Рецептори дофаміну D2 у вигляді наркоманії, подібної до дисфункції винагороди та компульсивного прийому їжі у щурів, що страждають ожирінням (2010)

Коментар: Це дослідження демонструє, що коли тварині надається необмежений доступ, сильний природний підкріплювач (дуже стимулююча їжа) може спричинити зниження рецепторів D2. Цей спад спостерігався майже у всіх щурів і відбувся досить швидко. Коли видаляли «дуже смачну» їжу, щури відмовлялися їсти звичайну чау. Щури продовжували пиятати (коли могли), незважаючи на поєднання ударів електричним струмом з «дуже смачним» споживанням їжі.

• Повне дослідження

Nat Neurosci. 2010 травень; 13(5): 635-641. Опубліковано онлайн 2010 березня 28. doi:  10.1038 / nn.2519

абстрактний

Ми виявили, що розвиток ожиріння поєднувалося з появою поступово погіршується дефіциту нервової відповіді. Подібні зміни в гомеостазі винагороди, індукованому кокаїном або героїном, вважаються вирішальними у справі переходу від випадкового до компульсивного вживання наркотиків. Відповідно, ми виявили компульсивно-подібну поведінку у щурів, що страждають ожирінням, але не на пісних, виміряних як споживання їжі, що було приємним, яке було стійким до порушення аверсивним умовним стимулом. Стриатальние рецептори дофамінових D2 (D2Rs) знижувалися в організмі щурів, що страждають ожирінням, як повідомлялося у людей, які вживали наркотики. Крім того, опосередкований лентивірусом нокдаун стриарних D2R швидко прискорює розвиток дефіциту винагороди, подібного до винагороди, та настання компульсивного харчування, що шукає у щурів з розширеним доступом до смачної їжі з високим вмістом жирів. Ці дані демонструють, що надмірне споживання смачної їжі викликає нейроадаптивні реакції, схожі на наркоманію, в схемах винагороди мозку і стимулює розвиток компульсивного харчування. Тому загальні гедонічні механізми можуть бути основою для ожиріння і наркоманії.

Вступ

На годування впливають задоволення та винагорода, а отримання харчової винагороди може сильно мотивувати споживання1, 2. Проте гедонічні механізми, що сприяють ожирінню, залишаються недостатньо вивченими. У гіперфагічних людей із вродженим дефіцитом лептину активність у спинному та черевному смугастому тілі, які є основними компонентами схем нагородження мозку, помітно зростає у відповідь на зображення їжі3, а замісна терапія лептином послаблює як стриатичну активність, так і `` симпатію '' до їжі3 . Це свідчить про те, що стриатум важливий у гедоністичних аспектах харчової поведінки. Нещодавно було показано, що активація стриатуму у відповідь на дуже смачну їжу притупляється у людей із ожирінням у порівнянні з худими контролями4. Більше того, гіпофункція дорсального стриатуму та тривале збільшення ваги найбільш виражені у осіб з алелем TaqIA в локусі гена DRD2 – ANKK1, що призводить до зниження експресії D2R в смужках і, як було доведено, схиляє людей до розладів залежності від речовин4, 5 Ці та подібні спостереження призвели до думки, що дефіцит в обробці винагород може бути важливим фактором ризику для розвитку ожиріння, і що люди з ожирінням можуть примусово споживати смачну їжу, щоб компенсувати гіпочутливість до винагороди6. Примітно, що незрозуміло, чи є дефіцит в обробці винагород складовим і передує ожирінню, чи надмірне споживання смачної їжі може спричинити дисфункцію винагороди і, таким чином, сприяти ожирінню, спричиненому дієтою.

Визначальною характеристикою осіб з надмірною вагою і ожирінням є те, що вони продовжують переїдати, незважаючи на добре відомі негативні наслідки для здоров'я та соціальні наслідки. Дійсно, багато людей з надлишковою вагою висловлюють бажання обмежити своє споживання їжі, але все одно борються за контроль над їх споживанням і неодноразово споживають за межами своїх енергетичних потреб7, 8. Розвиток харчової поведінки, нечутливий до негативного результату, аналогічно компульсивному прийому наркотиків, який спостерігається у наркоманів людини, що також є непроникним для негативних наслідків. Тут ми досліджували вплив розширеного доступу до смачної дієти з високим вмістом жирів на чутливість систем нагородження мозку у щурів. Ми також досліджували зв'язок між дієдонабудованою гедонічною дисрегуляцією і появою компульсивного пошуку їжі. Нарешті, ми досліджували роль стриарних D9R в цих поведінкових реакціях, подібних до залежності.

Наркотичні подібні дефіцити винагороди у щурів, що страждають ожирінням

Щоб перевірити ефекти обмеженого або розширеного доступу до смачної дієти з високим вмістом жиру, ми підготували самців щурів Wistar (300-350 г) з біполярним стимулюючим електродом у бічному гіпоталамусі та тренували їх протягом 10–14 днів у дискретному дослідженні. поточно-порогова процедура винагороди мозку (BSR) до встановлення стабільних порогів винагороди4. У процедурі BSR щури енергійно реагують на отримання винагороджувальної електричної самостимуляції через постійний стимулюючий електрод з мінімальною інтенсивністю стимуляції, яка підтримує поведінку самостимуляції, що називається порогом винагороди10. Оскільки пороги винагороди залишаються стабільними та незмінними протягом тривалого часу за базових умов, ця процедура забезпечує чутливий показник реагування систем винагороди мозку. Після встановлення стабільних порогових значень BSR (визначених як <10% варіації порогових значень протягом трьох послідовних сеансів), ми розподілили щурів на три групи, які не виявили різниці середньої ваги тіла або порогів винагороди між групами. Трьом групам було надано різний доступ до дієти в стилі "кафетерій", що складається з смачної енергетично щільної їжі, доступної для споживання людиною (див. Інтернет-методи). Щури мали 0 год (щури лише з чау; n = 9), 1 год (щури з обмеженим доступом; n = 11) або 18-23 год (щури з розширеним доступом; n = 11) доступ до дієти на день протягом 40 днів поспіль. Відомо, що дієта в кафетеріях призводить до ожиріння щурів, спричиненого дієтою11. Усі щури також мали вільний доступ до стандартної лабораторної чау-їжі, з пороговими значеннями винагороди, збільшенням маси тіла та споживанням калорій.

