Гіпокретин (орексин) полегшує винагороду за рахунок послаблення антирезурного ефекту динорфіну котрансмітера у вентральній тегментальной області (2014)

Джон В. Мушамп,^a,1 Джонатан А. Голандер,^b Дженніфер Л. Томпсон,^c Джордж Ворен,^b Лінда К. Хассінгер,^a Сара Онвані,^a Теодор М. Каменецький,^b Стефані Л. Боргланд,^c Пол Дж. Кенні,^b та Вільям А. Карлезон-молодший^a

Інформація про автора ► Інформація про авторські права та ліцензії ►

Гіпокретин (орексин) і динорфін - нейромодулятори, які відіграють важливу роль у регуляції афекту та мотивації. Орексин має вирішальне значення для винагороди і пов'язаний з пошуком наркотиків, тоді як динорфін опосередковує негативний настрій і втягується в депресивно-подібні стани. Враховуючи ці протилежні ефекти, повідомлення про те, що обидва пептиди експресуються в одних і тих же нейронах і є ядрами, є протиінтуїтивними. Тут ми демонструємо, що орексин і динорфін спільно експресуються в одних і тих же синаптичних везикулах і що ця колокалізація має глибокий вплив на винагороду, прийом наркотиків та імпульсивну поведінку. Той факт, що орексин перекриває депресивно-подібні антиреверсивні ефекти динорфіну, істотно змінює те, як ми бачимо функціональну роль орексину в мозку.

Гіпокретин (орексин) і динорфін - це нейропептиди, що мають протилежні дії на мотивовану поведінку. Орексин бере участь у станах збудження та винагороди, тоді як динорфін - у депресивно-подібних станах. Ми показуємо, що, незважаючи на протилежні дії, ці пептиди упаковані в ті ж синаптичні везикули всередині гіпоталамуса. Порушення функції орексину пригнічує корисні ефекти стимуляції бічного гіпоталамусу (ЛГ), усуває індуковану кокаїном імпульсивність та зменшує самоприйом кокаїну. Супутнє порушення функції динорфіну скасовує ці зміни поведінки. Ми також показуємо, що орексин і динорфін мають протилежні дії щодо збудливості дофамінових нейронів вентральної тегментальної зони (ВТА), важливої ​​мішені нейронів, що містять орексин, і що внутрішньо-VTA-орексиновий антагонізм спричиняє зменшення самостійного введення кокаїну та самостимуляції ЛГ які реверсуються антагонізмом динорфіну. Наші результати виявляють унікальний клітинний процес, за допомогою якого орексин може перешкоджати підвищенню порогових ефектів ядерного динорфіну і, таким чином, діяти вседозволено, щоб полегшити винагороду.

Орексин і Динорфін - котрансмітери.

Ми підтвердили спільну експресію орексину та динорфіну в одних і тих же нейронах латеральної, перифонічної та дорсомедіальної гіпоталамуси за допомогою флуоресцентної мікроскопії (18) (Рис. 1A). Існування нейронів, які експресують численні передавачі, було описано в інших ланцюгах мозку і може являти собою нейронну основу для фільтруючих механізмів, за допомогою яких вивільнення коекспресованих нейротрансмітерів відбувається при різній швидкості стрільби (19). Використовуючи ЕМ, ми виявили, що орексин та динорфін колокалізуються в одних і тих же синаптичних везикулах. Більшість випадків упаковки спостерігалися в немілінізованих, варикозно-аксональних процесах, де виявлено імуномаркирування в везикулах або поблизу них. У клітинах нейронних клітин значне маркування було пов'язане з комплексом Гольджі, тоді як жодне не виявлено у сусідніх ядрах (Рис. 1 B та C). Дендрити також містили зв'язування міхурців для обох пептидів, що дозволяє припустити дендритне вивільнення цих передавачів. Невелика кількість мікроструктурних профілів захопила аксонні термінали з міткою для обох пептидів, розташованих у великих (∼100 нм) везикулах, розташованих поза зоною вивільнення асиметричних синапсів (Рис. 1 B та C), надаючи підтримку висновку, що орексин і динорфін функціонують як котрансмітери, і що в нормальних умовах вони вивільняються разом, а не диференційовано, як функція частоти випалу клітин.

