Інсулін активує рецептори інсуліну (InsRs) в гіпоталамусі, щоб сигналізувати про ситості після їжі. Тим не менш, зростання захворюваності на ожиріння, яке призводить до хронічно підвищених рівнів інсуліну, означає, що інсулін також може діяти в центрах мозку, які регулюють мотивацію і винагороду. Ми повідомляємо, що інсулін може посилювати залежний від потенціалу дофаміновий (DA) вивільнення в ядрі accumbens (NAc) і хвостаті-путамени через непрямий механізм, який включає стриральні холінергічні інтернейрони, які експресують InsRs. Крім того, два різних хронічних маніпуляцій з дієтами у щурів, обмеження їжі (FR) і обезгенной (OB) дієти, протилежним чином змінюють чутливість стріального вивільнення DA до інсуліну, з підвищеною чутливістю в FR, але втратою чутливості в OB. Поведінкові дослідження показують, що інтактні рівні інсуліну в оболонці NAc необхідні для отримання переваги аромату парного розчину глюкози. Разом ці дані свідчать про те, що сигналізація стритального інсуліну посилює вивільнення DA, щоб впливати на вибір продуктів харчування.

Добре відомо, що стійке збільшення інсуліну в плазмі під час і після їжі активує інсулінові рецептори (InsRs) в гіпоталамусі, що забезпечує негативний зворотний зв'язок з апетитними схемами, що зменшує подальше харчування.^{1, 2, 3}. Мозковий інсулін виводиться головним чином з β-клітин підшлункової залози, з активним транспортом з плазми в головний мозок через гематоенцефалічний бар'єр^{4, 5, 6, 7, 8}, хоча є все більше доказів синтезу та вивільнення нейронального інсуліну^{1, 9}. Примітно, що експресія InsRs не обмежується гіпоталамусом, хоча функція позагипоталамусних InsRs залишається невирішеною^{1, 2, 3}. Враховуючи зростаючу частоту ожиріння і діабету II типу, в яких циркулюючі рівні інсуліну постійно підвищуються, а транспорт мозку інсуліну і чутливість рецепторів зменшуються^{3, 8, 10, 11}важливо розуміти функцію інсуліну в областях мозку, які регулюють мотивацію і винагороду. Регіони мозку, що представляють особливий інтерес, включають nucleus accumbens (NAc), який опосередковує корисні ефекти як продуктів харчування, так і лікарських засобів^{12, 13}і хвостатий-путамен (КПУ), який відіграє певну роль у поведінці, що базується на звичках, і потягу¹³. InsRs експресуються в цих регіонах, причому найбільша щільність зустрічається в NAc^{3, 14}; InsRs також експресуються нейронами дофаміну (DA) в середньому мозку, включаючи ті, що знаходяться в області вентрального тегментального (VTA) і substantia nigra pars compacta (SNc)¹⁵. Рівні інсуліну в мозку пропорційні концентрації інсуліну в плазмі і ожиріння тіла^{6, 7, 8}, що призводить до гіпотези, що інсулін може діяти на InsRs в цих областях мозку, щоб вплинути на винагороду за їжею^{3, 16, 17}.

Попередні дослідження в стриатических синаптосомах, гетерологічних клітинах, зрізах мозку і в природних умовах показали, що активація інсуліну InsRs призводить до збільшення поглинання DA за допомогою DA-транспортера (DAT)^{18, 19, 20, 21, 22, 23}. Цей процес передбачає сигнальний шлях кінази PI3^{19, 20}і призводить до введення DAT в плазматичну мембрану¹⁹. Рівні циркулюючого інсуліну динамічно модулюють активність стриатального DAT, зменшуючи поглинання DA і поверхневу експресію DAT у тваринних моделях діабету і після обмеження їжі (FR)^{20, 21}. Показано, що інсулінозалежне збільшення активності DAT знижує викликану позаклітинну концентрацію DA ([DA]_o) у VTA²³, що відображає зміну рівноваги між вивільненням DA і поглинанням. Відповідно до встановленої ролі інсуліну в ситості, гостра мікроін'єкція інсуліну в ВТА може зменшити нагороду їжі^{23, 24}у той час як миші, у яких відсутній InsRs у VTA і SNc DA, показують збільшений прийом їжі і ожиріння²⁵. Хоча інсулін може індукувати тривалий депресію збудливого введення до VTA DA нейронів²⁴, знову ж таки, що відповідає ролі в ситості, експозиція інсуліну може також збільшити швидкість стрільби нейронів DA, ​​можливо, шляхом зменшення вивільнення DA і опосередкованого авторецептором інгібування²⁵. Таким чином, чистий ефект інсуліну на вивільнення стриарного ДА важко передбачити. Дійсно, результати досліджень впливу інсуліну на стріальне вивільнення DA в колишніх природних умовах скибочки¹⁹ і вплив місцевої мікроін'єкції інсуліну в NAc на харчову винагороду²⁶ суперечливі. Щоб вирішити це, ми оцінили вивільнення і поглинання аксонального DA в інтактному мікросередовищі NAc і CPu колишніх природних умовах стриатальние зрізи за допомогою швидкої циклічної вольтамперометрії (FCV), і визначили вплив інсулінової сигналізації в NAc на винагороду в природних умовах.

Наші дослідження показують, що основний ефект інсуліну в NAc і CPu полягає в підвищенні вивільнення DA, незважаючи на одночасне збільшення поглинання DA. Ця динамічна регуляція вивільнення DA передбачає інсулінозалежне збільшення збудливості стриральних холінергічних інтернейронів (ChIs), що призводить до посилення вивільнення DA через активацію нікотинових ацетилхолінових рецепторів (nAChR). Вплив інсуліну на ChIs і на вивільнення DA опосередковується InsRs. Примітно, що вплив інсуліну на вивільнення DA посилюється на зрізах щурів FR, але притупляється у щурів на обезгенной (OB) дієті. Ці дані показують посилення вивільнення DA в колишніх природних умовах Зрізи інсуліном призводять до прогнозу, що інсулін може діяти як сигнал винагороди в природних умовах. Дійсно, паралельні поведінкові дослідження демонструють роль інсуліну в оболонці NAc у кондиціонуванні аромату. Разом ці результати свідчать про нову роль інсуліну як сигналу винагороди, який може впливати на вибір їжі

Інсулін, що діє на InsRs, збільшує вивільнення стриатальної DA

Початкова експертиза локально викликаного [DA]_o контролюється за допомогою FCV колишніх природних умовах стриатальние зрізи щурів з ad libitum (AL) доступ до їжі та води виявив несподіваний висновок, що гостре застосування інсуліну в діапазоні фізіологічно значущих концентрацій^{1, 4} збільшений одноімпульсно-викликаний [DA]_o (Рис. 1a – c), з інсуліном EC₅₀ значення (концентрація, при якій ефект був наполовину максимальним) 2 – 12 nM (1b). Збільшення викликано [DA]_o особливо дивно, враховуючи, що це супроводжувалося значним збільшенням максимальної ставки (V_Макс) для DAT-опосередкованого поглинання в кожному субрегіоні (Таблиця 1), що призвело б до конкурентного зниження викликаної_o, як повідомлялося раніше^{22, 23}. Замість цього ми виявили, що викликали [DA]_o був максимально посилений 20 – 55% інсуліном 30 nM; областю з найбільшим пропорційним ефектом була оболонка NAc, що є стриатичним субрегіоном з найвищим показником InsR^{1, 14}. Шматочки інсуліну 30 nM в однакових умовах не показували зміну вмісту стриарного ДА (Додатковий рис. 1a), що означає, що інсулін змінює регуляцію динамічного вивільнення, а не просто регулює синтез DA. Примітно, що вплив інсуліну на викликаний [DA]_o була втрачена при суперфізіологічних концентраціях ≥100 nM (1b). Це не було результатом підвищення активності DAT обгону вивільнення, як вплив інсуліну V_Макс також втрачено при цих концентраціях (Таблиця 1). В цілому, ці дані показують, що в інтактному стриарному мікрооточенні переважаючий ефект інсуліну на викликаний [DA]_o полягає в збільшенні вивільнення, незважаючи на одночасне збільшення поглинання DA.

  

  

(a) Середній одноімпульсно-викликаний [DA]_o в оболонці NAc, ядрі NAc і CPu до і після інсуліну (Ins), проілюстрованого для 30 nM; пропущені панелі помилок, але перегляньте (b); стрілки вказують час стимулу. Підвищений інсулін [DA]_o в оболонці (за 55 ± 10%), ядро ​​(за 37 ± 5%) і CPu (за 20 ± 4%) (***P<0.001). (b) Вплив інсуліну на концентрацію залежить від фізіологічного діапазону (1 – 30 nM) в оболонці (n= 22 – 24, F_5,133= 14.471, P<0.001), ядро ​​(n= 36 – 76, F_5,308= 16.318, P<0.001) та CPu (n= 30 – 62, F_5,253= 13.763, P<0.001), але програв при ≥100 нМ. (c) Репрезентативні записи піку викликаного [DA]_o проти часу в одному місці в ядрі NAc за відсутності застосування препарату (Con), під час застосування інсуліну (30 nM) або коли інсулін застосовували в присутності інгібітора InsR HNMPA (5 μM). (d) Середній пік викликаний [DA]_o дані, що показують профілактику дії інсуліну (30 nM) на HNMPA, антагоніст InsR S961 (1 μM) та інгібітор PI3K LY294002 (1 μM), але не на інгібітор IGF-1R PPP (1 μM) (n= 29 – 76; P> 0.9 проти інсуліну). Для 1a – d, n= кількість ділянок на субрегіон від щурів 3 – 6 для кожного препарату або концентрації інсуліну; односторонній дисперсійний аналіз, тест на чіткість значень (HSD). Подивитися Додатковий рис. 1b, c для даних оболонки NAc і CPu.

• Повнорозмірне зображення (98 Кб)

 

 

Тому що інсулін також може діяти на інсуліноподібні рецептори фактора росту 1 (IGF-1Rs), хоча і при концентраціях, що перевищують 100 nM (ref. 1), ми прагнули підтвердити, що посилюючий ефект інсуліну на викликаний [DA]_o був InsR залежним. Це виявилося так, оскільки ефект запобігався внутрішньоклітинним інгібітором InsR, гідрокси-2-нафталінілметилфосфоновою кислотою (HNMPA), а також антагоністом InsR, S961, але не селективним інгібітором IGF-1R, пікроподофіліном.²⁴ (ДПП; Рис. 1c, d та Додатковий рис. 1b, c). Потім ми досліджували залучення кінази PI3, яка ініціює сигнальний шлях, відповідальний за інсулінозалежну регуляцію DAT.¹⁹. При концентрації 1 μM інгібітор P13K, сам по собі LY249002, не впливав на пікову активність [DA]_o or V_Макс (n= Сайти 29 – 76 (ядро NAc) на препарат, P> 0.05, односторонній дисперсійний аналіз (ANOVA); дані не наведені), проте запобігли вплив інсуліну на викликаний [DA]_o у всіх стриатичних субрегіонах (Рис. 1d та Додатковий рис. 1b, c).

