Діабетологія. 2017; 60 (8): 1502 – 1511.
Опубліковано онлайн 2017 травня 20. doi: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1абстрактний
Цілі / гіпотези
Переїдання дієтичних жирів викликає ожиріння у людей і гризунів. Недавні дослідження на людях і гризунах продемонстрували, що залежність від жирів поділяє загальний механізм з пристрастю до алкоголю, нікотину та наркотиків з точки зору дисфункції систем нагородження мозку. Було підкреслено, що дієта з високим вмістом жирів (HFD) послаблює сигналізацію дофамінових рецепторів D2 (D2R) в стриатуме, що є ключовим регулятором системи нагородження мозку, що призводить до гедонічного переїдання. Ми раніше повідомляли, що коричневий рис-специфічний біоактивний компонент γ-оризанол послаблює перевагу HFD за допомогою гіпоталамічного контролю. Тому ми досліджували можливість того, що γ-орізанол модулював би функціонування системи нагородження мозку у мишей.
Методи
Самців мишей C57BL / 6J, яких годували HFD, перорально обробляли γ-оризанолом, і оцінювали стриатичні рівні молекул, що беруть участь у передачі сигналів D2R. Досліджено вплив γ-оризанола на метилювання ДНК промотору D2R і подальші зміни переваг для дієтичного жиру. Крім того, досліджено вплив 5-aza-2′-дезоксицитидину, потужного інгібітора ДНК-метилтрансферази (DNMTs), на харчові переваги, сигналізацію D2R і рівні DNMT в смугастому тілі. Інгібуючі ефекти γ-оризанола на активність DNMTs оцінювали ферментативно in vitro.
результати
У стриатумі у мишей, які отримували HFD, виробництво D2R зменшувалося за рахунок збільшення метилювання ДНК промоторної області D2R. Пероральне введення γ-оризанола знижувало експресію і активність DNMTs, тим самим відновлюючи рівень D2Rs в смугастому тілі. Фармакологічне інгібування DNMTs 5-aza-2′-дезоксицитидином також покращило переваги дієтичного жиру. Відповідно до цих результатів, ферментативні аналізи in vitro продемонстрували, що γ-орізанол інгібує активність DNMT.
Висновки / тлумачення
Ми продемонстрували, що γ-оризанол пом'якшує HFD-індуковане гіперметилювання ДНК промоторної області D2R в смугастому тілі мишей. Наша експериментальна парадигма висвітлює γ-орізанол як багатообіцяючу речовину проти ожиріння з чіткою властивістю бути новим епігенетичним модулятором.
Електронний додатковий матеріал
Онлайн-версія цієї статті (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) містить рецензовані, але нередаговані додаткові матеріали, доступні авторизованим користувачам.
Вступ
Переїдання у людей з ожирінням поділяє, принаймні частково, спільні механізми з пристрастю до алкоголю, нікотину та наркотиків [1]. Як і гіпоталамічна і гормональна регуляція апетиту, система нагородження мозку, зокрема сигналізація дофамінових рецепторів, тісно пов'язана з адиктивним або гедонистическим поведінкою [2]. Попереднє дослідження на щурах показало, що нокдаун рецептора стрианального дофамінового D2 (D2R) за допомогою інтерферуючої РНК короткою шпилькою, індукованої лентивирусом, швидко індукував дефіцит винагороди, подібний до пристрасті та примусовий пошук харчових продуктів [3]. Внаслідок зниженої щільності D2R, спинний стриатум менш сприйнятливий до винагороди за харчовими продуктами в порівнянні з піснею контрольних груп у людей із ожирінням і гризунами [3-5]. Відповідно до цього поняття, TaqIA алель ANKK1 генний локус (що кодує повтори DRD2 / ankyrin і кіназу, що містить 1), що знижує виробництво стриарних D2R, пов'язаний з фенотипом ожиріння у людини [6], тоді як наслідки втрати ваги після баріатричної хірургії пов'язані з підвищеною щільністю D2R стриату [7]. Ці дані настійно свідчать про важливість стриатального D2R як нової терапевтичної мішені для лікування ожиріння. Проте, деякі препарати, які були розроблені і діяли на систему винагороди головного мозку, викликали значні побічні ефекти, включаючи серйозні психіатричні проблеми, що призвели до їх можливого виходу з клінік.8].