 

Рис. 1.

Орексин і динорфін - котрансмітери в нейронах гіпоталамуса. (A, Край лівий) Фотомікрограф яскравого поля показує ділянку гіпоталамуса, дослідженого на імунореактивність орексину (червоного) та динорфіну (зеленого). (A, Край справа) З’єднане двоканальне зображення ...

Ефекти блокади орексину, що підвищують поріг, повертаються блокадою динорфіну.

Для вивчення функціональної значущості цієї унікальної картини експресії передавача ми дослідили, чи можуть порушення перешкод сигналу орексину та динорфіну впливати на складну поведінку, яка відображає нормальну та аберрантну мотивацію. У C57BL / 6 мишей, навчених виконувати внутрішньочерепну самостимуляцію (ICSS), посилену бічною гіпоталамічною (LH) стимуляцією (20), блокада OX₁Rs N- (2-метил-6-бензоксазоліл) -N ″ -1,5-нафтиридин-4-іл сечовина (SB334867) під час легкої фази спричиняв залежність від дози підвищення порогових значень (Рис. 2A; односторонні повторні заходи ANOVA для дози: F_3,12 = 4.44, P <0.02). Збільшення порогів ICSS відображає зниження корисного впливу стимуляції, спричинене лікуванням, депресивно-подібний знак, що свідчить про зниження чутливості до винагороди (20). Цей ефект не був обумовлений заспокійливим ефектом чи іншими неспецифічними порушеннями поведінки, оскільки на рівень відповіді МССС не впливали (Рис. 2B; односторонні повторні заходи ANOVA для дози: F_3,24 = 0.33, P > 0.80).

 

Рис. 2.

Ефекти блокади орексину, що підвищують поріг, змінюються блокадою динорфіну. (A) Блокада сигналізації орексину на OX₁R за допомогою SB334867 (0 – 30 мг / кг, ip) підвищує пороги винагороди в тесті ICSS, що вказує на зменшення винагороди. Цей ефект ...

Підвищення порогових значень винагороди, спричинених SB334867, запобігалось попередньою обробкою нор-біналторфіміном (norBNI) [двосторонній повторний захід ANOVA для наркотиків (між фактором суб'єктів) × Доза SB (в межах суб'єкта фактору): F_3,24 = 3.98, P <0.01], що виробляє тривалу блокаду дії динорфіну на КОР (10). Ці дані говорять про те, що втрата сигналу орексину виявляє приховані антиреверсійні ефекти серцевинного динорфіну. Тільки адміністрація norBNI не знижувала межі винагороди. Хоча цей ефект може бути пов'язаний з унікальною фармакодинамікою norBNI та іншими прототипними антагоністами KOR (10), це також може вказувати на надмірність процесів, що модулюють активність ланцюгів нагородження мозку, або що фазове підвищення тонусу орексину (не призначається ядерним динорфіном) є недостатнім для передачі нагородного сигналу з місця стимуляції в бічному гіпоталамусі. Ці висновки можуть спочатку здатися невідповідними роботі інших, хто досліджував SB334867 на порозі ICSS під час темної фази (21). Однак є вагомі докази того, що зниження функції орексину може мати наслідки, які залежать від того, чи будуть тварини випробовуватися під час їх світлої або темної фази. Наприклад, їжа та вода зберігають свою корисну дію на мишах з орексином КО, коли випробування проводяться в темну фазу, але не під час світлової фази (22), час, коли ми виконували всі наші поведінкові тестування.

