J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.
Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ.
manba
Psixiatriya bo'limi, Neuroscience markazi, Texas janubi-g'arbiy tibbiyot markazi, Dallas, Texas, 75390-9070, AQSh.
mavhum
Transkripsiyalashgan faktor DeltaFosB (shuningdek, FosB2 yoki FosB [qisqa form] deb nomlanadi) ko'plab psixoaktiv stimulyatsiyalarga, jumladan, suiiste'mol qilish, stress va elektrokonsivulseptiv urishlarning surunkali ta'siriga duchor bo'lgan uzoq muddatli plastisitikaning muhim vositachisi hisoblanadi . DeltaFosBning o'ziga xos xususiyati shundan dalolat beradiki, keyinchalik stimullanmagan holda miyada uzoq vaqt davomida davom etadi. Biroq, bu aniq barqarorlikning asosiy mexanizmlari noma'lum qolmoqda. Bu erda biz DeltaFosBning hujayra madaniyatida taxminan 10 soatlik yarim umrga ega nisbatan barqaror transkriptsion omil ekanligini namoyish qilamiz. Bundan tashqari, biz DeltaFosBning miyada fosfoprotein ekanligini va DeltaFosBdagi yuqori darajada saqlanib qolgan salqin qoldiqning (SerxNUMX) fosforlanishini uni proteazomal buzilishdan himoya qilishini ko'rsatamiz. Biz ushbu fosforlanishning xom-kinaz 27 tomonidan vositachilik qilganligini ko'rsatadigan bir qator dalillar taqdim etamiz. Ushbu topilmalar DeltaFosB ning fosforilatlangan birinchi dalilidir va fosforlanishning miyadagi uzoq muddatli moslashuvchanlik vositalarini yaratish qobiliyatining asosiy qismida joylashgan barqarorlikka yordam berishini ko'rsatib beradi.
Kirish
FosB2 yoki FosB (qisqacha forma) deb ataladigan transkriptsion faktori DFSB, darhol erta genning C terminali kesilgan biriktiruvchi varianti fosb (Dobrazanski va boshq., 1991; Nakabeppu va Nathans, 1991; Yen va boshq., 1991). To'liq uzunlikdagi FosB kabi, DFS-ning DNK-bog`lovchi asosiy domeniga ega va bu jarayon orqali jun oqsillari bilan dimerizatsiya qiladigan lyuzin fermuarlari mavjud va ular ko'p sonli genlarni ifodalashni tartibga keltiruvchi proton-1 (AP-1) transkriptsion faktor komplekslarini hosil qiladi.Morgan va Curran, 1995; Rylski va Kaczmarek, 2004). FosB ning C terminusida topilgan transactivatsiya domenining bir qismi bo'lishiga qaramasdan, DFB madaniy hujayralardagi va miyada (shuningdek, kuchli transkripsiya faollashtiruvchi va repressor sifatida ishlaydi)Dobrazanski va boshq., 1991; Nakabeppu va Nathans, 1991; Chen va boshq., 1997; McClung va Nestler, 2003; Kumar va boshq., 2005).
ΔFosB surunkali, ammo o'tkir emas, turli xil psixoaktiv stimullarga, shu jumladan stressga, ma'lum ziyonni, antipsikotik va antidepressant dori-darmonlarni, suiiste'mol qilish va tabiiy nafaqalarni o'z ichiga olgan holda mintaqada o'ziga xos tarzda yuqori darajalarga olib keladi. (Hope va boshq., 1994b; Xiroi va Graybiel, 1996; Moratalla va boshq., 1996; Bing va boshqalar, 1997; Mandelzys va boshq., 1997; Kelz va boshq., 1999; Werme va boshq., 2002; Andersson va boshq., 2003; Colby va boshq., 2003; Peakman va boshq., 2003; Perrotti va boshq., 2004; Zachariou va boshq., 2006). DFBning induktsiyasi bevosita bevosita ushbu ogohlantirishlarning bir nechta funktsional ta'siriga bevosita bog'liq edi. DFOSBning davomiyligi qo'shimcha stimulyatsiya bo'lmagan taqdirda ham uni FOSning barcha boshqa transkriptsiya omillaridan ajralib turadi, bu esa qattiq stimulyatsiyaga javoban tezda paydo bo'ladi, bir necha soat ichida bazal darajaga qaytadi va surunkali stimulatsiyadan so'ng desensitizatsiyani ko'rsatadiHope va boshq., 1992; Daunais va boshq., 1993; Persico va boshq., 1993; Xiroi va Graybiel, 1996; Perrotti va boshq., 2004). Bu esa, DFF ni ba'zi bir surunkali stimullarning kelib chiqadigan barqaror neyronal adaptatsiyalarga asoslangan gen ekspozitsiyasidagi uzoq davom etadigan o'zgarishlarga vositachilik qilish uchun jozibali nomzod qiladi.
DFOSB ning uzoq muddatli mavjudligi mRNA ning keyingi indüksiyonu yo'q bo'lganda (Chen va boshq., 1995), FosB va boshqa Fos oilaviy oqsillaridan farqli o'laroq, biz DFOSB o'zgacha statistik transkripsiyadan foydalanish faktori (Hope va boshq., 1994b; Chen va boshq., 1997; Nestler va boshq., 2001; McClung va uning hamkorlari, 2004). Bundan tashqari, o'tkir surunkali stimulyatsiya qilingan miya to'qimalarining immunoblotting tahlili shuni ko'rsatadiki, DF Mr surunkali davo vaqtida o'tkir xolada xNUMX-33 kDa dan xNUMX kDa dan (molekulyar massa)Hope va boshqalar, 1994a; Chen va boshq., 1995). Ushbu turli izoformlarni kodlovchi qo'shimcha mRNAlarning borligiga hech qanday dalil yo'qligi sababli, biz DFOSning posttranslatsion ravishda o'zgartirilganligini va bu uning o'zgacha stabilligiga hissa qo'shishi mumkinligini taxmin qilamiz. Shu bilan birga, bugungi kunda DFOSB ning aylanmasining yoki posttranslatsion o'zgarishlarning biokimyoviy tahlillari haqida xabar berilmagan. Ushbu tadqiqotning maqsadi DFOSBning fosfoproteinmi yoki yo'qligi va fosforiliyaning uning barqarorligida ishtirok etadimi-yo'qligini aniqlash edi.
Materiallar va usullari
Darra hujayralari va DNK tuzilmalari.
PC12 xujayralari (Clontech, Mountainview, KA) yuqori glyukoza DMEM o'z ichiga olgan l-glutamin (L-Gln) ichida ishlab chiqarilgan va 5% xomilalik boshoq sarum (FBS), 10% ot sarum (ikkalasi ham Invitrogen, Carlsbad, CA) , 100 U / ml penisilin va 100 ig / ml streptomitsin (ikkalasi ham Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO). HeLa hujayralari (American Type Madaniyat to'plami, Manassas, VA) yuqori darajali glyukoza DMEM o'z ichiga olgan L-Gln ichida ishlab chiqilgan va 10% FBS, penitsillin va streptomisin bilan qo'shilib ketgan. Har ikkala hujayra chizig'i ham nam 37% CO da 5 ° C da saqlanib qoldi2 atmosfera.
DNK bilan o'tadigan vaqtinchalik infektsiyalari uchun PC12 yoki HeLa xujayralari ertasi kuni 12-90% konfuzsiyaga erishish uchun va keyinchalik Lipofektamin 100 (Invitrogen) yordamida transfekte olti olti burchakli plitalar (PC2000 hujayralari uchun kollagen I bilan qoplangan) ustiga urildi. Ba'zi tajribalarda (qarang Shakl. 1⇓⇓⇓⇓⇓-7), DFOSB rekombinat herpes simplex virusi (HSV) bilan infektsiya orqali PC12 hujayralarida vaqtincha ifoda etilgan.