Локалізація InsRs на аксонах DA і ChIs

Спостерігається збільшення в V_Макс для поглинання DA фізіологічними рівнями інсуліну передбачає наявність InsRs на аксонах DA, як і попередні результати в різних стриатальних препаратах^{18, 19, 20, 21, 22}. Хоча функціональна експресія InsRs на нейронах DA середнього мозку була продемонстрована^{15, 23, 24, 25}Експресія InsR на аксонах стриарної DA не повідомляється. Ми розглянули це питання за допомогою імуногістохімії. Щільна імунореактивність InsR протягом всього стриатума обмежувала кількісну оцінку локалізації InsR на аксонах DA, які були ідентифіковані за імунореактивністю для синтезу DA-ферменту, тирозингидроксилази (TH). Тому ми прийняли раніше повідомлений протокол²⁷, який передбачав підрахунок InsR puncta, що перекривається з профілями TH + у звичайному перегляді зображень і знову підраховується після того, як зображення InsR обертається тільки 90 °. Якщо очевидне перекриття профілів InsR і TH + було неспецифічним, ця процедура повинна давати статистично подібні відліки, незалежно від того, звичайні чи 90 ° поза фазою. Однак цей аналіз показав зниження перекриття пункту InsR з профілями TH + з 14 ± 9% (n= Поля 42, P<0.01, парний двохвостий t-тест; Дані не показані), що підтверджують присутність InsR на аксонах DA. Більш інтригуюче, однак, ImR імунологічна на смугастому тілі виявила чітку експресію InsR на великих клітинних тілах, які були ідентифіковані як стриатичні ChIs за допомогою спільного імунолабелінгу для холіну ацетилтрансферази (ChAT), первинного ферменту, необхідного для синтезу ACh. Використання електрофізіологічних критеріїв²⁸ для ідентифікації ChI в попередніх дослідженнях із запису цілих клітин, кілька нейронів заповнювали біоцитином і потім обробляли для імуногістохімії; всі ці (4 / 4) були імунопозитивними як для InsR, так і для ChAT (Рис. 2a). Подальша оцінка локалізації InSr і ChAT в NAc підтвердила, що практично всі ChAT + нейрони виражали InsR (96%; n= Нейронів 27 / 28 у чотирьох секціях з двох щурів).

  

  

(a) ChI, наповнений біоцитином, потім імунобезпечним для ChAT, і InsR (представником ChIs, заповнених біоцитином 4 / 4); об'єднане зображення показує спільну локалізацію; шкала бар, 10 мкм. (b-e) Реакція стритальних ЧІ на серію деполяризуючих імпульсів струму (3-s; 200, 300 і 400 pA; інтервали 120-s) до і після інсуліну (30 nM). (bАдаптація частоти спайку в ЧІ (верхній) спостерігається в розряді втрати потенціалу дії (АП) під час поточного ін'єкції, тоді як піки зберігаються протягом всього імпульсу струму в інсуліні (нижче); повний набір даних, показаний у d. (c) Репрезентативний хід інсуліно-індукованого збільшення числа АР з кожним поточним кроком для ЧІ в b. (d) Підсумок числа АР під час імпульсів струму, що доставляються до і під піковим ефектом впливу інсуліну (n= Парні стимуляції 21, нейрони 7, щури 5) (e) Середні відповіді, що показують вплив інсуліну (+ Ins) в умовах контролю (Con; n= Парні стимуляції 21, нейрони 7, ***P<0.001, парний двохвостий t-тест), в присутності HNMPA (5 μM) (n= Парні стимуляції 12, нейрони 4, щури 4, P>0.05, парний двосторонній t-тест), і в присутності ПЗП (1 мкМ) (n= Парні стимуляції 18, нейрони 6, щури 6, **P<0.01, Wilcoxon підібрана пара підписала ранг-тест). (f) Середній одноімпульсно-викликаний [DA]_o в ядрі NAc до і після інсуліну (30 нМ) у мекамиламіну (Mec; 5 мкМ) або DHβE (1 мкМ), нормалізованого до 100% пікового контролю (n= Сайти 20 – 40 на кожну субрегіон за умовою від щурів 3 – 4, P> 0.05 порівняно з контролем, неспарений t-тест). (g) Середній одноімпульсно-викликаний [DA]_o у зрізах переднього мозку з гетерозиготного контролю (Het) і ЧАТ Миші KO до і після інсуліну (30 nM), нормалізовані до 100% пікового контролю. Підвищений інсулін [DA]_o у гетерозиготних мишей за 190 ± 23% в NAc оболонці, 140 ± 8% в ядрі NAc і 137 ± 12% в CPu (n= Сайти 15 – 25 на субрегіон від мишей 3 – 4 на генотип, **P<0.01, ***P<0.001 порівняно з контролем неспареним t-тест), але не вплинув на виклик [DA]_o в будь-якому стриатическом субрегіоні Росії ЧАТ Миші KO (P> 0.1).

• Повнорозмірне зображення (167 Кб)

 

 

Інсулін підвищує збудливість ЧІ

Щоб перевірити функціональність InsRs на стриатичних ЧІ, ми досліджували вплив інсуліну на збудливість ChI за допомогою реєстрації струмовим струмом у всіх клітинах. Збудливість ChI оцінювали, використовуючи серію деполяризуючих імпульсів струму 3, щоб отримати потенціал дії, який надійно демонстрував адаптацію частоти шипів (2b), часто з втратою spiking до кінця імпульсу струму. Вражаючим чином, інсулін (30 nM) послаблює адаптацію частоти шипів, що призводить до поступового збільшення кількості потенціалів дії протягом часу (Рис. 2c), з максимальним збільшенням (2d, e) зазвичай спостерігається між 20 і 50 хв експозиції інсуліну. За відсутності інсуліну, контрольні ЧІ не показали змін у кількості викликаних потенціалів дії (P> 0.05, спарений двохвостий t-тест; дані не показані); при порівнянні з контрольними нейронами, що контролювалися за той самий інтервал часу, нейрони, піддані впливу інсуліну, показали значно більшу зміну кількості викликаних потенціалів дії (контроль n= Пар 12 стимулу з чотирьох нейронів, інсуліну n= Пар стимуляторів 21 з семи нейронів, F_1,25= 5.63, P<0.05, двосторонній ANOVA змішаних заходів; дані не відображаються). Ефект інсуліну на збільшення потенційного числа дії запобігав HNMPA, але не селективний інгібітор IGF-1R PPP (Рис. 2e), демонструючи, що підвищена збудливість ChI інсуліном була опосередкованою InsR.

Посилення інсуліну викликаного [DA]_o вимагає nAChRs і ACh

Попередні дослідження показали, що ChIs і ACh потенційно регулюють вивільнення стриатального DA через nAChRs на аксонах DA^{29, 30, 31, 32, 33, 34}. Багаторазова експресія InsR на ChIs і посилення збудливості ChI, що спостерігається при гострому впливі на інсулін, показали, що ці нейрони можуть бути новими мішенями для інсуліну, що може призвести до посилення вивільнення DA. Щоб перевірити це, ми вивчили вплив інсуліну в присутності мекамиламіну, неселективного антагоніста nAChR, або дигідро-β-еритроїдину (DHβE), селективного антагоніста для nXhUM, що містять субодиниці β2 (β2 *). Аксон³⁵. Виклик [DA]_o легко виявляли в присутності цих антагоністів, хоча обидва препарати зменшували амплітуду одноимпульсного викликаного [DA]_o (наприклад, 13 – 26% в ядрі NAc), як повідомлялося раніше^{29, 30, 31, 32}. На підтримку ролі ACh і nAChRs вплив інсуліну на викликаний [DA]_o запобігали або мекамиламін, або DHβE (Рис. 2f). Щоб підтвердити причетність сигналізації стриарного ACh в інсуліноподібному вивільненні DA, ми вивчили вплив інсуліну колишніх природних умовах стриатальние скибочки у мишей, у яких експресія ChAT була генетично відмінена в структурах переднього мозку (передній мозок ЧАТ Мишей КО), включаючи стриатум³². Хоча у цих мишей ChIs є інтактними, синтез ACh скасовується, що призводить до зниження, але все ще легко виявляється одноімпульсно-викликаного [DA]._o, як описано раніше³². У контрольних гетерозиготних підлеглих, інсулін (30 nM) збільшився викликаний [DA]_o в оболонці і ядрі NAc і в CPu за 37 – 90% (2g), перевищуючи ампліфікацію, що спостерігається в стриатуме щура (наприклад, Рис. 1). Однак вплив інсуліну на викликаний [DA]_o був відсутній по всьому стриратическому комплексу в передньому мозку ЧАТ Миші KO, що демонструють, що інсулін-опосередковане посилення вивільнення DA вимагає стритального ACh, але не спільно вивільнених передавачів з ChIs, таких як глутамат³⁶.

Вплив інсуліну на викликаний [DA] \ t_o залежить від дієти

Концентрації інсуліну в плазмі і мозку пропорційні до тілесної ожиріння^{6, 7, 8}і може призвести до компенсаторних змін чутливості мозку до інсуліну. Тому ми протестували гіпотезу про те, що дієта впливає на здатність інсуліну сприяти вивільненню DA, використовуючи стриатние зрізи у щурів, які підтримуються на хронічній дієті FR або OB проти контролю AL. Як і очікувалося, рівні інсуліну в плазмі корелювали з масою тіла, з меншим інсуліном у FR, ніж у AL або OB щурівРис. 3a та Таблиця 2). Незважаючи на ці відмінності в циркулюючому інсуліні, викликаний піком [DA]_o в NAc оболонки і ядра, і CPu був значно нижче в колишніх природних умовах стриатальние зрізи обох дієтичних груп порівняно з AL (3b та 2 a, b), що передбачає, що крім інсуліну чинники регулюють абсолютну_o. Вміст Striatal DA не відрізнявся серед дієтичних груп, що вказувало на зміну регулювання вивільнення, а не на синтез DA (Додатковий рис. 2c). Відповідно до зміни динамічної регуляції, чутливість стриатального вивільнення до інсуліну була значною мірою залежною від дієти. У щурів FR концентрації інсуліну ≤1 nM, які не впливали на AL (1b), збільшена викликана [DA]_o (Рис. 3c), що відображає підвищену чутливість до інсуліну, з ЕК₅₀ значення в стриатуме FR (0.4 – 0.6 nM), які були приблизно на порядок нижче, ніж у AL (порівняти) Фіг. 1b та 3c). При вражаючому контрасті ефект інсуліну втрачався в OB striatum; інсулін 30 nM, який мав максимальний ефект при стриатуме AL (1b), не мали ефекту в OB (Рис. 3c).

