Nat Neurosci. Авторський рукопис; доступний у PMC Jan 1, 2014.
Опубліковано в остаточному форматі:
Nat Neurosci. Липень 2013; 16 (7): 10.1038 / nn.3420.
Опубліковано онлайн червня 2, 2013. doi: 10.1038 / nn.3420
PMCID: PMC3703824
NIHMSID: NIHMS477621
Хуй Ван,*,1,2,3 Флоріан Дукло,*,1,2 Ян Лю,2,3 Зуоксин Ван,2,3 та Мохамед Каббай1,2
Остаточна редагована версія цієї статті видавця доступна за адресою Nat Neurosci
Див. Інші статті у PMC cite опублікованої статті.
абстрактний
У соціально-моногамній прерійній польовій (Microtus ochrogaster) спаровування індукує стійкі парні зв’язки, ініційовані формуванням переваг партнера і регульовані різноманітними нейромедіаторами, включаючи окситоцин, вазопресин та дофамін. Тут ми розглянули потенційні епігенетичні механізми, що опосередковують регулювання парних зв'язків. Ми показуємо, що інгібітори гістонової деацетилази натрію бутірат та Трихостатин А (TSA) сприяють формуванню переваг партнерів у жіночих прерійних польотах за відсутності спаровування. Це було пов'язано зі специфічною регуляцією окситоцину (OTR) та вазопресину V1a рецепторів (V1aR) в ядрах, завдяки збільшенню ацетилювання гістону у відповідному промоторі. Крім того, перевагу партнерів, що підтримують TSA, запобігали блокада OTR або V1aR в ядрах ядер. Важливо, що перевагу партнерів, спричинених спаровуванням, викликали таку саму епігенетичну регуляцію промоторів генів OTR та V1aR, як TSA. Таким чином, ці спостереження вказують на те, що TSA та спаровування полегшують перевагу партнерів через епігенетичні події, забезпечуючи перші прямі докази епігенетичної регуляції парних зв’язків.
Вступ
Соціальна приналежність є найважливішою характеристикою соціальної поведінки людини, а соціально-когнітивний дефіцит - загальні риси у багатьох нервово-психічних розладах, включаючи шизофренію та розлади спектру аутизму, а також залежність та депресію1. Соціально-моногамні прерійні волоти (Microtus ochrogaster) стали дуже цікавою моделлю дослідження нейробіологічних основ соціальної прихильності, оскільки як лабораторні, так і вільноживучі особи встановлюють довгострокові парні зв’язки2-4, які вперше ініціюються формуванням вибіркової поведінки приналежності до партнера, називається перевагою партнера5. Таке формування переваг партнера включає різні нейромедіатори та гормональні системи, включаючи нейропептиди окситоцин і вазопресин (AVP) та мезолімбічний дофамін5.
In загалом, формування переваг партнера опосередковується через нейротрансмісію AVP у вентральному блідості та бічній перегородці (LS) у чоловіків та нейромедіацію окситоцину в ядрі ярусів (NAcc) та прелімбічну кору в жіночих прерій.6-8.
Зазвичай бере участь у природній винагороді, такому як спаровування, дофамін також виступає критичним посередником переваги партнерів у прерійних полюсах. Активація рецепторів типу D2 типу дофаміну (D2R) у NAcc полегшує, тоді як активація рецепторів типу D1 типу дофаміну (D1R) гальмує формування переваг партнерів як чоловічих, так і жіночих прерій9-11.
Важливо, що зміни в експресії генів окситоцину та рецепторів AVP V1a, OTR та V1aR відповідно можуть самі сильно вплинути на перевагу партнера. Наприклад, у жіночих прерійних ворсах, наприклад, надмірне вираження ОТР у NAcc полегшує перевагу партнера за відсутності спаровування12-14.
Крім регулювання парних зв'язків, окситоцин і AVP також залучені до широкого кола соціальних форм поведінки, включаючи соціальне визнання, агресію та материнську допомогу15, 16. Зокрема, порушення поведінки останнього у гризунів викликають тривалі нейроадаптації за допомогою епігенетичних механізмів, включаючи метилювання ДНК рецептора естрогену альфа17 і гени AVP18, а також ацетилювання гістону промотору глюкокортикоїдних рецепторів19. Більше того, інгібітори гістондеацетилази (HDAC), посилюючи експресію генів за рахунок посилення ацетилювання гістону в мозку гризуна20, може змінити ці зміни19та безпосередньо впливають на соціальну поведінку, таку як сексуальна сприйнятливість21. Важливо, що в клітинній лінії раку легенів інгібітор HDAC трихостатин A (TSA) безпосередньо підсилює транскрипцію OTR шляхом місцевого сприяння ацетилюванню гістону.22.
Тому може бути запропонована епігенетична основа у формуванні переваг партнерів у прерійних польотах. Щоб перевірити цю гіпотезу, ми спочатку оцінили вплив двох інгібіторів HDAC, бутирату натрію (NaB) та TSA, на формування переваг партнерів у дорослих жінок-прерій. Згодом ми дослідили молекулярні механізми, що опосередковували ефекти TSA у спонуканні переваги партнерів до жіночих прерій. Нарешті, ми прагнули встановити, чи епігенетичні зміни, викликані TSA під час співжиття, також були спровоковані спаровуванням.
