Антагоніст рецептора греліну (GHS-R1A) послаблює корисні властивості морфіну і збільшує рівні опіоїдних пептидів у зонах винагороди у мишей (2015)

Гостре, а також хронічне опромінення наркотичними засобами глибоко впливає на мезолімбічну дофамінову систему, важливу ключову ланцюг систем нагородження мозку (Nestler, 2005). Ці ефекти були запропоновані, щонайменше частково, лежать в основі розвитку наркоманії (Wise, 2004). Наркоманія спричиняє широкий спектр шкідливих наслідків як для людини, так і для суспільства, і нові фармакологічні втручання, які лікують цю головну проблему охорони здоров'я, є гарантованими (Koob та Le Moal, 2001). Роз'яснюючи сигнальні системи, що опосередковують здатність наркотичних речовин, що викликають залежність, активувати мезолімбічну дофамінову систему, можна визначити унікальні стратегії лікування порушень вживання речовин.

Дослідження показали, що загальні нейробіологічні механізми регулюють споживання та винагороду, спричинену харчовими та наркотичними засобами (Morganstern et al., 2011), припускаючи, що роль харчових регуляторних пептидів кишечника та мозку, таких як грелін, включає посередницьку винагороду. Спочатку було показано, що грелін викликає вивільнення гормону росту (Kojima et al., 1999) та індукує ожиріння у щурів (Tschop et al., 2000). На сьогодні добре відомо, що грелін збільшує споживання їжі, голод, а також стимулює апетит через гіпоталамічні ланцюги (огляд див. Egecioglu et al. (2011)). На додаток до гіпоталамуса, рецептори греліну (GHS-R1A) експресуються в ділянках, пов'язаних з винагородою, таких як мигдалина, смугастий течія, префронтальна кора, вентральна тегментальна зона (VTA) та гіпокамп (для огляду див. Engel and Jerlhag (2014)), маючи на увазі, що фізіологічна роль греліну виходить за рамки регулювання енергетичного гомеостазу. Справді, було показано, що орексигенний пептид грелін є активатором мезолімбічної дофамінової системи, а також регулятором винагороди, мотивації та споживання алкоголю, нікотину, амфетаміну та кокаїну мишам (огляд див. Engel and Jerlhag (2014)).

Опіоїди, як і інші наркотичні засоби, активують мезолімбічну дофамінову систему, викликаючи накопичувальний дофамін. через активація мк- та / або δ-опіоїдних рецепторів у ядрах ярусів (NAc) (Hirose et al., 2005, Murakawa et al., 2004, Yoshida та ін., 1999) та у VTA, імовірно, шляхом зменшення GABA -інгібування дофамінових нейронів (Johnson and North, 1992). Крім того, акумулятивні κ-опіоїдні рецептори регулюють активність мезолімбічної дофамінової системи (Chefer et al., 2005, Spanagel et al., 1992). Багаторазовий вплив опіоїдів призводить до адаптаційних змін декількох нейротрансмітерів, у тому числі опіоїдних пептидів, у зонах нагород, що сприяють розвитку залежності (De Vries and Shippenberg, 2002). У щурів фармакологічне пригнічення GHS-R1A послаблює індукований морфіном акумуляційний дофамін, а також стереотипну поведінку (Сусткова-Фісерова та ін., 2014). Метою першої частини цієї серії експериментів було дослідити гострий вплив антагоніста GHS-R1A, JMV2959, на здатність морфію викликати локомоторну стимуляцію, акумуляторне вивільнення дофаміну та обумовити перевагу місця у мишей. Метою другої частини цього дослідження було оцінити вплив повторного лікування JMV2959 або греліном на рівень опіоїдних пептидів (Met-enkephalin-Arg⁶Phe⁷ (MEAP), динорфін B (DynB) та Leu-enkephalin-Arg⁶ (LeuArg)) у областях, пов’язаних із винагородою, включаючи мигдалину, стриатум, префронтальну кору, ВТА та гіпокамп.