Для локалізації ефектів системного введення SB334867 та norBNI на ICSS окрему когорту мишей імплантували стимулюючі LH електроди та направляючі канюлі VTA. Мікроінфузія SB334867 у VTA викликала помітне підвищення порогових значень, що свідчить про зниження чутливості до винагороди. Незважаючи на те, що внутрішньо VTA norBNI не впливав на пороги ICSS, він блокував порогові ефекти після подальшої інфузії SB334867 (Рис. 2C; односторонні повторні заходи ANOVA для наркотиків: F_3,9 = 10.98, P <0.01). Незважаючи на те, що внутрішньочерепні вливання наркотиків мали тенденцію до помірного зниження максимального рівня відповіді порівняно із системними ін’єкціями лікарських засобів, ці ефекти не досягли статистичної значущості (Рис. 2D; односторонні повторні заходи ANOVA для наркотиків: F_3,9 = 1.03, P = 0.112).

Імпульсивність регулюється передачею орексину та динорфіну.

Імпульсивність характеризується дефіцитом придушення поведінки, що шукає винагороди, причому високий рівень імпульсивності є загальною ознакою багатьох психіатричних захворювань (23). Зловживання наркотиками, включаючи кокаїн, також може викликати посилення імпульсивності, що, як гіпотеза, стимулює розвиток залежності (24). Розглядаючи ключову роль орексину та динорфіну, що випускається з ядра, у контролі чутливості до корисного ефекту стимуляції ЛГ в тесті ICSS, ми припустили, що взаємодія між цими двома нейропептидами може впливати на базову імпульсивність та дефіцит кокаїну в цій поведінці. Імпульсивність можна кількісно визначити у гризунів, вимірявши передчасні реакції у завданні часу серійної реакції вибору 5 (5-CSRTT) (25), тваринна модель, аналогічна безперервному тесту на продуктивність, що використовується для вивчення уваги у людини. Передчасне реагування в цьому тесті має тенденцію бути низьким при нормальних умовах і посилюється препаратами, що підвищують передачу ДА (26). Ми використовували 5-CSRTT, щоб вивчити внесок системи орексин-динорфін у спонтанну та індуковану кокаїном імпульсивну поведінку. При самостійному введенні SB334867 додатково зменшив і без того малу кількість спонтанних передчасних реакцій (Рис. 3A; F_3,21 = 4.89, P <0.01). Ці скорочення відбулися за відсутності впливу на точність відповіді (F_3,21 = 1.45, P = 0.25), затримка пошуку гранул (F_3,21 = 0.91, P = 0.44), або кількість проведених випробувань стимулів (F_3,21 = 1.46, P = 0.25), що вказує на те, що вони не були обумовлені деградованою пильністю або руховими можливостями. Однак адміністрація norBNI відмінила вплив SB334867 на передчасне реагування (Рис. 3B; F_3,18 = 0.45, P = 0.71), що дозволяє припустити, що неопосередкована передача динорфіну є критичною при опосередкуванні цих протиімпульсивних ефектів. Даний окремо або в поєднанні з SB334867, norBNI не впливав на заходи точності відповіді (F_3,18 = 0.66, P > 0.58), затримка (F_3,18 = 3.09, P > 0.06), або кількість проведених випробувань стимулів (F_3,18 = 2.38, P > 0.10). Попередня обробка SB334867 також запобігла дворазовому збільшенню передчасної реакції, викликаної кокаїном (Рис. 3C; F_6,24 = 5.84, P <0.01). Ці дані свідчать про те, що нейротрансмісія орексину може регулювати імпульсивну поведінку як в базових умовах, так і в умовах, стимульованих кокаїном, динорфінчутливим способом.

 

Рис. 3.

Імпульсивна поведінка регулюється балансом орексину та динорфіну. (A) SB334867 послаблює передчасні реакції у щурячої моделі 5-CSRTT з руховою імпульсивністю. Були проведені заходи точності, затримки для вилучення гранул їжі та кількість випробувань, які були пропущені ...