DFOSB va FosB cDNA'ları o'z pTetop-tuzilmalarimizdan (Chen va boshq., 1997) va pcDNA3.1 vektoriga (Invitrogen) pastki klonlanadi. Ushbu pcDNA3.1-AFosB / FosB konstruktsiyalari darrandalar hujayralarida ifodalangan va saytga yo'naltirilgan mutagenez uchun shablon sifatida ishlatilgan. Rekombinant HSV-DFosB oldindan aytib o'tilganidek tayyorlangan (Neve va boshq., 1997), va preparat ~ 1 × 10 titeriga ega bo'lgan8 pfu / ml.
Pulse-chase tajribalari.
Infektsiya / transfeksiyadan taxminan 24 soat o'tgach, oltita quduqli plastinkalardagi hujayralar (PC12 yoki HeLa) 2 ml PBS bilan ikki marta uch marta yuvilgan va 37 ° C da 1 ml Cys / Met-free DMEM (Invitrogen) 2% bilan dializlangan FBS (Hyclone, Logan, UT) bilan to'ldirilgan va Met va Cys ichidagi hujayralar havosini iste'mol qilish uchun mo'ljallangan. Ushbu "ochlik" davrining oxirida dorilar (agar hujayralar davolanadigan bo'lsa) qo'shilgan va hujayralar 5-12 μCi bilan 35S Proteinni etiketlash vositasi (PerkinElmer, Wellesley, MA) xNUMXda har kuni yangi sintezlangan oqsillarni belgilash uchun 1 ° C darajasida. Keyin radiolabel 37 ml PBS bilan hujayralarni ikki yoki uch marta yuvish orqali chiqarildi va 35S-etiketli oqsillarga 5% FBS bilan to'ldirilgan va har xil vaqt nuqtalarida hujayralarni yig'ib olish bilan "sovuq" (radioaktiv bo'lmagan) vosita bilan almashtirish orqali (ta'qib) ta'qib qilindi. Hujayra muolajalari kuzatuv davomida davom etdi. Ushbu tajribalarning barcha ko'rsatkichlari ularning aylanish stavkalarini taqqoslashni optimallashtirish uchun turli xil oqsillarning boshlang'ich miqdorlarini ko'rsatadi.
Hayvonlar va surunkali elektrokonvulsif soqchilikni davolash.
Adult Sprague Dawley erkak sichqonlari (200-300 g, Charlz River Laboratories, Kingston, RI) kuniga bir marta 7-9 d uchun elektrokonsivulseptiv tutilishlar (ECS) bilan davolandi. ECS ilgari ta'riflanganidek bajarilgan (Hope va boshqalar, 1994a) Ugo Basile (Comerio VA, Italiya) ECS birligi quyidagi sozlamalar bilan: chastota, 100 pulslar / s; 0.5 chaqirim bilan zarba; zarba muddati, 1.0 s; va joriy, 75 mA. Shamni nazorat qiluvchi hayvonlarga elektr tokidan foydalanmasdan quloq-qisqich elektrodlarini qo'llash orqali parallel ravishda davolash qilindi.
32 R metabolik belgilar.
Miya bo'laklarini etiketlash uchun kalamushlarni qisqartirgan, miya tez tarqalgan va 300 mm frontal kortikal tilim DSK mikroselleri (Ted Pella, Redding, KA) bilan tayyorlangan. Bo'laklar 2 ml fosfat etishmayotgan sun'iy CSF (ACSF) plastmassa naychalari ichida inkübe qilindi va 30 ° C da doimiy O2/ CO2 aralashmasi (Hemmings va boshq., 1989). O'simliklar kislotasi (1.3 ng / ml) mavjudligi yoki yo'qligida 8-10-h uchun dilimlari (har bir kolba uchun ikki bo'lak) 100 mCi bilan etiketlangan. Ushbu inkübasyonun oxirida, dilimler sovuq ACSF bilan kamida uch marta durulanmış va undan keyin 250 mL sovuq radioimmunoprecipitation tahlil (RIPA) tamponunda [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (v / v % 0.5% ga qadar SDS bilan ishlatishdan oldin to'ldiriladigan IgEpal, 0.1% (h / h) natriy deoksikolat, 1% (w / v) SDS, 0.6 mm EDTA], darrandalar hujayralari uchun proteaz inhibitori kokteyli (5 ml / ml; Sigma-Aldrich), fosfataz inhibitori kokteyllari I va II (1: 100, Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF va 2% gliserol ishlatiladi. Homojenatlar 15 daqiqa davomida qaynatiladi va 15,000 × da santrifüj bilan tozalanadi g 15 daqiqa. Olingan suyuq moddalardagi protein konsentratsiyasi BCA protein tekshiruvi (Pierce, Holmdel, NJ) yordamida baholandi.
uchun 32P-xujayralarni etiketkalash, infektsiya / transfeksiyadan keyin ~ NNNXX h, hujayralar fosfatsiz vosita bilan ikki yoki uch marta yuvilgan va bu muhitda ~ NNXX soat davomida inkübe qilingan. Ushbu ochlikdan keyin 24-1 mCi 32PH3PO4 (PerkinElmer) har bir quduqqa qo'shildi va hujayralar 4-12 h uchun tajriba turiga qarab belgilandi (xususiyatlar uchun shakl 1-7 ga qarang). Hujayralar PBS bilan uch marta yuvilgan va 15 min uchun qo'shimcha buzilgan RIPA tamponlu 50 mili uchun muz ustida lyize qilingan. Lysates qazib olish yo'li bilan yig'ilgan va 10 marta 25 ga igna orqali 10 min uchun qaynatilgan DNKni kesish uchun va 15,000-15-30-daqiqada 4-27-daqiqada XNUMX-da santrifüj qilingan. Tozalangan lizatlar (supernatantlar) yangi trubaga o'tkazilib, BCA protein tekshiruvi (Pirs) bajarildi. Ushbu tajribalarning barcha ko'rsatkichlari ularning nisbiy fosforillanish darajalarini taqqoslashni optimallashtirish uchun jami yovvoyi turi (WT) va SXNUMXAFFB proteinlari o'xshash miqdorlarni ko'rsatadi.
Kimyoviy moddalar va hujayra madaniyati usullari.
