО у мишей було знижено фізичну активність у відкритому грунті (t₍₈₎ = 2.99, p = 0.02) та (F) на ходових колесах домашньої клітки (p = 0.01, n = 5–19 мишей / група).

(G) iMSN-Drd2-КО мишей і Drd2-контрольовані посмішки контролі набирають аналогічну кількість ваги на дієті з високим вмістом жиру (F_(5,70) = 1.417, p = 0.23; n = 6–10 мишей / група).

(H – J) (H) Не було суттєвої різниці в нормованому споживанні енергії (p = 0.60), (I) витратах енергії (p = 0.47) або (J) RER (p = 0.17) між iMSN-D2R-KO контролю мишей та односвітника.

Статистичний аналіз. (B і C) Лінійна регресія; (E, F і H – J) непарний тест Стьюдента; (G) двосторонній повторний захід ANOVA, ^*р <0.05.

Параметри малюнка

Для подальшого вивчення взаємозв'язку між наявними відмінностями в рівнях активності та збільшенням ваги ми скористалися генетичною моделлю миші з цільовим видаленням Drd2 ген від iMSN (iMSN-Drd2-KO), але збережена експресія в інших типах клітин ( Доббс та ін., 2016 та Лемос та ін., 2016). Як повідомлялося раніше, iMSN-Drd2-KO миші рухались менше, ніж контролери однобічних сміття, у відкритому полі (p = 0.02; Фігура 5E) та на ходових колесах домашньої клітки (p = 0.01; Фігура 5Ж). Відповідно до вищезазначених експериментів, iMSN-Drd2-KO миші не набирали більше ваги, ніж їх контролери одномісних однокліток, коли їх вводили на дієту з високим вмістом жиру (р = 0.23; Фігура 5Г). Щоб більш детально вивчити їх використання енергії, ми провели експерименти непрямої калориметрії для порівняння iMSN-Drd2-KO миші для контролю сміття. Ми не виявили істотних відмінностей у споживанні енергії (p = 0.60), витратах енергії (p = 0.47) або коефіцієнті дихального обміну (RER) (співвідношення CO₂ виробництво до О₂ споживання [VCO₂/ ВО₂], p = 0.17) між мишами iMSN-Drd2-KO та контролерами їх сміття, що вказує на те, що зменшення руху мишей IMSN-Drd2-KO не призвело до змін у використанні енергії (Фігури 5H – 5J). Нарешті, ми дослідили, наскільки менші скорочення смугастого D2R (такі, які спостерігаються у наших ожирілих мишей) могли регулювати рух і збільшення ваги. Для цього ми використовували лінію миші, яка призводить до зменшення смугастого на 30% –40% Drd2 мРНК (iMSN-Drd2-Het) ( Лемос та ін., 2016). Ці миші також демонстрували зменшений рух, демонструючи, що часткового збиття D2R достатньо для виникнення рухових дефіцитів (p = 0.04; Рисунок S5А). Подібно мишам iMSN-Drd2-KO, миші iMSN-Drd2-het не були більш сприйнятливими до збільшення ваги, спричиненого дієтою, з високим вмістом жиру (p = 0.89; Рисунок S5Б). Ми робимо висновок, що зміни в смугастих D2R є достатніми для зміни руху, але не балансу калорій або маси тіла у мишей.

Обговорення

Ожиріння пов’язане з фізичною бездіяльністю, яка, як вважають, часто сприяє набору ваги. Крім того, підвищена ожиріння гіпотезується, що сприяє низькому рівню активності людей з ожирінням (Еккекакіс і Лінд, 2006 та Вестертерп, 1999), хоча цю ідею важко перевірити безпосередньо. Цікаво, що люди, які худнуть або через дієту (де Бур та ін., 1986, де Гроот та ін., 1989, Мартін та ін., 2007 та Редман та ін., 2009) або баріатрична хірургія (Берглінд та ін., 2015, Берглінд та ін., 2016, Бонд та ін., 2010 та Рамірес-Марреро та ін., 2014) не збільшують рівень своєї активності, сперечаючись з вагою ожиріння, що викликає їх бездіяльність. Тут ми дослідили гіпотезу, що ожиріння, спричинене дієтою, викликає фізичну бездіяльність через дефіцит смугастої передачі ДА. Відповідно до попередньої роботи, ми виявили, що хронічна дієта з високим вмістом жиру знижує смугасте зв'язування D2R (Хайнал та ін., 2008, Хуанг та ін., 2006, Нараянасвамі та ін., 2013, ван де Гіссен та ін., 2012 та ван де Гіссен та ін., 2013). Ми також спостерігали дефіцит рухової стрільби нейронів смугастих у ожирілих мишей. Інгібування iMSN з G_i-поєднана DREADD врятована активність у ожирілих мишей, демонструючи, що миші з надлишковою ожирінням можуть нормально рухатися, коли відновлено вихід базальних ганглій. Дивно, однак, ні базальні вимірювання D2R, ні фізичні навантаження не корелювали із збільшенням ваги, що ми спостерігали у багатьох експериментах. Це на відміну від дослідження на щурах, яке може відображати види або експериментальні відмінності (Michaelides та ін., 2012). Ми робимо висновок, що зниження D2R і подальша фізична бездіяльність є наслідками ожиріння, але не обов'язково причинно пов'язані з подальшим збільшенням ваги у мишей.