результати
Лікування TSA полегшує перевагу партнера
Статевонебезпечні жіночі прерійні ворсинки вводили внутрішньомозково-шлуночково (icv.) з CSF або CSF, що містять 0.08, 0.4 або 4 nг TSA безпосередньо перед 6-годинним співжиттям з самцем без спаровування, і їх перевагу партнера потім тестували. Шість годин спільного проживання з самцем без спаровування не викликає формування переваг партнера в жіночих прерій4 і таким чином ця поведінкова парадигма широко застосовується для оцінки впливу різних лікарських засобів на сприяння формуванню переваг партнера5.
Тварини, оброблені CSF, виявляли неселективний бічний бік з партнером або незнайомцем після години співжиття 6 без спаровування (t15= 0.76, P = 0.46; Рис. 1a). Однак тварини, які отримували TSA у всіх перевірених дозах, провели переважно більше часу з партнером, ніж з незнайомцем (t8= 4.35, P = 0.002 для TSA 0.08 ng група; t15= 3.63, P = 0.002 для TSA 0.4 ng група; і t8= 2.58, P = 0.03 для TSA 4 nг група). Що важливо, не виявлено групових відмінностей у руховій активності (F3,46 = 1.25, P= 0.30, 1b) і не спостерігалося агресивної поведінки тест-самки до незнайомця чи партнера, що демонструє, що ефекти TSA були специфічними для соціальних уподобань, а не були вторинними для зміни руху або соціальної відрази до незнайомця.
Щоб дослідити, чи посилює TSA ацетилювання гістону в структурах мозку, що беруть участь у формуванні переваг партнера, окрему партію жінок вводили середньою дозою TSA (0.4 ng) і спільно проживають з самцем за відсутності спаровування протягом 30 хв, 2 або 9 годин. Зокрема, не було виявлено жодної суттєвої зміни в глобальному рівні ацетилювання H3 глобального гістону (Lys14) у будь-який момент часу як у NAcc, так і в хвостовому періоді (P > 0.05 для всіх груп, Рис. 1c & d). Це свідчить про те, що TSA сприяє формуванню переваг партнера за відсутності спаровування, незважаючи на те, що це не впливає на глобальну ацетиляцію H3 в гістоні в NAcc або в хвостовій формі.
Важливо, що бутират натрію також полегшив перевагу партнерів у жіночих прерійних польотах після співжиття з самцем протягом 6 годин без спаровування, пов'язаного зі збільшенням глобальної ацетиляції гістону H3 (Lys14) у NAcc (Додатковий малюнок 1). Вплив TSA на формування переваг партнера може, таким чином, відтворюватися за допомогою іншого інгібітора HDAC, що передбачає залучення інгібування HDAC, а не неспецифічний ефект TSA для полегшення переваги партнера. Враховуючи, що TSA є більш специфічним та афінним інгібітором HDAC класу I / II23, 24і що поведінкові ефекти TSA були більш вираженими, ніж NaB, ми вирішили використовувати TSA над NaB для дослідження конкретних молекулярних корелятів у наступних частинах дослідження.
Молекулярні кореляти переваг партнерів, що сприяють TSA
Оскільки зміни рівня експресії генів у NALC-польових були пов'язані з різними стратегіями спарювання між моногамними та немоногамними вулками, а також із зміною формування переваг партнера в прерійних польових, зокрема12, 13, 25, 26, ми оцінили, чи асоціюється формування переваг партнера за допомогою TSA з варіаціями експресії генів у NAcc.
Лікування TSA (0.4) ng, icv.) індукував підвищення рівня OTR мРНК у NAcc після години співжиття 2 порівняно з контролями, обробленими CSF (t10 = 2.38, P = 0.038, Рис. 2a), яка, як правило, зберігається після співжиття 9 годин (t9 = 2.17, P = 0.058, 2b). Хоча незначне, але незначне збільшення мРНК V1aR можна було спостерігати протягом NAcc 2 годин після введення TSA, жодних інших групових відмінностей не було виявлено в будь-який момент часу для будь-якої з інших вимірюваних мРНК, включаючи D1R або D2R (P > 0.05, 2a, b). Важливо, що в будь-якій точці часу та в будь-якій вимірюваної мРНК не спостерігалося різниць у групі у хвостатих хвостів (P > 0.05 для всіх груп, Рис. 2c, d), що дозволяє припустити, що збільшення мРНК OTR, що спостерігається у тварин, оброблених TSA, було специфічним для NAcc. Крім того, така регуляція підвищеної активності була присутня лише після співжиття з самцем, оскільки рівень мРНК OTR та V1aR в NAcc залишався незмінним 2 годин після введення TSA без співжиття (OTR: 100.0% ± 11.70 для групи CSF, 86.7% ± 12.11 для TSA група, t12 = 0.79, P = 0.444; V1aR: 100.0% ± 26.24 для групи CSF, 92.3% ± 13.75 для групи TSA, t9 = 0.27, P = 0.791).