Були використані дорослі чоловіки NMRI у післяпологовий вік (вік 8 – 12 тижнів та маса тіла 25 – 40 г; Річка Чарльз, Сульцфельд, Німеччина). Коротко кажучи, всіх мишей розміщували в групах і підтримували при циклі світла / темноти 12 / 12 h (світилося в сім ранку). Вода та їжа з водопровідної води (звичайна чау; Harlan Teklad, Норфолк, Англія) були поставлені ad libitum, за винятком експериментальних установок. Нових мишей використовували для кожного окремого тесту поведінки, а також для аналізу на опіоїдний пептид. Експерименти були затверджені Шведським етичним комітетом з досліджень на тваринах у Гетеборзі. Всі зусилля були докладені до мінімізації страждань тварин та зменшення кількості використовуваних тварин. Всім тваринам давали акліматизацію щонайменше за тиждень до початку експериментів.

Морфін гідрохлорид (лікарня Apoteksbolaget Sahlgrenska; Гетеборг, Швеція) розчиняли в носії (0.9% розчин натрію хлориду) і вводили ip у дозі 20 мг / кг 10 хв до початку експерименту. Ця доза була обрана, оскільки менша доза (10 мг / кг, ip) не викликала локомоторної стимуляції у наших мишей (дані не показані). Вибрана доза (6 мг / кг, ip) JMV2959 (синтезована в Інституті біомолекул Max Mousseron (IBMM), UMR5247, CNRS, Montpellier 1 та 2 University, Франція), антагоністом GHS-R1A, Франція, була визначена раніше не впливає на опорно-рухову активність, акумуляторне вивільнення дофаміну та перевагу умовного місця у мишей (Jerlhag et al., 2009). JMV2959 розчиняли в носії (0.9% розчин натрію хлориду) і його завжди вводили за двадцять хвилин до впливу морфіну або декапітації для аналізу рівнів опіоїдних пептидів. Вибрана доза JMV2959 не впливала на грубу поведінку мишей в жодному експерименті. Для поведінкових тестів JMV2959 вводили гостро, оскільки наші наполегливі дослідження показують, що однократна ін'єкція JMV2959 зменшує винагороду, спричинену наркотиками (огляд див. Енгель та Джерльгаг (2014)). JMV2959 вводили субхронічно протягом п'яти наступних днів для аналізу на опіоїдний пептид, щоб збільшити можливість виявлення стійкого ефекту. Крім того, при повторних ін’єкціях ви уникаєте можливого збиваючого впливу гострого ін'єкційного стресу на пептиди. Ацильований щур грелін (Bionuclear; Бромма, Швеція) був розведений в 0.9% хлориді натрію, і вибрана доза греліну (0.33 мг / кг, ip) раніше показала, що викликає винагороду у мишей (Jerlhag, 2008). Збалансований дизайн був використаний для всіх проблем, пов'язаних з наркотиками.

Попередні дослідження показали, що морфін викликає локомоторну стимуляцію у гризунів (Wise and Bozarth, 1987). Локомоторна активність була зареєстрована у восьми ослаблених, вентильованих та тьмяно освітлених локомоторних коробках (420 × 420 × 200 мм, Kungsbacka mät- och reglerteknik AB; Fjärås, Швеція). П’ять на п’ять рядів пучків фотоелементів, на рівні підлоги коробки, створюючи виявлення фотоелементів, дозволили комп'ютерній системі зареєструвати активність мишей. Локомоторна активність визначалася як накопичена кількість нових пучків фотоелементів, перерваних протягом періоду 60-хв. У всіх експериментах мишам дозволяли звикнути до коробки опорно-рухової активності за годину до виклику наркотиків. Не було відмінностей між звиканням ні в одній із груп лікування (дані не показані).

У першій серії експерименту було досліджено вплив JMV2959 (6 мг / кг, ip) на індуковану морфіном (20 мг / кг, ip) опорно-рухове збудження. JMV2959 вводили 20 хв до початку морфіну, і реєстрація активності починалася через десять хвилин після останньої ін'єкції. Кожна миша отримувала одну комбінацію лікування (транспортний засіб / транспортний засіб, JMV2959 / транспортний засіб, морфін / засіб або JMV2959 / морфін; n= 8 на комбінацію лікування) і піддавались лише одному експериментальному випробуванню.