Епігенетичні модифікації мають вирішальне значення не тільки для розвитку та диференціації, але також і тому, що вони виникають внаслідок змін навколишнього середовища, у тому числі в дієті та способі життя [9]. Метилювання ДНК є головним епігенетичним явищем для стабільності експресії генів9]. У щурів вплив матері на дієту з високим вмістом жирів (HFD) між поколінням змінює метилювання ДНК в системі центрального винагороди у потомства, що призводить до надмірного споживання HFD цуценятами [10]. Зокрема, ДНК-метилтрансферази (DNMT) відіграють важливу роль у регуляції як поведінки харчування, так і фізичної активності [10, 11], що свідчить про те, що ДНМТ можуть бути перспективними терапевтичними мішенями для терапії синдрому ожиріння – цукровий діабет. Важливо, що деякі природні харчові речовини, включаючи кавову кислоту та епігалокатехіни, відомі як інгібітори ДНМТ [12, 13].
Нещодавно ми показали, що біоактивний, коричневий рис, специфічний компонент γ-оризанол, суміш ефіру ферулової кислоти і декілька фітостеролів, послаблює перевагу дієтичного жиру за рахунок зниження стресу гіпоталамічного ендоплазматичного ретикулуму [ER].14]. У мишей і кроликів перорально вводили γ-оризанол швидко абсорбувалися з кишечника і розподілялися головним чином у мозок [15, 16]. Беручи ці знахідки разом, натуральні продукти, отримані з харчових продуктів, що діють на центральну нервову систему, можуть бути альтернативою для безпечного поліпшення порушеної харчової поведінки при ожирінні. У цьому контексті ми перевірили гіпотезу, що γ-орізанол змінить статус метилювання ДНК у системі винагороди мозку, що призведе до ослаблення переваги HFD у мишей.
Методи
Звірята
Семитижневих самців мишей C57BL / 6J, отриманих з лабораторій Charles River Japan (Канагава, Японія), утримували (3-4 у клітці) в умовах без специфічних патогенів при 24 ° C при 12 год / 12 год світла / темний цикл. Після тижня акліматизації 8-тижневих мишей підбирали за вагою та розділяли на дві-три групи для кожного експерименту. Мишам був наданий вільний доступ до їжі та води. Усі експерименти на тваринах були схвалені Комітетом з етики експериментів на тваринах Університету Рюкюса (№ 5352, 5718 та 5943).
Введення γ-оризанола і 5-аза-2′-дезоксицитидину
Для оцінки переваги для HFD, γ-оризанол (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Японія) вводили мишей 8-тижня за допомогою зонда під час випробування на вибір їжі, як описано раніше [14, 17]. Для інших експериментів HFD (D12079B; дослідницькі дієти, Нью-Брансвік, Нью-Джерсі, США), що містить 0.4% γ-оризанол, виготовляли у вигляді гранул. Компоненти раціону показані в електронній таблиці додаткового матеріалу (ESM) 1. Після 12 тижнів годування тканину відбирали із смугастого тіла та гіпоталамуса. Щоденне споживання γ-оризанолу, оцінене за середнім споживанням їжі мишами, становило приблизно 320 мкг / г маси тіла. Дози γ-оризанолу визначали, як описано раніше [14]. 5-аза-2′-дезоксицитидин (5-аза-dC; Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США) вводили внутрішньочеревно (0.25 мкг / г маси тіла) тричі на тиждень протягом 12 тижнів [18].
Оцінка переваги дієтичного жиру
Щоб оцінити переваги дієтичного жиру, тести на продукти харчування дозволили вибирати між чау та ХФД (D12450B і D12451; дослідницькі дієти), як було описано раніше [14]. Компоненти раціону наведені в таблиці ESM 1. Коротко кажучи, мишам був наданий вільний доступ до чау та HFD. Споживання чау та СНВ вимірювали щотижня та аналізували на зміну переваги харчового жиру. Вподобання HFD обчислювали за формулою: перевагу HFD = [(споживання HFD / загальне споживання їжі) × 100].