Динорфін опосередковує зменшення самоконтролю кокаїну в OX₁R-Null Миші.

Уразливість до звикання помітно зростає у імпульсивних осіб, а збільшення імпульсивності, спричинене кокаїном, гіпотезується, що сприяє виникненню залежності (23, 27). Крім того, передача орексину та передача динорфіну були незалежно залучені до регулювання корисних ефектів зловживання кокаїном та іншими наркотиками (28-32). Ми припускали, що взаємодія між передачею орексину та динорфіну може безпосередньо контролювати прийом наркотиків. Щоб вивчити цю можливість, ми вивчили внутрішньовенне введення кокаїну на генетично модифікованих мишах, яким не вистачає OX₁Rs (OX)₁R^{- / -}). Миші цього генотипу виявляють значно нижчий рівень самоконтролю кокаїну в широкому діапазоні доз (0.1 – 1 мг / кг на інфузію), але демонструють незмінне реагування на нагороди за їжу за однаковими графіками посилення (33), що дозволяє припустити, що зменшення споживання кокаїну не є вторинним наслідком дефіциту поведінкових показників. Більше того, OX₁R^{- / -} миші демонструють нормальну швидкість самостійного введення кокаїну протягом приблизно трьох початкових сеансів доступу кокаїну, але потім швидко показують зменшення прийому кокаїну (33). Ми підтвердили цей фенотип у дозі 0.3 мг / кг на інфузію, що вказує на те, що сигналізувати через OX₁Rs відіграє вирішальну роль у встановленні та підтримці поведінки кокаїну в адміністрації [Рис. 4; двосторонні повторні заходи ANOVA, Генотип (між факторами суб'єктів) × Лікування лікарськими засобами (в межах суб'єктного фактора): F_1,12 = 12.91, P <0.01]. Подібно до того, як попередня обробка норBNI відновила нормальний ICSS та імпульсивно-подібну поведінку у мишей, яким дали SB334867, вона також частково відновила самоконтроль кокаїну в OX₁R^{- / -} мишей, надаючи унікальний приклад, коли дефіцит поведінки, викликаний генетичною абляцією у функції однієї нейромедіаторної системи, рятується блокадою іншої. Ці висновки говорять про те, що в OX₁R^{- / -} мишей, неопосередковані дії динорфіну послаблюють корисні властивості кокаїну і тим самим зменшують самоприйом наркотику. Цікаво, що в OX₁R^{+ / +} (контрольні) миші, norBNI несподівано знизили самоприйом кокаїну. Одним з можливих пояснень цього ефекту є те, що динорфін, що виділяється нейронами нонорексину, наприклад, так звані «прямі» стриатонігральні середні колючі нейрони, має протилежний вплив на споживання кокаїну і може фактично полегшити корисний ефект кокаїну. Існування двох груп КОР, які мають різну роль у нагородженні кокаїном, також пояснило б, чому norBNI лише частково змінив дефіцит поведінки щодо прийому кокаїну, виявлений у OX₁R KO мишей. Альтернативно, антагонізм KOR знижує неприємні або стресові наслідки виведення кокаїну (34), які сприяють вживанню наркотиків (17). Незважаючи на те, ці дані говорять про те, що депресивно-подібні ефекти динорфіну переважають за відсутності непошкодженого сигналу орексину, спричиняючи зменшення корисних ефектів кокаїну, тоді як ефекти орексину полегшують корисний ефект кокаїну, збільшуючи їх тривалість за відсутності динорфінова сигналізація.

 

Рис. 4.

Зменшене самовведення кокаїну в OX₁R KO мишей відновлюється блокадою KOR. Погіршення сигналу орексину на OX₁R шляхом генетичної делеції цього рецептора знижує внутрішньовенне введення кокаїну (0.3 мг / кг на вливання). Цей дефіцит частково ...

Орексин і динорфін можуть чинити врівноважений протилежний вплив на збудливість нейронів VTA DA.