Okadaik kislota (OA; Sigma-Aldrich) etanolda eritildi va xNUMX ng / ml ning yakuniy konsentratsiyasida ishlatildi. 100-Dichloro-5,6-b-d-ribofuranosil-benzimidazol (DRB, Biomol, Plymouth Meeting, PA) dimetil sulfoksidda (DMSO, Sigma-Aldrich) eritildi va xNUMXm ning yakuniy konsentratsiyada hujayra madaniyatida ishlatildi. Spermin (Sigma-Aldrich) suvda eritildi va xNUMXm ning yakuniy konsentratsiyasida ishlatildi. Calphostin-C (Biomol) DMSOda eritildi va 1mmda ishlatildi, XBNUMX-myristat 50-asetat (PMA, Promega, Madison, WI) XMSUMXda eritildi va 200mmda ishlatildi. myristoylated-autocamtide-0.2 bilan bog'liq inhibitiv peptid (m-AIP, Biomol) suvda eritildi va 12 va 13 mmning oxirgi konsentratsiyasida ishlatildi. Keng spektrli oqsil kinaz inhibitörleri H-0.1 va H-2 (Biomol) suvda eritildi va navbati bilan 1 va 10 mkm yakuniy konsentratsiyasida ishlatildi. MG7 (Calbiochem, San-Diego, KA) va epoxomicin (Peptides International, Louisville, KY) ikkalasi ham DMSOda eritilib, 8 va 150 ìm ning yakuniy konsentratsiyasida ishlatilgan. Barcha tajribalarda DMSO (transport vositasi) muolajalar bo'ylab doimiy miqdorda DMSO saqlash uchun zarur bo'lgan hujayralarga qo'shilgan. Uchun 32P markirovkalash tajribalari, dorilar kirishdan oldin darhol qo'shilib, etiketkalash davrining qolgan qismi uchun saqlangan. Pulse-kovalovchi tajribalar uchun Cys / Met "ochlik" vaqtida dori-darmonlar ilova qilingan, etiketkalash davrida saqlanib qolgan va kovlash vositasiga qo'shilgan. Proteazom inhibitörleri, bu peptidlerin tez aylanishi uchun muvozanat ichida har bir 3-4-h'ye tarqaldi.
DFOSB immunoprecipitation, immunoblotting va autoradiografi.
Immunoprecipitatsiyalar uchun lizatlar 1: 5 bilan to'g'ri RIPA bilan suyultirildi va immunoprecipitatsiya (IP) ga o'tishdan oldin SDS konsentratsiyasini 0.1% ga kamaytirdi. Nonspesifik bo'lmagan ulanishni cheklash uchun lizatlar birinchi marta kamida 4 soat davomida nonimmun IgG va protein G-septaroz (Sigma-Aldrich) bilan immunoprecipitatsiyalash orqali tozalanadi. FosB keyinchalik 48-mg lizat oqsiliga 0.5-1 mk IgG da FosB va DFosB (SC-10G, Santa Cruz Biotexnology, Santa Cruz, CA) da mavjud bo'lgan ichki epitopni taniydigan echki poliklonal antikor yordamida tozalangan lizatlardan immunoprecipitatsiya qilindi (Jami proteinning 50-300 mkg) jami xNUMX ml hajmida. IP-larni kamida 0.5-daqiqada 4 ° C ga kamroq aralashtirib, undan keyin 8 mL protein G-Sefaroz qo'shilgan va IP-lar kamida boshqa 15-soat uchun aralashtirildi. IPlar 4 × ga tejamkorlik bilan pellet qilingan g 3-5 minutida 4 ° C da uch marta 0.5 ml sovuq tekis RIPA bilan va ikki marta 0.1% Tween 20 o'z ichiga olgan sovuq PBS bilan yuviladi. IP-lar bundan keyin 0.5 ml sovuq PBSda qayta suspenziya qilindi, transfer qilindi, yangi trubada pellet qilindi va immunoprecipitatsiyalangan oqsillar 15-25 mL 2x ning qo'shilishi bilan elib yuborildi va Laemmli protein namunaviy tamponini kamaytirdi. Ushbu IP protokoli lizatadagi DF-ning deyarli barcha qismini o'ziga xos va samarali tarzda yog'dirdi. Immunopresipitatsiya qilingan oqsillar butun IPni 12.5% Tris-HCl Kriterlash jeli (Bio-Rad, Hercules, CA) ustiga o'rnatish orqali SDS-PAGEga ta'sir o'tkazdi va keyin PVDF yoki nitroselulozaga o'tkazildi. O'tkazilganidan so'ng membran havo bilan quritilgan va 32P- va 35S-radiolabelatsiyalangan oqsilli bantlar autoradiografiya yordamida Kodak (Rochester, NY) autoradiografik filmi yordamida, shuningdek, Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) fosforli migratsiyasi orqali fosforimlash orqali kuzatildi. Hujayra lizatlarida yoki fiziologik homogenatlarda (fosforillangan va fosforilatlangan) DF (FosB) ning immunobakteriyalangan proteinin immunoblotlanish yo'li bilan aniqlanishi ( 32P-etiketli oqsil) yoki SDS-PAGEga teng miqdorda lizat / homogenat oqsili yoki PVDF yoki nitroselelozaga o'tkaziladi. 1% (v / v) Tween 0.1 (Sigma) bilan to'ldirilgan 20% (w / v) nonfat quruq sut (Bio-Rad) bilan 1 ° C da 25% Membranani 4 ° C da kecha davomida immunoblot qilingan. FosB / DFOSB (1: 16 da ishlatilgan) ning 1-10,000 amino kislotalariga qarshi yaratilgan quyon anti-FosB poliklonal antikoru bilan. Birlamchi inkubatsiyadan so'ng, membranalar blokirovkalash tampon bilan 5 min uchun to'rt marta yuvilgan va keyin 25 ° C da ~ 1 h uchun kovaloq peroksidaza qo'shilgan echki-quyonga qarshi IgG bilan inkubatsiyalangan (1: 5000 da blokirovka tamponida ishlatilgan, Vektorli Laboratoriyalar, Burlingame, KA). Keyinchalik membranlar blokirovkalash tamponlari bilan 10 min uchun uch marta va PBS bilan 5 min uchun bir marta yuvildi. Jami FFSB oqsilli bantlari Kodak MR kinofilmida ximyolizatsiyasi yaxshilangan (Pirs) va / yoki ECL-Plus reaktivlari (Amersham Biosciences) va Storm PhosphorImager yordamida floresansni aniqlash orqali namoyish etildi.
Hashoratli hujayralardagi rekombinat DFBni oshkor qilish va tozalash.
DFOSNB Bac-Bac Baculovirus ekspresyon tizimi (Invitrogen) yordamida va ishlab chiqaruvchining yo'riqnomasidan kelib chiqqan holda Nfus NUMX hasharotlar hujayralarida N-terminali hexa-His-etiketli oqsil (N-His (9) DFB) sifatida haddan ortiq ta'sir ko'rsatdi. Qisqacha aytganda, DFosB cDNA (qoldiqlari 6-2) oldindan yaqin N-terminal yorlig'i MGHHHHHHAG rekombinat bakulovirus ishlab chiqarish uchun ishlatilgan pFASTBacTM237 vektorida pastki klonlangan. Sf1 hujayralari rekombinatli virus bilan yuqilgan va N-His (9) DFBB bir nechta kromatografik qadamlarni o'z ichiga olgan hujayra lizatlaridan (Qiagen, Valencia, CA), mono-Q kolonini (Amersham Biosciences) va o'lchamlari cheklashni jel-filtrlash ustunidan (Amersham Biosciences) ishlatish.
In vitro fosforilasyon ishlari.
In vitro (N-His (30) DFSB yoki ijobiy nazorat substrati), 10mm ATP va 6 mCi / mL [g-250 mikmentli 1 mk (XNUMX) substratli hajmda va stoikiometriya tahlillari uchun fosforillanish reaktsiyalari o'tkazildi32P] ATP, kinaz ishlab chiqaruvchi tomonidan taqdim etilgan tampon va quyidagi kinazlardan biri: CK2 (20 ng / ml; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / mL; Upstate), PKC (1.6 ng / ml; Calbiochem) yoki p70S6K (2.5 mU / ml; Upstate). Vaqt kursi reaktsiyalari reaksiya eritmasidan belgilangan 5 mili alikotlarini belgilangan vaqt nuqtalarida olib tashlash va 4 × tenglamdagi Laemmli protein namunaviy tamponini kamaytirish orqali amalga oshirildi. Michaelik-Mentenning CK2 reaktsiyasi uchun kinetik parametrlari empirik tarzda aniqlangan chiziqli barqaror vaziyat sharoitida aniqlandi. Ushbu reaktsiyalar 15 nm / ml enzim, 10mm ATP, 2 mCi / mL [g-32R] ATP va N-His (6) ning DFosB konsentratsiyasi 2.5-30mmdan farq qiladi. Barcha reaktsiyalar 30 ° C da suv hammomida bajarilgan. SDS-PAGE dan keyin va Bio-Havfli Coomassie (Bio-Rad) bilan jel binoni jel quritilgan va 32P-fosfat birikmasi fosforimaj tahlillari yordamida baholandi (quyida ko'rib chiqing, ma'lumotlar miqdori, hisoblashlar va statistika).