  

  

(a) Концентрація інсуліну в плазмі позитивно корелює з масою тіла у групах, що годують (R= 0.76). (b) Середній одноімпульсно-викликаний [DA]_o в ядрі NAc (див Додаткова фіг. 2a, b для оболонки NAc і CPu) була нижчою у FR (38 ± 4%) і OB (25 ± 4%) проти AL (n= Сайти 50 – 60 з щурів 5 – 6 на групу дієти, F_2,156= 23.337, одностороння ANOVA, Tukey HSD; ***P<0.001); OB проти FR (P<0.08). (c) Чутливість викликаного [DA]_o інсуліну посилювали в FR, але втратили в OB (n= Сайти 21 – 49 на субрегіон на концентрацію щурів 2 – 4 на одну дієтичну групу, односторонню ANOVA, Tukey HSD), з більшою чутливістю у щурів FR проти AL у всіх субрегіонах (P<0.001 для кожного регіону; двосторонній ANOVA; ЦП: F_{(конц. дієта; 3,286)}= 10.253; ядро: F_{(конц. дієта; 3,353)}= 6.166; оболонка: F_{(конц. дієта; 3,195)}= 10.735).

• Повнорозмірне зображення (124 Кб)

 

 

Ці дані вказують на зворотну залежність між чутливістю стриральних інсультів і ожирінням тіла. Альтернативно, однак, ці залежні від дієти відмінності можуть відображати змінену чутливість до nAChR. Тому ми визначили відповідь на концентрацію нікотину в ядрі NAc з кожної дієтичної групи. Нікотин викликає десенсибілізацію nAChR, яка може бути кількісно визначена шляхом порівняння співвідношення [DA]_o викликаний коротким потягом з п'яти імпульсів на 100 Гц до одноимпульсного викликаного [DA]_o (5 p: коефіцієнт 1 p) як індекс активації / десенсибілізації nAChR^{30, 31}. Використовуючи цей підхід, ми не виявили відмінностей між дієтичними групами в чутливості nAChR в ядрі NAc (Додаткова Рис. 3a – c). Крім того, відношення контрольних 5 p: 1 p не відрізнялося серед дієтичних груп в ядрі NAc (Додаткова Рис. 3d) або CPu (не проілюстровано), що означає, що дієта не змінює nAChR-залежне регулювання вивільнення DA. Таким чином, чутливість стриральної InsR, як видається, посилюється у щурів FR проти AL, але відсутня в OB щурів, з втратою регуляції вивільнення striatal DA при фізіологічних концентраціях інсуліну.

Інсулін оболонки NAc модулює кондиційний смак аромату

Харчові переваги породжуються як до-, так і посттравматичними факторами; механізми для кожного з них не повністю вирішені, але поточні докази вказують на сигналізацію NAc DA в обох^{37, 38}. Враховуючи, що рівень інсуліну в плазмі та цереброспінальній рідині (CSF) швидко зростає після підвищення периферичної глюкози⁶і що збільшення інсуліну в смугастому тілі може бути виявлено протягом 5 хв підвищення плазми інсуліну⁷логічно припустити, що вивільнення периферичного інсуліну під час їжі може підвищити вивільнення NAc DA і сприятиме механізмам винагороди після ін'єкції. Ми адаптували раніше описаний протокол аромату³⁷ з сахариновими розчинами глюкози у щурів для перевірки гіпотези, що блокування ефекту ендогенного інсуліну через місцеве застосування антитіла до інсуліну (InsAb) в NAc зменшить переваги для парного аромату. Ефективність InsAb у блокуванні ефектів інсуліну була випробувана в пробірці аналіз поглинання DA в стрианальні синаптосоми. Інсулін (30 nM) викликав значне збільшення в V_Макс у синаптосомах з NAc або CPu (Додатковий рис. 4), узгоджується з нашим V_Макс дані зі стритальних фрагментів (Таблиця 1) і з попередніми дослідженнями^{18, 19, 20, 21, 22, 23}. У відсутність інсуліну ні InsAb, ні контрольний антитіло імуноглобуліну G (IgG) не змінювали V_Макс для поглинання DA проти контролю. У присутності IgG інсулін ще викликав значне збільшення в V_Макс; проте вплив на інсулін V_Макс було втрачено в присутності InsAb (Додатковий рис. 4).

Щоб мінімізувати пошкодження тканин і зберегти чутливість тканинної мішені, були протестовані дві групи суб'єктів, в яких ми чергували внутрішньо-NAc мікроін'єкцію з процедурою мікроін'єкції, а не використовували одну групу суб'єктів і спарювали один ароматизований розчин з InsAb та іншим транспортного засобу. Отже, під час сеансів кондиціонування однієї пляшки експериментальна група отримувала мікроін'єкції InsAb, сполучені з одним з двох смаків, і на змінних сеансах, макетні мікроін'єкції, сполучені з іншим ароматом (Рис. 4a, зліва). Контрольна група отримувала макетні мікроін'єкції, що чергувалися з микроинъекциями або фосфатно-буферного сольового розчину (PBS) або IgG. Обидва ароматизовані розчини містили глюкозу під час кондиціонування. В контрольній мікроін'єкційній групі не очікувалося диференційованої переваги між ароматизаторами, тоді як очікувалося, що перевага буде зміщуватися в бік макетного мікроін'єкційно-парного аромату в InsAb-микроинъецированной групі.

  

  

(a) Діаграма, що ілюструє кондиціювання однієї пляшки (ліворуч) і тест на дві пляшки (праворуч). (bОб'єм споживання (мл) під час сеансів кондиціонування. Існувала значна взаємодія між сеансом інфузійного кондиціонування та мікроін'єкційним лікуванням (n= Щури 19 – 20 на групу, F_(3,111)= 3.088, P<0.05, 2 × 4 змішаної ANOVA з повторними заходами на сеансі кондиціонування інфузії). Мікроін’єкція InsAb значно зменшила споживання порівняно з контролем протягом третього (t(40) = 3.026, **P<0.01) і четвертий (t(40) = 3.052, **P<0.01, захищений однобічний t-тести) інфузії. Мокетні ін'єкції не впливали на споживання в обох групах (F_3,111= 1.110, 2 × 4 змішують ANOVA з повторними заходами на сеансі макетного кондиціонування). (cОб'єм, витрачений під час випробування аромату з двома пляшками. Існувала значна взаємодія між ароматизатором і мікроін'єкційним лікуванням під час кондиціонування (F_1,37= 5.36, P<0.05, двосторонній змішаний ANOVA з повторними вимірами щодо смаку). Група InsAb споживала значно менше аромату, сполученого з InsAb, порівняно з ароматом, що був здвоєним (t(18) = 2.82, ** P<0.01, захищений однобічний t-тест); контрольна група не показала переваги смаку (t(19) = 0.803, P> 0.05, захищений t-тест). Порівнюючи групи, щури InsAb випивали значно менше смаку інфузійно-парних (t(40) = 1.96, *P<0.05) і значно більша кількість притворного аромату (t(40) = 1.77, *P<0.05, захищений однобічний t-тест), ніж контроль.

• Повнорозмірне зображення (161 Кб)

 

 

Під час сеансів кондиціонування на одному флаконі мікроін'єкція InsAb значно зменшила споживання порівняно з автомобілем під час третьої та четвертої інфузій (4b). На відміну від цього, обидві групи споживали однаковий об'єм розчину протягом всіх чотирьох сеансів інтелектуальної ін'єкції (F_3,111= 0.127, P>0.05, змішана двостороння ANOVA) (4b). Після проведення восьми сеансів кондиціонування, ароматизація була оцінена в тесті двох пляшок, в якому щури мали доступ до обох ароматизованих розчинів одночасно (Рис. 4a). Статистичний аналіз виявив значну взаємодію між ароматом і мікроін'єкційною обробкою, отриманої під час кондиціонування (Рис. 4c). Група InsAb споживала значно менше аромату InsAb-пар, порівняно з макет-парним смаком (Рис. 4c), тоді як група транспортних засобів не показала переваги смаку (Рис. 4c), маючи на увазі, що інтактна інсулінова сигналізація сприяла виділенню солодкого калорійного розчину. У порівнянні з носієм щури InsAb мікроін'єкційно випили значно менше аромату інфузійно-парного аромату і значно більшої кількості ароматизованих парних ін'єкцій (Рис. 4c). Мікроін'єкція IgG (t(9) = 0.792. P>0.05, захищений t-тести) або PBS (t(9) = 0.442. P>0.05, захищений t-тести) не впливали на смакові переваги (дані не показані), стверджуючи, що неспецифічний ефект мікроін'єкції InsAb зменшив споживання або смакові переваги. Слід також зазначити, що перевага групи InsAb при випробуванні не є перевагою для менш нового аромату, оскільки не існувало взаємодії між сеансом і типом сеансу (фактична інфузія проти макетної інфузії) для групи InsAb (F_3,54= 1.584, P> 0.05, двостороння ANOVA). Тобто група InsAb не споживала більше аромату, що поєднується з інфузійною парі, порівняно з ароматом, сполученою з інфузією InsAb; швидше, відмінності між групами лікування виявилися лише під час сеансів кондиціонування інфузії. Загалом, ці дані вказують на те, що інсулін у NAc відіграє певну роль у посиленні переваги смаку, який сигналізує про глікемічне навантаження.

Ми повідомляємо, що інсулін посилює вивільнення стриатального DA в залежному для nAChR способі, модулюючи збудливість ChI через InsRs. Наші результати показують, що інсулін може слугувати сигналом винагороди, на додаток до його встановленої ролі в сигналізації ситості. Примітно, що вплив інсуліну на вивільнення ДА модулюється дієтою, з помітно підвищеною чутливістю до інсуліну після ФР, але повна втрата регульованого інсуліном регулювання на дієті ОВ. Ці зміни відображають зміни в чутливості до InsR, які обернено пов'язані з циркулюючими рівнями інсуліну, враховуючи, що рівень інсуліну в плазмі залежав від дієти, але чутливості nAChR не було. Нарешті, наші дослідження смакових переваг у поведінці тварин свідчать про те, що передача інсуліну в оболонці NAc впливає на переваги харчових продуктів, що не тільки впливає на інсулін у навчанні, пов'язаному з харчовими продуктами, але також підтверджує його роль як винагороди.

Чиста [DA]_o відображає баланс між вивільненням DA і захопленням DA через DAT. Попередні дані, що показують, що інсулін може регулювати активність DAT^{18, 19, 20, 21, 22, 23} призвели до прогнозу, що збільшення інсуліну має викликати чисте зниження викликаного [DA]_o за рахунок збільшення поглинання DA. Однак ми виявили, що в смугастому тілі ефект інсуліну є більш складним, ніж це. Хоча експозиція інсуліну зростала V_Макс для DAT, первинний ефект інсуліну був на вивільнення DA, а не на поглинання DA, з послідовним збільшенням викликаного [DA]._o через фізіологічний діапазон концентрацій інсуліну в оболонці і ядрі NAc і в CPu. Хоча збільшення викликано [DA]_o повернулися до контрольних рівнів при суперфізіологічній концентрації 100 nM, V_Макс також не змінювався від контролю, усуваючи переважну дію на DAT як пояснення. Навпаки, втрата ефекту на поглинання, а також вивільнення призводить до десенсибілізації InsRs або зниження регуляції сигнальних шляхів нижче за високими концентраціями інсуліну. Дійсно, InsRs піддаються швидкому ендоцитозу і деградації після зв'язування інсуліну в периферичних тканинах¹, з з'являються свідчення про втрату чутливості нейронів InsR після короткочасного впливу високих рівнів інсуліну або висококалорійних дієт^{10, 11, 39}.