Для оцінки впливу JMV2959 на корисну дію морфіну у нових мишей проводили тести на перевагу умовного місця на мишах, як описано раніше (Jerlhag, 2008). Коротше кажучи, використовувався двокамерний CPP-апарат з lx-підсвічуванням 45 та чіткими візуальними та тактильними сигналами. Одне відділення було визначене чорно-білими смугастими стінами та темною ламінованою підлогою, тоді як інша мала білу пофарбовану дерев'яну підлогу та стіни з дерев’яної фактури. Процедура складалася з попередньої кондиціонування (день 1), кондиціонування (дні 2 – 5) та після кондиціонування (день 6). Після попередньої кондиціонування мишам вводили ip в носій і поміщали в камеру з вільним доступом до обох відділень протягом 20 хв для визначення початкового місця (або бічного) переваги. Кондиціонування (20 хв на сеанс) проводили за допомогою упередженої процедури, при якій морфін (20 мг / кг) був у пару з найменш кращим відділенням та носієм з кращим відділенням. Всі миші отримували по одній ін'єкції морфіну, а також транспортного засобу щодня, і ін'єкції змінювались вранці та вдень у вигляді балансу. Після кондиціонування мишей (n= 16) вводили JMV2959 (6 мг / кг, ip) або рівний об'єм розчину транспортного засобу, і 20 хв. Пізніше поміщали на середню лінію між двома відділеннями з вільним доступом до обох відділень протягом 20 хв (створюючи наступні групи лікування; Morph-Veh і Morph-JMV2959).

Перевагу місця місця розраховували як різницю у відсотках від загального часу, проведеного в парі з наркотиками (тобто. найменш кращий) відділення під час сеансу після кондиціонування та попереднього кондиціонування.

Зважаючи на те, що JMV2959 послаблює збудження моторно-опорно-рухової стимуляції та надає перевагу умовному розташуванню у мишей, вплив JMV2959 (6 мг / кг, ip) на індукований морфіном (20 мг / кг, ip) вивільнення акупального дофаміну з використанням в природних умовах мікродіаліз у мишей, що вільно рухаються. Для вимірювання рівня позаклітинного дофаміну мишам імплантували однобічно з допомогою зонду для мікродіалізу, розміщеного в ядрах ядра. Тому мишей знеболювали ізофлураном (Isofluran Baxter; Univentor 400 Anesthesia Unit, Univentor Ldt., Zejtun, Мальта), поміщали в стереотаксичний каркас (David Kopf Instruments; Tujunga, Каліфорнія, США) та тримали на нагрівальній майданчику для запобігання переохолодження. Кселокаїновий адреналін (5 мкг / мл; Pfizer Inic; Нью-Йорк, США) застосовували як місцеві анестетики, а карпрофен (Римаділ, 5 мг / кг ip) (Astra Zeneca; Гетеборг, Швеція) використовувався для полегшення можливого болю. Кістка черепа була оголена і просвердлено один отвір для зонда та один для кріплення гвинта. Зонд був випадковим чином чергуватися або з лівого, або з правого боку мозку. Координати 1.5 мм спереду від брегми, ± 0.7 бічно до середньої лінії та 4.7 мм нижче поверхні поверхні мозку використовувались для нуклеїнових ядер (Franklin та Paxinos, 1997). Відкритий наконечник діалізної мембрани (20,000 kDa відрізаний з / id 310 / 220 мкм, HOSPAL, Gambro, Lund, Швеція) зонда становив 1 мм. Всі зонди були імплантовані хірургічним шляхом за два дні до експерименту. Після операції мишей утримували в окремих клітках до випробувального дня (Macrolon III).

У день випробування зонд з'єднували з мікроперфузійним насосом (шприц-насос U-864; AgnThós AB) і проливали розчином Рінгера зі швидкістю 1.5 мкл / хв. Після однієї години звикання до мікродіалізу, зразки перфузії збирали кожні 20 хв. Рівень базового дофаміну визначався як середній показник трьох послідовних зразків перед першим викликом лікарських засобів / носіїв, а збільшення акумуляційного дофаміну розраховувалося як збільшення відсотка від базового рівня. Після зразків базової лінії (від −40 хв до 0 хв) мишам вводили JMV2959 або носій (на 0 хв.), Після чого проводили морфін або ін'єкцію носія (на 20 хв). Після цих прийомів лікарських засобів було зібрано ще вісім проб 20 хв. Наступні групи лікування (n= 8 в кожній групі) були створені: транспортний засіб (транспортний засіб - транспортний засіб), транспортний засіб - морфін (транспортний засіб - морф), транспортний засіб JMV2959 (JMV2959-транспортний засіб) та JMV2959-морфін (JMV2959-морф).