Зв'язок між зміненою сигналізацією D2R і ожирінням вперше був виявлений у людей і спочатку був реплікуваний іншими (де Вейер та ін., 2011, Кесслер та ін., 2014, Волков та ін., 2008 та Ванг та ін., 2001). Однак новітні роботи поставили під сумнів цей висновок (Караваджо та ін., 2015, Косгроув та ін., 2015, Данн та ін., 2012, Го та ін., 2014, Карлссон та ін., 2015, Карлссон та ін., 2016, Стіл та ін., 2010 та Туомінен та ін., 2015). Хоча необхідні додаткові дослідження для розуміння розбіжностей, виявлених у клінічних дослідженнях, вони можуть відображати складності, притаманні клінічним дослідженням та ПЕТ-томограм. Наприклад, раклоприд, радіоліганд, використовуваний у багатьох дослідженнях, може бути зміщений ендогенним DA, і тому на зв'язування може впливати різниця в базальному тоні DA (Горстманн та ін., 2015). Крім того, зв'язок між рівнями D2R та ожирінням може бути нелінійним, так що зміни у D2R можуть виникати по-різному у пацієнтів з різним рівнем ожиріння (Горстманн та ін., 2015). Нарешті, такі фактори, як тривалість сну (Wiers et al., 2016) і споживання кофеїну (Волков та ін., 2015) також може впливати на зв'язування D2R, і не повідомляється або контролюється в більшості клінічних досліджень. Ці джерела дисперсії можна пом'якшити в дослідженнях на тваринах, які малюють стійку картину зменшення мРНК D2R (Матес та ін., 2010 та Чжан та ін., 2015), білок (Адамс та ін., 2015 та Джонсон і Кенні, 2010) та зв'язування рецепторів (Хайнал та ін., 2008, Хуанг та ін., 2006, Нараянасвамі та ін., 2013, ван де Гіссен та ін., 2012 та ван де Гіссен та ін., 2013) у ожирілих гризунів. Наша робота розширює цю частину літератури, повідомляючи, що інші аспекти сигналізації DA залишаються незмінними у ожирілих мишей, навіть у тих, у кого зменшення D2R. Крім того, враховуючи наше спостережуване зниження зв'язування D2R ³Н-спіперон, але без зміни загального білка D2R або Drd2 мРНК, ми вважаємо, що зміни D2R можуть включати посттрансляційні зміни, такі як інтерналізація рецепторів. Хоча наші дані говорять про те, що знижене зв'язування D2R є достатнім для зменшення фізичних навантажень при ожирінні, на фізичне навантаження впливають багато факторів, включаючи генетику та навколишнє середовище ( Бауман та ін., 2012). Ми вважаємо, що малоймовірно, що D2R є єдиною неврологічною зміною, пов'язаною з фізичною бездіяльністю при ожирінні. Наприклад, зміни циркулюючих гормонів, таких як грелін, лептин та інсулін, діють на дофамінергічні нейрони і можуть впливати на активність (Мюррей та ін., 2014). Нарешті, хоча ми не спостерігали змін у D1R, ми не можемо виключити зміни нейронного вистрілення нейронів прямого шляху, які також можуть впливати на фізичну активність.

Незрозуміло, чи різниця у доступності D2R спричиняє людей до набору ваги. Люди з Drd2 Алель Taq1A знизив доступність D2R та підвищив ризик ожиріння ( Блюм та ін., 1996, Карпентер та ін., 2013, Noble та ін., 1991, Стіце та ін., 2008 та Томпсон та ін., 1997). Крім того, миші з глобальним вилученням D2R легше набирали вагу на дієті з високим вмістом жиру, яку пояснювали фізичною бездіяльністю (Білер та ін., 2015). На відміну від цього, індивідуальні зміни (природні або генетично обумовлені) смугастих D2R корелювали з рівнями активності у нашому дослідженні, але не корелювали із збільшенням ваги. Важливою відмінністю в нашому дослідженні було те, що наша генетична модель видаляла D2R виключно з iMSN. Крім того, ретельне вимірювання споживання їжі та витрат енергії показало, що маніпулювання D2R на цих нейронах не змінювало енергетичний баланс. Таким чином, дослідження, які демонструють зв'язок між глобальною функцією D2R та енергетичним балансом, можуть спостерігати вплив D2R на інші типи клітин. Наші експерименти підтримують висновок, що фізична бездіяльність є наслідком ожиріння, але сама по собі є недостатньою, щоб викликати зміни ваги.