Вага помітно збільшувався у щурів з розширеним доступом до дієти в кафетерії порівняно з групами, які отримували тільки чау-чау або з обмеженим доступом (рис. 1a). Вага також мав тенденцію до збільшення у щурів з обмеженим доступом порівняно з щурами тільки з чау, але цей ефект не досягав статистичної значущості. Розвиток ожиріння у щурів з розширеним доступом тісно пов'язано з погіршенням дефіциту функції винагороди головного мозку, що виражається в поступово підвищених порогах BSR (рис. 1b). Оскільки в трьох групах не спостерігалося розбіжностей у затримках відповіді для BSR (додатковий рис. 1), дефіцит в поведінковій характеристиці не може пояснити це спостереження. Аналогічні дефіцити в функції винагороди мозку були зареєстровані у щурів з поширеним, але не обмеженим доступом до внутрішньовенного кокаїну або героїну, що самостійно призначається 12, 13, 14. Таким чином, розширений доступ до смачної їжі з високим вмістом жирів може викликати дефіцит, подібний до залежності, як функція винагороди мозку, що вважається важливим джерелом мотивації, що може призвести до переїдання і сприяти розвитку ожиріння1, 6.

Фігура 1: Збільшення ваги і дисфункція винагороди у щурів з розширеним доступом до дієти кафетерію.

(a) Середній (± sem) приріст ваги у щурів, що мають лише чау, обмежений доступ та розширений доступ (взаємодія доз × день: F39,702 7.9 = 0.0001, P <0.05; * P <78,1092 у порівнянні з групою, яка приймає лише чау, post hoc тест). (b) Середня (± sem) процентна зміна від базових порогових значень винагороди (взаємодія × час взаємодії: F1.7 = 0.0005, P <0.05; * P <XNUMX у порівнянні з групою лише для чау, пост hoc тест).

Коли ми детально вивчили поведінку їжі (рис. 2), ми виявили, що загальний добовий прийом калорій був подібним між щурами лише для чау та обмеженим доступом (рис. 2a, d). На відміну від цього, загальний калорійний прийом у щурів з розширеним доступом був майже вдвічі більшим, ніж у щурів з обмеженим доступом і тільки чоу-чау (рис. 2a, d). Хоча щури з обмеженим доступом і тільки чоу-чау підтримували приблизно однакову добову калорійність (рис. 2a, d), щури з обмеженим доступом отримували лише ~ 33% від їх щоденних калорій з чау (рис. 2b, d), що вказує на те, що вони розвивали поведінку, подібну до переїдання, і споживали ~ 66% від їх щоденного калорійності під час сеансу доступу до 1 до дієтичного ресторану15 (рис. 2d). Щури з розширеним доступом отримували лише невелику частку (~ 5%) від їх загального калорійного споживання з чау (рис. 2b); вони споживали дієту їдальні майже виключно (рис. 2d). Зміна переваги в харчових продуктах у групах з обмеженим та розширеним доступом також відображається у помітному збільшенні споживання жирів порівняно з щурами, які отримували тільки чау-чау (рис. 2c та додатковий рис. 2). У відповідності з попередніми повідомленнями16, спостерігалася тенденція до споживання їжі в кафетерії, щоб зменшитися з плином часу у щурів з розширеним доступом. Це може відображати розвиток толерантності до смакових якостей харчових продуктів, що надаються як частина дієти в їдальні з плином часу. Тим не менш, перевага для дієти в їдальні порівняно зі стандартною чау залишалося постійно високим у цих щурів (додатковий рис. 3). Ці дані свідчать про те, що розширений, але не обмежений доступ до смачної дієти з високим вмістом жирів викликає дефіцит винагороди, подібний до залежності, переїдання і втрата гомеостатичного енергетичного балансу. Навпаки, обмежений доступ до смачної їжі призводить до випивання, але не порушує гомеостатичний енергетичний баланс і функцію винагороди мозку. Однак, можливо, що обмежений доступ до дієти в кафетерії протягом більш ніж 40 послідовних днів призведе до значного збільшення ваги і порушення функції винагороди мозку.

Фігура 2: Моделі споживання у щурів з розширеним доступом до їдальні кафетерію.

(a) Середнє (± sem) добове споживання калорій у щурів, що мають лише чау, обмежений доступ та розширений доступ (доступ: F1,324 = 100.6, P <0.0001; час: F18,324 = 7.8, P <0.0001; доступ × взаємодія за часом: F18,324 = 4.6, P <0.0001; * P <0.05 у порівнянні з групою, яка використовує лише чау, пост hoc тест). (b) Середнє добове споживання калорій (± sem) від чау (доступ: F2,504 = 349.1, P <0.0001; час: F18,504 = 5.9, P <0.0001; доступ × час взаємодії: F36,504 = 3.52, P <0.0001; * P <0.05 у порівнянні з групою, що приймає лише чау, пост-спеціальний тест). (c) Середнє добове споживання калорій (± sem) з жиром (доступ: F2,486 = 118.7, P <0.0001; час: F18,486 = 8.8, P <0.0001; доступ × час взаємодії: F36,486 = 6.2, P <0.0001; * P <0.05 у порівнянні з групою, що приймає лише чау, пост-спеціальний тест). (d) Порівняння середнього (± sem) загального споживання калорій та споживаних калорій виключно від чау протягом усього 40-денного періоду доступу (доступ: F2,54 = 25.0, P <0.0001; джерело калорій: F2,54 = 1235.2, P <0.0001; доступ × взаємодія джерел калорій: F2,54 = 485.7, P <0.0001; *** P <0.001 порівняно із загальною кількістю калорій у групі, що містить лише чау, ### P <0.001 порівняно із загальною калорією в та ж група щурів, post hoc тест).

Через 40 днів щурам більше не дозволяли отримати доступ до смачної дієти, але вони продовжували мати доступ до стандартних лабораторних чау. Ми оцінювали пороги винагороди та споживання чау щодня протягом цього примусового періоду «утримання». Підвищення порогів винагороди зберігалося протягом щонайменше 2 тижнів у щурів з розширеним доступом, коли вони більше не мали доступу до смачної дієти (рис. 3а). Це контрастує із відносно тимчасовим (~ 48 год) дефіцитом функції винагороди, про який повідомляють у щурів, які утримуються від самоконтролю кокаїну13. Також спостерігалося помітне зменшення споживання калорій (рис. 3b) та поступове зменшення маси тіла (рис. 3c) у щурів з пролонгованим доступом, і в меншій мірі у щурів з обмеженим доступом, протягом цього періоду утримання, відповідно до попередні звіти11, 15. Після 14 днів утримання щурів вбивали, а розташування електродів визначали фарбуванням крезилфіолетовим (рис. 3d).

Фігура 3: Постійна винагорода дисфункція і гіпофагія під час абстиненції у щурів з розширеним доступом до їдальні кафетерію.