Рівень дофаміну в діалізатах визначали за допомогою ВЕРХ з електрохімічним виявленням. Насос (Gyncotec P580A; Kovalent AB; V. Frölunda, Швеція), іонообмінний стовпчик (2.0 × 100 мм, Prodigy 3 мкм SA; Skandinaviska GeneTec AB; Kungsbacka, Швеція) та детектор (Antec Decade; Antec Leyden; Zoeterwouou , Нідерланди), оснащений проточною коміркою VT-03 (Antec Leyden). Рухливу фазу (pH 5.6), що складається з сульфонової кислоти 10 mM, лимонної кислоти 200 mM, цитрату натрію 200 mM, 10% EDTA, 30% MeOH, фільтрували у вакуумі з використанням мембранного фільтра 0.2 мкм (GH Polypro; PALL Gelman Laboratory; Лунд, Швеція). Рухливу фазу подавали зі швидкістю потоку 0.2 мл / хв, пропускаючи дегазатор (Kovalent AB), і аналізований окислювали при + 0.4 V.

Після завершення експериментів з мікродіалізу мишей обезголовили, а зонди пронизали понтаміном небесно-блакитного 6BX для полегшення локалізації зонда. Мізки були встановлені на пристрої з віброслізом (752 M Vibroslice; Campden Instruments Ltd., Лафборо, Великобританія) і розрізали на секції 50 мкм. Місце зонду визначали грубим спостереженням за допомогою світлової мікроскопії. Точне положення зонда було підтверджено (Franklin та Paxinos, 1997) і в статистичному аналізі використовувались лише миші з правильними місцями розташування.

Досліджено ефекти лікування JMV2959 на рівні MEAP, DynB та LeuArg у областях, що стосуються нагород. Мишам вводили або JMV2959 (6 мг / кг, ip, n= 8) або рівний об'єм транспортного засобу (ip, n= 8) протягом п'яти наступних днів. 20 хв після останньої ін'єкції мишей жертвували, а мізки цих мишей збирали. Окремим мишам вводили або грелін (0.33 мг / кг, ip, n= 8) або рівний об'єм транспортного засобу (ip, n= 8) протягом п'яти наступних днів. Через п'ять хвилин після останньої ін'єкції мишей жертвували, а мізки у цих мишей збирали. Амігдалу, стриатум, префронтальну кору, ВТА та гіпокамп швидко розсікали та негайно клали на сухий лід та зберігали при -80 ° C до подальшої обробки.

Процедури гомогенізації та екстракції пептидів дотримувалися стандартної процедури, раніше детально описаної (Nylander et al., 1997). Коротше кажучи, до заморожених зразків додавали гарячу (95 ° C) оцтову кислоту (1 M). Зразки нагрівали на водяній бані (95 ° C) протягом 5 хв., Охолоджували на льоду та потім гомогенізували за допомогою соніфікатора Бренсона (Danbury, CT, США). Гомогенат повторно нагрівали при 95 ° C протягом 5 хв і охолоджували на льоду перед центрифугуванням протягом 15 хв при 4 ° C і 12,074 ×g в центрифузі Beckman GS-15R (Фуллертон, Каліфорнія, США). Екстракти додатково очищали за описаною раніше процедурою (Nylander et al., 1997). Були зібрані дві фракції: фракція III (Leu-Arg і MEAP) і фракція V (DynB). Зразки сушили у вакуумній центрифузі (Savant SpeedVac Plus SC210A; Thermo Scientific Inc., Waltham, MA, США) і зберігали в морозилці (-20 ° C) до аналізу пептидів.