Бисульфитное секвенування для метилювання ДНК
ДНК очищали за допомогою набору DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Токіо, Японія). Розчин ДНК змішували зі свіжоприготовленим 3 моль / л NaOH, інкубували при 37 ° С протягом 15 хв і додавали 5.3 моль / л сечовини, 1.7 моль / л бісульфіту натрію та 4.9 ммоль / л гідрохінону. Розчин піддавали 15 циклам денатурації при 95 ° С протягом 30 с та інкубації при 50 ° С протягом 15 хв [19]. ДНК, оброблену бісульфітом, очищали з використанням набору для очищення PCE MinElute (QIAGEN) і ампліфікували за допомогою ПЛР з використанням набору KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix PCR (KAPA Biosystems, Woburn, MA, USA) і праймерів навколо CpG-сайту промоторної області D2R . Послідовності праймерів були наступними: прямий праймер, 5′-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3 ′; зворотний праймер, 5′-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3 ′. Далі послідовності адаптерів додавали і очищали за допомогою Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Зразки потім об'єднували і завантажували на GS Junior (Roche Diagnostics, Tokyo, Japan) для секвенування згідно з протоколом виробника. Рівень метилювання виражали у відсотках метильованих цитозинів у всіх залишках цитозинів.
Аналіз активності DNMT
Аналіз ферментативної активності DNMT проводили з використанням набору EpiQuik ДНК-метилтрансферазной активності / інгібування (Epigentek Group, Brooklyn, NY, USA) і набору EPIgeneous Methyltransferase Assay (Cisbio Japan, Chiba, Japan) відповідно до протоколів виробника.
Для оцінки інгібуючої активності кожного з'єднання на метилювання ДНК, формування S-аденозил-20-гомоцистеїн (SAH) вимірювали у присутності кожної сполуки (XNUMX мкмоль / л для скринінгових аналізів), S-аденозилметіонін (SAM; 10 мкмоль / л) та субстрат DNMT (4 нг / мкл) при 37 ° C протягом 90 хв. Для оцінки кінетики Міхаеліса – Ментена DNMT1 (20 мкмоль / л) інкубували з γ-оризанолом, SAM (5 мкмоль / л) та вказаною концентрацією полі dI-dC при 37 ° C протягом 90 хв. DNMT3a (100 мкмоль / л) та DNMT3b (100 мкмоль / л) інкубували з γ-оризанолом, SAM (5 мкмоль / л) та зазначеною концентрацією полі dG · dC при 37 ° C протягом 120 хв. Аналізи проводили в чотирьох повторах. Екстрагований білок (0.75 мг / мл) інкубували з SAM (5 мкмоль / л), полі dI-dC (5 мкг / мл) та полі dG · dC (5 мкг / мл) при 40 ° C протягом 120 хв, і Вимірювали утворення SAH.
Естроген-пов'язаний рецептор-γ-аналіз активності
Потенційну антагоністичну активність γ-оризанолу на пов'язаний з естрогеном рецептор-γ (ERRγ) оцінювали за допомогою системи аналізу репортерів гамма-репортерів, пов'язаних з естрогеном людини (INDIGO Bioscience, State College, PA, USA) відповідно до протоколу виробника. Коротко кажучи, репортерні клітини ссавців, що не є людиною, які конститутивно експресують активний ERRγ, піддавались зазначеним концентраціям кожної сполуки протягом 24 годин у трьох примірниках.
Вестерн-блот
Це було виконано, як описано раніше [20] з антитілами проти D2R (1: 500, кролик), транспортером дофаміну (DAT; 1: 500, кролик), тирозингідроксилазою (TH; 1: 1000, кролик) (AB5084P, AB1591P та AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, США), перетворювач сигналу та активатор транскрипції 3α (STAT3α; 1: 1000, кролик), DNMT1 (1: 1000, кролик), DNMT3a (1: 1000, кролик) (No 8768, 5032 та 3598; Технологія сигналізації клітин, Токіо, Японія), DNMT3b (1 мкг / мл, кролик), ERRγ (1: 1000, кролик) та β-актин (1: 10,000, миша) (ab16049, ab128930 та ab6276; Abcam, Кембридж, Массачусетс, США).
Кількісна ПЛР у реальному часі
Експресію генів досліджували, як описано раніше [14]. Рівні мРНК нормалізували до Rn18s (РННК 18S). Набори праймерів, що використовуються для кількісного ПЛР-аналізу в реальному часі, підсумовані в таблиці ESM 2.