Незважаючи на зростаючі докази того, що фізичне навантаження пов'язане з поліпшенням серцево-судинного здоров’я та зниженням ризику для ряду інших хронічних захворювань, фізичне навантаження залишається низьким у людей з ожирінням (Еккекакіс та ін., 2016). Відсутність ефективних втручань для підвищення рівня фізичної активності відображається на недостатньому розумінні клітинних та молекулярних механізмів, що лежать в основі фізичної бездіяльності людей з ожирінням. Тут ми пов'язуємо фізичну бездіяльність зі змінами функції базальних гангліїв, забезпечуючи біологічне пояснення відсутності фізичних навантажень у людей з ожирінням.

Експериментальні процедури

Предмети та дієти

У всіх дослідженнях мишей індивідуально утримували у стандартних умовах (12-годинний цикл світло / темрява, 21-22 ° C), з вільним доступом до їжі та води. Мишам забезпечували або стандартну дієту чау (дієта на гризунах 5001; 3.00 ккал / г з 29% енергії, отриманої з білка, 13% з жиру та 56% з вуглеводів; LabDiet), або дієту з високим вмістом жиру (D12492; 5.24 ккал / г з 20% енергії, одержуваної з білка, 60% з жиру та 20% з вуглеводів; Дієти досліджень). Всі процедури виконувались відповідно до рекомендацій Комітету з догляду та використання тварин Національного інституту з діабету, хвороб органів травлення та нирок.

Трансгенний умовний нокаут iMSN-Drd2-KO мишей генерували шляхом схрещування мишей, що експресують Cre, керованих регуляторними елементами гена рецептора аденозину 2A (Adora2a) (B6.FVB (Cg) -Tg (Adora2a-Cre) KG139Gsat / Mmucd; GENSAT; 036158-UCD) з мишами, що перевозять умовні Drd2 нульові алелі B6.129S4 (FVB) -Drd2^{tm1.1Mrub / J}, JAX020631 (Белло та ін., 2011).

Розрахунки складу та енерговитрат

Склад тіла вимірювали через день, використовуючи ¹ЯМР-спектроскопія (EchoMRI-100H; Echo Medical Systems). Витрати на енергію визначали за допомогою розрахунку енергетичного балансу (Го та ін., 2009 та Равуссін та ін., 2013):

Витрати на енергію = метаболізація енергозабезпечення ((Δfatmass + Δfat-freemass).

Увімкніть MathJax

Активність на відкритому полі

Тести на відкритих полях проводились у клітках PhenoTyper (30 × 30 см; Noldus IT), а програмне забезпечення для відеоаналізу EthoVision (версія 11; Noldus IT) використовувалося для відстеження мишей протягом тестування.

Домашня колеса клітки працює

Біг на колесах вимірювали шляхом розміщення низькопрофільних бездротових бігових коліс (Med Associates) у домашніх клітках мишей протягом 72 годин кожні 3 тижні (експерименти з ожирінням, спричинені дієтою) або безперервно (iMSN-Drd2-КО експерименти).

Заходи крові

Кров із зорових вен від жертвоприношених тварин використовували для аналізу метаболітів та гормонів сироватки крові після швидкості 4-год.

Авторадиографія дофамінових рецепторів

Праві гемісекції кріосекціонували на рівні смужок (-0.22, 0.14, 0.62 та 1.18 мм від брегми, що охоплює всю довжину смугастого тіла) на 12-міліметрові ділянки. Слайди розморожували та попередньо інкубували в пробному буфері (20 мМ HEPES, 154 мМ NaCl та 0.1% бичачого сироваткового альбуміну [BSA]; рН 7.4) протягом 20 хв при 37 ° C. Зв'язування D1R оцінювали шляхом інкубації предметних стекол в аналітичному буфері, що містить 1.5 нМ міченого тритієм SCH-23390 (Перкін-Елмер) та 100 нМ кетансерину протягом 60 хв при 37 ° С. Зв'язування D2R оцінювали інкубацією предметних стекол з 600 мкМ міченим тритієм спіпероном (Перкін-Елмер) та 100 нМ кетансерином протягом 100 хв при 37 ° С. Після інкубації з відповідним радіолігандом предметне скло промивали двічі протягом 10 хв при 4 ° C у буфері для промивання (10 мМ Tris-HCl, 154 мМ NaCl), а потім занурювали у воду (0 ° C) і давали висохнути протягом ночі. Потім предметні стекла піддавали дії фосфорних зображень протягом 7 (зв’язування D1R) або 11 днів (зв’язування D2R) і розробляли за допомогою фосфоімаджера (Cyclone; Perkin-Elmer). Для аналізу було визначено та проаналізовано сфери інтересів за допомогою програмного забезпечення для аналізу зображень Optiquant (Perkin-Elmer).