Відповідно до більш високих рівнів мРНК OTR, тварини, оброблені TSA, також демонстрували більш високий рівень білка OTR в обох часових точках протягом NAcc (2 год: t10 = 2.34, P = 0.041; 9 годин: t10 = 3.16, P = 0.01, Рис. 2e, f), але не хвостатий путмен (t10 = 0.41, P = 0.69, Рис. 2g, год). Цікаво, що при значній зміні рівнів мРНК V1aR не вдалося виявити в NAcc через 2 або 9 години після введення TSA (2a, b), рівень білка V1aR був значно підвищений за години 9 порівняно з тваринами, обробленими CSF, у NAcc (t9 = 3.46, P = 0.007, Рис. 2f), але не зухвалих разівmen (t10 = 0.98, P = 0.35, Рис. 2h). Хоча з деякими варіаціями, рівень білка D1R та D2R в NAcc та хвостатих каукатах не зазнав істотного впливу на введення TSA (P > 0.05, Рис. 2e-h).
TSA полегшує ацетилювання гістону oxtr та avpr1a
Збільшення рівня мРНК та білка для OTR після співжиття після лікування TSA припускає, що TSA, ймовірно, збільшив транскрипцію oxtr, ген, що кодує OTR, замість зміни трансляції або обороту білка. Більше того, рівень білка V1aR був вищим в NAcc, пов'язаному з невеликим, але не значним підвищенням рівня мРНК після лікування TSA (Рис. 2). Враховуючи, що TSA є потужним інгібітором HDAC класу I та II23, 24, 27, ми припускали, що TSA збільшує ацетилювання гістону при oxtr та avpr1a промотори в NAcc, після чого посилюючи їх транскрипцію. Отримали нову партію тварин icv. введення TSA (0.4) ng) і негайно спільно проживають з самцем без спаровування протягом 30 хв., перш ніж їх принести в жертву. Час вікна 30-хв був обраний на основі попередньої роботи, що повідомляє про максимальне збільшення ацетилювання гістону після місцевої ін'єкції TSA у щурів та мишей28, 29. H3K14 ацетилювання в oxtr та avpr1a Потім промотори аналізували хроматиновим імунопреципітацією.
Відповідно до збільшення рівня мРНК OTR та білка, раніше спостерігалося, тварини, оброблені TSA, показали дуже високе збільшення (+ 460%) ацетилювання гістону H3 при oxtr ген-промотор порівняно з контрольованими CSF контролями в NAcc (t10 = 5.88, P = 0.0002), але не зухвалий час (t9= 0.31, P = 0.76, Рис. 3a). Більше того, ацетилювання гістону H3 при avpr1a промотор був значно підвищений 30 хв після введення TSA (+ 196%) в NAcc (t10 = 3.12, P = 0.01), але не зухвалий час (t9= 0.38, P = 0.71) порівняно з елементами контролю CSF (3b). Тому TSA збільшував місце ацетилювання гістону спеціально в NAcc ще на 30 хвилині після початку співжиття з самцем.
TSA полегшує перевагу партнерів через OTR та V1aR
З попереднього набору експериментів виходить молекулярна модель дії, де під час співжиття TSA потенціює ацетилювання гістону при oxtr та avpr1a промотори, після чого посилюючи їх транскрипцію і призводячи до підвищення рівня білків OTR та V1aR до 9 годин після початку періоду співжиття. Важливо, що цей ефект ТСА є специфічним для сайту, оскільки хвостаті хвороби залишаються без змін. Тут ми перевірили, чи пов’язане це збільшення рівня OTR та V1aR, спричинене TSA, сприянням формуванню переваг партнера. Жіночі прерійні волоті отримали внутрішньо NAcc ін'єкцію TSA (0.04)nг на сторону) з попередньою ін'єкцією або без неї (30хвилин до введення TSA, 0.5nг на сторону) CSF або CSF, що містить один з двох різних антагоністів OTR, OTA (B) і OTA (T), або антагоніст V1aR (V1aRA). Відразу після ін'єкції ТСА самки проживали разом з самцем протягом 6 годин без спаровування, після чого проводився тест на перевагу партнера.
Тварини, оброблені CSF, не виявляли переваги партнера (t5 = 0.17, P = 0.87, Рис. 4a). Однак тварини, оброблені TSA, проводили значно більше часу в бічних сторонах контактів з «партнером», ніж із «незнайомцем», припускаючи, що однієї ін'єкції TSA безпосередньо в NAcc є достатньою для полегшення формування переваг партнера без спаровування (t5 = 7.04, P = 0.0009). Цікаво, що блокада або OTR, або V1aR попередньою обробкою OTA (B), OTA (T) або V1aRA запобігла наслідкам TSA (P > 0.05 для всіх груп). Оскільки групових відмінностей у руховій активності виявлено не було (F4,32 = 1.89, P = 0.14, 4b), ці дані говорять про те, що TSA в NAcc сприяє формуванню переваг партнера за допомогою механізмів, опосередкованих OTR- і V1aR, специфічно для поведінки.