Статистичний аналіз
Дані виражаються як середнє значення ± SEM. Там, де це застосовано, використовували односторонній ANOVA та повторні вимірювання ANOVA з подальшим кількома порівняльними тестами (метод Бонферроні – Данна). Студентська t Тест був використаний для аналізу відмінностей між двома групами. Відмінності вважалися значними на p <0.05.
результати
Фармакологічне інгібування DNMTs за допомогою 5-aza-dC послаблювало переваги дієтичного жиру у мишей
У мишей, які отримували HFD, метилювання ДНК в промоторній області D2R в смугастому тілі значно збільшувалося порівняно з мишами, які отримували дієту з чау (фіг. (Fig.1a) .1а). З іншого боку, метилювання ДНК гіпоталамусу в промоторній області D2R, мабуть, вище, ніж у смугастому тілі під дією чоу (p <0.01) (рис. (Фиг.1a, 1a, f) і не був змінений HFD (рис. (Fig.1f) .1f). У мишей, яких годували HFD, метилирование збільшеної ДНК в промоторній області D2R в смугастому тілі нормалізували шляхом лікування 5-aza-dC, потужним інгібітором DNMT (фіг. (Fig.1a) .1а). Навпаки, метилювання ДНК в промоторній області D2R в гіпоталамусі не було суттєво змінене шляхом лікування 5-aza-dC (рис. (Fig.1f) .1е). У стриатумі 20-тижневих самців мишей, яких годували HFD протягом 12 тижнів, рівень мРНК та білка D2R значно знижувався (рис. (Фиг.1b, 1b, k, l). На відміну від цього, рівні дофамінових рецепторів D1 (D1Rs, що кодуються Drd1), які діють протилежним чином на D2Rs на аденилилциклазу і cAMP-опосередковану внутрішньоклітинну сигналізацію, були незмінними (фіг. (Fig.1c) .1в). Крім того, не було ніяких змін в рівнях інших молекул, пов'язаних з передачею сигналів D2R, таких як TH і DAT на рівні мРНК та / або білка (фіг. (Фіг.1d, 1d, e, k, m). З іншого боку, в гіпоталамусі не спостерігалося явних змін, у тому числі для D2R (рис. (Fig.1g – m) .1g – m). Примітно, що рівні білків D2R і TH в гіпоталамусі були набагато нижче, ніж у смугастому тілі (рис. (Фиг.1l, 1l, m), можливо, відображає відносну важливість сигналізації дофамінових рецепторів у системі винагороди мозку порівняно з гіпоталамусом.
Щоб перевірити, чи метилювання ДНК в промоторній області D2R змінює переваги для харчового жиру, аналізували харчову поведінку мишей, оброблених 5-aza-dC. Як і очікувалося, 5-aza-dC значно підвищував рівні мРНК і білків для D2R в смугастому тілі HFD-годуваних мишей (фіг. (Фиг.1b, 1b, k, l). З іншого боку, не було ніякого впливу на рівні Drd1, Th та Slc6a3 (кодування DAT) в смугастому, або на рівнях Drd2, Drd1, Th та Slc6a3 в гіпоталамусі (рис. (Fig.1c – e, 1c – e, g – m). Тоді як миші, оброблені транспортним засобом, віддавали перевагу HFD, переваги для HFD були значно знижені у мишей, оброблених 5-aza-dC (88% від значень для мишей, оброблених носієм) (Фіг. (Fig.1n) .1n). Отже, лікування 5-aza-dC знижувало приріст маси тіла (рис. (Фіг.11o).
γ-орізанол знижує рівні DNMTs у стриатумі мишей, що харчуються HFD
Як ми раніше повідомляли [14пероральне введення γ-оризанола мишам-самцям за допомогою зонда значно послаблює переваги для HFD (93% від значень для мишей, оброблених носієм) (Фіг. (Фиг.2a), 2а), що призводить до явного ослаблення збільшення маси тіла (фіг. (Fig.2b) .2б). Тому ми досліджували потенційний вплив γ-орізанолу на епігенетичну модуляцію D2R в смугастому тілі.