(a) Середній відсоток зміни від базових порогових значень винагороди (± sem) під час утримання від смачної дієти з високим вмістом жиру (доступ: F2,112 = 3.7, P <0.05; час: F4,112 = 2.3, P> 0.05; * P <0.05 у порівнянні з групою, що приймає лише чау, пост-hoc тест) (b) Середнє споживання калорій (± sem) в останній день доступу до дієти з високим вмістом жиру (базовий рівень) та протягом 14 днів утримання, коли була доступна лише стандартна чау (доступ: F2,168 = 41.7, P <0.0001 ; час: F6,168 = 65.6, P <0.0001; доступ × взаємодія часу: F12,168 = 38.3, P <0.0001; * P <0.05 у порівнянні з групою лише для чау, пост-hoc тест). (c) Зміна середньої маси тіла (± sem) порівняно з масою тіла в останній день доступу до дієти з високим вмістом жиру (базовий рівень) та протягом 14 днів утримання, коли була доступна лише стандартна чау (доступ: F1,126 = 37.2, P <0.0001; час: F7,126 = 3.1, P <0.01; взаємодія × час взаємодії: F7,126 = 40.9, P <0.0001; * P <0.05 у порівнянні з групою лише для чау, пост-hoc тест). (d) Гістологічна реконструкція розташування стимулюючих BSR електродів у бічному гіпоталамусі лише для чау (трикутники), обмеженого доступу (квадрати) та розширеного доступу (кола) щурів.

Striatal D2Rs у щурів, що страждають ожирінням: роль у дефіциті винагороди

Далі ми перевірили гіпотезу про те, що надмірне споживання смачної дієти в їдальні може зменшити щільність смугастого D2R, сприяючи розвитку гіпочутливості до винагороди, подібної до залежності. Новій когорті щурів з обмеженим доступом та обмеженим доступом дозволявся доступ до дієти їдальні до тих пір, поки не спостерігалося статистично значущого збільшення маси тіла у щурів з розширеним доступом порівняно з групою, що використовувала лише чау (Р <0.05 ; Рис. 4а). Стриатальна експресія, як повідомляється, сильно глікозильованої (~ 70 кДа) мембранної форми D2R була нижчою у щурів з розширеним доступом, ніж у щурів з обмеженим доступом або лише з чау (Рис. 4b; див. Інтернет-методи). Коли ми розділили щурів у кожній групі доступу на дві підгрупи на основі медіанного розбиття маси тіла (легкої або важкої), ми виявили чіткий зворотний зв'язок між вагою тіла та експресією D2R в смугах (рис. 4а, в). Ми не виявили статистично значущого зниження експресії незгликозильованих незрілих (~ 39 кДа) та проміжно глікозильованих цитоплазматичних (~ 51 кДа) форм D2R (Додаткова рис. регулюється за допомогою посттранскрипційних механізмів.

Рисунок 4: Приріст ваги обернено пов'язаний зі стриатичними рівнями D2R.

(a) Пацюки, що мали лише чау, обмежений доступ та розширений доступ, були розділені на дві групи за умовами доступу на основі середнього розподілу ваги тіла: легкого (L) або важкого (H). (b) Весь смугастий комплекс був зібраний у всіх щурів та рівні D2R у кожній групі, виміряні вестерн-блот. Мембранно-асоційована смуга D2R розщеплюється при 70 кДа, а контроль завантаження білка відображається нижче (β-актин, 43 кДа). Імуноблоти повної довжини показані на додатковому малюнку 12. (c) Відносні кількості D2R у смугастому щурі, що мають лише чау, обмежений доступ та розширений доступ, визначаються за допомогою денситометрії (F2,6 = 5.2, Р <0.05, основна ефект доступу; * P <0.05 та ** P <0.01 порівняно з групою лише для чау-L).

Далі, щоб перевірити функціональну значимість дієто-індукованого скорочення стриарної D2R на функцію винагороди мозку, ми розробили і підтвердили лентивирусний вектор, щоб доставити коротку шпильку, що заважає РНК (shRNA), щоб збити D2R (Lenti-D2Rsh; рис. 5 і додатковий рис. 5). Пороги винагороди почали збільшуватися у щурів, які отримували Lenti-D2Rsh майже відразу після того, як був дозволений розширений доступ до дієти кафетерію, тоді як пороги винагороди залишалися незмінними у щурів з розширеним доступом, оброблених порожнім лентивирусним вектором (Lenti-контроль) протягом порівняно короткого періоду доступу до дієти в кафетерії (14 d; рис. 6a). Затримки відповіді були незміненими в обох групах щурів, що свідчить про те, що цей ефект не був вторинним по відношенню до дефіцитів у виконанні завдань (додатковий рис. 6). Пороги винагороди також не змінювалися у щурів, які отримували Lenti-D2Rsh або Lenti-контроль, які мали доступ до чау тільки протягом такого ж періоду (рис. 6b).

Пороги залишалися постійно підвищеними під час додаткової абстиненції 15d, коли всі щури мали доступ тільки до стандартної чау (додатковий рис. 7). Отже, нокдара стриарної D2R збільшила вразливість до дієво-індукованої нагороди гіпофункції, але не змінила базову активність систем нагородження мозку.

Малюнок 5: Лентивірус-опосередкований нокдаун експресії стриатального D2R.

(а) Графічне зображення смугових областей, в яких Lenti-D2Rsh був надмірно виражений. Зелені кола в лівій смугастій півкулі представляють місця, на які були націлені вірусні інфузії. Зелене фарбування в правій смугастій півкулі є репрезентативним імунохімічним фарбуванням зеленого флуоресцентного білка (GFP) з мозку щура Lenti-D2Rsh. (b) Репрезентативний імуноблот зниженої експресії D2R у смугастому щурі Lenti-D2Rsh. Імуноблоти повної довжини показані на додатковому малюнку 13. (c) Відносні кількості D2R у смугастому щурі Lenti-control та Lenti-D2Rsh, кількісно визначені за допомогою денситометрії (* P <0.05 порівняно з групою Lenti-control, post hoc тест ). (d) Зараження гліальних клітин у смугастому тілі вектором Lenti-D2Rsh не виявлено. Зелене фарбування - це GFP від ​​вірусу; червоний - маркер астроцитів гліальний фібрилярний кислий білок (GFAP); ядра клітин виділені DAPI фарбуванням у синій колір. Білі стрілки позначають локалізовану ділянку гліозу, виявлену лише в місці ін’єкції вірусу в смугастому тілі, а не в навколишніх тканинах, в які вірус дифундував. Навіть у цій області жоден з астроцитів не є GFP-позитивним. Жовті стрілки на збільшеному зображенні виділяють типові виявлені GFP-негативні астроцити. (е) Високий рівень нейрональної інфекції в смугастому тілі за допомогою вектора Lenti-D2Rsh. Зелене фарбування - це GFP від ​​вірусу; червоний - ядерний маркер нейронів NeuN; ядра клітин виділені DAPI фарбуванням у синій колір. Жовті стрілки на збільшеному зображенні виділяють GFP-позитивні та NeuN-позитивні нейрони в смугастому тілі. (f) Збільшене зображення вірусно інфікованого (GFP-позитивного) нейрона в смугастому щурі Lenti-D2Rsh, що показує типові морфологічні особливості нейронів середнього колючого середовища.

Рисунок 6: Нокдаун стриатального D2R підвищує вразливість для винагороди дисфункції у щурів з розширеним доступом до дієти в кафетерії.