Спаровування викликає подібні нейроадаптації, як TSA
Виходячи з попередніх спостережень, ми встановили, що епігенетична потенціація нейротрансмісії окситоцину та вазопресину у жіночої NAcc була достатньою для полегшення формування переваг партнера за відсутності спаровування. Щоб дослідити, чи відбуваються ці нейроадаптації також під час природного формування переваг партнера, жіночі прерійні ляльки спільно проживали з самцем протягом годин 24 у присутності спаровування, що викликає перевагу партнера4, і приносили жертви. Ми спостерігали збільшення рівня мРНК OTR та V1aR та білка в NAcc порівняно із статевонебезпечними жінками (OTR: + 38%, t10 = 2.68, P = 0.02 для мРНК і + 58%, t8 = 3.05, P = 0.01 для білка; V1aR: + 89%, t14= 2.53, P = 0.02 для мРНК і + 26%, t20 = 2.23, P = 0.037 для білка, 5a, b).
Оскільки рівень мРНК та білка для OTR та V1aR збільшувався за допомогою співжиття зі спаровуванням, ми далі дослідили, чи пов’язана ця регуляція з епігенетичним посиленням oxtr та avpr1a транскрипція генів. Таким чином, нову партію самки спільно проживали з самцем протягом 6 годин зі спаровуванням та ацетилюванням H3K14 у oxtr та avpr1a промотори вимірюють хроматиновим імунопреципітацією. Відповідно до рівнів мРНК OTR та V1aR та білків, жіночі прерійні полюси демонструють більш високе ацетилювання H3K14 при oxtr та avpr1a промоутери NAcc, порівняно із сексуально наїтими жінками (oxtr: t9 = 2.64, P = 0.02; avpr1a: t9 = 2.91, P = 0.017 Рис. 5c, d). Ці дані говорять про те, що парадигми співжиття, які надійно індукують перевагу партнерів у жіночих прерійних полюсах, викликають підвищення регуляції експресії OTR та V1aR в NAcc за допомогою епігенетичних механізмів, як це спостерігалося після лікування TSA.
Обговорення
У цьому дослідженні ми вперше повідомляємо про епігенетичну регуляцію формування переваг партнера. По-перше, ми продемонстрували, що посилення ацетилювання гістону в NAcc шляхом введення інгібітора HDAC полегшує формування переваг партнерів у дорослих жінок-прерій у відсутності спаровування. Tкурка, ми оприлюднили прямі докази того, що формування переваг партнерів у жінок епігенетично спричинене, оскільки співжиття та спаровування з самцем посилюються oxtr та avpr1a експресія генів через посилене ацетилювання гістону в NAcc. Введення TSA в NAcc викликало перевагу партнерів і призвело до підвищення рівня OTR мРНК та білків у NAcc. Крім того, незважаючи на те, що глобальне ацетилювання H3 у світі не вплинуло на жінок, оброблених TSA, помітне збагачення ацетилювання гістону на oxtr промотор у NAcc спостерігався ще на 30 хв після введення TSA. Нарешті, блокування OTR в NAcc було достатньо для запобігання переваги партнерів, що сприяли TSA. Оскільки подібні епігенетично модифіковані модифікації були виявлені після співжиття зі спаровуванням, в рамках процедур, які, як відомо, викликають перевагу партнерів, наші дані висунули модель епігенетичної регуляції соціальної поведінки. Dспільне проживання з самцем, TSA або спаровуванням, швидко індукує специфічне гістонове ацетилювання H3 при oxtr промотор в NAcc, що підсилює його транскрипцію, внаслідок чого підвищується рівень мРНК OTR та білка, що згодом сприяє формуванню переваг партнера.
У жіночих прерійних польотах 6 годин співжиття з самцем без спаровування не викликає формування переваг партнера4, і ця поведінкова парадигма була використана для вивчення впливу фармакологічних маніпуляцій на спонукання переваги партнера5. У нашому дослідженні, хоча контролі, що лікувалися сольовим розчином або ЦСЖ, не розвивали перевагу партнерів, жіночі прерійні в'язки, які отримували NaB або TSA. Оскільки ні NaB, ні TSA не вплинули на загальний рух, їх вплив на перевагу партнера, здавалося, був специфічним для поведінки, а не вторинним впливом на рух. Цей специфічний ефект TSA було додатково підтверджено нашими молекулярними спостереженнями. Дійсно, хоча і адміністративно icv., нам вдалося виявити специфічну зміну експресії генів у NAcc, але не в сусідній структурі, хвостатих пупмен. Крім того, навіть в межах NAcc, рівень мРНК D1R та D2R та білка залишалися незадіяними. Така специфіка виглядає дивовижною для широкого інгібітора HDAC, як TSA, який впливає на HDAC класу I та II. Тим не менш, повідомлялося, що TSA впливає на експресію лише невеликої підмножини генів геному ссавців30-32, у тому числі у мишей20.