Імунореактивні (ir) рівні DynB, LeuArg та MEAP аналізували за допомогою чітко встановлених радіоімунологічних аналізів, а протоколи були детально описані в інших місцях (Nylander et al., 1997). В аналізі DynB козячий анти-кролячий IgG (GARGG; Bachem, Bubendorf, Швейцарія) був використаний для відділення вільного пептиду та антитіла. Для остаточного розведення 113: 1 використовували антисенсум Dyn (600000 +). Перехресна реактивність з великим Dyn становила 100%, а з DynB (1 – 29) 1%. Не спостерігалося перехресної реакції з іншими опіоїдними пептидами. В аналізах LeuArg та MEAP для суспензії вільного та антитіла пептиду використовували суспензію деревного вугілля. Для антисеруму LeuArg (91: 6D +, остаточне розведення 1: 60000) перехресна реакційна здатність була меншою, ніж 0.01% для Leu-енкефаліну та MEAP, 0.02% для DynB, 0.04% для DynA та 0.08% для альфа-неоендорфіну. Для остаточного розведення 90: 3 1 використовували антисерум MEAP: 160: 000D (II). Перехресна реакція з Met-енкефаліном, Met-enkephalin-Arg⁶, Мет-енкефалін-Арг⁶Gly⁷Леу⁸, Leu-енкефалін та Leu-enkephalin-Arg⁶ було <0.1%

Загальний основний ефект лікування виявлено на опорно-рухову активність у мишей після системного введення морфіну (20 мг / кг) та JMV2959 (6 мг / кг) (F (3,27) = 7.409, P= 0.0009; n= 8 для транспортного засобу – транспортного засобу, JMV2959-транспортного засобу, JMV2959-морфа та n= 7 для транспортного засобу-морфа). Як показано в малюнок 1А, постхок-аналіз показав, що попередня обробка однією ін'єкцією JMV2959 (P<0.001) суттєво послаблює індуковану морфієм локомоторну стимуляцію (P<0.01 Veh – Veh vs Транспорт - морф). Вибрана доза JMV2959 не впливала на опорно-рухову активність порівняно з лікуванням транспортним засобом (P> 0.05). Не було різниці у реакції рухової активності у мишей, оброблених транспортними засобами, та мишей, оброблених морпіном JMV2959 (P> 0.05).

  

малюнок 1

Антагоніст GHS-R1A JMV2959 послаблює індуковану морфіном локомоторну стимуляцію, акумуляційне вивільнення дофаміну і обумовлює перевагу місця у мишей. (A) Локомоторну стимуляцію, спричинену морфіном (20 мг / кг ip), було ослаблено однією ін'єкцією JMV2959 (6 мг / кг ip) (n= 7 – 8 у кожній групі; **P<0.01, ***P<0.001 одностороння ANOVA з подальшим тестом Бонферроні пост-hoc). (B) Індукований морфіном (20 мг / кг в / в) перевагу місця (CPP) послаблювався гострим одноразовим введенням JMV2959 (6 мг / кг в / в) мишамn= 8 у кожній групі, *P<0.05, непарний t-тест). (C) Спочатку ми продемонстрували значний ефект морфіну (20 мг / кг в / в) на збільшення вивільнення дофаміну порівняно з лікуванням носієм (інтервал часу 40–180 хв (P<0.001), Veh – Veh vs Транспорт - морф). Як показано в (C), попередня обробка JMV2959 (6 мг / кг ip) послаблювала індуковане збільшенням вивільнення дофаміну, спричиненого морфіном порівняно з попередньою обробкою препаратом на часовому інтервалі 40 – 100 та 140 – 180 хв (^##P<0.01, ^{# # #}P <0.001, JMV2959-Morph порівняно з лікуванням Veh-Morph). Обрана доза JMV2959 не мала суттєвого впливу на вивільнення аккумалу дофаміну порівняно з лікуванням носієм у будь-який інтервал часу (P> 0.05, Veh – Veh vs JMV2959-транспортний засіб). JMV2959 зменшив, але не повністю блокував, інфікований морфіном акумуляційний вивільнення дофаміну на часовому інтервалі 60-140 (*P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001, JMV2959-Morph порівняно з лікуванням Veh-Morph). Стрілки відображають часові точки введення JMV2959, транспортного засобу та морфію. Дані проаналізовані за допомогою двостороннього ANOVA з подальшим тестом Bonferroni post-hoc (n= 8 у кожній групі). Транспорт - транспортний засіб (квадрат), транспортний засіб - морф (ромб), JMV2959-транспортний засіб (трикутник), JMV2959-морф (коло). Всі значення представляють середнє значення ± SEM.

Переглянути велике зображення | Перегляд Hi-Res зображення | Завантажте слайдер PowerPoint

Перевагу умовного місця, спричиненого морфіном (20 мг / кг) (Morph-Veh), було значно послаблено гострою одноразовою ін'єкцією JMV2959 (6 мг / кг) (Morph-JMV2959) у день після кондиціонування (P= 0.025, n= 8 у кожній групі; малюнок 1B).