Домінуючий ефект інсуліну для посилення стріальної резистентності ДА повідомляється тут контрастує з результатами двох інших останніх колишніх природних умовах дослідження зрізу. У першому інсулін викликав зменшення електрично викликаного переповнення³H] DA з стриатальних зрізів, хоча збільшується [³H] переповнення DA було виявлено при інгібуванні DAT²². Враховуючи, що звільнено³H] DA повинен уникнути опосередкованого DAT поглинання по всій тканині, що виявляється в суперфузирующем розчині, цей протокол особливо чутливий до регулювання DAT. Наші результати, які показують, що інсулін підвищує вивільнення DA через ChIs і активацію nAChR, на додаток до посилення DAT-опосередкованого поглинання, пояснює, здавалося б, парадоксальне збільшення інсуліну³H] DA переповнення видно, коли конкуруючі ефекти на DAT були заблоковані²². Друге дослідження використовувало FCV для прямого виявлення соматодендритного вивільнення DA у VTA, але також виявило переважний вплив інсуліну на поглинання DA, що відбилося на зменшенні викликаного [DA]._o (вих. 23). Відмінності в ряді факторів, від локальних мікросхем до соматодендритних і аксональних механізмів вивільнення DA⁴⁰, могли б сприяти цьому регіональному відмінності. Проте, як обговорюється нижче, регіонально залежні ролі інсуліну, швидше за все, будуть взаємодоповнюючими, а не суперечливими.

Раніше будь-яка роль інсулінозалежної регуляції сигналізації DA передбачалася опосередкованою безпосередньою активацією InsRs на DA нейронах. Ми показуємо, що InsRs також експресуються на стриатичних ChIs, і що інсулін модулює збудливість ChI для посилення вивільнення striatal DA, що може відігравати ключову роль у впливі інсуліну на дієту. Striatal ChIs отримують проекції від нейронів внутрішньоламінарних ядер таламуса, які демонструють вибуховий випал у відповідь на виразні сенсорні стимули і допомагають приводити до вибухових пауз у ChIs, які мають важливе значення для привернення уваги, підкріплення та асоціативного навчання.⁴¹. Таким чином, дія інсуліну у InsRs на стриатичних ЧІ може підвищити ефект сенсорних харчових сигналів на стриатильну чутливість до випалу таламуса, що сприяє підвищенню сприйняття цінності їжі. Безпосереднє заохочення вивільнення стриатного ДП шляхом активації ЧІ призвело до припущення, що фактори, які стимулюють ЧІ, матимуть привілейовану роль як тригери випуску ПД³³. Наші дані дають перші підтверджуючі докази для цього, з підвищеною чутливістю до інсуліну і ACh, що сигналізує про динамічне збільшення вивільнення DA.

Підвищене вивільнення DA в присутності інсуліну також обґрунтовує посилення в сигналізації ACh до ступеня, що викликає десенсибілізацію nAChR або активацію мускаринового рецептора ACh (mAChR), будь-яка з яких може пригнічувати одне імпульсно-викликане [DA]_o (посилання) 29, 30, 31, 42). Таким чином, механізми, описані тут, відрізняються від активації ACh mAChRs, яка була пов'язана з відхиленням і ситості⁴³.

Однозарядний [DA]_o був нижчим як у щурів FR, так і OB, ніж у щурів AL; хоча ці результати співпадають з попередніми звітами^{44, 45, 46}Наші дослідження забезпечують перше систематичне порівняння трьох стриатичних субрегіонів у двох дієтичних групах протягом постійного часу. Механізми, що лежать в основі дієтозалежних змін вивільнення ДА, не з'ясовані і виходять за рамки цих досліджень. Однак, враховуючи, що рівні плазмового інсуліну протилежно змінені за допомогою дієт FR і OB, малоймовірно, щоб зниження викликало [DA]._o в обох групах є наслідком дієтозалежних рівнів інсуліну.

З іншого боку, зміни в чутливості до InsR з дієтою та послідовним рівнем інсуліну плазми, що залежить від дієти, є найбільш імовірним поясненням підвищеної чутливості до інсуліну в FR і втрати чутливості до інсуліну в OB. Не було жодних доказів для альтернативного пояснення зміненої чутливості nAChR у FR або OB щурах проти AL. Хоча наші висновки є одними з перших, що вказують на підвищену стриатическую чутливість InsR з FR¹⁸втрата ваги може супроводжуватися зниженням рівня інсуліну в ЦСЖ⁷, що сприяло б підвищенню чутливості вивільнення DA до інсуліну у ФР. І навпаки, втрата чутливості до інсуліну у щурів О.Б.^{3, 10, 11}.

наш колишніх природних умовах дані зрізу підтверджують гіпотезу, що інсулін може сигналізувати як про винагороду, так і про насиченість. Ми протестували цю гіпотезу, блокуючи дію ендогенного інсуліну з двосторонньою мікроін'єкцією InsAb в оболонці NAc під час кондиціонування аромату. Відповідно до ролі у винагороді, блокування ефекту інсуліну знижувало перевагу аромату парного глюкозосодержащего розчину проти аромату, пов'язаного з інтактною інсуліновою сигналізацією. Блокування інсуліну в оболонці NAc також зменшило споживання парного розчину при одноразовому кондиціонуванні, тоді як макетні або контрольні мікроін'єкції не впливали на споживання. Ці дані свідчать про те, що інсулін в оболонці NAc відіграє певну роль в перевазі харчування. Попередні дослідження показали, що інтактна сигналізація DA в NAc необхідна для придбання кондиціонування смаку^{37, 38}, підтверджуючи роль NAc DA в опосередкуванні підсилюючих ефектів харчових розчинів. У цьому світлі перевага для розчину глюкози у парі з інтактною доступністю інсуліну є аргументом проти первинного ефекту інсуліну на DAT-опосередкований поглинання DA в оболонці NAc, оскільки це очікується зменшення [DA]_o і, отже, зменшують споживання аромату, що має контрольно-парний характер. Наші результати також узгоджуються з результатами попереднього дослідження, в якому мікроін'єкція інсуліну в оболонці NAc збільшувала час залучення тварин до перорального самозастосування сахарози з прикордонним збільшенням споживання сахарози.²⁶, що було протилежним очікуваного наслідку поглинання DA. В цілому, ці поведінкові дані узгоджуються з прогнозованим впливом інсуліну на стриатичні ЧІ та посилене вивільнення DA. Однак ці результати не виключають залучення інших елементів стриральної мікросхеми в контрольовану поведінку, отриману широку експресію InsR у всьому стриатуме^{1, 14}.

Дослідження, наведені тут, є першим доказом того, що інсулін відіграє певну роль у передачі калорійності, а отже, корисного ефекту прийому їжі, що має важливі наслідки для впливу інсуліну у суб'єктів з недостатнім вагою і ожирінням. Декілька досліджень вказують на те, що постгетативні ефекти їжі, незалежно від того, чи є шляхи трансдукції смаку цілими⁴⁷збільшити вивільнення NAc DA і позитивне посилення поведінки^{37, 47}. Таким чином, пост-абсорбційний інсуліновий відповідь може кодувати глікемічний вихід їжі і сприяти посиленню харчових переваг і поведінки, які дозволяють споживання. Проте, екстремальні зміни рівня циркулюючого інсуліну і центральна чутливість до InsR можуть відігравати певну роль у порушенні, а також адаптивної поведінки. Наприклад, гіпоінсулінемія і компенсаторна регуляція чутливості InsR у суб'єктів ФР може бути фактором у їх схильності до випивки⁴⁸. Навпаки, центральна нечутливість до інсуліну при цукровому діабеті II типу або ожирінні, що відображається тут у щурів О.Б., може сприяти зменшенню почуття винагороди після прийому їжі, споживання їжі з високим глікемічним індексом як компенсація^{49, 50}. Таким чином, або збільшення, або зменшення чутливості стриатику до інсуліну може сприяти патологічному прийому їжі, що призводить до переїдання і / або ожиріння.

В цілому, наші результати показують нову роль інсуліну як сигналу винагороди. Така роль контрастує зі своєю відомою функцією сигналу насичення, включаючи недавні висновки про те, що інсулін, інженерно введений у VTA, може зменшити гедонічне харчування та переваги для сигналів, пов'язаних з винагородою за їжу^{23, 24}. Це ставить питання про те, як, здавалося б, протилежні ролі інсуліну в цих DA-залежних функціях можуть бути узгоджені. Відповідь може бути, що ці ефекти є взаємодоповнюючими, а не суперечливими. Наведені результати свідчать про те, що інсулін в смугастому тілі повідомляє цінність винагороди при попаданні в їжу. Двояка роль у сигналізації про насиченість може просто дозволити інсуліну служити важливій меті закінчення прийому їжі, одночасно встановлюючи пам'ять про його поживні та, таким чином, корисні якості, тим самим посилюючи повторення проковтування.

Обробка тварин

Процедури для тварин виконувалися відповідно до керівних принципів NIH та схвалені Комітетом з догляду та використання тварин у Школі медицини Нью-Йоркського університету. Всі тварини знаходилися на світло 12 h: темний цикл, з висвітленням від 06: 00 до 18: 00; колишніх природних умовах зрізи готували між 08: 00 і 12: 00. Механістичні дослідження в AL щурів і мишей були проведені в Росії колишніх природних умовах зрізи тварин розміщувалися парами, тоді як щури були одноразово розміщені для всіх порівнянь групи дієт і для поведінкових досліджень.

Режими харчування для щурів

Дорослі самці щурів Sprague – Dawley (Taconic) були 8 – 10 тижнів при ініціюванні дієтичних схем тривалістю 21 – 30 днів. Щурів розподіляли напів-випадковим чином на групи дієти: суб'єктів ранжирували за початковою вагою, потім кожну наступну трійку щурів розподіляли випадково серед дієтичних груп. Щури AL мали вільний доступ до чау для щурів протягом того ж періоду, що і парні щури на дієтах FR або OB. У всіх щурів був вільний доступ до води. Обмеження на харчування відбувалося, як і раніше⁵¹; Коротко, щури отримували 40 – 50% прийому АЛ стандартної панчохи для щурів щодня, доки маса тіла не зменшувалася на 20%, після чого їжу титрували для підтримки цієї ваги. ОБ щури мали вільний доступ до чау-чау і шоколаду для щурів. Це дуже вкусна рідина з помірно високим вмістом жиру і цукру⁵².

Передній мозок ЧАТ нокаутних мишей

Миші з умовно-флокуваним алелем ЧАТ (ЧАТ^flox) були схрещені з Nkx2.1^Кре трансгенної лінії для продукування мишей, в яких абляція синтезу ACh обмежена переднім мозком³². Немутантними трансгенними літерами були контролі; їх генотипи Cre⁺;ЧАТ^{flox / +} і Кре^-;ЧАТ^{flox / flox} називаються "гетерозиготами". Дорослим самцям мишей, що використовувалися для дослідження зрізів, були ad libitum доступ до чау та води.