Ми продемонстрували тут, що ацетилювання гістону H3 на Lys14 в oxtr промотор, модифікація, пов'язана з посиленою транскрипцією генів, в тому числі під час мозкової пластичності33, 34, підкреслює більш високий рівень мРНК ОТР та білка. У відповідь на TSA, ацетилювання гістону на oxtr промотор збільшує і полегшує активацію його транскрипції в клітинній лінії людини22, підтримуючи наше висновок про це oxtr може регулюватися епігенетично. Оскільки локальна блокада ОТР у NAcc була достатньою для запобігання поведінкових ефектів TSA, наші дані дозволяють припустити, що викликана TSA експресія OTR в NAcc під час співжиття опосередковувала сприяння формуванню переваг партнера. Більше того, години співжиття 24 із спаровуванням, процедура, яка, як відомо, надійно індукує перевагу партнерів у жіночих прерійних польотах, викликала подібне збільшення експресії OTR у жіночої NAcc. Це повністю узгоджується з відомим залученням окситоцину та його рецептора до нейробіології формування переваг партнерів у жіночих польотах. Спаровування викликає підвищення рівня позаклітинного окситоцину в NAcc25, а місцеве вливання окситоцину в NAcc сприяє формуванню переваг партнера за відсутності спаровування8. Більше того, антагоністи OTR блокують формування переваг партнера, індуковане введенням окситоцину або спаровуванням8, 35. Важливо, що надмірне вираження OTR у жіночій NAcc є вірусно опосередкованим, щоб полегшити формування переваг партнера12, 13.
На додаток до посилення ролі ОТР, наші результати також свідчать про активацію експресії генів OTR за допомогою епігенетичних механізмів під час співжиття з самцем за відсутності спаровування. Дійсно, хоча недостатньо, щоб викликати перевагу партнера, таке співжиття без спаровування протягом коротких періодів часу активізує нейробіологічні процеси, що лежать в основі формування переваг партнера. Наприклад, дві години вільного впливу у чоловіків викликають незначне, але незначне підвищення вивільнення окситоцину в жіночій NAcc25. Тому можна запропонувати, щоб TSA або NaB потенціювали нейроадаптації, викликані співжиттям з чоловіком, сприяючи розвитку переваг партнера. Цікаво, що про таке потенціювання вже повідомлялося у гризунів, де інгібітори HDAC класу I та II, включаючи NaB та TSA, полегшують консолідацію навчального події, що не призводить до тривалого формування пам'яті у контрольних тварин36, 37. На підтвердження цієї думки триваліші періоди співжиття (наприклад., 48hours) може викликати перевагу партнера навіть за відсутності спаровування4. Важливо також зазначити, що співжиття зі спаровуванням викликало у самки NAcc підвищення регуляції експресії OTR та V1aR через ті ж епігенетичні механізми, що і спостереження після співжиття з лікуванням TSA, які демонструють, що TSA та спаровування впливають на однакові шляхи просування формування переваг партнера Важливо, що TSA не індукує регуляцію OTR та V1aR у NAcc самки за відсутності співжиття з чоловіком. Загалом це підтверджує гіпотезу про те, що TSA сприяє формуванню переваг партнера за рахунок посилення ендогенних нейроадаптацій, природним чином викликаних співжиттям з чоловіком, а не активізації самостійно цих чи різних нейроадаптацій.
OУр-дослідження також підкреслює критичну роль NAcc V1aR у формуванні переваг партнерів самки, оскільки тварини, оброблені TSA, виявляють більш високі рівні V1aR, блокада яких перешкоджала формуванню переваг партнерів, що сприяли TSA. Більше того, ці ефекти були пов'язані з більш високим ацетилюванням гістону на avpr1a промотор, незважаючи на суттєве підвищення мРНК V1aR, ймовірно, через неоптимальну часову точку. Хоча ми не можемо виключати регулювання стійкості білка за допомогою TSA за допомогою ацетилювання білків негістону38, ця знахідка підказує, що, подібно до oxtr промотор, TSA може сприяти avpr1a транскрипція через локальне ацетилювання гістону. У той час як опис внеску AVP в парне зв язок чоловічої статі був описаний5, її роль у поведінці жінки все ще суперечлива. З одного боку, ан icv. AVP-ін'єкція полегшує формування переваг партнера як на чоловічих, так і на жіночих польотах, що запобігає блокаді або V1aR, або OTR39. З іншого боку, ан icv. ін'єкція антагоніста V1aR блокує перевагу партнера, спричиненого спаровуванням, у прерійних польових чоловіків, але не у жінок40. Однак усі ці дослідження використовували icv. ін'єкції, що перешкоджає будь-якому подальшому оглядові структури, що займаються. Тут ми наводимо перші докази того, що нейромедіація AVP в межах NAcc може бути залучена до формування переваг партнерів у жіночих польових, тоді як більша частина літератури описує його участь у різних областях, таких як вентральне блідостіння, бічна перегородка, ядро ложа stria terminalis та мигдалина у самців5. Тому стає цікавим зауважити, що блокада або OTR, або V1aR в NAcc жінки була достатньою для запобігання формуванню переваг партнера після лікування TSA, припускаючи, що формування переваги партнера вимагає активації як V1aR, так і OTR. Tйого висновок відповідає і підтверджує попереднє спостереження у польових прерій чоловічої статі, що одночасний доступ до OTR і V1aR в LS є важливим для переваги партнера, спричиненого AVP.6. Крім того, спостереження за специфічним збільшенням рівнів OTR та V1aR у тварин, оброблених TSA, додатково підтримує вимогу одночасної активації нейротрансмісій AVP та окситоцину для парного зв’язку.