Ikki o'lchovli fosfopeptid xaritasi va fosfamino kislotasi tahlillari.
Ushbu tahlillarning ikkalasi ham ta'rif etilganidek amalga oshirildi Ploegh va Dunn (2000). Qisqacha, quruq jel fragmanlar mavjud 32P-belgisi bo'lgan DFB (yoki in vitro reaktsiyalar yoki metabolik belgilarga ega hujayralardagi immunoprecipitatlardan) eksize qilindi, qaytadan yuvindi, yuvindi va triptik ovqat hazm bo'lishiga uchradi. Triptik hazm qilish mahsulotlarini o'z ichiga olgan supernatant liyofilizatsiya qilingan va liofilat bir necha marta yuvilgan va 10 mL elektroforez bufer, pH 1.9da qayta ishlab chiqarilgan. Misol (3 mk) tsellyuloza yupqa qatlamli kromatografiya (TLC) plastinka (Analtech, Newark, Dv) ustiga belgilandi va elektroforez va boshqa o'lchamdagi ko'tarilgan TLC bilan bir o'lchovda ajratildi. Olingan fosfopeptit xaritalari autoradiografiya va fosforimajiya orqali aniqlandi. Fosfamino kislotasi tahlil qilish uchun elektroforez tamponunda qayta süspansiyona olingan 2 mL'lik triptik digestlerin 105 ° C'de 25 min uchun HCN hidrolizi tomonidan 3 m HC1 ichida N2 atmosfera. Reaksiya suvda olti marta eriydi va bu aralash liofilize qilindi. Liyofilat 5 mL elektroforez bufferi, pH 1.9da qayta ishlangan va fosfotr, -Thr va -Tyr standartlari bilan bir qatorda tsellyuloza TLC plastinkasida kuzatilgan. Elektroforez elektroforez tamponu, pH 1.9 yordamida TLC plastinkasining uzunligining yarmidan ko'prog'ida bajarildi va keyin plita pH 3.5 buferiga o'tkazildi va elektroforez bajarilishi uchun bajarildi. Fosfamino kislota standartlari, TLC plastinkasini aseton ichida bir xNUMX% (v / v) ninhidrin eritmasi bilan püskürtülerek tasvirlangan va 32P-etiketli aminokislota namunalari ham autoradiografiya va fosforimayzatsiya orqali aniqlandi.
siRNA bilan indikatsiyalangan CK2a pasayishi.
Biz RNKning aralashuv usuli yordamida CK2 (Di Maira va boshq., 2005). PC12 xujayralari kollagen I-qoplangan oltita quduqli plitalar ustiga ertasi kuni ~ 70-80% konfuzsiyaga erishish uchun, ular katalizatorning mRNA'siga yo'naltirilgan yoki maqsadga muvofiq bo'lmagan siRNA yoki siRNA ning 20 nm (yakuniy konsentratsiyasi) Rat CK2 ning A subuniti, SilentFectin (Bio-Rad) transfeksiyalovchi agentining 5 mili yordamida va ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga binoan. Taxminan 24 soatdan so'ng, yuqorida aytib o'tilganidek, hujayralar vaqtincha DFB plazmidi bilan transfekte qilindi. Taxminan 24 soat keyin (siRNA transfeksiyasidan keyin ~ NNXX soat keyin) hujayralar 32Yuqorida ta'riflanganidek, P metabolik belgilar yoki puls-ta'qiblarni tahlil qilish. Quyidagi to'rt CK2α siRNAs o'xshash natijalar bilan ishlatiladi: 5'P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3, 5'P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3, 5'P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUU3, 5'P-AAAUCCCUG ACAUCAUAUUUU3 »(Dharmacon, Lafayette, CO). Salbiy nazorat sifatida foydalanar edik Susturucu Ambion (Austin, TX) dan salbiy nazorat # 3 siRNA. CK2ning noqulay darajasi 2: 06 dilyutasida kechada anti-CK873 poliklonal antikor (Upstate'dan # 1-1000 katalogi) yordamida immunoblotlanish orqali kuzatildi. B-Tubulin yukni nazorat qilish uchun ishlatilgan va bir kecha-kunduzda 05: 661 suyuqlikda monoklonal antikor bilan (katalog # 1-20,000) topilgan.
Saytga yo'naltirilgan mutagenez.
SerxNUMX ning Ala yoki Aspga mutatsion jarayoni Tez o'zgartirish saytidan boshqariladigan Mutagenesis to'plamidan (Stratagene, La Jolla, CA) va ishlab chiqaruvchining yo'riqnomasidan kelib chiqqan holda amalga oshirildi. Sichqoncha DFSB proteinida SerxNUMX mutatsiyalarini tanishtirish uchun quyidagi mutagenez primerlari ishlatilgan. SerxNUMX to Ala: (teskari primer) 27'GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 '. SerxNUMX to Asp (old primer) 27'CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 '. Mutatsiyaga uchragan bazalar qalin va Ser27 kodoni kursivdir.
Bioinformatika.
DFOSB uchun potentsial fosforillanish joylari va kinazlari sichqonchani protein sekansini ProSite (shu jumladan,http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost va boshq., 2004) va NetPhosK (Blom va boshq., 2004).
Ma'lumotlar miqdori, hisob-kitoblar va statistika.
PVDF yoki nitroselülozli membranada mavjud bo'lgan oqsil miqdori Storm PhosphorImager va unga tegishli bo'lgan ImageQuant dasturi (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics) yordamida aniqlandi. Hujayra madaniyati va miya dilimindeki fosforilasyon faoliyatlarida, 32Keyin P-etiketli oqsillar jami DFB uchun olingan qiymatlar bilan bo'linadi va nisbati sifatida ifodalanadi. In in vitro fosforilasyon faoliyatlari 32DFOSB molekulasi (stokiometriya) uchun P-belgisi bilan DFSB oldindan aytib o'tilganidek hisoblab chiqilgan (Shahin va boshq., 2004). Barcha o'lchovlar qo'llanilgan asbobning lineerligi oralig'ida olingan. Kinetik parametrlar Michaelis-Menten modeli yordamida aniqlandi V = VMax[S] / ([S]+KM) va VMax = k2[Ejami]. Yarim umr (t1/2) va FosB va FosB ning qiymatlari pulse-kovak uchastkalaridan baholangan (ma'lumotlar punktlariga eng mos keladigan chiziqli regressiya yordamida) va qolgan oqsil miqdori asli 50% bo'lgan vaqtga to'g'ri keladi. Barcha raqamlarda ko'rsatilgan natijalar kamida ikki-uchta mustaqil tajribadan iborat. Barcha grafiklarda ko'rsatilgan ma'lumotlar o'rtacha ± SEMs (3 ≤ n ≤ 16). Turmushlarning statistik ahamiyatini hisobga olmaganda, uncha ko'p bo'lmagan t test, bir nechta taqqoslashlar uchun tuzatilgan va yulduz belgilarini ko'rsatadi p ≤ 0.05.