У ссавців є три основні DNMT - DNMT1, 3a і 3b. Функції DNMT1 підтримують метилювання ДНК, тоді як DNMT3a і 3b відіграють певну роль у полегшенні метилювання ДНК.21]. Щоб дослідити потенційний вплив γ-орізанолу на DNMT in vivo, ми оцінили рівні DNMTs у мозку мишей, які отримували HFD. Хоча HFD per se не впливав на мРНК і рівні білків DNMT або в стриатуме або в гіпоталамусі, добавки з γ-орізанолом значно знижували рівні DNMT в стриатумі, але не в гіпоталамусі (рис. (Fig.2c – e, 2c – e, g – i, k – n). Ці дані підвищують ймовірність того, що γ-орізанол може регулювати рівні ДНМТ у вигляді стриатуму. Аналогічно, 5-aza-dC значно знижував рівні мРНК DNMT3a і 3b переважно в смугастому тілі (ESM, рис. 1a – d).
На основі попереднього дослідження, що показує, що рівень мРНК DNMT1 був позитивно регульований, принаймні частково, ядерним рецептором ERRγ [22], ми розглянули потенційний вплив γ-орізанолу на активність ERRγ. У нелюдських клітинах ссавців, конститутивно експресують активний ERRγ, 4-гідрокситамоксифен, сильний зворотний агоніст ERRγ, помітно знижував активність ERRγ. Відзначимо, γ-оризанол частково знижує активність ERRγ (приблизно 40% зниження вродженого значення) (фіг. (Fig.3a) .3а). Важливо, що ERRγ сильно експресувався в стриатуме, але не в гіпоталамусі (рис. (Fig.3b-d) .3b-d). Всупереч ситуації для стриатума, γ-оризанол значно підвищував рівень білка DNMT1 тільки в гіпоталамусі (рис. (Фиг.2k, 2k, l). Ці результати можна пояснити, принаймні частково, нашою знахідкою, що STAT3α, позитивний регулятор рівня DNMT1 [23], рясно експресувався в гіпоталамусі, але не в смугастому тілі (рис. (Фіг.33e – g).
Для подальшої оцінки впливу γ-оризанола на активність ДНМТ in vivo формування SAH, побічного продукту метилювання ДНК, а також потужним інгібітором DNMT, оцінювали у мишей, оброблених γ-оризанолом, які отримували HFD. Істотних змін у формуванні SAH у стриатумі або гіпоталамусі не було між мишами, що отримували HFD, і мишами, що годувалися чоу-чау (рис. (Фиг.2f, 2f, j). Помітним є те, що γ-оризанол значно знижував утворення SAH в смугастому тілі (фіг. (Fig.2f) 2f) але не в гіпоталамусі (рис. (Fig.2j), 2j), припускаючи, що γ-оризанол може пригнічувати активність DNMTs в striatum-специфічному способі у HFD-годуваних мишей.
Ферментативні аналізи на інгібуючі властивості γ-оризанола для DNMTs in vitro
Далі оцінювали вплив γ-оризанола на активність DNMTs in vitro. Оцінювали інгібіторну активність γ-орізанолу, ферулової кислоти, 5-aza-dC, галоперидолу (репрезентативного антагоніста D2R), хінпіролу (репрезентативного агоніста D2R) і SAH проти DNMT. В якості позитивного контролю SAH сильно послаблює активність DNMTs залежним від дози способом (фіг. (Fig.4a – f) .4a – f). Як і очікувалося, галоперидол і хінпірол не показали ніякого впливу на активність ДНМТ (ESM на фіг. 2). Помітно, γ-оризанол значно інгібує активність DNMT1 (IC50 = 3.2 мкмоль / л), 3а (IC50 = 22.3 мкмоль / л) та 3b (максимальне інгібування 57%) (рис. (Fig.4d – f) .4d – f). На відміну від цього, інгібіторна активність ферулової кислоти, метаболіту γ-орізанолу, була набагато нижчою, ніж у γ-оризанола (фіг. (Фіг.44d – f).