(a) Середня (± sem) процентна зміна від вихідних порогових значень винагороди у щурів Lenti-control та Lenti-D2Rsh, які мали розширений доступ до дієти їдальні протягом 14 днів поспіль (вірус: F1,156 = 5.9, P <0.05; час: F13,156 = 2.2, P <0.05; взаємодія вірусу × час: F13,156 = 2.2, P <0.05; #P <0.05, ефект взаємодії). (b) Середня (± sem) процентна зміна від базового порогу винагороди у щурів Lenti-control та Lenti-D2Rsh, які мали доступ лише для чау. (c) Середнє (± sem) калорійне споживання щурів протягом 14 днів лише чау чи розширеного доступу (доступ: F2,28 = 135.6, *** P <0.0001). (d) Середній (± sem) набір ваги протягом 14 днів лише чау або розширеного доступу (доступ: F2,28 = 96.4, P <0.0001; *** P <0.001, основний ефект доступу).

Ми виявили, що споживання калорій (рис. 6c) і збільшення ваги (рис. 6d) були подібними в Lenti-D2Rsh і відповідних Lenti-контрольних групах в умовах тільки для чоу-або або розширеного доступу (додаткові фігури 8 і 9). Таким чином, стриатальний нокдаун D2R не змінював ні переваги для дієти в кафетерії, ні загальний калорійний прийом, коли смачна їжа була вільно доступна для споживання.

Компульсивний прийом їжі у щурів, що страждають ожирінням: роль стриральної D2R

Далі ми перевірили гіпотезу про те, що компульсивне харчування може з’являтися у щурів з розширеним доступом до дієти кафетерію та що дефіцит передачі сигналів D2R у смужку може сприяти цьому ефекту. Новій когорті щурів лише з чау, обмеженого доступу та розширеного доступу було дозволено отримати доступ до дієти їдальні протягом> 40 днів до тих пір, поки у розширених щурів не відбулося статистично значущого збільшення ваги (Р <0.05 порівняно з щурами, що мали лише чау; дані не показано). Потім усім трьом групам щурів було дозволено лише 30 хв доступу на день до дієти їдальні протягом 5–7 днів в оперантній камері, поки не було досягнуто стабільне споживання (визначається як <10% варіація щоденного споживання). Потім щури в кожному стані доступу були піддані впливу світла (умовного подразника) у парі з ударами стопи (карана група), тоді як решта щурів у кожній групі були піддані дії світлового сигналу за відсутності удару стопи (безкарна група ). У день тестування ми дослідили вплив лише впливу світлового сигналу на смачне споживання їжі (рис. 7; див. Інтернет-методи). Ми виявили, що середнє споживання калорій протягом 30-хвилинних базових сеансів було вищим у щурів, що мали лише чау та обмежений доступ, ніж у щурів з розширеним доступом (рис. 7а, б). Це свідчить про те, що щури, що мали лише чау та обмежений доступ, перепивались смачною їжею під час періодичних 30-хвилинних сеансів доступу, що відображається в тому, що ці щури споживали ~ 40-50% щоденного споживання калорій, як правило, ~ 100 ккал, під час цих сеансів (рис. 7а, б). Навпаки, щури з пролонгованим доступом здаються стійкими до розвитку такої поведінки, схожої на п’янку, можливо, тому, що їх історія майже необмеженого доступу до смачної їжі протягом> 40 днів поспіль встановила схеми харчування, які були відносно негнучкими до змін. У день випробування ми не спостерігали статистично значущих наслідків відтворення світлового сигналу на споживання їжі у непокараних щурів із груп, що мали лише чау, обмежений доступ або розширений доступ, порівняно з прийомом протягом базового періоду (рис. 7а). Отже, світло-сигналізація, отже, не мало мотиваційного характеру. У покараних щурів ударне світло битка значно зменшило споживане смаку їжі у щурів, що мали лише чау та обмежений доступ. Однак світло-реплика не впливало на смачне споживання їжі у щурів з розширеним доступом, показуючи, що їх споживання було нечутливим до неприємних екологічних сигналів, що передбачають біду. Базове споживання енергії у щурів з розширеним доступом було нижчим, ніж у інших групах. Однак, оскільки споживання чау протягом подібних періодів часу було набагато нижчим (рис. 7г), навряд чи це представляє "ефект підлоги", який заважає нашим висновкам. Наші дані разом підтримують ідею про те, що компульсивно-подібна харчова поведінка може виникнути у щурів з розширеним доступом аналогічно примусовому прийманню кокаїну, яке спостерігається у щурів з історією розширеного доступу до наркотику18.

Фігура 7: компульсивна реакція, що відповідає їжі.

(a) Середнє (± sem) смачне споживання дієти у безкарних щурів протягом 30-хвилинних базових сеансів та в день тесту, коли щури піддавались нейтральному умовному подразнику, який раніше не поєднувався зі шкідливим ударом стопи (доступ: F2,20 = 5.2, P <0.05; #P <0.05 у порівнянні з щурами, що містять лише чау). (b) Середнє (± sem) смачне споживання дієти у покараних щурів протягом 30-хвилинних базових сеансів та в день тесту, коли щури піддавались умовному подразнику, який раніше поєднувався зі шкідливим шоком ніг (доступ: F2,21 = 3.9 , P <0.05; кий: F1,21 = 8.6, P <0.01; взаємодія × кий: F2,21 = 4.7, P <0.05; * P <0.05 порівняно з прийомом протягом базового сеансу, #P <0.05 порівняно з щури лише з чау). (c) Середнє (± sem) смачне споживання дієти під час 30-хвилинних базових сеансів та в день тесту у щурів Lenti-control та Lenti-D2Rsh, які раніше мали лише чау чи розширений доступ до дієти в їдальні (репліка: F1,26, 29.7 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <30 у порівнянні з прийомом під час базових сеансів, post hoc тест). (d) Середнє (± sem) споживання чау під час 2-хвилинних базових сеансів та в день тесту у щурів Lenti-control та Lenti-D1,26Rsh, які раніше мали лише чау або розширений доступ до дієти в їдальні (кий: F44.9 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <XNUMX порівняно з прийомом під час базових сеансів, post hoc тест).