natijalar
DFB - bu odatiy bo'lmagan transkriptsion faktor
Biz ilgari DFOSB ning nisbatan barqaror transkriptsion faktori (Nestler va boshq., 2001), oqimning aylanma profilini to'g'ridan-to'g'ri tahlil qilish hozirgi kungacha bajarilmagan. Ushbu savolga javob berish uchun biz PC12 hujayralarini foydalanib, neyronga o'xshash hujayra chizig'i sifatida keng qo'llanilgan impulslarni kuzatish tajribasini o'tkazdik, bu erda DFB rekombinatli herpes simplex virusi (HSV-DFB) bilan infektsiya orqali o'tib ketgan. Yangi sintezlangan oqsillar metabolik belgilar bilan belgilandi 35S-Met / Cys va uning tanazzulga uchrashi 35S-belgisi bilan DFOSB (35S-DFosB) radiolabellangan aminokislotalar chiqarilgandan keyin turli vaqt nuqtalarida olingan hujayra lizatlaridan immunoprecipitatsiyalash orqali kuzatildi. SDS-PAGE va autoradiografiya yordamida immunoprecipitatlarning tahlili shuni ko'rsatdiki, PC12 hujayralarida DFOSBning yarim umri ~ 10 soat (Anjir. 1). Ushbu topilmalar DFOSBning yarimparchalanish davri eng ko'p ta'sirlanadigan transkriptsiya omillaridan (Qarang: Munozara), shu jumladan to'liq uzunlikdagi FosB dan yuqori bo'lib, uning hujayra madaniyatida yarim umri ~ 90 min (Dobrazanski va boshq., 1991; Carle va boshq. 2004). Bundan tashqari, DFB ning degradatsiyasi birinchi darajali eksponentsial parchalanish chizig'iga mos kelmasligini ta'kidlash joiz, aksincha u sekinroq ajralish tezligi bilan boshlanib, ikki fazoviy bo'ladi. Bu bir nechta DFB turlarining mavjudligini va / yoki bir nechta degradatsiya yo'lining mavjudligini ko'rsatadi.
Ko'rinishni kengaytirish:
Shakl 1.
DFB - bu odatiy bo'lmagan transkriptsion faktor. DFOSB ning yarimparchalanish davri hujayra madaniyatida ~ 10 soat. DFOSB PC12 hujayralarida HSV-DFV bilan infektsiyalangan yoki DFOSB o'z ichiga olgan plazmid bilan vaqtinchalik transfeksiyada ifodalangan va hujayralar Materiallar va usularda ta'rif etilganidek, yurak urish tajribasiga tobe etildi. DFFBni ortiqcha bosim qilish uchun ishlatiladigan usuldan qat'i nazar, teng natijalar olingan. Rasmda DFOSB degradatsiyasining vaqti kursi (va vakolatli autoradiogram) ko'rsatilgan. Berilgan ma'lumotlar kamida besh mustaqil tajribadan olingan kamida 15 ta shaxsiy ma'lumot nuqtalarining o'rtacha ± SEMsi. Taqqoslash uchun to'liq uzunlikdagi FosB ning yarim yarim muddati ko'rsatilgan.
DFF - miyada fosfoprotein
DFF ning posttranslatsion modifikatsiyasi uning sezilarli barqarorligiga hissa qo'shishi mumkinligini taxmin qildik. Fosforillanish transkriptsiya omillarining faolligini ko'p jihatdan, shu jumladan ularning barqarorligini modulyatsiya qilish uchun ko'rsatildi (ko'rib chiqish uchun qarang. Desterro va boshq., 2000; Whitmarsh va Davis, 2000), biz DFF ning fosfoproteinmi yoki yo'qligini tekshirdik. Shu maqsadda, DFOSB ekspresyonu surunkali ECS foydalanib, sıçan miyada paydo bo'ldi, ayniqsa, frontal korteks (ayniqsa, frontal korteks)Hope va boshqalar, 1994a). So'nggi ECS davolashdan bir kun o'tib, DFB darajalari yuqori bo'lib qolganda, ingichka frontal kortikal tilim tayyorlandi va metabolik 32P-ortofosfat. Parallel parchalar majmuasi radiolabeled emas edi va ular jami DFB darajasini aniqlash uchun ishlatilgan. Muayyan anti-FosB / FFB antikorlari bilan immunopreptitatsiyadan so'ng va immunoprecipitatsiyalangan oqsillarni SDS-PAGE bilan ajratish natijasida fosforilatlangan 32PF belgisi DFOSB autoradiografiya yordamida aniqlandi, bunda immunoblotlanish bilan birga DFOSB aniqlandi. Ushbu tahlil, DFOSB ning ma'lum bir mantiqqa ko'ra, miyada fosforilatlanganligini aniqladi 32X-nurli davolash qilingan miya namunalarida P-etiketli bantli ~ 35 kDa mavjud, ammo soxta ishlov beriladigan nazoratlarda deyarli aniqlanmaydi (Anjir. 2A). Surunkali stimulyatsiya bo'lmaganida, DFBning bazal darajasi juda past bo'ladi. Immunoprecipitation reaktsiyasining o'ziga xosligi noimmun IgG cho'kindida signal etishmasligi bilan izohlanadi.
Ko'rinishni kengaytirish:
Shakl 2.
DFF - miyada fosfoprotein. A, DFFB miyada fosforilatlangan. Materiallar va usularda ko'rsatilganidek, endojen DFOSB surunkali ECS bilan davolash orqali so'rg'ich miyada paydo bo'ladi. Frontal kortikal tilim metabolik sifatida etiketlenmiş edi 32PH3PO4 bir necha soat davomida. Bo'shliqlarni homogenlashdan so'ng, DFB immunopresipidatsiyalangan va fosforli DFB (32P-DFOSB) autoradiografiya (yuqori panel) tomonidan aniqlandi. Radioaktiv bo'lmagan immunoprecipitatlarda jami DFB immunoblotlanish orqali aniqlandi (pastki panel). Salbiy tekshiruvlar sifatida, soxta hayvonlarning va immunizm bo'lmagan IgGning immunoprecipitatsiyasi ko'rsatiladi. B, Bioinformatik tahlil qilish yo'li bilan sichqonchani DFSB protein sekansına tegishli kiritish skorları bilan nomzod fosforilasyon joylari va kinazlar qo'lga qilindi. Yuqori bashoratli ballarni hisobga olgan nomzodlar oqsil sekansida ko'rsatilgan va jadvalda keltirilgan. DNKni bog'laydigan (asosiy) domen va leucine fermuar oqsil sekansida qalin bo'ladi. C, D, DFFS fosforilasyon Ser / Thr fosfataz inhibitörü OA tomonidan oshiriladi. C, 32Og'izzorografiya yordamida aniqlanmagan (Ctr) yoki 100 ng / ml OA (grafik va yuqori panel) borligi bilan belgilanadigan frontal kortikal tilimdan immunoprecipitatlarda P-DFOSB darajalari aniqlandi. Pastki panelda immünoblotipidatlarda immunoblotlanish orqali aniqlanmagan bo'laklardan aniqlangan DFB mavjud. D, PC12 hujayralari HSV-DFOSB yoki HSV-LacZ (vektor) bilan infektsiyalangan va metabolik 32PH3PO4 (Ctr) yoki 100 ng / ml OA borligida. 32Immunoprecipitatlardagi P-DFB darajalari autoradiografiya (grafika, yuqori panel) orqali aniqlandi. Pastki panelda immunoblotlanish orqali hujayra lizatlarida aniqlangan DFF mavjud.