Ex vivo приготування зрізу і фізіологічні розчини

Щури або миші були глибоко анестезовані за допомогою 50 мг кг^-1 пентобарбітал (внутрішньоочеревинний (ip)) і декапітований. Для вольтамперометрії зрізи корональних передніх волокон (товщина 300 – 400-мкм) були розрізані на мікротомі Leica VT1200S (Leica Microsystems; Bannockburn, IL) у льодовий HEPES-буферний штучний CSF (aCSF), що містить (мМ): NaCl (120); NaHCO₃ (20); глюкоза (10); Кислота HEPES (6.7); KCl (5); Натрієва сіль HEPES (3.3); CaCl₂ (2); і MgSO₄ (2), врівноважену 95% O₂/ 5% CO₂. Зрізи потім витримували в цьому розчині при кімнатній температурі протягом 1 год до експерименту^{30, 32, 53}. Для електрофізіології, після анестезії, щурів перффузировали транскардиально з охолодженим льодом розчином, що містить (в мМ): сахарозу (225); KCl (2.5); CaCl₂ (0.5); MgCl₂ (7); NaHCO₃ (28); NaH₂PO₄ (1.25); глюкоза (7); аскорбат (1); і піруват (3), і врівноважену 95% O₂/ 5% CO₂. Зрізи розрізали в цьому розчині, потім переносили в камеру для відновлення в модифікованому aCSF, що містить (в мМ): NaCl (125); KCl (2.5); NaH₂PO₄ (1.25); NaHCO₃ (25); MgCl₂(1); CaCl₂ (2); глюкоза (25); аскорбат (1); піруват (3); і myo-инозитол (4), врівноважений з 95% O₂/ 5% CO₂; цей розчин спочатку при 34 ° C, потім давали охолонути поступово до кімнатної температури⁵⁴. Всі експерименти з вольтамперометрії та фізіології були проведені в камері для запису занурення при 32 ° C, яка була злита на 1.5 мл^-1 з aCSF, що містить (в мМ): NaCl (124); KCl (3.7); NaHCO₃ (26); CaCl₂ (2.4); MgSO₄ (1.3); KH₂PO₄ (1.3); і глюкоза (10) і бичачий сироватковий альбумін (BSA, 0.05 – 0.1 мг.^-1) врівноважено з 95% O₂/ 5% CO₂; Зрізи дозволяли врівноважити в цьому середовищі протягом 30 хв до експерименту.

Циклічна вольтамперометрія швидкого сканування

Дослідження, викликані вивільненням DA, проводили з використанням FCV в зрізах мозку^{32, 53} готують від самців щурів або ЧАТ миші з нокаутом переднього мозку та гетерозиготні контролі (5 – 8 тижнів). Навчання в Росії ЧАТ нокаутні миші були засліплені, але групи раціонів щурів мали очевидні фенотипи, які перешкоджали сліпу. Вольтамперометричні вимірювання проводилися за допомогою вольтамперометра Millar (доступний за спеціальним запитом д-ру Julian Miller в St Bartholomew і Королівській Лондонській школі медицини і стоматології Лондонського університету). Для FCV використовувалася звичайна трикутна форма сигналу, діапазон сканування −0.7 до + 1.3 V (проти Ag / AgCl), швидкість сканування 800 V s^-1і інтервал вибірки 100 мс^{30, 32, 53}. Дані були отримані за допомогою плати DigiData 1200B A / D, керованої програмним забезпеченням Clampex 7.0 (Molecular Devices). Вивільнення DA викликали за допомогою концентричного стимулюючого електрода; Амплітуда імпульсу стимулу становила 0.4 – 0.6 мА і тривалість 100 мкс^{30, 32, 53}. Локальна одноімпульсна стимуляція була використана в ядрі NAc і CPu; однак для посилення викликаного короткого струму використовувався короткий високочастотний потік імпульсів (п'ять імпульсів на 100 Гц)_o в оболонці NAc. Обидві парадигми стимулу викликають вивільнення DA, тобто потенціал дії і Ca²⁺ залежні, не піддаються впливу одночасно вивільненого глутамату і ГАМК^{42, 55}і полегшується одночасно вивільненим ACh^{29, 30, 31, 32, 33, 34}. Кількісно оцінити виклик [DA]_o, електроди калібрували з відомими концентраціями DA при 32 ° C після кожного експерименту в aCSF і в присутності кожного лікарського засобу, використаного під час даного експерименту⁵³.

Експерименти з вольтамперометрії для оцінки впливу інсуліну на викликаний [DA]_o були отримані з використанням одного з двох протоколів. Початкові експерименти для визначення часу впливу інсуліну (Sigma, I5523) були проведені за допомогою моніторингу виклику [DA]_o кожен 5 хв на одному сайті. Інсулін застосовувався після послідовного викликання [DA]_o було отримано (зазвичай вимірювання 4 – 5); ефект інсуліну був максимальним після хв. 50 – 60 хв, а потім викликаний [DA]_o залишався на цьому рівні протягом тривалості експерименту (як правило, 90 хв загального впливу інсуліну; Рис. 1c). Згодом вплив інсуліну оцінювали за допомогою запису [DA]._o на дискретних ділянках 4 – 5 на зрізах (+ 1.5 мм від брегми) в кожному з трьох стриатичних субрегіонів в умовах контролю (aCSF або aCSF плюс препарат) і знову під час максимального ефекту інсуліну (відбір проб протягом 60 – 80 хв), ці зразки були усереднені для кожного субрегіону. Ефект інсуліну зменшувався з часом після приготування зрізу; для мінімізації часу колишніх природних умовах і для оптимізації використання тварин, як правило, дві зрізи даної тварини були випробувані в камері запису одночасно. Лікарські засоби, які використовувалися для оскарження ефекту інсуліну, застосовували 15 хв до інсуліну через суперфузинг aCSF, включаючи HNMPA trisacetoxymethyl ester (HNMPA-AM)._3; Enzo Life Sciences), S961 (Ново Нордіск), LY294002 (Sigma), пікроподофілотоксин (PPP; Tocris), мекамиламин (Tocris) і DHβE (Tocris). Як описано в результатах, можлива змінена чутливість нікотинових рецепторів ACh серед дієтичних груп була перевірена шляхом порівняння співвідношення піку [DA]._o викликано 5 p (100 Гц), що викликано 1 p викликом (5 p: 1 p співвідношення)^{30, 31} в ядрі NAc в присутності нікотину 0 – 500 nM (Sigma).

Визначення V _Макс від викликаного [DA]_o перехідні процеси в стриатичних зрізах

Щоб оцінити індуковані індуковані зміни в DAT-опосередкованому поглинанні DA, початкова частина падаючої фази викликаного [DA]_o Криві були пристосовані до рівняння Міхаеліса – Ментена для вилучення V_Макс (максимальна константа швидкості поглинання)⁵⁶. K_m (що обернено пов'язано з спорідненістю DAT для DA) було зафіксовано на 0.2 μM і, як відомо, є подібним через стриатичні субрегіони⁵⁷ і не піддаються впливу інсуліну (див Додатковий рис. 4 підпис).

Записування на всі клітини

Зрізи головного мозку готували з щурів-самців 29- до 35-день; умови запису були ідентичні тим, які використовувалися в дослідженнях вивільнення DA. Записи цілого клітини струмового струму використовували звичайні методи⁵⁴. Striatal ChIs візуалізували, використовуючи мікроскоп Olympus BX51WI (Olympus America, Center Valley, PA) з інфрачервоною контрастною оптикою з диференційними інтерференціями та об'єктивом поглинання води 40. Розчин піпетки містив (в мМ): K-глюконат (129); KCl (11); HEPES (10); MgCl₂ (2); EGTA (1); Na₂-АТР (2); Na₃-GTP (0.3); і доводять до рН 7.2 – 7.3 з КОН. Для того, щоб зареєстровані нейрони були оцінені для імунореактивності ChAT, біоцитин 0.3% був включений в розчин піпетки, і нейрони ретельно зареєстровані (~ 5 min) для мінімізації розведення внутрішньоклітинного вмісту. Опір пипеток становив ~ 3 – 5 MΩ. Записи були отримані з використанням підсилювача Axopatch 200B (Molecular Devices, Sunnyvale CA) і фільтра низьких частот на кГц 2. ChIs були ідентифіковані за встановленими електрофізіологічними критеріями²⁸; Більшість з них були тонічно активними спочатку, але активність зменшувалася мінливо після латання. Однак реакція на ін'єкцію в даний час була загалом стійкою і послідовною з часом, і тому використовувалася для дослідження ефекту інсуліну на збудливість ChI (див. Результати). В експериментах для вивчення ролі InsRs і IGF-1Rs у цьому відповіді або HNMPA, або PPP застосовували протягом щонайменше 20 хв, перш ніж ChI було виправлено. Максимальні ефекти самого інсуліну, як правило, спостерігалися після ~ 16 хв експозиції, хоча в деяких клітинах збільшення не було максимальним до 50 хв або довше. Більш того, у чотирьох з шести нейронів, зареєстрованих в РРР, інсулін викликав початкове зменшення кількості спайків до відновлення і перевищення початкового числа спайків. Отже, у всіх експериментах вплив інсуліну визначали кількісно шляхом порівняння максимального ефекту з числом спайків з кількістю спайків, викликаних безпосередньо перед застосуванням інсуліну. Явна різниця в часі досягнення пікового ефекту може відображати ряд факторів, включаючи глибину записаної клітини в зрізі. Виявлені потенціали дії також були зареєстровані в ChIs за відсутності інсуліну в порівнянні моменти часу.

Високоефективна рідинна хроматографія

Вміст DA у шматочках стриаталів щурів (товщина 400-μm) визначали за допомогою високоефективної рідинної хроматографії з електрохімічним детектуванням⁵⁸. Пари зрізів були врівноважені для 30 хв при 32 ° C в aCSF, а потім один зріз на пару інкубували протягом додаткових 60 хв при 32 ° C в aCSF, в той час як інший інкубували в aCSF з інсуліном 10 або 30 nM. Для порівняння з дієтичними групами, тканина стриата була зібрана між 30 – 60 хв після відновлення. Після інкубації надлишок aCSF обережно видаляли з зрізів, зразок тканини зі шнурок (7 – 10 мг) зважували, заморожували на сухому льоду і потім зберігали при зберіганні при -80 ° C. У день аналізу зразки обробляли ультразвуком в крижаному, елюенті, дезоксигенированном аргоном⁵⁸, центрифугували в микроцентрифуге за 2 хв і супернатант вводили безпосередньо в колонку ВЕРХ (BAS, West Lafayette, IN); детектор був склоподібним вуглецевим електродом, встановленим на 0.7 V проти Ag / AgCl.