Нарешті, ми дослідили вплив спареного за покарання умовного стимулу на споживання їжі у щурів Lenti-control та Lenti-D2Rsh, які раніше мали доступ лише до чау або розширений доступ до дієти кафетерію (щури з рис. 6). Ми виявили, що базове смачне споживання їжі протягом 30-хвилинних базових сеансів було настільки ж високим (~ 40 кКал) у всіх чотирьох групах (рис. 7в). Крім того, загальне добове споживання чау (у домашній клітці) було однаковим між усіма чотирма групами щурів під час сеансів кондиціонування та в день тесту (Додаткова Рис. 10). Таким чином, 14 днів попереднього доступу до дієти в їдальні було недостатньо, щоб заблокувати поведінку, схожу на випивку, подібною до тієї, що спостерігається у щурів, які мали> 40 днів розширеного доступу до дієти в їдальні (рис. 7а, б). Аверсивний світловий стимул порушив смачне споживання їжі у щурів Lenti-control та Lenti-D2Rsh, які раніше мали доступ лише для чау (рис. 7в). Подібним чином, аверсивний умовний подразник порушив смачне споживання їжі у щурів, що контролювали Ленти, які раніше мали 14 днів розширеного доступу до дієти в їдальні. На відміну від цього, аверсивний умовний стимул не впливав на смачне споживання їжі у щурів Lenti-D2Rsh, які раніше мали 14 днів розширеного доступу до дієти в їдальні (рис. 7в). Порогові показники BSR залишались значно підвищеними у цих щурів, коли їх реєстрували через 48 год після сеансу випробувань, тоді як пороги залишались стабільними та незмінними в інших трьох групах щурів

(Додатковий рис. 11). Щоб переконатися, що стійкість до умовного стимулювання-індукованого придушення смачного споживання їжі у щурів Lenti-D2Rsh не була вторинною по відношенню до порушень в класичних процесах кондиціонування, ми перевірили вплив аверсивного умовного стимулу на споживання менш смачного стандартного чау-чау всі чотири групи щурів. На відміну від прийому їжі, подібної до випивання, ми виявили, що всі чотири групи щурів споживали маленьку чау (~ 2 kCal) під час сеансу 30 min (рис. 7d) і що споживання чау у всіх чотирьох групах було порушено подібної величини при впливі аверсивного умовного стимулу (рис. 7d). Ці дані показують, що нокдаун стриарних D2R помітно прискорив появу компульсивного споживання їжі з привабливою їжею, але тільки у щурів з історією розширеного доступу. Більше того, оскільки компульсивне харчування було виявлено тільки у щурів Lenti-D2Rsh, які мали підвищені пороги BSR, гіпофункція винагороди, пов'язаної з дієтою, може бути необхідною передумовою для появи компульсивного пошуку їжі.

Обговорення

Простота доступу до смачної їжі з високим вмістом жирів вважається важливим фактором екологічного ризику для ожиріння19. Ми виявили, що розширений доступ до дуже смачної їжі в стилі кафетерію призвів до переїдання і збільшення ваги в поєднанні з поступовим підвищенням порогів BSR у щурів. Цей вплив на пороги BSR можна пояснити поступовим зменшенням чутливості схем винагороди головного мозку, інтерпретація якого відповідає тому, що обмеження харчових продуктів і втрата ваги можуть збільшуватися, тоді як гостре перегодовування може тимчасово зменшуватися, відповідно, для BSR у щурів. Цей висновок є продовженням роботи, що показує, що гостре перегодовування щурів через внутрішньошлункове введення трубки20, розтяг шлунка або внутрішньовенне вливання глюкагону, що імітує постпрандіальний satiety21, 21, 22, зменшує реакцію на користь бічних гіпоталамічних BSR стимулювання23. Попередня робота також показала, що неодноразово примусово годувати щурів через внутрішньошлункові пробірки, поки їх вага не збільшиться на ~ 24 g, аналогічно знижує показники відповіді на BSR, ефект, який зберігається до тих пір, поки маса тіла не нормалізується. Як і у цих висновків у щурів, відповідь у кішок на бічну гіпоталамічну BSR інгібувалася попереднім харчуванням satiation25, що показує, що взаємодії між функцією винагороди мозку і метаболічним станом зберігаються і, таким чином, ймовірно, відбуваються і у людей. Легкий доступ і, як наслідок, переїдання дієт у стилі їдальні у людей вважається важливим фактором впливу на навколишнє середовище в епідемії ожиріння в західних суспільствах200. Наші дані показують, що винагорода гіпофункції виникає у щурів, які вочевидь переїдуть смачну їжу їдальні, схожу на ту, яку споживають люди, і що цей ефект стає все гірше, оскільки вони набувають більшу вагу. Примітно, що всі щури з підвищеними граничними величинами ≥23% мали BSR-електроди, розташовані в межах ~ 26 мкм форекса дорзолотерально. Чутливість пов'язаних з винагородою нейронів у цій області збільшується обмеженням їжі таким чином, що є чутливим до гормону лептину, отриманого з жиру, і ця область мозку вважається важливим субстратом для харчової винагороди19. Таким чином, мозкові ланцюги, які регулюють харчові гедоніки, інгібуються постінтестивальними сигналами, які передбачають ситості, що відповідає недавнім дослідженням людини, які показують, що розтяг шлунка20 і пептид YY500-27 (PYY) 28 модулюють активність областей мозку залучення до обробки винагороди. Крім того, системи винагороди також пригнічуються надмірним збільшенням ваги. Останні повідомлення свідчать про те, що циркулюючий лептин, ключовий регулятор енергетичного балансу, може проникати в тканини мозку і пригнічувати активність схем винагороди3, 36, 29, 3.

Дефіцит винагороди у щурів із надмірною вагою може відображати протилежне зниження базової чутливості схем нагородження мозку, щоб протистояти їх надмірному стимулюванню смачною їжею. Така гіпофункція винагороди, спричинена дієтою, може сприяти розвитку ожиріння, збільшуючи мотивацію споживати дієтогенні дієти з високою винагородою, щоб уникнути або полегшити цей стан негативної винагороди6, 32. Це може пояснювати гіпофагію, яку ми спостерігали при розширеному доступі щурів і в меншій мірі у щурів з обмеженим доступом, коли смачна їжа була вилучена і доступна була лише менш смачна чау. Подібний сценарій також узгоджується з даними досліджень зображень людського мозку, в яких притуплена активація смугастого тіла у відповідь на дуже смачну їжу, особливо у осіб з генетичним поліморфізмом, які, як вважається, зменшує експресію D2R в смугах, пов'язана з довгостроковим збільшенням ваги4. Неясно, чи така гіпочутливість винагороди у людей із ожирінням проявляється до розвитку ожиріння і пов’язана виключно з генетичними факторами („синдром дефіциту винагороди“), чи переїдання може спричинити порушення в обробці винагороди. Наші дані демонструють, що розширений доступ до смачної високоенергетичної їжі та подальше переїдання тупих винагороджує чутливість і, отже, може представляти важливий гедоністичний механізм, який сприяє розвитку ожиріння. Подібна дисфункція винагороди, яка повідомляється тут у ожирілих щурів, також виявляється у щурів з історією розширеного доступу до внутрішньовенного введення кокаїну або героїну, але не у тих, хто в анамнезі має обмежений доступ12, 13, 14. Більше того, перехід від випадковий до компульсивного пошуку наркотиків був запропонований результатом спроби полегшити стійкий стан зниженої винагороди, спричиненої цією наркотичною дисфункцією винагороди12, 32, 33. Таким чином, наші дані вказують на те, що ожиріння та наркоманія можуть мати спільні гедонічні механізми.