Мозкові структури, які отримують надходження від гіпоталамічних орексину та динорфінових нейронів, піддаються впливу обох пептидів і, таким чином, піддаються протилежному впливу на збудження нейронів (35, 36). Те, наскільки ефекти одного пептиду переважають над ефектами іншого, ймовірно, залежать від численних факторів, у тому числі відносної кількості кожного пептиду, довговічності у позаклітинному просторі та експресії рецепторів у різних популяціях нейронів-мішеней, а також взаємодії між рецептори та їх внутрішньоклітинні сигнальні механізми в постсинаптичних клітинах. Імпульсивність та винагорода за кокаїн регулюються, принаймні частково, нейронами DA в VTA (26), помітна мішень клітин, що містять гіпоталамічний орексин (37). Більше того, вливання орексину у ВТА посилює пошук наркотиків (6). Щоб оцінити відносний внесок кожного пептиду в активність нейронів VTA, ми зробили електрофізіологічні записи з клітин DA в клітинах мозку C57BL / 6 миші, що зазнали впливу орексину та динорфіну, застосовуваних окремо або разом. Як передбачалося, при застосуванні окремо орексин був рівномірно збуджуючим, тоді як динорфін викликав лише інгібіторну дію (Рис. 5 A та B; F_2,50 = 18.95, P ≤ 0.01). У зафіксованій популяції нейронів DA найчастіше реагували на насичуючі концентрації обох пептидів, хоча незначна меншість вибірково реагувала лише на орексин або динорфін (Рис. 5B). Примітно, що обидва пептиди були застосовані до подвійних чутливих нейронів (n = 10), відсутній чистий ефект на швидкість стрільби (Рис. 5A), вказуючи на те, що протилежні ефекти кожного пептиду при насичуючих концентраціях ефективно виключають один одного при випуску кореля. Чотири з 10 нейронів показали переважне інгібування динорфіном, незважаючи на присутність орексину, тоді як одна клітина переважно збуджувалась (> 1.5-кратна зміна) орексином, незважаючи на присутність динорфіну (Рис. 5 A та C). В цілому, хоча більше клітин реагувало на орексин, ніж на динорфін, у тих клітин, які були чутливими до обох пептидів, не спостерігалось чистої зміни швидкості випалу при застосуванні орексину та динорфіну, що дозволяє припустити, що протилежні впливи кожного пептиду були врівноважені в межах набору VTA DA вивчені нейрони.

 

Рис. 5.

Орексин і динорфін чинять врівноважений, але протилежний вплив на нейрони VTA DA. (А, зліва) Нанесений орексин і динорфін не призводять до зміни швидкості випалу нейронів VTA DA (n = 10). Застосовуваний поодиноко, динорфін був інгібуючим, а орексин - збудливим. ...

Для подальшого з'ясування потенційної взаємодії орексин-динорфін у нейронах VTA DA, які були чутливими як до орексину, так і до динорфіну, ми намагалися, як альтернатива, посилити інгібіторну дію дінорфіну, застосованого у ванні, шляхом лікування SB334867 (S2A; F_5,25 = 2.13, P <0.01) або для посилення збудливого ефекту орексину, що застосовується у ванні, обробкою норBNI (S2B; F_3,27 = 5.48, P <0.01). В обох експериментах OX₁R та KOR-блокада не призвела до цих ефектів, що дозволяє припустити, що SB334867 і norBNI не чинять наслідків через неспецифічні дії. Що ще важливіше, ці дані говорять про те, що на тонус кожного пептиду in vitro недостатньо впливати, застосовуючи маломолекулярні антагоністи, такі як SB334867 та norBNI. Цей висновок узгоджується з попередньою роботою, яка вказує на те, що екзоцитоз великих пептидсодержащих пухирців зазвичай виникає лише при високій стійкій частоті випалу, як правило, відсутній у препаратах зрізів38).