DFOSB fosforillanishiga qaysi kinaz (lar) ni va maydonlarni aniqlashni kiritish bo'yicha birinchi qadam bo'lib, biz uning amino kislotalar sekansını bir nechta bioinformatik tahlillarga bo'ysundirdik. DFosB Tyr fosforilasyon nomzod saytlari bo'lmasa-da, u uchta CaMKII saytlari, uchta CK2 saytlari va juda yuqori fosforlanish prognozi ballari bo'lgan 2 PKC-saytni o'z ichiga olgan bir nechta Ser / Thr kinaz konsensus saytlariniAnjir. 2B). Bioinformatika bo'yicha prognoz qilinganidek, DFOSB nafaqat Ser yoki Thr qoldiqlariga fosforilatlangan bo'lsa, unda uning fosforilatsiyasini Ser / Thr fosfatazlarning faolligi sezilarli ravishda modulyatsiya qilinishi kerak. Ushbu gipotezasini sinab ko'rish uchun biz frontal kortikal chiziqlarga egamiz 32P-orthofosfat OA ning mavjudligi yoki yo'qligi, Ser / Thr protein fosfataz inhibitöründedir. Ko'rsatilganidek Shakl 2C, OA katta (~ 2.5-marta) o'sishiga sabab bo'ldi 32P-DFosB. Bundan tashqari, oldingi ma'ruzalar bilan mos keladigan, DF protein darajasini (shu jumladan, Fos proteinlarini (masalan, Fos proteinlarini) birlashtiruvchi qobiliyatiga OA ning kanserogen ta'siriniMiller va boshq., 1998; Choe va boshq., 2004). Aniq natijalar fosforillangan DFB darajasida sezilarli umumiy o'sishdir (~ 60%).
Keyinchalik eksperimental manipulyatsiyaga ko'proq mos keladigan PC12 hujayralarida DFOSB miyada kuzatilgan fosforillanish modelini ko'rsatdi. Biz PC12 hujayralarida DFOSB ni HSV-DFS bilan infektsiya orqali ifodalaymiz va xujayralar bilan metabolik ravishda etiketli bo'ldik. 32P-ortofosfat OA borligida yoki yo'qligida. HSV-DFS bilan kasallangan hujayralardagi oqsilning muvaffaqiyatli ifodasi va immunopretsizligi immunoblotda ham mavjud (Anjir. 2D, pastki paneldagi) va vektor-infektsiyali hujayralarda yo'q bo'lgan ~ 35 kDa tarmoqli autoradiograf (yuqori panel). Miyada kuzatilgandek, OA jami DFB darajasining kichik o'sishiga olib keldi, lekin bu juda katta (taxminan ikki barobar) oshdi. 32P-DFOSB, DFOSB fosforillanishida sezilarli miqdorda (~ 50%) aniq o'sishga olib keladi. Bundan tashqari, biyoinformatik öngörülerle muvofiq, PC12 xujayralari, bir Tyr fosfataz inhibitörü bilan davolash, 32P-DFOSB darajalari (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). Birgalikda, bu topilmalar DFOSB ning miya va PC12 hujayralarida Ser va / yoki Thr qoldiqlariga fosforilatlandiklarini va bu DFFning fosforillanish va degradatsiyaga oid profillarini o'rganish uchun yaxshi hujayra madaniy tizimi bo'lishini tasdiqladi.
CK2, ammo PKC yoki CaMKII fosforli bo'lmagan DFB mavjud emas in vitro
Yuqorida aytib o'tganimizdek, DFOSB amino kislotalar sekansının tahlil qilish, CK2, PKC va CaMKII fosforilasyon hududlari uchun yuqori öngörme skorlarını berdi. Ushbu kinazlardan qaysi biri DFBni fosforilatlashi mumkinligini aniqlash uchun biz bir qator eksperiment o'tkazdik in vitro saflaştırılmış kinazlar va saflaştırılmış rekombinant DFB bilan fosforilasyon reaktsiyalari. Ko'rsatilganidek Shakl 3A, uchta nomzod kinazdan faqatgina CK2 fosforli DFB bilan fosforillanadi. Bundan tashqari, bir nechta boshqa kinazlar sinovdan o'tkazildi (masalan, GSK3 va p70S6K), lekin DFOSB ni sezilarli darajada fosforilatlamadi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). Vaqtni tahlil qilish orqali CK2 reaktsiyasini qo'shimcha tavsiflash bu kinazning DFOSB molekulasiga (xlorid kislota) molekula bo'yicha ~ NNUMX mol fosfat birikmasini katalizatsiya qilishi mumkinligini aniqladiAnjir. 3B). CK2 ning DFOSBni fosforilashishi mumkinligi in vitro sezilarli stokiyometriyaga (~ 50%) fiziologik jihatdan tegishli reaktsiya haqida gap boradi. Keyinchalik, bu reaktsiyaning kinetikasi CK2 ni artib borayotgan miqdorda DFSB borlig'ida inklyuziya orqali o'rganib chiqdik va biz CFX bilan fosforli FF Vmax 5.8 pmol min-1 · Mg-1 fermenti, a KM 18.4 mm va a kmushuk 0.2 / s (Anjir. 3C). Ushbu kinetik parametrlar uchun olingan qiymatlar ushbu reaktsiyaning fiziologik ahamiyatini yanada oshiradi. Misol uchun, KM DARPP2 uchun CK32 ning eng mashhur substratlaridan biri 3.4 ìm va kmushuk ~0.3 / s (Girault va boshq., 1989); The KM ATX diapazonlari uchun ~ 10-40 μm (Cochet va boshq., 1983; Silva-Neto va boshq., 2002) va kazein uchun ~ 10-50 μm (Meggio va boshq., 1977; Pyerin va boshq., 1987). Bu ma'lumotlar birgalikda DFOSB ning CK2 uchun juda yaxshi substrat ekanligidan dalolat beradi in vitro.
Ko'rinishni kengaytirish:
Shakl 3.
CK2, ammo PKC yoki CaMKII fosforli bo'lmagan DFB mavjud emas in vitro. Avtoreatografiya (yuqori panel) fosforli mahsulotni ko'rsatadi va Coomassie bilan bo'yalgan jel (pastki panel) reaktsiyada jami DFB mavjud. A, Puriflangan rekombinat DFB ta'sir o'tkazdi in vitro turli nomzod kinazlar tomonidan fosforillanish (ularning uchtasi ko'rsatilgan). B, Vaqt kursi va stokiyometrik tahlillar CK2ning FFBQni fosforilatlashi mumkinligini ko'rsatadi in vitro ~% 50% lik stoikiometriya bilan. C, CK2 reaktsiyasining kinetik tahlillari DFFning noqulay bo'lganligini ko'rsatdi in vitro substratdan foydalaning. Reaksiyaning chiziqli chizig'i er-xotin o'zaro uchastkada (pastda) ko'rsatiladi, ammo kinetik parametrlar Michaelis-Menten egri (tepa) dan olingan.