Вимірювання акумуляційного мікродіалізу дофаміну у мишей виявило загальний головний ефект лікування (F(3,33) = 24.15, P<0.0001), час F(11,308) = 7.05, P<0.0001) та лікування × час взаємодії (F(11,308) = 8.63, P<0.0001) (малюнок 1C; n= 8 у кожній групі). Морфін збільшив вивільнення акумуляторного дофаміну щодо лікування препаратом на часовому інтервалі 40 – 180 хв (P<0.001). Як показано в малюнок 1C цей ефект був зменшений попередньою обробкою JMV2959 на часовому інтервалі 40 – 80 (P<0.01), 100 (P<0.001), 140 (P<0.01) та 160–180 хв (P<0.001). JMV2959 зменшив, але не повністю блокував, індуковане морфіном вивільнення акупального дофаміну, оскільки існувала різниця між лікуванням носієм та лікуванням морфіном JMV2959 у часовому інтервалі 60–80P<0.01), 100 (P<0.001), 140 (P<0.01) та 160 хв (P<0.05). Обрана доза JMV2959 не мала суттєвого впливу на вивільнення аккумалу дофаміну порівняно з лікуванням носієм у будь-який інтервал часу (P> 0.05).

Дане дослідження надалі підтримує гіпотезу, що фізіологічна роль орексигенного пептиду включає регуляцію винагороди. Дійсно, ми показали, що периферичне введення антагоніста GHS-R1A послаблює здатність морфіну викликати локомоторну стимуляцію, підвищувати рівень дофаміну в NAc та індукувати перевагу умовного місця у мишей. Ми також виявили, що субхронічне лікування JMV2959, але не грелін, збільшувало рівень тканин MEAP у VTA, DynB у гіпокампі та LeuArg у стриатумі, надаючи перші докази того, що здатність сигналізації греліну регулювати посилення може включати опіоїдні пептиди .

Дані, представлені в цьому документі, показують, що антагонізм GHS-R1A впливає на здатність морфіну активувати мезолімбічну дофамінову систему у мишей. Відповідно до висновків, які показують, що JMV2959 блокує здатність морфіну збільшувати позаклітинний рівень акумуляльного дофаміну та викликати стереотипну поведінку у щурів (Сусткова-Фісерова та ін., 2014). Підтримуючи це, центральне введення греліну збільшує точку зупинку, але не кількість активних натискань важелів, у графіку посилення співвідношення у щурів, які самостійно вживають героїн (Maric et al., 2012). Твердження про те, що сигналізація про грелін лежить в основі наркоманії, додатково підтверджується висновками, які показують, що JMV2959 зменшує споживання, а також мотивацію споживання алкоголю у щурів і що винагорода, спричинена амфетаміном, кокаїном та нікотином, блокується антагонізмом GHS-R1A у гризунів ( для огляду див. Engel and Jerlhag (2014)) і про те, що поліморфізми у генах, пов’язаних з греліном, пов’язані з прийомом алкоголю, курінням та амфетаміном (для огляду див. Engel and Jerlhag (2014)).

Наведені дані зі збільшенням рівня опіоїдних пептидів у стриатумі, VTA та гіпокампі після субхронічного лікування JMV2959 вперше свідчать про взаємодію між опіоїдними пептидами та сигналом греліну. Ендогенні опіоїди причетні до корисних ефектів, спричинених не лише опіоїдами, але й іншими наркотиками зловживання та природними винагородами, а також у адаптаційних процесах, що спостерігаються після повторного впливу наркотиків (Trigo et al., 2010, Van Ree et al., 2000). Дійсно, активність мезолімбічної дофамінової системи регулюється ендогенними опіоїдами як на рівні VTA, так і NAc (Hirose et al., 2005, Spanagel et al., 1992), і дії показали, що вони є прямими або непрямими. за допомогою модуляції інших передавачів (Charbogne et al., 2014).