У поєднанні з окситоцином та AVP нейромедіація дофаміну в NAcc модулює формування переваг партнера в жіночих польотах9. Хоча спаровування індукує вивільнення дофаміну в NAcc9зміни в рівнях рецепторів спостерігаються лише після тривалого періоду - довше, ніж 24h- співжиття із спаровуванням, важливим для підтримки парного зв’язку10. У відповідності з цими спостереженнями, жіночі прерійні вулкани, оброблені TSA, виявляли перевагу партнерів без значних змін в дофамінових D1R та D2R рецепторах. Тому ця відсутність регуляції рецепторів дофаміну є ще одним доказом специфічності TSA.
Наші дані вперше повідомляють про епігенетичний компонент в нейробіології парних зв'язків і припускають, що TSA індукує «вседозволений стан» в жіночих прерійних полетах, потенціюючи природну молекулярну реакцію на співжиття і сприяючи формуванню більш сильних соціальних взаємодій що веде до переваги партнера. Тому спокушати гіпотезувати, що перевагу партнера, що сприяє TSA, можна додатково посилити та призвести до стійких зв'язків. Незважаючи на те, що конкретні HDAC, що беруть участь, ще не визначені, таким чином, було б цікаво додатково дослідити вплив TSA на інші форми поведінки, пов’язані з моногамною життєвою стратегією в прерійних польотах, таких як селективна агресія та догляд за батьками. Розглядаючи актуальність польових прерій у моделюванні нейробіологічних механізмів парних зв’язків у людини5, а також багатообіцяючі інгібітори HDAC вже в клінічних випробуваннях24, 41, 42, наші дані прокладають шлях до нових фармакологічних можливостей впливу на соціальну поведінку.
Методи
Тематика
Сексуально наївні жіночі прерійні поле (Microtus ochrogaster) з лабораторії племінної колонії відлучили у віці 21 днів і розмістили в одностатевих парах побратимів у пластикових клітках (12 × 28 × 16 см) з подачею води та їжі ad libitum. Всі клітини підтримували за циклом 14: 10 h світло-темний цикл, і температура була приблизно 20 ° C. Усі тварини були випадковим чином розподілені в експериментальні групи, коли вони досягли 70 – 90 днів. Кількість використовуваних тварин грунтувалася на попередніх дослідженнях на місцях нашою групою та іншими, поєднаними з аналізом живлення. Експериментальні процедури були затверджені Інституційним комітетом з догляду за тваринами та їх використанням у штаті Флориди.
Наркотики
Бутират натрію (NaB), розчинений у фізіологічному розчині, і трихостатин A (TSA), розчинений у носії штучної спинномозкової рідини (CSF, BioFluids, Rockville, MD), були придбані у Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі). NaB вводили внутрішньочеревно (ip) в дозі 600 мг / кг, яка, як відомо, індукує ацетилювання гістону в декількох структурах мозку у мишей43, 44. Аналогічно, діапазон доз, використовуваний для TSA, базувався на попередній роботі, що визначає його ефективність в індукуванні місцевих подій ацетилювання гістону та варіації експресії генів у гризунів.19, 20. Селективний антагоніст рецепторів V1aR V1aRA, d(CH2)5[Tyr (Me)] AVP і антагоніст OTR OTA (B), [d(CH2)5, Tyr (Мене)2, Чт4, Тир-NH29] -OVT), були отримані від Bachem (Torrance, Каліфорнія). Другий, більш селективний антагоніст OTR, OTA (T), dГлі-NH2-d(CH2)5 [Тир (Мене)2, Чт4] OVT45, був люб’язно наданий доктором Морісом Меннінг (Університет Толедо, Огайо). Ці антагоністи та застосовані дози були обрані на основі попередніх досліджень, що демонструють їх вибірковість для V1aR або OTR відповідно35, 39, 46-49.
Стереотаксична канюляція та мікроін'єкція
Самкам анестезували пентобарбітал натрію (маса тіла 1mg / 10g), а напрямні канюлі з нержавіючої сталі калібру 26 (Plastics One, Roanoke, VA) були імплантовані стереотаксично, спрямовані на бічний шлуночок (в односторонньому порядку; носовий брусок при −2.5 мм, 0.6 мм, 1.0X мм, 2.6X мм рострал, бічний 2.5 мм і вентральний 1.7 мм до брегми) або місце - конкретно до NAcc (двосторонньо; носовий брусок при −1.0 мм, 4.5 мм рострал, ± 3 мм двосторонній і 1 мм вентральний до брегми). Після 30 днів відновлення випробовувані отримували мікроін'єкції або CSF, або CSF, що містять різні концентрації TSA. Коли використовувались селективні антагоністи для OTR або V33aR, їм вводили 1 за хвилину до TSA. Ін'єкції проводили за допомогою каліброваної голки 500, яка простягалася XNUMX мм нижче направляючої канюлі в цільову область, в об’єм ін'єкції XNUMX nL в бічний шлуночок (icv.) або 200 nL на сторону в NAcc. Голку з'єднували з шприцом Гамільтона (Hamilton, Reno, NV) через поліетиленову трубку 20, і впорскування плунжера виконували повільно, вимагаючи 1 хвилини на ін'єкцію. Після закінчення експерименту всіх суб'єктів жертвували швидким обезголовленням, а мізки витягували для перевірки розміщення канюлі спостерігачем, сліпим для експериментальних умов. Суб'єкти з неправильно розміщеними канюлями були виключені з аналізу даних.