CK2 buzilmagan xujayralardagi DFB ning fosforilatsiyasini va barqarorligini modullaydi
DFOSB ning CK2 vositachiligidagi fosforillanishining fiziologik ahamiyatini baholash uchun biz fosfopeptidni qiyosiy qiyoslashni qo'lladik. in vitro fosforilatlangan va PC12-hujayrali fosforli DFB. SDS-PAGE va gelsin elüsyonundan keyin 32P-DFosB ( in vitro reaktsiyalar yoki immunoprecipitatsiyadan 32P-etiketli xujayralar), oqsillar tripsin bilan hazm qilingan va hosil bo'lgan fosfopeptidlar ikki o'lchovli ajratishga uchragan. Ushbu tahlil CK2 reaktsiyasidan olingan asosiy fosfopeptidning DFOSB dan PC12 hujayralarida fosforilatlangan ikkita asosiy fosfopeptiddan birigaAnjir. 4A), PKC yoki CaMKII (ma'lumotlar ko'rsatilmagan) reaktsiyasidan kelib chiqadigan fosfopeptidlar yo'q. Xaritada PC12 hujayralarida mavjud bo'lgan ikkinchi FFB fosfopeptidi mavjud edi, ammo biz shunga o'xshash fosfopeptidni ishlab chiqarish uchun sinovdan o'tgan kinazlardan biron birining in vitrobu ikkinchi fosfopeptidning boshqa fosfopeptiddan farqli bo'lgan fosforillanish joyini yoki u bir xil fosforiliya maydonini o'z ichiga olgan aniq bir tripsin peptidini o'z ichiga olganligini bilmaymiz.
Ko'rinishni kengaytirish:
Shakl 4.
CK2 buzilmagan xujayralardagi DFB ning fosforilatsiyasini va barqarorligini modullaydi. A, CK2, lekin PKC emas, balki hujayralardagi DFB ni fosforilatlaydi. DFOSB ning ikki o'lchamli fosfopeptid xaritalari CK2 yoki PKC tomonidan fosforli in vitro yoki PC12 hujayralari buzilmagan. Oklar, PC2 hujayralarida olingan DFosB fosfopeptidlaridan biri bilan PKC-fosforilatlangan emas, balki CK12-fosforilatlangan peptidning zaryadini ko'rsatadi. B, PC12 hujayralarida DFOSB fosforillashuvi kuchli CK2 aktivator sperma (SP) bilan xujayralarni davolash orqali oshiriladi va CK2 inhibitori DRB bilan davolash orqali kamayadi. Aksincha, PC12 hujayralarida DFOSB fosforillanish PKC faollashtiruvchisi (PMA) yoki PKC-ga qarshi preparat-calfostin-C (Calph) bilan davolash orqali ta'sirlanmadi. Vakillar autoradiogram (yuqori panel) va immunoblot (pastki panel) ko'rsatiladi. C-F, CK2 faoliyatining DFOSB barqarorligiga ta'siri. Raqamlar, DFosB degradatsiyasining vaqt jadvalini (va vakolatli autoradiogrammani) ko'rsatadi. DFOSBni vaqtincha ifodalovchi PC12 xujayralari CK2 inhibitori DRB (yo'qligi yoki yo'qligi)C), CK2 aktivator sperma (D) yoki keng spektrli kinaz inhibitori H-8 (E), bu DRB ning nonspesifik ta'sirini nazorat qilish uchun ishlatilgan. F, CK2 ning katalitik pastki qismini DFOSB stabilligiga tushirishning ta'siri. PC12 xujayralari, keyinchalik bir DFOSB plazmidi bilan transfekte qilingan sıçan CK2a va 24 h ni maqsad qilib olgan, bir siRNA (Ctr) yoki siRNA bilan transfekte qilindi. Yuqori panelda CK2 siRNA ning CK2 va FFB protein darajalariga ta'sirini ko'rsatuvchi butun hujayrali lizatlarning immunoblotlari tasvirlangan. B-tubulin uchun mos keladigan immunoblot yukni boshqarish sifatida ko'rsatiladi.
CFXQ ning kinofili sifatida CK2 ning fiziologik ahamiyatini yanada batafsil ko'rib chiqish uchun biz DFOSB eksprese qilgan PC12 hujayralarini CK2 faoliyatini modulyatsiya qiluvchi ikkita preparat bilan davolashdik. Ko'rsatilganidek Shakl 4B, DFOSB fosforillashuvi PC12 hujayralarini hujayra o'tkazuvchan CK2 inhibitori DRB (Meggio va boshq., 1990; Szyszka va boshq., 1995) va potensial CK2 aktivatori sifatida ma'lum bo'lgan poliamin sperma bilan davolash orqali ortdiCochet va Chambaz, 1983; Meggio va boshq., 1983). Buning aksincha, PC12 hujayralarini PKC inhibitori calfostin-C (Kobayashi va boshq., 1989; Tamaoki va boshq., 1990) yoki PKC aktivatori PMA (Shmidt va Hekker, 1975; Beh va boshqalar, 1989) FosB fosforillanishida sezilarli o'zgarishlarga olib kelmadi. PMA bo'lsa, eng kichik (va sezilarli darajada) o'sish 32P-DFOSB ushbu dori vositasida yuzaga kelgan DFB darajalarining o'sishiga bog'liq bo'lishi mumkin; Aslida, phorbol esterlar bir nechta Fos family proteynlarini, jumladan FosB (Yoza va boshq., 1992; Suh va boshq., 2004). Bundan tashqari, ma'lum hujayra-passiv CaMKII inhibitori bo'lgan m-AIP (Ishida va Fujisawa, 1995; Stevens va boshq., 1999), shuningdek, DF fosforlanishini kamaytirmagan (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). Birgalikda, bu natijalar biz bilan mos keladi in vitro Natijada, DFOSB ning buzilmagan hujayralarida CK2 bilan fosforilanishi mumkin, ammo PKC yoki CaMKII emas. CK2ning inhibisyoni butunlay to'sqinlik qilmasligi fakti DFOSB fosforilatsiyasini oqsil tarkibida qo'shimcha fosforlanish joylari mavjudligini ko'rsatadi.
Keyin CK2 ning DFOSB aylanmasida va shuning uchun uning barqarorligida rol o'ynaganligini tekshirdik. Shu maqsadda biz fosforillash jarayonida ishlatiladigan CK12 inhibitori yoki CK2 aktivatori bilan davolash qilingan DFOSB eksprese qilgan PC2 xujayralari yordamida impulslarni kuzatish tajribalarini o'tkazdik. Ko'rsatilganidek Shakl 4C, CK2 inhibitori DRB bilan hujayralarni davolash DFF ning aylanma sur'atlariga sezilarli ta'sir ko'rsatdi, bu uning degradatsiyalashgan egri shakli o'zgarishi bilan, bifazikdan eksponentsial parchalanishga yaqinroq bo'lgan egri chiziqqa to'g'ri keladi. Aksincha, CK2 faollashtiruvchi sperma mavjudligi DFB ning degradatsiyalanish tezligida sezilarli pasayishiga olib keldi, bu esa prostagning birinchi soatlarida to'planishiga olib keldi (Anjir. 4D).
Ko'pgina kinaz aktivatorlari va inhibitorlari singari, sperma va DRB CK2 faolligining modulyatsiyasidan tashqarida metabolik ta'sirga ega bo'lishi mumkin. Darhaqiqat, DRB transkriptsion faktori IIH (TFIIH) bilan bog'langan kinazni (Yankulov va boshq., 1995), bu RNK polimeraza II-vositachilik transkripsiyasining inhibisyoniga olib keladi. Ushbu ta'sir DFFning barqarorligiga ta'sir etishi mumkinligi sababli biz keng spektrli kinaz inhibitori H-8 (Hidaka va Kobayashi, 1992) TFIIH bilan bog'li kinazni inhibe qilish uchun ma'lum bo'lgan konsentratsiyada (200 mmm) DFSb aylanmasida, ammo CK2 (Yankulov va boshq., 1995). Ko'rsatilganidek Shakl 4E, H-8 bilan davolanish DFBning aylanish tezligiga ta'sir qilmadi. Xuddi shunday natijalar ham TFIIH bilan bog'li kinazni inhibe qiluvchi konsentratsiyada ishlatiladigan, ammo CK7 (ma'lumotlar ko'rsatilmagan) yordamida qo'llaniladigan boshqa keng spektrli kinaz inhibitori H-2 bilan olingan. Ushbu ma'lumotlar, shuningdek, DRF tufayli yuzaga keladigan DFOSB stabilitesindeki kamayishning eng ko'p CK2 inhibisyonuna atfedilebildiğinin talqinini ham qo'llab-quvvatlaydi.