Імуногістохімія

Для імуногістохімічного маркування щурів анестезировали пентобарбіталом натрію (50 мг \ t^-1, ip), потім перффузируют транскардиально з PBS (154 mM NaCl в 10 mM фосфатному буфері, рН 7.2) з наступним 4% параформальдегідом в цьому PBS; зняли мозок і вирізали корональні зрізи (20 мкм) і умовно обробляли^{27, 59}. Зображення іммунофлуоресценції були отримані з конфокальним мікроскопом Nikon PM 800, обладнаним цифровою камерою, керованою програмним забезпеченням Spot (Diagnostic Instruments Inc.) та з використанням об'єкта × 100 (числова апертура = 1.4) або конфокального мікроскопа Zeiss LSM 510 з використанням × 63 об'єктив (числова апертура = 1.2). Лазерами були аргон (488 nm), He / Ne (543 nm) та He / Ne (633 nm). Відповідні фільтри для кожного лазера були обрані за допомогою програмного забезпечення конфокальної мікроскопи. Розмір щілини змінювався з використовуваним об'єктом і вибраною товщиною секції z- генерація стеку; ми вибрали оптимальне значення отвору, вказане програмним забезпеченням (зазвичай 30 мкм). Цифрові файли були проаналізовані за допомогою програмного забезпечення деконволюції (AutoQuant Imaging), з кінцевими зображеннями, обробленими за допомогою Adobe Photoshop 7.0. Всі зображення були налаштовані на яскравість і контрастність; такі корективи були зроблені рівномірно для всіх частин зображення. Аксони Striatal DA були ідентифіковані з використанням двох антитіл TH: поліклонального кролячого анти-TH (152: 1) і моноклонального мишачого анти-TH (800: 318) (обидва з Chemicon). Використовували три антитіла InsR: sc-1 і sc-500 (57342: 09; Santa Cruz) і PP1 (подарунок від Pfizer). Специфічність кожного з них була продемонстрована раніше^{60, 61}, і було підтверджено в цих дослідженнях відсутність иммуноблокирования з антитілами sc-57342 або PP5 в присутності відповідного блокуючого пептиду. Антитіло ChAT було AB144 (1: 200; Millipore), і біотин був від Vector (1: 200). Вторинними антитілами використовували осел анти-кролика Alexa 488 (Invitrogen), або осла анти-кролика Cy2 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), осел анти-кози Cy3 (Jackson) і віслюк анти-миша Cy5 (Jackson).

Для оцінки спільної локалізації InsRs в аксонах TH + ми використовували методи, описані раніше для виявлення присутності Kir6.2, порообразующей субодиниці АТФ-чутливих K⁺ канали в аксонах DA²⁷. Puncta, що представляє собою InsRs, розподіляли по впорядкованим зображенням, що вказувало на те, що накладання з імунореактивністю TH може відбуватися певною мірою випадково. Щоб перевірити це припущення, ми підрахували суперпозиції InsR / TH у незалежних полях 42 у трьох імунобелячних ділянках NAc з двох щурів. Цифрові файли InsR потім були повернені 90 ° за годинниковою стрілкою, і підрахунок повторився; обертання зменшило кількість пунктів InsR, які локалізовані з TH у більшості полів (див. Результати). Зменшення кількості накладених об'єктів з обертанням²⁷ вказували частку InsR puncta в кожному стриатальному полі, асоційованому з аксонами DA.

Глюкоза крові і інсулін ELISA

Стовбування крові збирали під час декапітації для дослідження зрізу. Глюкозу в крові визначали негайно за допомогою стандартного монітора глюкози в крові. Для інсуліну збирали додаткову кров у пробірки, що містять EDTA, і центрифугували на 1,500g для 15 хв; супернатант (плазму) збирали і зберігали при -80 ° C до обробки за допомогою набору ELISA для інсуліну щурів ALPCO.

Розміщення канюлі і гістологічна верифікація

Сорок один дорослий самець щурів Sprague – Dawley (Taconic і Charles River), які спочатку зважували 350 – 425 g, були анестезіровані кетаміном (100 мг / кг)^-1, ip) і ксилазин (10 мг кг^-1, ip) і стереотаксично імплантують з двома хронічно розташованими канюлями керівництва (датчик 26), розміщеним двосторонньо дорсально до місць інфузії 2.0 мм в медіальній оболонці NAc⁶² (1.6 мм напередодні bregma; 2.1 мм збоку до сагітального шва, наконечники під кутом 8 ° до середньої лінії, 5.8 мм вентрально до черепної поверхні). Щурам давали банамін (2.0 мг кг^-1, підшкірний) як післяопераційний аналгетик після одужання після наркозу та вранці після неї. Через тиждень після операції щурів поміщали на FR (описаний вище) і підтримували при 80% від їх післяопераційної відновлення ваги до кінця дослідження. Розміщення канюлі визначали гістологічно після завершення поведінкового тестування. Кожна пацюка була вбита CO₂, обезголовили, а мозок видалили і зафіксували у 10% забуференному формаліні протягом> 48 год. Заморожені корональні зрізи (товщина 40 мкм) нарізали на кріостаті Рейхерта-Юнга, відтали, встановлені на предметних скляних предметних стеклах, покритих желатином, і фарбували крезилфіолетовою. Дані даного щура використовували лише в тому випадку, якщо обидві канюлі знаходились у медіальній оболонці NAc⁶² (включаючи оболонку / серцевину або оболонку / нюховий кордон горбка) (Додатковий рис. 5); виходячи з цих критеріїв, дві щури були виключені з остаточного аналізу.

Кондиціювання смакових переваг попереднього опромінення

Щури отримували одну протягом ночі (у домашній клітці) і шість сеансів попередньої експозиції (у тестових камерах) до 30% натрію сахарину (Sigma) у воді з інтервалом 0.2-h між сеансами. Потім щури отримували два сеанси 48-min-per-day під впливом 5% натрію сахарин у несолодкому винограді 0.2% або вишневій Kool-Aid (Kraft Foods) у воді. Для першої сеансу попередньої експозиції Kool-Aid половина щурів отримувала ароматизований вишневий розчин, а іншу половину отримували ароматизований виноград. Ароматизатори були скасовані на другому сеансі попередньої експозиції Kool-Aid для забезпечення того, щоб всі щури відбирали кожен аромат. Споживання вимірювали для всіх сеансів попереднього опромінення. Випробувальні камери були прозорими пластиковими клітинами зі свіжими постільними речами. Для всіх сеансів попереднього опромінення щури мали доступ до одного і того ж розчину з обох сторін камери. За винятком сеансу попередньої експозиції протягом ночі, всі сеанси проводилися в кімнаті з поведінковими процедурами, з періодом звикання 0.05-хв до будь-якого навчання або тестування.

Кондиціювання однієї пляшки

Попередні дослідження показали, що мікроін'єкція InsAb у вентромедіальний гіпоталамус може блокувати вплив інсуліну на харчову поведінку і секрецію глюкагону.^{63, 64}. Тут ми використовували цей підхід для оцінки можливої ​​ролі інсуліну в підкріпленні вибору їжі. Щурів розподіляли напів-випадковим чином на підставі середнього обсягу споживання перед експозицією на дві групи, контрольної або експериментальної (InsAb). У контрольній групі щури отримували носій (мікроін'єкційний PBS; 137 mM NaCl і 2.7 mM KCl в фосфатному буфері 10 mM) або IgG (Abcam ab81032; 0.5 мкг мкл).^-1 в PBS, як отримано, мікроін'єкції в NAc оболонку перед споживанням одного з двох ароматизованих розчинів, а також макетної мікроін'єкції перед споживанням іншого ароматизованого розчину. У дослідній групі щури отримували мікроін'єкцію оболонки NAc з InsAb (Abcam ab46707; 0.5 мкл 1 мкг мкл)^-1 в PBS, як отримано) перед впливом одного ароматизованого розчину, і макет мікроін'єкції перед впливом на інший. Два набору суб'єктів з чергуванням між микроинъекциями рідини і мікроін'єкцією були використані, так що загальна кількість мікроін'єкцій обмежувалася чотирма, тим самим мінімізуючи можливе пошкодження тканин і втрату чутливості на місці ін'єкції⁶⁵. Для мікроін'єкції рідини, контрольний розчин або InsAb завантажували в дві 30-см довжини труби PE-50, прикріплені на одному кінці до шприців 5 μl Hamilton, наповнених дистильованою водою, а на іншому кінці до канюль інжектора 31 поза імплантованими напрямними. Об'єм інфузії 2.0 мкл був доставлений протягом 0.5 с при нормі 90 мкл^-1; інжектор залишився на місці протягом ~ 60 s, щоб дати час для дифузії, потім інжектор був замінений стилетом.

Щурів переносили безпосередньо в поведінкові камери протягом 2 хв завершення мікроін'єкції або макетної мікроін'єкції. Кондиціонуючі розчини містили 0.2% натрієвий сахарин, 0.05% несолодкого винограду або вишневий Kool-Aid, і 0.8% глюкози. Доступ до рішення обмежувався 30 хв на сеанс. Парний аромат і сторона камери з доступом до питної води були розподілені напівавтоматично і врівноважено в кожній групі. Інтервал між микроинъекциями становив щонайменше 72 год.

Випробування на дві пляшки

Сорок вісім годин після останнього сеансу кондиціонування щурів поміщали в тестові камери з одночасним доступом до обох кондиціонуючих ароматизаторів; розчини були 0.2% натрієвого сахарину в 0.05% винограду або вишневої Kool-Aid, без глюкози. Тестування відбулося протягом 2 днів (60 хв на день). Положення питної трубки, що містить mock-paired або інфузійно-парний розчин, чергували, щоб забезпечити тестування кожної щури на споживання кожного розчину з обох сторін клітини. Введення кожного ароматизованого розчину усереднювали для двох тестових днів для визначення переваги.

[³H] DA поглинання в стрианальних синаптосомах для оцінки ефективності InsAb

Стриатальние синаптосоми^{21, 66} готувалися з щурів AL (чоловіки, 350-400 g), з NAc (оболонка і ядро) і CPu розсічені і готувалися окремо. Тканини з кожної області гомогенизировали в обсягах 15 крижаного розчину сахарози 0.32 M в скляному гомогенізаторі з моторним тефлоновим пестиком; після промивання і центрифугування кінцеву таблетку повторно суспендують у крижаній цукрозі 0.32 M^{21, 66}. Перед ініціюванням³H] DA засвоєння аналізу⁶⁶, синаптосомні аликвоти в загальному обсязі 180 мкл буфера поглинання інкубували в шейкері протягом 15 хв при 30 ° C у присутності або відсутності інсуліну 30 nM, в носії (PBS) або в InsAb (кінцеве розведення 1: 500) в IgG (кінцеве розведення 1: 500) або в транспортному засобі. Буфер всмоктування містив (в мМ): NaCl (122); Na₂HPO₄ (3); NaH₂PO₄ (15); KCl (5); MgSO₄ (1.2); глюкоза (10), CaCl₂ (1); ніаламід (0.01); трополон (0.1); і аскорбінова кислота (0.001), рН 7.4. Захоплення³H] DA ініціювали швидким дозуванням 20 мкл кожної синаптосомальной суспензії в планшети 96-лунок з різними концентраціями DA (0.003-1.0 мкМ) і [³H] DA (5 nM); після 5 хв у шейкері на платівці при 25 ° C припиняли поглинання холодним, швидким вакуумним фільтруванням⁶⁶. Підрахунок на лунку переводили в pmoles, потім коригували до мг загального білка в хвилину. Всі аналізи проводили у трьох повторностях і повторювали принаймні чотири рази; V_Макс та K_m були розраховані з використанням програмного забезпечення Biosoft Kell Radlig (Cambridge, UK).