Зниження експресії стриарної D2R є помітною нейроадаптивною реакцією на надмірне споживання смачної їжі. Дійсно, зниження щільності стриарних D2R спостерігається у індивідуумів з надмірною вагою4, 34 і гризунів35, 36. І навпаки, у людей з нервовою анорексією підвищена стриарная D2R37, а втрата ваги при ожиріннях після баріатричної (шлункового шунтування) операції пов'язана з підвищеною щільною щільністю D2R28. Поліморфізм генів, який називають алелем TaqIA A1, призводить до зниження щільності стриарних D2R, і особи, які містять цей алель, надмірно представлені в популяціях із ожирінням4. Алель TaqIA також підвищує вразливість до алкоголю, опіоїдних та психомоторних стимуляторів. Зменшення щільності стриарної D38R, що відбувається або через конститутивні генетичні фактори, або як наслідок переїдання, може, таким чином, сприяти нейробіологічним механізмам ожиріння. Ми виявили, що стриатальні рівні ізоформи ксу 2 D70R, які, як вважають, відображають мембранно-асоційований D2R, були зворотно пов'язані з масою тіла у щурів з груп тільки з чоу, обмеженим доступом і розширеним доступом (рис. 2). Нарушення експресії стриарної D4R, найбільш помітно в дорсолатеральній стриатумі (рис. 2), призводило до збільшення порогів BSR майже відразу після впливу дієти кафетерію. Зниження експресії стриарної D5R, таким чином, стрімко прискорило виникнення нагороди гіпофункції у щурів з розширеним доступом до дуже смачної їжі, що відповідає даним візуалізації людського мозку, що вказує на те, що дефіцит в стриарній щільності D2R сприяє нагороді гіпофункції у людей з ожирінням2.

Три особливості щурів Lenti-D2Rsh також заслуговують на увагу. По-перше, хоча нокдаун стритарій D2R у поєднанні з розширеним доступом до смачної дієти призводив до підвищення порогів BSR, не було відмінностей у споживанні калорій або збільшенні ваги у цих щурів порівняно з контрольними щурами. Це може відображати той факт, що щури мали 14 d доступу до дієти в їдальні; більш тривалий період доступу може призвести до збільшення ваги з часом, подібно до більшої сприйнятливості до збільшення ваги, що спостерігається у людей з дефіцитом у стрианальному сигналізі D2R4. Однак перевагою обмеження доступу до дієти в їдальні тільки 14 є те, що нокдаун щури з розширеним доступом були єдиною групою, яка показала підвищені пороги BSR, і це дозволило оцінити потенційну роль нагороди гіпофункції у розвитку компульсивного \ t їжі (див. нижче). По-друге, пороги BSR залишалися стабільними і незміненими в нокдаунських щурах, які мали доступ тільки до чау-чау. Це вказує на те, що зменшена експресія стриарної D2R само по собі не була достатньою для індукції гіпочутливості винагороди; замість цього він, здавалося, взаємодіє з надмірним споживанням смачної їжі для прискорення виникнення цього стану зниженої чутливості винагороди. Інші адаптивні реакції в схемах винагороди мозку можуть, таким чином, викликати підвищену чутливість винагороди у щурів з розширеним доступом до дієти в кафетерії. Маючи це на увазі, відзначимо, що агоніст D2R бромокриптин знижує циркулюючі рівні leptin39, а лептин пригнічує харчування, принаймні частково, інгібуючи смугасті області, які контролюють гедонічні реакції на food3, 30, 31. Таким чином, можливо, що регуляція стриарної D2R у відповідь на збільшення маси тіла збільшує сигналізацію лептину і тим самим підвищує інгібуючу дію цього адипокіну на системи нагородження мозку. Нарешті, зауважимо, що ми націлювали наші лентивірусні вектори на дорсолатеральний стриатум. Це було в першу чергу з технічних причин, оскільки латеральне розміщення канюль для доставки вірусу в стриатум дозволило нам також розмістити гіпоталамічний стимулюючий електрод для визначення порогу BSR. Таким чином, цілком можливо, що націлювання D2R на нокдаун в інших областях стриатуму, особливо дорсомедіальних і вентральних областей (core and shell), може мати підвищені пороги BSR навіть при відсутності смачної дієти.

Дорсолатеральний стриатум значною мірою брав участь у вивченні типу звички з реагуванням на стимул, що відображається у розвитку поведінки, яка не сприймає знецінення шляхом попереднього годування до насичення або поєднання зі шкідливими подразниками40. Орієнтуючись переважно на дорзолатеральний смугастий шар, ми могли б збити популяції D2R, які регулюють вразливість щурів до розвитку подібного до компульсивного харчування. Відповідно до ролі смугових D2R у компульсивній поведінці, алель TaqIA людського локусу гена DRD2 – ANKK1, що призводить до низької щільності смугастого D2R5, притупляє активацію смуг у відповідь на смачну їжу4 та підвищує вразливість до ожиріння4, також дефіцит у навчанні уникати вчинків з негативними наслідками41. Втрата інгібіторного контролю над поведінкою, яка може мати негативний результат, є характерною рисою як ожиріння, так і наркоманії, при якій споживча поведінка зберігається, незважаючи на негативні соціальні наслідки, наслідки для здоров’я чи фінансові наслідки. Поведінка прийому кокаїну у щурів, які в анамнезі широко вживали наркотики, може стати гнучким і стійким до руйнувань за рахунок аверсивного умовного подразника, що передбачає негативний результат (шок стопи) 18. Подібним чином миші, які раніше мали доступ до смачної дієти з високим вмістом жиру, будуть проводити більше часу в неприємному середовищі (яскраво освітленому), щоб отримати смачну їжу, ніж миші, які не мали досвіду з дієтою42. Ми виявили, що смачне споживання їжі у щурів з розширеним доступом до їжі в їдальні було настільки ж нечутливим до аверсивного умовного стимулу. Відповідно до ролі стриатальних D2R у цьому ефекті, компульсивне харчування було виявлено у стриатних D2R щурів, які раніше мали 14 днів розширеного доступу до дієти кафетерію, але не в контрольних групах. З точки зору нейроциркуляції, розширений доступ до смачної їжі може спричинити пластичність в кортикостріальних шляхах, роблячи тим самим тварин більш вразливими до розвитку подібних до компульсивних форм поведінки, а дефіцит смугастого D2R сигналізує про посилення цього процесу. Дійсно, знижена щільність смугастого D2R у осіб із ожирінням корелює зі зниженим метаболізмом в префронтальній та орбітофронтальній кортикальних областях43, які здійснюють інгібуючий контроль над поведінкою44.