Тест на співжиття та перевагу партнера
Відразу слідує ip., icv., або внутрішньо-NAcc ін'єкції ліків, жінки проводили спільне проживання з самцем протягом 6 годин без спаровування. Відсутність спаровування була перевірена шляхом вивчення поведінки на відео. Для дослідження нейроадаптацій, спричинених співжиттям із спаровуванням самок, споряджених естрогеном (2 мкг на день, ip., протягом 3 днів) спільно проживали з самцем протягом 6 або 24 годин, і наявність спаровування перевіряли апостеріорний на відеокасеті (від 6 до 11 нападів протягом перших годин співжиття 6).
Випробування переваг партнера проводили негайно після співжиття 6-годин, як описано раніше11. Коротко кажучи, трикамерний випробувальний апарат складався з нейтральної клітки, з’єднаної з двома паралельними однаковими клітинами, в кожній з яких перебувала збудлива тварина - незнайомий «незнайомець» чоловічої статі або знайомий «партнер» чоловічої статі, використовуваний у період спільного проживання. Під час 3-годинного тестування жінки-суб'єкти могли вільно пересуватися по апарату, а самці, що стимулювали, були прив'язані до клітин, не допускаючи прямого контакту один з одним. Весь сеанс був знятий на відео, а тривалість паралельного контакту випробовуваного або з партнером, або з незнайомцем пізніше була визначена кількісно кваліфікованим експериментатором, не знаючи про біологічні групи. Вподобання партнера визначали як суб'єкти, які проводять значно більше часу в тілесному контакті з партнером порівняно з незнайомцем, як визначається парним двостороннім t-тест. Крім того, трикамерний апарат був оснащений фотопроменевими датчиками, що дозволяло визначати опорно-рухову активність, вказану за кількістю входів самки в камери подразника. Цей показник опорно-рухового апарату дозволяє нам контролювати можливі вторинні ефекти наркотиків на поведінку жінки, такі як загальна активність, тривожність або змінене вивчення нового середовища, як зазвичай використовують наша група та інші12.
РНК та екстракція білків
Жінок приносили в жертву швидким обезголовленням, а мізки негайно витягували і заморожували на сухому льоду. Корональні зрізи (200 мкм) вирізали на кріостаті, а мороз встановив на гірки мікроскопа. Двосторонні перфоратори тканини діаметром 1 мм були взяті з усього NAcc та хвостатих зубців, останній був контрольною площею, і зберігалися при −80 ° C до обробки. Загальну РНК та білки екстрагували за допомогою протоколу TRI-Reagent відповідно до інструкцій виробника (Molecular Research Center, Cincinnati, OH).
Аналіз експресії білка вестерн-блотом
Після поділу на поліакриламідному гелі 10% (15% для гістонів) білки переносили на мембрани нітроцелюлози та інкубували з такими первинними антитілами: анти-OTR (sc-8102, 1: 1000), -V1aR (sc-18096, 1: 500), -D1R (sc-33660, 1: 1000), -D2R (sc-9113, 1: 1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), -actin (A2066, 1: 1000: 3: Сент-Луїс, штат Міссурі) або антиацетиловий гістон H14 (Lys06, # 911 – 1, 1000: 3) і загальний H05 (# 928 – 1, 1000: 81, Millipore, Temecula, Каліфорнія). Всі антитіла перевірені для їх використання у людях, щурах та мишах, у яких прерійні волоті мають високий відсоток гомології (від 96 до 6.0%). Після гібридизації з вторинним антитілом, кон'югованим з HRP, мембрани виявляли за допомогою ECL (субстрат ECL SuperSignal West Dura, Pierce Biotechnologies, Rockford, IL) і експонували на плівку Fuji XAR (Fuji Film, Tokyo, Japan). Кількісне визначення проводили за допомогою програмного забезпечення AIS 3 Image (Imaging Research, St. Catharines, Онтаріо, Канада), і всі сигнали були нормалізовані в межах однієї мембрани для актину, за винятком сигналу ацетил-H3, який був нормалізований на загальний гістоновий сигнал HXNUMX. Нормалізовані дані потім виражають у відсотках тварин, оброблених CSF.