Статистичний аналіз

Дані дані у вигляді ± sem; Значення оцінювали за допомогою парних або непарних Стьюдента t-проби або ANOVA, якщо не вказано інше. Для даних вольтамперометрії, n кількість записуючих ділянок, враховуючи, що мінливість між ділянками в межах смугового субрегіону перевищує мінливість між тваринами або міжсреза^{30, 32, 55, 56}; номер тварини відзначається для кожного набору даних. ЄК₅₀ впливу інсуліну та нікотину на пікову викликану [DA]_o обчислювали з використанням Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Для електрофізіологічних даних статистичну значущість оцінювали за допомогою парних t-тести або тест Вілкоксона в Prism 6.0, або змішана двостороння ANOVA в SAS 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Для оцінки залучення інсуліну до кондиціонування аромату було завершено два повних дослідження з використанням протоколів, які були ідентичними, за винятком використовуваного засобу лікування. У першому дослідженні щури 10 отримували інфузії PBS, а 9 отримував інфузії InsAB. У другому дослідженні щури 10 отримували інфузії IgG, і 10 отримував інфузії InsAb. Не було значущої різниці між двома групами транспортних засобів (PBS або IgG) під час сеансів кондиціонування інфузії (F₁₉= 0.619, змішаний двосторонній ANOVA) з повторними заходами на сеансі кондиціонування) або при випробуванні (F₁₉= 0.012, двостороння змішана ANOVA з повторними заходами на смак). Отже, два експерименти були об'єднані для аналізу. Для цього аналізу використовували змішану ANOVA 2 × 4 (з повторними заходами на день вливання) для визначення впливу мікроін'єкційного лікування під час кондиціонування, а потім захищали t-тестування (одне з хвостами, щоб визначити, в якому кондиціонуванні сеансів мікроін'єкції лікування знижується обсяг всмоктування). Аналогічний аналіз був завершений для сеансів фіктивного кондиціонування. Щоб визначити вплив кондиціонуючої обробки під час тестування на ароматизатори з двома пляшками, дані аналізували за допомогою змішаного двостороннього ANOVA (з повторними заходами на ароматизатор), а потім захищали t-тести (одна перевірена гіпотеза про те, що InsAb зменшить переваги).

Як цитувати цю статтю: Stouffer, MA та ін. Інсулін підсилює стриатальний вивільнення дофаміну, активуючи холінергічні інтернейрони і тим самим сигналізує про винагороду. Nat. Commun. 6: 8543 doi: 10.1038 / ncomms9543 (2015).