Далі досліджено інгібуючі властивості γ-орізанолу на ДНМЦ. Формування SAH вимірювали для оцінки інгібуючої активності γ-оризанола на DNMTs in vitro. Дані про утворення SAH під час ДНМТ-опосередкованого метилювання ДНК вказують на насичувану картину кінетики Міхаеліса – Ментена як для присутності, так і для відсутності γ-оризанола (рис. (Fig.4g – i) .4g – i). В результаті метилування ДНК, опосередкованого DNMT1, аналіз Eadie – Hofstee показав, що γ-орізанол не проявляє впливу на V Макс утворення SAH (носій, 597 пмоль / хв; γ-оризанол 2 мкмоль / л, 619 пмоль / хв; γ-оризанол 20 мкмоль / л, 608 пмоль / хв), тоді як γ-оризанол, мабуть, збільшив K m (транспортний засіб, 0.47 мкг / мл; γ-оризанол 2 мкмоль / л, 0.67 мкг / мл; γ-оризанол 20 мкмоль / л, 0.89 мкг / мл) (рис. (Fig.4j) .4j). Ці результати дозволяють припустити, що γ-орізанол пригнічує DNMT1 принаймні частково конкурентним чином. З іншого боку, для метилювання ДНК, опосередкованого DNMT3а і 3b, γ-орізанол зменшив V Макс утворення SAH (DNMT3a: транспортний засіб, 85.3 пмоль / хв; γ-оризанол 2 мкмоль / л, 63.1 пмоль / хв; γ-оризанол 20 мкмоль / л, 42.5 пмоль / хв; DNMT3b: транспортний засіб, 42.3 пмоль / хв; γ -оризанол 2 мкмоль / л; 28.0 пмоль / хв, γ-оризанол 20 мкмоль / л, 15.0 пмоль / хв) і, аналогічно, K m для цієї реакції (DNMT3a: носій, 0.0086 мкг / мл; γ-оризанол 2 мкмоль / л, 0.0080 мкг / мл; γ-оризанол 20 мкмоль / л, 0.0058 мкг / мл; DNMT3b: носій, 0.0122 мкг / мл; γ- оризанол 2 мкмоль / л, 0.0097 мкг / мл; γ-оризанол 20 мкмоль / л, 0.0060 мкг / мл) (рис. (Фиг.4k, 4k, l). Ці результати дозволяють припустити, що γ-орізанол пригнічує DNMT3a і 3b принаймні частково неконкурентним чином.
γ-оризанол підвищує рівні D2R в стриатумі мишей, яких годували HFD
Далі ми перевірили можливість того, що γ-орізанол збільшить вміст стриатального D2R через інгібування DNMT. У мишей, які отримували HFD, пероральне введення γ-орізанолу значно знижувало мерилювання striatal ДНК в промоторній області D2R (фіг. (Фиг.5a), 5а), тоді як цього не робили в гіпоталамусі (рис. (Fig.5f) .5f). Відповідно до цих висновків, рівні мРНК і білків D2R були взаємно збільшені (фіг. (Фиг.5b, 5b, g, k, l). Аналогічні дані про лікування 5-aza-dC (рис. (Фіг.1), 1), не було ніяких очевидних ефектів на рівні РНК і білка Drd1, Th та Slc6a3 (DAT) в смугастому тілі, і ніяких ефектів на рівні Drd1, Th та Slc6a3 в гіпоталамусі (рис. (Fig.5c – e, 5c – e, h – k, m).
Попередні дослідження показали, що рівні D2R і DNMT1 регулюються стресом ER і запаленням принаймні частково через NF-κB [17, 24, 25]. Тому ми досліджували рівні гена, пов'язаних зі стрессом і запаленнями. Як продемонстровано раніше26], HFD збільшував експресію генів, що кодують TNF-α (Tnfa, білок моноцитарного хемоаттрактанта - 1 (MCP-1) (Ccl2), Гомологічний білок C / EBP (Чоп, ER-локалізована DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) і сплайсированную форму X-box зв'язуючого білка 1 (Xbp1s) в гіпоталамусі, але не в смугастому тілі (рис. (Fig.6) .6). Примітно, що доповнення HFD γ-оризанолом значно зменшило збільшену експресію Ccl2, Чоп, Dnajb9 та Xbp1s виключно в гіпоталамусі, але не в смугастому тілі (рис. (Фіг.66).