Тут ми виявили, що субхронічне лікування JMV2959 підвищувало рівень MEAP у VTA. MEAP виходить виключно з проенкефаліну і використовувався як маркер проенкефалінових пептидів, які в основному активують δ-опіоїдні рецептори. Ми гіпотезуємо, що підвищений рівень ендогенного МЕАП у терапії VTA після лікування JMV2959 може перешкоджати здатності морфіну знижувати GABA-інгібування мезоаккумулятивних дофамінових нейронів (Johnson and North, 1992), що може сприяти зменшенню ефектів, викликаних морфіном, виявлених після JMV2959. Крім того, GHS-R1A розташовані на GABAergic інтерневронах у VTA (Abizaid et al., 2006). Більше того, попередні дослідження показали, що внутрішньо ВТА-інфузія JMV2959, через невідомі механізми, послаблюють винагороду, обумовлену греліном (Jerlhag et al., 2011), а також споживання сахарози, опосередковане греліном у гризунів (Skibicka et al., 2011), припускають, що вентральний тегментальний GHS-R1A є важливим для регулювання винагороди. На підтвердження такої суперечки наводяться дані, що показують, що інші пептиди, регулюючі голод, такі як галанін та орексин, опосередковують корисні властивості морфіну через локальні механізми всередині VTA (Наріта та ін., 2006, Річардсон та Астон-Джонс, 2012).

У стриатумі ми виявили, що субхронічний JMV2959 підвищує рівень LeuArg, що дозволяє припустити, що здатність JMV2959 послаблювати перевагу умовного місця, спричиненого морфіном, вивільнення дофаміну та опорно-рухове збудження залежить, принаймні частково, від посиленої акумулятивної δ- активність опіоїдних рецепторів. Підвищений рівень LeuArg може бути результатом посиленої ферментативної конверсії динорфінових пептидів до енкефалінів або від посиленого вивільнення Dyn в NAc як відповідь на підвищення дофаміну з подальшою деградацією на LeuArg. Хоча попередні дослідження показали, що активність мезолімбічної дофамінової системи регулюється через κ-опіоїдні рецептори в NAc (Spanagel et al., 1992) та ендогенні κ-опіоїдні рецептори забезпечують тонічне інгібування мезоаккубальної дофамінової нейротрансмісії та послаблюють кокаїновий викид дофаміну в NAc (Chefer et al., 2005). показують, що JMV2959 змінює рівні ir DynB в смузі. Таким чином, надалі проводяться подальші дослідження щодо пептидів продинорфіну для з'ясування взаємодії між антагонізмом GHS-R1A та динорфінами.

У цьому дослідженні ми також показали, що лікування JMV2959 значно підвищує рівень DynB гіпокампа. Грелін збільшує консолідацію пам’яті, а також дендритне формування хребта, генерує довгострокове потенціювання та сприяє полегшенню пам’яті через гіпокампа GHS-R1A у гризунів (Carlini et al., 2010, Diano et al., 2006). Крім того, миші з нокаутом GHS-R1A демонструють покращену просторову пам'ять у тесті на водно-лабіринт Морріса та порушену контекстну пам’ять у парадигмі кондиціонування страху порівняно з мишами дикого типу (Albarran-Zeckler et al., 2012). Динорфінові пептиди, включаючи DynB, в гіпокампі рясні, і вони послаблюють тривалу потенціювання (Chavkin et al., 1985, Wagner et al., 1993), а також погіршують просторове навчання у щурів (Sandin et al., 1998). Тому ми гіпотезуємо, що антагоніст GHR-R1A може послабити пам’ять про винагороду шляхом інгібування довготривалого потенціювання гіпокампа. через активація DynB. Ці дані сукупно забезпечують новий потенціал механізму, за допомогою якого JMV2959 через опіоїдні пептиди можуть змінювати посилення. Однак опіоїдні рецептори широко розповсюджуються в мозку, що дозволяє припустити, що інші ділянки, не включені до цього дослідження, можуть бути залучені до винагороди, обумовленої GHS-R1A, регульованою морфіном. Наприклад, споживання їжі, спричиненої греліном, а також натискання на важіль для сахарози зменшується центральним або внутрішньогіпоталамічним введенням антагоніста κ-опіоїдних рецепторів (Romero-Pico et al., 2013). Однак роль опіоїдних пептидів в інших областях потребує з'ясування в майбутніх дослідженнях.