Вестерн Блотінг

Вестерн-плями інкубували з мишачим анти-D2DR антитілом (1: 500; Santa Cruz; sc-5303) або мишачим анти-GAPDH антитілом (1: 1,000; Santa Cruz; sc-32233) і після цього з козячим антимишиним IgG- HRP (1: 1,000; Санта-Крус; sc-2005). Сигнал хемілюмінесценції генерували з використанням посилених реактивних реагентів для детінтування блокації блокуванням хемілюмінесценції (Bio-Rad) та візуалізували за допомогою системи Chemidoc Imaging System (Bio-Rad).

Гібридизація в ситу

Для гібридизації in situ використовували мультиплексний флуоресцентний набір для аналізу RNAscope (Advanced Cell Diagnostics). Коротко, закріплені формаліном зрізи зневоднювали в етанолі з подальшим впливом протеази. Потім зрізи гібридизували з олігонуклеотидними зондами RNAscope проти Drd2. Після гібридизації зонду слайди інкубували з підсилювачем сигналу згідно з протоколами РНК -скопа. Потім слайди промивали буфером для промивання РНКскопом. Нарешті, слайди були змонтовані з протидією DAPI.

Високопродуктивна рідинна хроматографія з електрохімічним виявленням

Ліві півкулі обробляли для виявлення DA за допомогою високоефективної рідинної хроматографії з зворотною фазою з електрохімічним виявленням (ВЕРХ-ЕС), як описано раніше (Кілпатрік та ін., 1986).

Імуногістохімія тирозин гідроксилази

Зрізи, встановлені на слайдах, фіксували у 10% нейтральному буферизованому формаліні, промивали в 0.1 М TBS (рН 7.5) та інкубували у первинному розчині антитіл, що містить 3% нормальної ослиної сироватки, 0.3% Triton X-100 та антитіл до кроликів проти тирозин гідроксилази. (1: 1,000; Millipore; MAB152) протягом ночі при 23 ° C. Наступного дня зрізи тканини промивали в TBS і інкубували у вторинному розчині антитіл, що містив 3% нормальну ослину сироватку, 0.3% Triton X-100 та козячий анти-кролик, кон'югований з Alexa Fluor 555 (Millipore; AQ132F). Для кожної миші аналізували дві смугасті ділянки, за винятком чотирьох мишей (дві HFD, дві чау), де аналізували лише одну секцію через погану якість тканини або зображення.

Мікро-ПЕТ

Мишам вводили ін'єкцію ¹⁸F-фаліприд із питомою активністю 2.5 ± 0.34 мКі / нмоль в обсязі 130 мкл через хвостову вену під час анестезії ізофлураном. Мікро-ПЕТ-сканування проводили протягом 2 годин, протягом яких було отримано 25 кадрів для аналізу. Криві часової активності для ¹⁸F-fallypride в регіонах, що цікавлять (ROI), отримували за допомогою програмного забезпечення AFNI (https://afni.nimh.nih.gov/afni) і кінетичні параметри підходили до моделі з чотирма відділеннями, використовуючи користувацький сценарій MATLAB (з мозочком, що використовується в якості еталонної тканини) для визначення потенціалу зв'язування D2R (Ламмерцма і Юм, 1996).

In Vivo Електрофізіологія

Записи були зроблені з електродної маси, що містила 32 вольфрамових мікропровідних покриттів з тефлоновим покриттям (діаметром 35 мм), імплантованих в односторонньому порядку в дорзомедіальний смугастий простір (передній / задній [A / P]: +0.8; медіальний / бічний [M / L]: +1.5 ; спинний / черевний [D / V]: -2.6 мм на брегму) та оброблений комерційним програмним забезпеченням (Offline Sorter та Neuroexplorer; Plexon).