Напівкількісна ланцюгова реакція полімерази в реальному часі (RT-PCR)
0.5 мкг загальної РНК обробляли для комплементарного синтезу ДНК, а потім аналізували, як описано раніше50 з нормалізацією гена нікотинаміду-аденінунунуклеотиддегідрогенази (NADH). Всі реакції проводили в трикратних продуктах, а їх специфічність перевіряли за допомогою аналізу кривих плавлення та поділу на гель агарози 2%. Використовувані послідовності праймерів були такими: 5'-TCCAAGGCCAAAATCCGCACGG-3 '(Fwd) і 5'-GGCAGAAGCTTCCTTGGGCGC-3' (Rev) для OTR, 5'-GAGGTGACGATGACGATGACGATGACGATGACGATGACGATGACGATGACGACGATGACGATGACGATGACGACGATGACGATGACAGAXNTXACAACNTACACAACN ' (Rev) для AVP3aR, 5'- TTAACAACAATGGGGCTGTG-3 '(For) і 1'-GGCATGAGGGATCAGGTAAA-5' (Rev) для D3R, 5'-XTGTCTXTGTGTGTGTGTGTTXTTXTXTGTGTTXTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTXTGTXTGTXTGTGTGTXTXTGTGTXTGTXTGTXTXTGTXTXTGTGTXT '' ) для D3R і 1'-CTATTAATCCCCGCCTGACC-5 '(For) і 3'-GGAGCTCGATTTGTTTCTGC-5' (Rev) для NADH. Нормалізовані дані виражаються у відсотках тварин, оброблених CSF.
Хроматин Імуноосадження
Ацетилювання гістону H3 (Lys14) у тканинах NAcc та хвостатих тканин хвостатого типу аналізували за допомогою набору тканин Magna ChIP протеїну G (Millipore, Temecula, Каліфорнія) відповідно до інструкцій виробника. Коротко, після зшивання з 1% формальдегідом хроматин було зрізано за допомогою Misonix XL-2000 до фрагментів 200 – 600 bp. Імунопреципитацію ацетильованого гістону H3 (Lys14) потім здійснювали за допомогою 10 мкг антиацетил-H3 (Lys14) антитіла (Millipore) протягом ночі при 4 ° C. Після промивання, элюирования з бісеру та відміни поперечної зв язки імунопреципітована ДНК очищалася та аналізувалась у три екземплярах методом RT-PCR на платформі iCycler (див. Вище) за допомогою внутрішньої стандартної кривої, виготовленої з об'єднаних зразків INPUT. Праймери були розроблені для ампліфікації 236 bp-довгої області, розташованої 128 bp вище за течію першого екзону, що кодує прерійну ляльку OTR (oxtr, Приєднання до Генбанку №AF079980), або 192 bp-довга область, розташована 141 bp вище за течією першого коду, що кодує екзон, для прерійної ляпки V1aR (avpr1a, Приєднання до Генбанку №AF069304). Послідовності були такими: 5'-CTCCGGAGCCGGGGGCTAAGT-3 '(Fwd) і 5'-ACCGCTTCCCCGAGAGTAGGG-3' (Rev) для oxtr, і 5'-GGTGGACCAGCCAGACCCCA-3 '(Fwd) і 5'-TGCAGAGCCAGGCGCTTTCC-3' (Rev) для avpr1a. Кожен зразок був нормалізований відповідним значенням INPUT, а потім дані виражаються у відсотках від тварин, оброблених CSF.
Статистичний аналіз та обробка даних
Для аналізу переваг партнерів були виключені тварини, які проявляли поведінку спаровування протягом періоду співжиття або з неправильно розміщеними канюлями. Для всіх інших молекулярних аналізів максимум одна точка даних на біологічну групу була виключена, коли вона була ідентифікована як зовнішня. Більшість експериментів були повторені, за винятком випадків, коли результати були дуже чіткими. Час, проведений у бічній стороні контакту з будь-яким стимулюючим твариною під час тестування переваг партнера, аналізувався за допомогою двосторонніх пар t-тест. Оцінки локомоції аналізували за допомогою двохвостого t-тест (для двох груп) або односторонній ANOVA (для більш ніж двох груп), і, коли це доречно, PLSD Фішера ретроспективному випробування проводилися з порогом значущості P <0.05. Після перевірки нормальності всі інші дані були проаналізовані двостороннім t-тест, якщо заздалегідь протестувати однакові або неоднакові відхилення. Всі статистичні аналізи проводили за допомогою програмного забезпечення StatView (SAS Institute). Коли дані стандартизуються у відповідних контрольних групах (% групи CSF, фізіологічний розчин або спаровування), статистичні аналізи проводилися за необробленими даними.
Подяки
Ця робота була підтримана Національним інститутом психічного здоров'я (NIMH), який надає MHR21-083128 MK та ZW, а MHR01-058616 до ZW. Ми також дякуємо доктору Морісу Меннінгу за щедрий подарунок антагоніста OTR (T).
Виноски
Конфлікт інтересів: Автори не оголошують конфлікту інтересів.
Авторські внески
HW, FD і YL виконували експерименти. HW та FD проаналізували дані. HW, FD, ZW та MK розробили дослідження. FD, ZW та MK написали статтю. Усі автори обговорили результати та прокоментували рукопис.
посилання
;