1. Schulingkamp, ​​RJ, Pagano, TC, Hung, D. & Raffa, RB Інсулінові рецептори та дія інсуліну в мозку: огляд та клінічні наслідки. Невроски. Біобехав. Видання 24, 855–872 (2000).
   • CAS
   • ISI
   • PubMed
   • Стаття
   • Показати контекст
2. Gerozissis, K. Мозковий інсулін, енергетичний і глюкозний гомеостаз; гени, середовище та метаболічні патології. Євро. J. Pharmacol. 585, 38 – 49 (2008).
3. CAS
4. PubMed
5. Стаття
6. Показати контекст
7. CAS
8. PubMed
9. Стаття
10. Показати контекст
11. CAS
12. PubMed
13. Стаття
14. Показати контекст
15. CAS
16. PubMed
17. Стаття
18. Показати контекст
19. CAS
20. ISI
21. PubMed
22. Стаття
23. Показати контекст
24. ISI
25. PubMed
26. Стаття
27. Показати контекст
28. CAS
29. PubMed
30. Стаття
31. Показати контекст
32. Показати контекст
33. CAS
34. ISI
35. PubMed
36. Стаття
37. Показати контекст
38. CAS
39. ISI
40. PubMed
41. Стаття
42. Показати контекст
43. CAS
44. ISI
45. PubMed
46. Показати контекст
47. ISI
48. PubMed
49. Стаття
50. Показати контекст
51. CAS
52. ISI
53. PubMed
54. Стаття
55. Показати контекст
56. CAS
57. ISI
58. PubMed
59. Стаття
60. Показати контекст
61. Показати контекст
62. CAS
63. ISI
64. PubMed
65. Стаття
66. Показати контекст
67. CAS
68. ISI
69. PubMed
70. Стаття
71. Показати контекст
72. CAS
73. ISI
74. PubMed
75. Стаття
76. Показати контекст
77. PubMed
78. Стаття
79. Показати контекст
80. Показати контекст
81. CAS
82. PubMed
83. Стаття
84. Показати контекст
85. ISI
86. PubMed
87. Стаття
88. Показати контекст
89. CAS
90. ISI
91. PubMed
92. Стаття
93. Показати контекст
94. CAS
95. ISI
96. PubMed
97. Стаття
98. Показати контекст
99. CAS
100. PubMed
101. Стаття
102. Показати контекст
103. Показати контекст
104. CAS
105. ISI
106. PubMed
107. Стаття
108. Показати контекст
109. CAS
110. ISI
111. PubMed
112. Стаття
113. Показати контекст
114. CAS
115. ISI
116. PubMed
117. Стаття
118. Показати контекст
119. CAS
120. ISI
121. PubMed
122. Стаття
123. Показати контекст
124. PubMed
125. Стаття
126. Показати контекст
127. CAS
128. ISI
129. PubMed
130. Стаття
131. Показати контекст
132. CAS
133. PubMed
134. Стаття
135. Показати контекст
136. CAS
137. ISI
138. PubMed
139. Стаття
140. Показати контекст
141. CAS
142. PubMed
143. Стаття
144. Показати контекст
145. ISI
146. PubMed
147. Стаття
148. Показати контекст
149. Показати контекст
150. Показати контекст
151. CAS
152. ISI
153. PubMed
154. Стаття
155. Показати контекст
156. CAS
157. ISI
158. PubMed
159. Стаття
160. Показати контекст
161. CAS
162. ISI
163. PubMed
164. Стаття
165. Показати контекст
166. CAS
167. ISI
168. PubMed
169. Стаття
170. Показати контекст
171. CAS
172. ISI
173. PubMed
174. Показати контекст
175. CAS
176. ISI
177. PubMed
178. Стаття
179. Показати контекст
180. PubMed
181. Стаття
182. Показати контекст
183. CAS
184. ISI
185. PubMed
186. Стаття
187. Показати контекст
188. CAS
189. ISI
190. PubMed
191. Стаття
192. Показати контекст
193. CAS
194. ISI
195. PubMed
196. Стаття
197. Показати контекст
198. CAS
199. ISI
200. PubMed
201. Стаття
202. Показати контекст
203. Показати контекст
204. CAS
205. ISI
206. PubMed
207. Показати контекст
208. Показати контекст
209. Показати контекст
210. Показати контекст
211. CAS
212. ISI
213. PubMed
214. Стаття
215. Показати контекст
216. CAS
217. PubMed
218. Стаття
219. Показати контекст
220. CAS
221. ISI
222. PubMed
223. Показати контекст
224. Показати контекст
225. CAS
226. PubMed
227. Стаття
228. Показати контекст
229. ISI
230. PubMed
231. Стаття
232. Показати контекст
233. Показати контекст
234. ISI
235. PubMed
236. Стаття
237. Показати контекст
238. Показати контекст
239. CAS
240. ISI
241. PubMed
242. Стаття
243. Показати контекст
244. Показати контекст
245. Vogt, MC & Bruning, JC Сигналізація інсуліну ЦНС у контролі енергетичного гомеостазу та метаболізму глюкози - від зародка до старості. Тенденції розвитку ендокринолу. Метаб. 24, 76–84 (2013).
246. Хавранкова, Дж., Шмехель, Д., Рот, Дж. І Браунштейн, М. Ідентифікація інсуліну в мозку щурів. Proc. Natl Акад. Наук. США 75, 5737–5741 (1978).
247. King, GL & Johnson, S. Рецептор-опосередкований транспорт інсуліну через ендотеліальні клітини. Science 227, 1583–1586 (1985).
248. Strubbe, JH, Porte, D. Jr & Woods, SC Реакції інсуліну та рівні глюкози в плазмі та лікворі під час голодування та повторного годування у щурів. Фізіол. Поводитись. 44, 205–208 (1988).
249. Banks, WA & Kastin, AJ Диференціальна проникність гематоенцефалічного бар'єру для двох пептидів підшлункової залози: інсуліну та аміліну. Пептиди 19, 883–889 (1998).
250. Banks, WA Джерело церебрального інсуліну. Євро. J. Pharmacol. 490, 5 – 12 (2004).
251. Немото, Т. та ін. Нові висновки щодо синтезу інсуліну та його секреції в гіпокампі щурів і корі головного мозку: індуковане амілоїд-βХНУМХ-ХНУМХ зниження рівня проінсуліна за допомогою глікогенсинтази кінази-1β. Сигнал клітинки. 42, 3 – 26 (253).
252. De Souza, CT та ін. Споживання жирів, багатих дієтою, активізує провоспалительную реакцію і індукує резистентність до інсуліну в гіпоталамусі. Ендокринологія 146, 4192 – 4199 (2005).
253. Anthony, K. та ін. Затухання викликаних інсуліном відповідей в мозкових мережах, що контролюють апетит і винагороду за інсулінорезистентність: церебральна основа для порушення контролю над прийомом їжі при метаболічному синдромі? Діабет 55, 2986 – 2992 (2006).
254. Kelley, AE & Berridge, KC Неврологія природних винагород: значення для наркотиків, що викликають залежність. J. Neurosci. 22, 3306–3311 (2002).
255. Koob, GF & Volkow, ND Нейроциркуляція наркоманії. Neuropsychopharmacology 35, 217–238 (2010).
256. Вертер, Г.А. та ін. Локалізація та характеристика рецепторів інсуліну при використанні головного мозку і гіпофіза щурів пробірці авторадіографія та комп'ютеризована денситометрія. Ендокринологія 121, 1562 – 1570 (1987).
257. Figlewicz, DP, Evans, SB, Murphy, J., Hoen, M. & Baskin, DG Експресія рецепторів до інсуліну та лептину в вентральній тегментальній ділянці / чорній речовині (VTA / SN) щура. Мозок Res. 964, 107–115 (2003).
258. Daws, LC та ін. Сигналізація і пристрасть до інсуліну. Нейрофармакологія 61, 1123 – 1128 (2011).
259. Figlewicz, DP & Sipols, AJ Енергетичні регулятивні сигнали та винагорода за їжу. Фармакол. Біохім. Поводитись. 97, 15–24 (2010).
260. Паттерсон Т.А. та ін. Позбавлення їжі зменшує мРНК і активність допаминового транспортера щурів. Нейроендокринологія 68, 11 – 20 (1998).
261. Carvelli, L. та ін. PI 3-кіназа регулювання поглинання дофаміну. J. Neurochem. 81, 859 – 869 (2002).
262. Вільямс, JM та ін. Гіпоінсулінемія регулює індукований амфетаміном зворотний транспорт допаміну. PLoS Biol. 5, e274 (2007).
263. Zhen, J., Reith, MEA & Carr, KD Хронічне обмеження їжі та транспортер допаміну у стриатумі щурів. Мозок Res. 1082, 98–101 (2006).
264. Schoffelmeer, AN та ін. Інсулін модулює функцію транспортера моноаміну, чутливого до кокаїну, і імпульсивну поведінку. J. Neurosci. 31, 1284 – 1291 (2011).
265. Mebel, DM, Wong, JC, Dong, YJ & Borgland, SL Інсулін у вентральній тегментальній зоні зменшує гедонічне харчування та пригнічує концентрацію дофаміну за рахунок збільшення зворотного захоплення. Євро. J. Neurosci. 36, 2336–2346 (2012).
266. Labouebe, G. та ін. Інсулін індукує довгострокову депресію вентральних сегментів дофамінових нейронів через ендоканнабіноїди. Nat. Neurosci. 16, 300 – 308 (2013).
267. Konner, AC та ін. Роль сигналізації інсуліну в катехоламінергічних нейронах в контролі гомеостазу енергії. Стільниковий метаб. 13, 720 – 728 (2011).
268. Figlewicz, DP, Bennett, JL, Aliakbari, S., Zavosh, A. & Sipols, AJ Інсулін діє в різних центрах ЦНС, щоб зменшити гостре споживання сахарози та самовведення сахарози щурам. Am. J. Physiol. Регул. Інтегр. Комп. Фізіол. 295, R388 – R394 (2008).
269. Patel, JC, Witkovsky, P., Coetzee, WA & Rice, ME Субсекундна регуляція вивільнення смугастого дофаміну за допомогою пресинаптичного K_ATP каналів. J. Neurochem. 118, 721 – 736 (2011).
270. Tepper, JM & Bolam, JP Функціональна різноманітність та специфіка неостріальних інтернейронів. Curr. Думка. Нейробіол. 14, 685–692 (2004).
271. Zhou, FM, Liang, Y. & Dani, JA. Ендогенна нікотинова холінергічна активність регулює вивільнення дофаміну в смугастому тілі. Нат. Невроски. 4, 1224–1229 (2001).
272. Райс, ME & Cragg, SJ Нікотин посилює сигнали дофаміну, пов'язані з винагородою, у смугастому тімені. Нат. Невроски. 7, 583–584 (2004).
273. Zhang, H. & Sulzer, D. Частотна залежність модуляції вивільнення дофаміну нікотином. Нат. Невроски. 7, 581–582 (2004).
274. Patel, JC, Rossignol, E., Rice, ME & Machold, RP Протилежність регулюванню вивільнення дофаміну через смужку та дослідницькій моторній поведінці холінергічними входами переднього мозку та стовбура мозку. Нат. Комун. 3, 1172 (2012).
275. Threlfell, S. та ін. Стріатальне вивільнення дофаміну викликається синхронною активністю в холінергічних інтернейронах. Нейрон 75, 58 – 64 (2012).
276. Cachope, R. та ін. Селективна активація холінергічних інтернейронів підвищує акумулярне стадійне вивільнення дофаміну: встановлює тон для обробки винагороди. Стільниковий респ. 2, 1 – 9 (2012).
277. Jones, IW, Bolam, JP & Wonnacott, S. Пресинаптична локалізація імунореактивності субодиниці нікотинового ацетилхолінового рецептора бета2 у нігростріальних дофамінергічних нейронах щурів. J. Comp. Нейрол. 439, 235–247 (2001).
278. Higley, MJ та ін. Холінергічні інтернейрони опосередковують швидку VGluT3-залежну глутаматергічну передачу в смугастому тілі. PLOS ONE 6, e19155 (2011).
279. Touzani, K., Bodnar, R. & Sclafani, A. Активація дофамінових D1-подібних рецепторів у nucleus accumbens має вирішальне значення для набуття, але не для експресії, смакових уподобань у щурів, обумовлених поживними речовинами. Євро. J. Neurosci. 27, 1525–1533 (2008).
280. Sclafani, A., Touzani, K. & Bodnar, RJ Дофамін та вивчені харчові уподобання. Фізіол. Поводитись. 104, 64–68 (2011).
281. Mayer, CM & Belsham, DD Центральна сигналізація інсуліну послаблюється тривалим впливом інсуліну за допомогою фосфорилювання серину рецептора інсуліну-1, протеасомної деградації та деградації лізосомних рецепторів інсуліну. Ендокринологія 151, 75–84 (2010).
282. Райс, ME, Patel, JC & Cragg, SJ Вивільнення дофаміну в базальних гангліях. Neuroscience 198, 112–137 (2011).
283. Сміт, Ю., Сурмейер, ді-джей, Редгрейв, П. та Кімура, М. Таламік, внесок у переключення та підкріплення поведінки базальних гангліїв. J. Neurosci. 31, 16102–16106 (2011).
284. Threlfell, S. та ін. Стриатальні мускаринові рецептори підвищують залежність активності дофамінової передачі через різні підтипи рецепторів на холінергічні інтернейрони у вентральному проти дорсального стриатуму. J. Neurosci. 30, 3398 – 3408 (2010).
285. Hoebel, BG, Avena, NM & Rada, P. Накопичує допамін-ацетилхоліновий баланс у підході та униканні. Curr. Думка. Фармакол. 7, 617–627 (2007).
286. Pothos, EN, Creese, I. & Hoebel, BG. Обмежене вживання їжі зі зниженням ваги вибірково зменшує позаклітинний дофамін в ядрі і змінює реакцію дофаміну на амфетамін, морфін та споживання їжі. J. Neurosci. 15, 6640–6650 (1995).
287. Гейгера Б.М. та ін. Дефіцити мезолімбічної нейротрансмісії допаміну в дієтичному ожирінні щурів. Неврологія 159, 1193 – 1199 (2009).
288. Morris, JK та ін. Інсулінорезистентність погіршує функцію нігростріатального дофаміну. Exp. Neurol. 231, 171 – 180 (2011).
289. De Araujo, IE та ін. Продовольча винагорода за відсутності рецепторного сигналу смаку. Нейрон 57, 930 – 941 (2008).
290. Stice, E., Spoor, S., Bohon, C. & Small, DM Взаємозв'язок між ожирінням та притупленою смугастою реакцією на їжу модерується за допомогою алелю TaqIA A1. Science 322, 449–452 (2008).
291. Ван, GJ та ін. Мозковий допамін і ожиріння. Ланцет 357, 354 – 357 (2001).
292. Johnson, PM & Kenny, PJ Допамінові D2-рецептори при порушенні функцій винагороди, подібному до наркоманії, та примусовому харчуванні у ожирілих щурів Нат. Невроски. 13, 635–641 (2010).
293. Карр, К.Д., Кім, Г.-Й. & Cabeza de Vaca, S. Нагороджуючі та локомотор-активізуючі ефекти прямих агоністів рецепторів дофаміну посилюються хронічним обмеженням їжі у щурів. Психофармакологія (Берл.) 154, 420–428 (2001).
294. Левін, Б. Е. та Кізі, Р. Е. Захист різної заданої маси тіла у страждаючих ожирінням та стійких щурів, що страждають дієтою. Am. J. Physiol. 274, R412 – R419 (1998).
295. Patel, JC & Rice, ME Моніторинг вивільнення аксонального та соматодендритного дофаміну за допомогою циклічної вольтамперометрії у зрізах мозку за допомогою швидкого сканування. Методи Мол. Біол. 96, 243–273 (2013).
296. Лі, CR, Вітковський, P. & Rice, ME Регулювання активності речовини чорної речовини pars reticulata GABAergic нейрону за допомогою H₂O₂ через флуфенамові чутливі до кислоти канали і K_ATP каналів. Фронт. Сист. Neurosci. 5, 14 (2011).
297. Чен, Б.Т., Моран, К.А., Авшалумов, М.В. та Райс, М.Є.²⁺ канали контрастують з сильною регуляцією аксонального вивільнення дофаміну. J. Neurochem. 96, 645 – 655 (2006).
298. Li, X. та ін. Покращена стриатальная передача допаміну та рухова робота з надекспресією LRRK2 у мишей усувається мутацією хвороби Паркінсона G2019S. J. Neurosci. 30, 1788 – 1797 (2010).
299. Wu, Q., Reith, MEA, Wightman, RM, Kawagoe, KT & Garris, PA Визначення параметрів вивільнення та поглинання за допомогою електрично викликаної динаміки дофаміну, виміряної за допомогою вольтамперометрії в реальному часі. J. Neurosci. Методи 112, 119–133 (2001).
300. Chen, BT, Avshalumov, MV & Rice, ME H₂O₂ є новим ендогенним модулятором синаптичного вивільнення дофаміну. J. Neurophysiol. 85, 2468 – 2476 (2001).
301. Вітковський, П., Патель, Дж. К., Лі, КР і Райс, М. Є. Імуноцитохімічна ідентифікація білків, що беруть участь у вивільненні дофаміну, із соматодендритного відділу нігральних дофамінергічних нейронів. Neuroscience 164, 488–496 (2009).
302. Сугімото, К. та ін. Рецептор інсуліну в периферичному нерві щура: його розташування і альтернативно сплайсовані ізоформи. Діабет Метаб. Res. 16, 354 – 363 (2000).
303. Санчес-Алавес, М. та ін. Інсулін викликає гіпертермію шляхом прямого інгібування теплочутливих нейронів. Діабет 59, 43 – 50 (2010).
304. Paxinos, G. & Watson, C. Мозок щурів у стереотаксичних координатах 6-е видання Academic (2007).
305. Strubbe, JH & Mein, CG Посилене годування у відповідь на двостороннє введення антитіл до інсуліну в VMH. Фізіол Бехав. 19, 309–313 (1977).
306. Paranjape, SA та ін. Вплив інсуліну у вентромедіальний гіпоталамус на секрецію панкреатичного глюкагону в природних умовах. Діабет 59, 1521 – 1527 (2010).
307. Wise, RA & Hoffman, DC Локалізація механізмів винагороди за ліки шляхом внутрішньочерепних ін’єкцій. Синапс 10, 247–263 (1992).
308. Zhen, J., Maiti, S., Chen, N., Dutta, AK & Reith, MEA Взаємодія між аналогом гідроксипіперидину 4- (2-бензгідрилокси-етил) -1- (4-фторбензил) піперидину та аспартату 68 в транспортер дофаміну людини. Євро. J. Pharmacol. 506, 17–26 (2004).

Завантажити посилання

Ці дослідження були підтримані грантами NIH DA033811 (MER, KDC і MEAR), NS036362 (MER), DA03956 (KDC) і незалежною нагородою NARSAD (KDC). S961 був щедрий подарунок від д-ра Lauge Schaffer, Novo Nordisk. Антитіло PP5 було щедрим подарунком від Pfizer. Ми дякуємо д-ру Чарльзу Ніколсону, Школі медицини Нью-Йоркського університету, за програмне забезпечення для вилучення V_Макс значення з даних FCV.