Щоб переконатися, що norBNI не вплинув на поведінку за допомогою «поза цільових» дій безпосередньо в OX₁Наступним чином ми вивчили вплив цього антагоніста на OX₁R сигналізація. Зокрема, ми використовували аналіз флюорометричного зчитувального планшета (FLIPR) для визначення здатності орексину A, SB334867 або norBNI, що застосовується для ванни, індукувати внутрішньоклітинні перехідні кальцію в культивованих клітинах CHO, що експресують OX людини₁Rs Хоча орексин А викликав очікуване збільшення внутрішньоклітинного кальцію (ЕК)₅₀ = 0.01 мкМ) та доза SB334867, відповідно, послаблюють цей ефект (ЕС)₅₀ = 0.035 мкМ), норБНІ не спровокував жодних впливів ні на вихідну, ні на орексин А, викликану збільшення внутрішньоклітинного кальцію. Це говорить про те, що вплив norBNI на фізіологію нейронів VTA DA здійснюється виключно за допомогою запропонованих механізмів сигналізації KOR, і препарат не має прямого впливу на OX₁R (39) (S3 A-C).

Взаємодія Орексин-Динорфін у VTA регулюють самоконтроль кокаїну.

Наші електрофізіологічні дослідження показують, що динамічні взаємодії орексину і динорфіну регулюють активність ВТА DA і що нейрони VTA, ймовірно, служать ключовим субстратом для впливу системи орексин-динорфін на мотивовану поведінку. Щоб перевірити цю гіпотезу безпосередньо, ми вивчили ефекти внутрішньо-ВТА-інфузії SB334867 на внутрішньовенне введення кокаїну щурам. Порівняно з внутрішньовенною інфузією VTA, внутрішньо VTA SB334867 спричинило помітне зменшення споживання кокаїну, яке було заблоковано norBNI (Рис. 6; односторонній ANOVA: F_3,24 = 11.56, P <0.01), припускаючи, що дії протилежного динорфіну в цій ділянці мозку послаблюють винагороду кокаїну. Ці результати, як видається, суперечать результатам, які продемонстрували відсутність внутрішньо-VTA SB334867 при самоконтролі кокаїну в графіках посилення з фіксованим співвідношенням 1 (FR1) з низьким зусиллям (40). Однак декілька звітів показали, що із збільшенням вимог до завдань, SB334867 є більш ефективним у зниженні прийому наркотиків (2, 33). Оскільки щури в цьому експерименті виконували графік FR5 з більш високим зусиллям, то ці результати відповідають даній літературі. Ці дані дають прямі докази того, що протилежна природа орексину та динорфіну на фізіології нейронів VTA DA може чинити суттєвий вплив на поведінку, спричинену винагородою.

 

Рис. 6.

Взаємодії орексин-динорфін при ВТА опосередковують прийом наркотиків. Самоконтроль кокаїну зменшується внутрішньо VTA SB334867 (3 мкг на сторону), тоді як цей ефект відміняється попередньою обробкою норБНІ (10 мг / кг, ip) (n = 9). ***P < ...

Тварини.

Дорослі миші C57BL / 6J (вік 8, тиждень; лабораторія Джексона), які використовувались в експериментах ЕМ, знаходились у групах (три-п’ять на клітку); ті, що використовуються для ІКСС, розміщувались окремо після операції. Дорослі самці (350 g) щури Sprague – Dawley (Charles River Laboratories) були використані в експериментах із самовведенням 5-CSRTT та кокаїну та були розміщені у чотири групи. Миші дорослих самців C57BL / 6J (післяпологові дні 19 – 21), які використовувались для проведення експериментів з електрофізіології, розміщували у групах (три-п’ять на клітку). OX1^{- / -} мишей та їх OX1^{+ / +} послідовники (6 тиждень віку), які використовували для досліджень з самостійного введення, були отримані в лабораторії Джексона і були перекреслені більш ніж на сім поколінь мишам C57BL / 6. Ці миші були утримувані у групах (по дві на клітку). Всі тварини розміщувались у контрольованих температурою умовах на циклі 12-h світла / темна, і поведінкове тестування відбувалося 4 – 5 h у світловий цикл; продукти харчування та вода були доступні ad libitum, якщо не вказано інше. Процедури проводилися відповідно до Національних інститутів охорони здоров’я Посібник з догляду та використання лабораторних тварин (50) та були затверджені Інституційними комітетами з догляду за тваринами та їх використанням у лікарні Маклін, Університеті Британської Колумбії та Скріппс у Флориді.