Примітно, що компульсивне споживання смачної їжі було виявлено тільки в нокдаунних щурах, які раніше мали розширений доступ до дієти в кафетерії, а не у контрольних щурів, які мали розширений доступ до дієти в їдальні за той же період часу, ані у щурів з нокдауном, які мали доступ лише до хова. Основною відмінністю між нокдаун-щурами з попереднім розширеним доступом та іншими групами було їх постійно підвищені пороги BSR. Це може відображати загальні нейробіологічні джерела нагороди гіпофункції і виникнення компульсивно-подібного харчування, які є тимчасово збігаються, але незалежні явища. Альтернативно, дієва індукована гіпофункція винагороди може слугувати субстратом для негативного підкріплення, що полегшує розвиток компульсивно-подібної їжі 14, 32, 33. Які б не були основні механізми, наші дані показують, що пристрасність, спричиняюча пристрасність для смачної їжі, може з'явитися у щурів, що страждають ожирінням, і вказують на те, що дефіцит сигналізації стриктурного сигналу D2R підвищує вразливість до розвитку цієї поведінки.

Підсумовуючи, ми виявили, що надмірне стимулювання систем нагородження мозку через надмірне споживання приємної, енергоємної їжі, викликає глибоке стан нагороди, гіпочутливість і розвиток компульсивного харчування. Ці дезадаптивні поведінкові реакції у щурів, що страждають ожирінням, ймовірно, виникають внаслідок дефіциту, викликаного дієтою, при сигналізації стриарної D2R. Надмірне споживання наркотичних засобів аналогічним чином знижує щільність стриарних D2R, індукує глибоке стан гіпофункції винагороди і викликає появу компульсивної поведінки прийому наркотиків. Таким чином, наші висновки підтримують попередній work4, 19, 42, 45, 46, 47, вказуючи на те, що ожиріння і наркоманія можуть виникнути в результаті подібних нейроадаптівних реакцій у схемах винагороди мозку.

Методи

Щури.

Самців щурів лінії Wistar вагою 300 – 350 g на початку експериментів отримували з Charles River. Після прибуття щури розміщувалися індивідуально при постійній температурі на циклі світло-темрява 12-h (підсвічування в 2200 h). Щурам дозволяли ad libitum доступ до стандартної лабораторної чау і води протягом усього експерименту. Всі процедури були схвалені Комітетом Scripps Florida з догляду за тваринами та їх використанням, а щурів лікували відповідно до керівних принципів, встановлених Національними інститутами здоров'я щодо принципів догляду за тваринами.

Хірургічні процедури.

Щурів, підготовлених з стимулюючими BSR електродами, спочатку анестезували шляхом інгаляції ізофлурану 1 – 3% кисню і поміщали в стереотаксичну рамку (Kopf). Біполярні BSR-електроди (11 мм довжиною) імплантували в задній бічний гіпоталамус (переднезадній, -0.5 мм від бергми; медіолатеральний, ± 1.7 мм від середньої лінії; дорсовентральний, 8.3 мм від твердої мозкової оболонки; брусок різця регулювали до 5 мм над межвуральной ) 47. Щурів, які отримували ін'єкції вірусу, також готували двосторонні напрямні канюлі (датчик 23, довжина 14 мм), розташовані над стриатумом (переднезадній, 2.8 мм від брегми; медіолатеральний, ± 3.1 мм від середньої лінії; dorsoventral, -2.4 мм від dura) з стилі 48-мм. Чотири гвинти черепа з нержавіючої сталі і зубний акрил утримували електрод і канюлі на місці. Хірургічну рану обробляли місцевим антибіотиком один раз кожні 14 год для 12 d після операції. Щурам дозволяли 5 – 7 d одужувати після операції і потім тренувалися в пороговій процедурі BSR.

Процедура BSR.

Щури навчали реагувати на стимуляцію BSR згідно з дискретно-пробною поточно-пороговою процедурою, аналогічною описаній в інших місцях10, 14. Коротко, рівні струму BSR змінювалися в чергуванні низхідних і висхідних рядів в кроках 5-μA. У кожному сеансі тестування були представлені чотири чергуються низхідних / висхідних ряди. Поріг для кожної серії визначався як середня точка між двома послідовними інтенсивностями струму, для яких щури відповіли принаймні в трьох з п'яти випробувань, і дві послідовні інтенсивності струму, для яких щури не відповіли у трьох або більше з п'яти випробувань. Загальний поріг сесії визначався як середнє значення порогів для чотирьох окремих серій. Кожна сесія тестування тривала приблизно 30 хв. Стабільні пороги BSR були визначені як ≤10% зміни порогів протягом 5 послідовних днів, як правило, встановлених після навчання 10 – 14 d. Час затримки відповіді для кожного тестового сеансу визначався як середня затримка відповіді всіх випробувань, під час якої сталася позитивна відповідь.

Вірусна упаковка та доставка.

Коротка шпилька РНК доставлялася і конститутивно експресувалась за допомогою векторної системи pRNAT-U6.2 / Lenti (GenScript). Вірусні частинки готували згідно з протоколом виробника. Коротко кажучи, клітини HEK 293FT трансфікували вектором, що містив вставку shRNA (5′-GGATCCCGCGCAGCAGTCGAGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCTCGACTGCTGCGCTTTTTTCCAACTCTCAGAG-3 ′) або порожній вектор, плюс ViraPower Packaging Mix суміш для 72 (hv) (24). Потім супернатант збирали і концентрували ультрацентрифугуванням (76,755 г, ротор Beckman Coulter SW 32 TI, 90 хв, 4 ° C), а титр вірусу визначали шляхом сортування клітин, активованого флуоресценцією, відповідно до інструкцій виробника. Вірус розподілявся та зберігався у захищених від світла коробках при -80 ° C до використання.

Щури зі стабільними порогами BSR отримували дворазові ін'єкції вірусу на трьох ділянках в смугастому тілі кожного півкулі мозку (2 мкл на ін'єкцію, 1 мкл min-1, 1 хв між ін'єкціями, всього шість ін'єкцій на щура). Щурам дозволяли відновлювати принаймні 2 – 3 d після інтрастрітальних ін'єкцій до відновлення порогової оцінки BSR. Щоденну порогову оцінку BSR продовжували протягом 33d після ін'єкції вірусу для забезпечення максимального стрианального нокдауну D2R до того, як дозволити щурам отримати доступ до дієти кафетерію. Не було відмінностей у порогах BSR між щурами Lenti-контроль і Lenti-D2Rsh протягом цих 33 d (дані не показані).

Імуноблотінг.