Обговорення
Найважливішим висновком у цьому дослідженні є те, що γ-орізанол діє як потужний інгібітор ДНМТ у смугастому тілі мишей, тим самим послаблюючи, принаймні частково, перевагу HFD за допомогою епігенетичної модуляції стриарного D2R. У стриатуму у мишей, яких годували HFD, рівні D2R були значно знижені, тоді як рівні D1R, TH і DAT не змінювалися (рис. (Рис. 1b – e, 1b – e, k – m). Ці дані узгоджуються з уявленням про те, що порушення регуляції стриарної D2R відіграє важливу роль у сприйнятті винагороди за харчовими продуктами при HFD, що призводить до надмірного споживання HFD у тварин, що страждають ожирінням [3]. У даному дослідженні лікування HFD-годуваних мишей з 5-aza-dC значно підвищувало рівні стриарного D2R (фіг. (Фиг.1b, 1b, k, l) можливо за рахунок зниження рівня метилювання ДНК в промоторной області D2R (фіг. (Фиг.1a), 1а) і, отже, послаблюють переваги дієтичного жиру (фіг. (Fig.1n) .1n). Цей висновок також підтверджує критичну роль стриарних D2R у сприйнятті винагороди за їжею, коли вони знаходяться на HFD.
Наш аналіз in vitro продемонстрував, що інгібіторна активність γ-орізанолу проти DNMT, мабуть, сильніше, ніж його метаболіту ферулової кислоти (рис. (Fig.4d – f), 4d - f), що свідчить про важливість повної структури γ-оризанола для його інгібуючої дії на DNMTs. У мишей, яких годували HFD, наші дослідження показують, що після перорального введення γ-орізанол досягає мозку як повна структура і знижує рівні і активність DNMT, переважно в смугастому тілі, з подальшим зниженням метилювання ДНК в промоторной області D2R в смугастому тілі. Крім того, наші дослідження in vitro продемонстрували, що γ-оризанол діє як частковий антагоніст проти ERRγ, який в першу чергу служить позитивним регулятором для виробництва DNMT1 [22], і, отже, знизилася активність DNMT1 (рис. (Fig.3a) .3а). Слід зазначити, що ERRγ був високо экспрессирован в смугастому тілі, але не в гіпоталамусі у мишей (фіг. (Fig.3b) .3б). Ці дані дозволяють припустити, що γ-оризанол має потенціал для зниження рівня мРНК DNMT1, принаймні частково, через інгібування ERRγ. На відміну від стриатума, γ-орізанол не виявляв впливу на рівень D2R у гіпоталамусі у HFD-годуваних мишей (фіг. (Рис. 5g, 5g, k, l).
З іншого боку, ми продемонстрували, що γ-орізанол значно підвищує рівень DNMT1 в гіпоталамусі, але не в смугастому тілі (рис. (Фиг.2k, 2k, l). Було показано, що STAT3 збільшує вміст DNMT1 у злоякісних Т-лімфомах23]. Примітно, що раніше ми показали, що γ-орізанол значно збільшив фосфорилювання STAT3, спричинене лептином, в гіпоталамусі у мишей, яких годували HFD [14]. Слід також зазначити, що STAT3α істотно експресувався в гіпоталамусі, але не в смугастому тілі у мишей (фіг. (Fig.3e – g) .3e – g). Ці дані спонукають нас припустити, що очевидна різниця в ефекті γ-орізанолу на рівні DNMT1 між гіпоталамусом і стриатумом може бути приписана, принаймні частково, до специфічного для області вмісту STAT3α і ERRγ у мозку мишей ( Рис. (Fig.3b – g) .3b – g). У сукупності, мабуть, існує зворотна картина експресії ERRγ і STAT3α між стриатумом і гіпоталамусом у мишей. На підставі наших результатів обґрунтовано припустити, що в стриатуме, де виробництво ERRγ багато, γ-орізанол може переважно знижувати рівень мРНК і ферментну активність DNMT1 як негативного регулятора ERRγ. На відміну від цього, в гіпоталамусі, де STAT3α є домінуючим, γ-орізанол може переважно підвищувати рівні DNMT1.
Недавнє дослідження продемонструвало, що послаблення сигналізації стриарної D2R, індукованої HFD, порушує поведінку харчування [3], що свідчить про потенційну важливість інгібування стриатних ДНМТ для лікування ожиріння. З іншого боку, попереднє дослідження продемонструвало можливість того, що статус метилювання ДНК гена рецептора меланокортину, експресованого в специфічних ядрах гіпоталамусу, може модулювати трансгенераційні форми ожиріння у життєздатних жовтих мишах27]. Незважаючи на необхідність подальших досліджень для з'ясування основних механізмів, ці дослідження свідчать про важливість метилювання ДНК, специфічних для тканин, генів і послідовностей, в патофізіології індукованого HFD ожиріння.