Тут не аналізували ендогенні мк-рецепторні ліганди, ендоморфіни та бета-ендорфіни, тому ми не можемо виключити можливий вплив JMV2959 на ці пептиди. Дійсно, корисні властивості морфіну включають мк-опіоїдні рецептори як VTA, так і NAc (Hirose et al., 2005, Johnson and North, 1992, Murakawa et al., 2004, Yoshida et al., 1999). Однак антагоніст мк-рецепторів не зменшує споживання їжі, спричиненої греліном (Naleid et al., 2005), ані стимульовану греліном локомоторну стимуляцію та вивільнення допаміну (Jerlhag et al., 2011), маючи на увазі, що здатність GHSR- Антагоніст 1A для регулювання посилення не включає μ-рецептори. З іншого боку, JMV2959 впливав на опіоїдні пептиди, отримані з проенкефаліну та продинорфіну, показуючи, що вони можуть бути залучені до ефектів, викликаних антагоністами GHSR-1A.

Хоча попередні дослідження показали, що системне введення греліну викликає винагороду (Jerlhag, 2008), а також посилює корисні властивості наркотиків, що викликають звикання (огляд див. Енгель та Джерльгаг (2014)), ми тут показуємо, що субхронічне лікування греліном не змінило рівні тканинних опіоїдних пептидів в будь-якій з досліджуваних областей, пов'язаних із винагородою. Системне введення греліну активує експресію c-fos в гіпоталамічних областях, але не в мезолімбічних та гіпокампальних областях (Pirnik et al., 2011), а зв'язування флуоресцентно маркованого греліну обмежується харчовими регуляторними нейронами гіпоталамуса (Schaeffer et al., 2013 ). У сукупності з висновками, що показують, що грелін, крім мікроелементів гіпоталамуса, не може бути виявлений у більш глибоких областях мозку після периферичного введення греліну (Furness et al., 2011, Grouselle et al., 2008, Sakata et al., 2009 ), підвищує можливість того, що системний грелін активує систему винагород через непрямі механізми, незалежні від ендогенних опіоїдів. Крім того, індукований греліном акумуляційний вивільнення дофаміну вимагає висхідної орексигенної гіпоталамічної сигналізації (Cone et al., 2014), периферичне введення греліну не змінює споживання алкоголю у мишей (Lyons et al., 2008), а також нейтралізація периферичного греліну не послаблює алкоголь. -наведена винагорода мишам або споживанню алкоголю щурам (Jerlhag та ін., преса). Необхідно враховувати можливість того, що субхронічне введення греліну збільшує рівень тканинних пептидів опіоїдів, однак це необхідно детально дослідити в майбутніх дослідженнях.

Здатність наркотичних речовин викликати стимуляцію, вивільнення дофаміну та індукувати перевагу умовного місця, тісно пов'язана з посилюючими властивостями наркотичних речовин, і ці параметри вважаються складовою частиною процесу залежності (Wise, 2004). Зважаючи на те, що ми тут встановили, що JMV2959 послаблює ці параметри винагороди у мишей, ми вважаємо, що GHS-R1A може відігравати важливу роль у процесах звикання, і що ендогенні опіоїди беруть участь у цих процесах. Ці дані в сукупності вказують на те, що антагоністи GHS-R1A слід з'ясувати як лікування залежності від наркотиків.

JE та EJ підтримуються грантами шведської дослідницької ради (грант № 2011-4646, 2009-2782 та 2011-4819), шведської фундації мозку, LUA / ALF (грант № 148251) від університетської лікарні Сальгренська, алкоголь науково-дослідна рада шведської монополії на роздрібну торгівлю алкоголем та основи Адлербертської, Фредріка та Інгрід Тюрінг, Торе Нільссон, Ленгманської, Торстен і Рагнар Седерберг, Вільгельма та Мартіни Лундгрен, НовоНордіск, Кнут та Еліс Валленберг, Магнуса Бергвалла, Енерса, Жансона Вікс , Шведське товариство медицини, Шведське товариство медичних досліджень та Гетеборзький дослідницький фонд психіатрії. Рада з дослідження алкоголю Шведської монополії на роздрібну торгівлю алкоголем та Шведська наукова рада (K2012-61X-22090-01-3) підтримує IN. Джерела фінансування не відігравали жодної ролі у розробці дослідження, у зборі, аналізі та інтерпретації даних, у написанні звіту та у рішенні опублікувати дані.