Імуногістохімія та мікроскопія.

Флуоресценція та посилене сріблом золото імуномаркулювання орексином А або продинорфіном проводили на альтернативних ділянках мозку миші відповідно до раніше повідомлених процедур (51) та обробляються згідно стандартних протоколів EM. Потім нерозбірливі ділянки імуномаркрованої тканини були вибрані випадковим чином і сфотографовані для кількісного визначення частинок за допомогою програмного забезпечення ImageJ (Національний інститут охорони здоров'я) (С.І. Матеріали та методи, імуногістохімія та мікроскопія).

Електрофізіологія.

Патчеві піпетки (3 – 5 MΩ) були заповнені глюконатом калію 143 mM, 10 mM Hepes, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgATP, 0.3 mM NaGTP (з рН 7.2) та 270 – 280 mM mmmm. Дані були отримані на частоті 20 кГц і відфільтровані на частоті 2 кГц за допомогою програмного забезпечення pClamp 10.0 (Molecular Devices). Отримавши конфігурацію цілої комірки, клітини були затиснуті напругою при −70 мВ, і ряд ступінь напруги (250 мс, від −60 до −130 мВ на етапах 10-mV) застосовували для виявлення гіперполяризації (I_h) струми. I_h визначали як зміну струму між ∼30 мс та 248 мс після застосування кроку напруги. Внутрішню активність нейронів VTA DA вимірювали в режимі струму-затиску. Експерименти почалися, коли було досягнуто стабільної базової швидкості стрільби; Потім субстрати наносили протягом 5 хв і потім промивали штучною спинномозкової рідиною. Останні 3 хв кожного сегмента 5-хв були використані для аналізу даних. Динорфін А (1 – 17; 200 нМ) та орексин А (100 нМ) були отримані з американського пептиду та розчинені в дистильованій воді. Раніше було виявлено, що ці концентрації надають насичуючий вплив на активність клітин VTA (5, 52). Тиорфан (1 мкМ) і бестатин (10 мкМ) були отримані від Sigma – Aldrich, розчинені в дистильованій воді і застосовані разом з динорфіном A (С.І. Матеріали та методи, електрофізіологія).

Аналіз FLIPR.

OX₁Активність R оцінювали шляхом вимірювання внутрішньоклітинного рівня кальцію за допомогою аналізу FLIPR, як описано раніше (53) (Матеріали та методи SI, аналіз флуорометричного зображення зчитування пластин).

ICSS.

Мишам імплантували монополярні стимулюючі електроди або канюлі (PlasticsOne) під кетаміном / ксилазином (80 і 10 мг / кг відповідно, ip; Sigma), направленими стереотактично до ЛГ (18) та / або контралатеральний VTA [від брегми: передньозадній (AP), −3.2 мм; середньосторонній (ML), −0.5 мм; дорсовентральний (DV), −4.7 мм від дура]. Після періоду відновлення 7-d мишей навчали реагувати на стимуляцію мозку, як описано раніше (18). Найнижча частота, яка підтримувала відповідь (поріг), була обчислена за допомогою аналізу ліній найкращих розмірів найменших квадратів. Коли миші виконували критерії стійкості для порогів ICSS (± 10% протягом днів 5 підряд), вимірювали ефекти лікування препаратами. SB334867 (Скрипп Флорида) або DMSO носили в альтернативні дні за допомогою шприца Гамільтона (0.1 мл / кг ip), а пороги були негайно кількісно визначені в ході тестових сесій 15. НорБНІ (10 мг / кг ip; Sigma) давали в фізіологічному розчині (10 мл / кг) 48 год перед початком тестування на ICSS.