Стереотаксична ін'єкція вірусного вектора

Мишей короткочасно знеболювали через вплив ізофлурану. Після глибокої анестезії зробили єдиний розріз по середній лінії, оголили череп і зробили двобічну краніотомію (A / P: +0.5; M / L: ± 1.5 мм на брегму). Вірусний вектор, що містить інгібуючий KOR-DREADD (Syn-DIO-hKORD-IRES-mCit-WPRE; 0.5 мкл), вводили двосторонньо в дорсомедіальну смугасту тканину (D / V, -2.8 мм від верхньої частини черепа) і дозволяли експресувати для За 9 тижнів до експериментів.

Мікродіаліз та аналіз на дофамін без флюсу

Вимірювання базального позаклітинного DA, DOPAC та HVA у спинному стриатумі мишей проводили методом мікродіалізу без чистого потоку. Односторонні 2-мм зонди (відсікання мембрани 18 кДа) стереотаксично імплантували через 1 тиждень після імплантації канюлі з безперервною перфузією штучної ліквору (1CL) зі швидкістю 4 мкл / хв протягом XNUMX годин перед забором зразка (див. Додаткові експериментальні процедури). Експеримент без чистого потоку для вимірювання позаклітинних рівнів DA проводили шляхом випадкового перфузування шести різних концентрацій DA (0, 2.5, 5, 10, 20 та 40 нМ) в aCSF через діалізний зонд. Кожну концентрацію DA перфузували протягом 30 хв, а потім зразки 2 × 10 хв відбирали у 2.5 мкл 100 мМ HCl плюс 1 мМ EDTA для запобігання деградації катехоламіну та заморожували при -80 ° C. Для нейрохімічних аналізів використовували ізократичну систему ВЕРХ, поєднану з амперометричним виявленням (HPLC-EC; BASi LC-4C). В аналіз були включені лише миші з належним розміщенням зонда (Рисунок S3Д).

Статистика

Статистичний аналіз проводили за допомогою GraphPad Prism (версія 6.07; програмне забезпечення GraphPad). Якщо не зазначено, використовувались двосторонні t-тести Стьюдента. В іншому випадку використовувались двосторонні парні t-тести, односторонні ANOVA повторних заходів або двосторонні ANOVA повторних заходів, коли це було доречно та як зазначено. ANOVA супроводжувались t-тестами для порівняння post hoc. Результати вважалися значущими при альфа-значенні р <0.05 або при альфа-коефіцієнті, визначеному корекцією коефіцієнта хибного виявлення Беджаміні-Хохберга (FDR), де це доречно.

Внески автора

DMF, KD, TJO, MS, AK, IPSGRVAA, MR, KDH та AVK розробляли експерименти. DMF, KD, TJO, MS та AVK проводили та аналізували поведінкові експерименти. IP проводив вестерн-блот-експерименти. DMF та AVK виконували та аналізували електрофізіологічні дані in vivo. DMF, J.-SL, JG та AVK проводили та аналізували експерименти з мікро-ПЕТ. DMF, KD, TJO та AVK написали рукопис. Усі автори обговорили результати та прокоментували рукопис.

Подяки

Ця робота була підтримана Інтрамуральною дослідницькою програмою NIH, Національним інститутом діабету та травних та ниркових захворювань (NIDDK). Ми хотіли би подякувати ядра метаболізму миші в NIDDK за оцінку сироваткових метаболітів і гормонів, Андресу Буонанно за його допомогу в розробці експериментів з мікродіалізу дофаміну, а також д-р Джудіт Уолтерс, доктор Крістін Дюпре та доктор Клер Делавіл за допомогу в ВЕРХ аналіз вмісту тканини дофаміну. Ми також хотіли б подякувати доктору Скотту Янг за використання його лабораторного обладнання та допомогу в проведенні обов'язкових досліджень. Дякуємо також членам лабораторії AVK Марку Рейтману та Ніку Рибі за вклад у експериментальне проектування та уважне читання рукопису.

Додаткова інформація

Документ S1. Додаткові експериментальні процедури та цифри S1 – S5.

Довідка з файлами PDF

Опції

Документ S2. Стаття плюс додаткова інформація.

Довідка з файлами PDF

Опції

посилання

Адамс та ін., 2015
В. К. Адамс, Дж. Л. Суссман, С. Каур, А. М. Дзуза, Т. Дж. Кіффер, Каліфорнія, Вінстанлі
Довготривале, обмежене калорійністю дієта з високим вмістом жиру у щурів зменшує контроль імпульсів та вентральну смугасту передачу D2 рецепторів - два маркери вразливості залежності
Євро. J. Neurosci., 42 (2015), с. 3095 – 3104
CrossRef

Швидкі посилання