Нещодавно ми повідомили, що HFD підвищив рівень D2R в панкреатичних острівцях мишей [17, 24]. Цілком імовірно, що таке підсилення опосередковане, принаймні частково, ER стресом і запаленням через NF-κB, оскільки в промоторній області D2R існує кілька NF-κB-чутливих елементів.17, 24]. Крім того, нещодавнє дослідження показало, що TNF-α та IL-1β підвищують рівень і активність DNMT1 у жировій тканині у мишей, яких годували HFD [25]. Важливо, що дане дослідження продемонструвало, що HFD індукує ER стрес і запалення переважно в гіпоталамусі, але не в стриатуме (рис. (Fig.6) .6). Поглиблені механізми метилювання та деметилювання ДНК в тканини, області та ділянки в нашій експериментальній парадигмі повинні чекати подальшого дослідження.
Разом з нашим попереднім звітом про те, що γ-оризанол послаблює перевагу HFD за допомогою гіпоталамічної регуляції стресу ER у мишей [14], γ-орізанол також є унікальним властивістю поліпшення як гедонічної, так і метаболічної дисрегуляції харчової поведінки. Оскільки відомо, що деякі розроблені препарати проти ожиріння викликають критичні побічні ефекти [8], очікується, що для лікування синдрому ожиріння – цукровий діабет передбачено природний підхід до системи винагороди мозку16]. У цій парадигмі γ-орізанол є перспективним кандидатом для запобігання ожиріння з чіткою властивістю бути епігенетичним модулятором.
Подяки
Ми вдячні С. Окамото (Університет Рюкюса, Японія) за перегляд рукопису. Дякуємо М. Хіраті, Г. Канешіро, І. Асато і К. Ногучі (Університет Рюкюса, Японія) за секретарську допомогу.
Скорочення
| 5-aza-dC | 5-аза-2′-дезоксицитидин |
| D1R | Рецептор дофаміну D1 |
| D2R | Рецептор дофаміну D2 |
| DAT | Транспортер дофаміну |
| DNMT | ДНК метилтрансферази |
| ER | Ендоплазматичний ретикулум |
| ERR | Естроген-пов'язаний рецептор |
| HFD | Дієта з високим вмістом жирів |
| SAH | S-Аденозил-1-гомоцистеїн |
| SAM | S-Аденозил метіонін |
| STAT3α | Сигнальний перетворювач і активатор транскрипції 3α |
| TH | Тирозин гідроксилази |
примітки
Доступність даних
Набори даних, що генеруються та / або аналізуються під час поточного дослідження, доступні у відповідних авторів за розумними запитами.
Фінансування
Цю роботу частково підтримали гранти в допомозі від Японського товариства сприяння науці (JSPS; номери грантів KAKENHI 15K19520 і 24591338), Рада з питань науки, технологій та інновацій (CSTI), Міжнародна програма сприяння інноваціям (SIP) "Технології для створення сільського, лісового та рибного господарства наступного покоління", Фонд Лотте, Японська фундація прикладної ензимології, Нова організація з розвитку енергетики та промислових технологій (NEDO), Проект формування мережі наук про життя (фармацевтичне поле) (Префектура Окінава, Японія) та Проект сприяння медичному кластеризації префектури Окінава, Японія, а також грант від префектури Окінава для просування передової медицини (префектура Окінава, Японія).
Двосторонність інтересу
Автори заявляють, що немає ніякого подвійного інтересу, пов'язаного з цим рукописом.
Звіт про внесок
CK і HM розробили дослідження. СК і ТК проводили експерименти і аналізували дані. TK, CS-O, CT, MT, MM і KA сприяли інтерпретації даних. CK і HM написали рукопис. Всі автори сприяли інтерпретації даних. Всі автори приєдналися до перегляду рукопису та затвердили її остаточний варіант. HM є гарантом цієї роботи, має повний доступ до всіх даних і бере на себе повну відповідальність за цілісність даних і точність аналізу даних.
Виноски
Електронний додатковий матеріал
Онлайн-версія цієї статті (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) містить рецензовані, але нередаговані додаткові матеріали, доступні авторизованим користувачам.
посилання
;