Щурів умертвляли приблизно через 1 год після регулярного планового доступу до їдальні кафетерію, і мозок швидко видалявся. Розрізи мозку товщини ~ 1 – 2 мм готували з використанням корональної матриці мозку (інтервал зрізів 1-мм; пластмаси One) на блоці льоду і брали пуансони тканин спинного стриатума (bregma: ~ 2.2 до -0.26 мм). Штамповані пуансони швидко збирали, швидко заморожували і зберігали при -80 ° C до використання. Окремі зразки розморожували на льоду, і рівну кількість тканини стриатули об'єднували на основі залежного від ваги медіанного розподілу груп доступу (щури 7 – 10 на пул). Тканину ресуспендували в 500 мкл крижаного буфера RIPA (Thermo Scientific), що містить ортованадат натрію, інгібітори фосфатазного коктейлю 1 і 2 (Sigma-Aldrich), лейпептин і пепстатин перед гомогенізацією. Тканинні лізати кип'ятили протягом 10 хв у буфері для зразків і завантажували на 4% -20% або 10% трис-гліцин SDS гелі (Invitrogen). Білок переносили на нітроцелюлозні мембрани, блокували протягом 1 год при ~ 23-25 ° C (5% нежирного сухого молока і 0.2% Tween-20 в PBS, рН 7.4) і інкубували в первинному антитілі протягом ночі при 4 ° C. Наступні первинні антитіла розбавляли в блочному розчині: мишачий моноклональний D2R (Santa Cruz, 1: 100) або β-актин мишачого моноклонального (Santa Cruz, 1: 200). Хемілюмінесцентний реагент ECL додавали після інкубації з кон'югованими вторинними антитілами з пероксидазою хрону (Amersham, 1: 2,000). Зрілу мембранно-асоційовану форму D2DR (~ 70 kDa) 17, 49 нормалізували на контроль завантаження білка (β-актин; 43 kDa) і кількісно визначали за допомогою денситометрії з використанням програмного забезпечення NIH Image J.

Імунохімічний аналіз.

Щурів анестезировали і транскардировали перфузією з 4% параформальдегідом в PBS (рН 7.6). Мозок видаляли, постфіксували протягом ночі і зберігали в сахарозі (розчин 30% в PBS, рН 7.4) протягом щонайменше 72 год. Заморожені зрізи тканини (товщина 30 мкм) збирали з мікротома і блокували (3% BSA, 5% нормальної сироватки кози і 0.3% Triton X-100 в PBS) для 1 h при ~ 23-25 ° C. Наступні первинні антитіла додавали до розчину блоку і інкубували протягом ночі при 4 ° C: курячий поліклональ до GFP (Abcam, 1: 1,000); моноклональний кролик до GFAP (Millipore, 1: 1,000); мишачого моноклонального NeuN (Millipore, 1: 1,000). Зрізи інкубували з флюоресцентно-барвнико-кон'югованими вторинними антитілами при ~ 23 – 25 ° C: барвник анти-курча – 488-нм (Jackson ImmunoResearch, 1: 1,000), барвник анти-кролячий – 594-нм (Invitrogen, 1: 1,000) ), і барвник anti-mouse – 594-nm (Invitrogen, 1: 1000). Зрізи монтувалися за допомогою монтажних носіїв Vectashield, що містять DAPI (Vector Labs) і охоплювали. Знімки були зроблені за допомогою флуоресцентного мікроскопа Olympus BX61 (об'єктив × 2) або конфокальний мікроскоп Olympus (цілі 10 та × 100).

Процедура годівлі.

Щури розміщувалися індивідуально на паперових постільних речах (альфа-прокладки; папірці спеціального вжитку), щоб запобігти забрудненню харчових продуктів розсипними постільними матеріалами. Дієта в їдальні складалася з бекону, ковбаси, чізкейку, торта, фрізу і шоколаду, які індивідуально зважувалися перед тим, як були надані щурам. Продукти харчування дієти в кафетерії доставлялися в невеликих посудинах з металу. Всі продукти харчування, включаючи стандартну лабораторну чаву, знову зважувалися після завершення сеансу годівлі. Споживання калорій з різних макронутрієнтів обчислювалося з використанням поживної інформації, наданої виробником.

Cue-індуковане придушення харчової поведінки.

Процедури годівлі проходили в ослаблених звуком оперантних камерах, однакових за розмірами до тих, що використовувались в експериментах BSR. Щурів поміщали в оперантну камеру і вони мали доступ до дієти їдальні або чау протягом 30 хв. Харчові продукти доставлялись у невеликих металевих ємностях. Всі продукти харчування зважували до та після сеансів годування, які проводили під час нормального періоду годування щурів. Споживання чау оцінювали за споживанням 45-мг гранул чау-чау, ідентичних за своїм складом чау-чау в домашніх клітинах щурів. Потім щурам дозволявся доступ до дієти в їдальні протягом 30 хвилин на день, доки не було досягнуто стабільне споживання (визначається як <10% коливання щоденного споживання), що вимагало 5–7 днів. Після стабілізації смачного споживання їжі протягом цього базового періоду щурів у кожному стані доступу розподіляли на дві групи: караних (тих, хто зазнав удару стопи) і безкарних (не отримуючи удару стопи). Потім щурів піддавали чотирьом сеансам кондиціонування протягом наступних днів в тій же оперантній камері, в якій вони раніше мали доступ до смачної їжі. Під час 30-хвилинних сеансів кондиціонування світловий сигнал (умовний подразник) активувався протягом 10 хв, вимикався на 10 хв, а потім знову вмикався на 10 хв. Покарані щури отримували удар ногами лише під час подачі світлового сигналу (0.5 мА протягом 1.0 с; 10 стимулювань з інтервалом ~ 1 хв). Безкарним щурам подавали світлову сигналізацію таким же чином, але без удару ногою. У день випробування, на наступний день після останнього сеансу кондиціонування, щури в покараних групах отримували переривчастий удар ногами (загалом п’ять стимулів) у парі з активацією світлового сигналу протягом 5 хв. Безкарні щури знову потрапляли під дію світла за відсутності удару ногою. Після 5-хвилинного періоду покарання всім щурам було дозволено отримати доступ до смачної їжі протягом 30-хвилинного сеансу з періодичним активуванням умовного подразника (10 хв. Включеного світла, 10 хв. Вимкненого світла, 10 хв. Включеного світлового сигналу).

Статистичний аналіз.

Порогові значення винагороди за базовою лінією були визначені як середнє граничне значення для 5 d перед доступом до дієти в кафетерії для кожного суб'єкта. Порогові значення винагороди були виражені як відсоткове зміна від базового граничного значення. Дані про відсоткові значення порогових значень базової лінії, збільшення ваги, споживання калорій і споживання калорій з жирів були проаналізовані за допомогою двофакторного, повторного аналізу дисперсій, з доступом (тільки для чау, обмежений доступ або розширений доступ), джерело калорій ( стандартна дієта чау або кафетерії), вірус (Lenti-control або Lenti-D2Rsh) і кий (парні або непарні з покаранням) як фактори між суб'єктами і час як фактор, що підлягає суб'єктам. Коли це було доречно, основні ефекти в аналізі дисперсії були додатково проаналізовані постхофос-тестами Бонферроні. Всі статистичні аналізи проводили за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism.

посилання

посилання

Кореспонденція:

· Paul J Kenny ([захищено електронною поштою])