5-CSRTT.

Щурів обмежували харчовими продуктами (до 85% ваги для вигодовування) і навчали в контрольованих комп'ютером операційних камерах, розміщених всередині вентильованих, звукозаглушаючих шаф (Med Associates), та процедурам 5-CSRTT, як описано (25). SB334867 (у ДМСО, 0.1 мл / кг) та / або кокаїн (у фізіологічному розчині, 1 мл / кг; Сигма) вводили ip ін'єкцією 10 хв перед тестуванням, як і в інших експериментах, і norBNI давали щонайменше 48 год до початок тестування (Матеріали і методи SI, 5-Завдання часу вибору серійної реакції).

IV Кокаїнове самоуправління.

Щурів і мишей знеболювали сумішшю кисню пари ізофлурана (1 – 3% об. / Об.) І хірургічно готували за допомогою силастичних (VWR Scientific) катетерів у яремній вені згідно встановлених процедур (54). Відразу після імплантації катетера щурам двосторонні направляючі канюлі з нержавіючої сталі (калібру 23, довжиною 17 мм) були імплантовані в VTA (від брегми: AP, 5.3 мм; ML, ± 0.7 мм; DV, -7.5 мм від твердої мозкової оболонки ). Тестування за допомогою SB334867 або norBNI протягом 60-хвилинних щоденних сеансів проводили після досягнення стабільного споживання кокаїну (<20% відхилення у відповіді протягом 3 днів поспіль; С.І. Матеріали та методи, IV самоконтроль кокаїну).

Статистика

Дані виражаються як середнє значення ± SEM. Для експериментів ICSS використовували двосторонній повторний захід ANOVA для порівняння засобів між умовами, які лікували SB334867, та умовами, які лікували norBNI + SB334867. Односторонній повторний захід ANOVA за допомогою спеціальних тестів Ньюмена-Кеулса використовувався для порівняння засобів в умовах SB334867 та norBNI + SB334867. Для порівняння засобів у всіх експериментах 5CSRTT також використовувались односторонні повторні заходи ANOVA та Newman – Keuls. Двосторонній повторний захід ANOVA застосовували для порівняння засобів між групами лікування в експериментах із самоконтролем кокаїну з OX₁R KO мишей. Односторонні повторні заходи Аналізи ANOVA та Ньюмена-Келса використовувались для порівняння середньої реакції нейронів VTA DA на орексин та динорфін. Односторонні повторні заходи ANOVA та Newman – Keuls були також використані для порівняння способів споживання кокаїну у щурів, які отримували SB334867 та norBNI. Відмінності вважалися істотними, якщо P < 0.05.

Ми дякуємо доктору Гаррет Фітцмауріце за корисні коментарі до рукопису та Міранді С. Галло та Меліссі Чен за допомогу в зборі даних. Цю роботу підтримали Національні інститути грантів з охорони здоров’я F32-DA026250 і K99-DA031767 (до JWM), F32-DA024932 і K99-DA031222 (до JAH), R01-DA023915 (до. PJK) і RXNNXX. ) та грантом на відкриття Ради з природничих та інженерних досліджень (SLB).

Заява про конфлікт інтересів: WAC має патент (патент США 6,528,518; правонаступник: лікарня Маклін), пов'язаний із застосуванням антагоністів каппа-опіоїдів для лікування депресивних розладів. Усі інші автори заявляють про відсутність конкуруючих фінансових інтересів.

Ця стаття є PNAS Пряме представлення.

Див. Коментар на стор 5765.

Ця стаття містить допоміжну інформацію в Інтернеті за адресою www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1315542111/-/DCSupplemental.