DFOSB aylanmasida CK2 rolini yanada mustahkamlash uchun biz CK2 ni siRNA orqali urib tushirish oqibatlarini o'rganib oldik. Keyinchalik DFosB bilan transfekte bo'lgan issiq CK12 (CK2a) va 2h katalitik subunitining mRNK ni boshqaradigan (nontargeting) siRNA yoki siRNA bilan transfekte qilingan PC24 xujayralari yordamida bu tajribalarni amalga oshirdik. Ko'rsatilganidek Shakl 4F, CK2a siRNA bilan transfektsiya samarali va maxsus DFOSB darajalariga (yuqori panel) ta'sir qilmasdan CK2a protein darajasini pasaytirdi. Pulse-chase tahlillari CK2 ning qulab tushishi, DFosB aylanish tezligining sezilarli o'sishiga olib keldi, bu esa oqsilning tezroq degradatsiyasidan dalolat beradi. CK2 faoliyatini inhibe qilish haqiqati (DRB bilan davolash yoki siRNA orqali) DFOSB ning aylanishini oshiradi va ikki fazli egri asta-tezkor komponentining yo'qolishiga olib keladi, CK2 aktivatsiyasi esa egri asta-fazasini kuchaytiradi, CFXS barqarorligini tartibga solishda CK2 ning rol o'ynashi haqidagi fikr.
CX2 fosforillari DFOSB ni SerxNUMXda
CK2 tomonidan fosforli qilingan DFOSB dagi saytlarni aniqlash uchun biz CK2 tomonidan fosforilangan rekombinat DFB ning fosfano-amino kislotalar tahlilini o'tkazdik in vitro va DFOSB ning PC12 hujayralarida fosforli qilinganligi. Ushbu tajribalar shuni ko'rsatdiki, har ikkala holatda ham aniqlangan fosforo-amino kislotasi fosfo-Ser (Anjir. 5A). Ushbu topilma CK2 uchun olingan stoikiometriya bilan birga in vitro fosforillanish reaktsiyasi (~50%) (Anjir. 3B) va CK2 fosfopeptid xaritasida faqat bir muhim nuqta borligi (Anjir. 4A), DFOSB ning CK2 fosforillanishining, ehtimol, bitta salqin qoldiq bilan cheklanganligini ko'rsatadi. Ushbu xulosa, fosforilasyon konsensus sayt tahlil qilish (Anjir. 2B), bu faqat bir nomzod serinini, ya'ni SerxNUMX, CK27 uchun bashorat qilgan. Taxonomik tahlillar shuni ko'rsatdiki, SerxNUMX Fos oilasi a'zolarining evolyutsiyasi orqali juda himoyalanganAnjir. 5B), bu muhim fiziologik funktsiyaga olib kelishi mumkinligini bildiradi.
Ko'rinishni kengaytirish:
Shakl 5.
CX2 fosforilatlari DFOSB SerxNUMXda. A, CK2-fosforilatlangan fosfamamin kislotasi tahlili (in vitro) va PC12 hujayra-fosforillangan DFB, har ikki holatda ham fosforilatlangan asosiy qoldiqning serin ekanligini ko'rsatib beradi. B, FosB / DFosB amino kislotalar sekansining o'zaro faoliyat turlari tahlillari Fosning oila a'zolari orasida zebrafishdan tortib zebrafishgacha (qorong'u yorug'lik) Ser27 ning yuqori darajada saqlanishini aniqladi. Biroq, CK3 konsensus saytida zarur bo'lgan + 2 pozitsiyasidagi kislotali qoldiq konserva qilinmagan (engil yoritilgan). C, HeLa xujayralari vaqtinchalik yoki yovvoyi tipdagi DF (WT) yoki DFosB bilan Ser27ni Ala (S27A) bilan almashtirish uchun nuqta mutatsiyasiga ega bo'lgan holda transfekte qilindi. Hujayralar metabolik sifatida etiketlenmişti 32PH3PO4 va CK2 ni faollashtirish uchun avtomobil yoki sperma (SP) bilan davolanadi. Olingan DFOSB immunoprecipitatlarining vakili autoradiogram (yuqori panel) va immunoblot (pastki panel) ko'rsatiladi. Mock-transfektsion hujayralar (vektor) ning immunoprecipitatsiyasi ko'rsatiladi.
Ser27 ning DFOSBda fosforilatlanganmi yoki yo'qligini aniqlash uchun ushbu qoldiqni Ala-ga almashtirdik va oqsil fosforillanish holatiga ta'sirini tahlil qildik. Shu maqsadda, WT yoki S27A mutant DFBB'sini vaqtincha eksprese qilish uchun HeLa xujayralari (yuqori rentabellikga bilan transfekte mumkin) ishlatildi. Transfeksiyondan taxminan 24 soat keyin hujayralar metabolik sifatida etiketlendirildi 32P-ortofosfat va butun hujayra lizatlar tayyorlandi. Immunoprecipitation va SDS-PAGE dan so'ng, 32P-DFOSB autoradiografiya va immunoblotlanish orqali jami DFB bilan aniqlandi. Ko'rsatilganidek Shakl 5C (pastki panel), VF-FOSB vektor bilan almashtirilgan hujayralarda aniqlanmadi, VT yoki S27A mutant DFB bilan almashtirilgan hujayralar oqsilni muvaffaqiyatli ifodaladi. Biz S27A mutatsiyasining muhim (~% 30%) pasayishiga olib keldi 32P-DFB darajalari (Anjir. 5C, yuqori panel va grafika), DFOSB tirik hujayralardagi Ser27da fosforilatlanganligini ko'rsatmoqda. SerxNUMX hujayralarida CK27 tomonidan fosforilatlanganligini aniqlash uchun, biz CK2 faollashtiruvchi sperminning WT va S2A DFB ning fosforilatsiyasini modullash qobiliyatini solishtirdik. Biz ilgari PC27 hujayralaridaAnjir. 4B), Spermin bilan HeLa hujayralarini davolash WT proteininin fosforilasyonunu sezilarli darajada oshirdi. Ushbu ta'sir S27A mutatsion tomonidan sezilarli darajada kamayganligi (Anjir. 5C), DFosB SerxNUMX ning CK27 uchun fiziologik substrat ekanligi haqidagi sharhni qo'llab-quvvatlaydi.
Ser27 ning fosforillanishida DFBning barqarorligi belgilanadi
CK2 faollashtirilganda DFOSB ning barqarorligi pasayib, CK2 faollashtirilganda (+Anjir. 4) va CX2 fosforilatining DFosB ning Ser27 (Anjir. 5), biz bu sayt fosforilatsiyasini oldini olish oqsilni barqarorlashtirishi kerakligini taxmin qildik. HeLa xujayralari bilan o'tkazilgan WT yoki S27A mutant DFOSB ekspresyoni bilan o'tkazilgan yurak urish tajribalari shuni ko'rsatdiki, S27A mutatsiyasi DFF ning degradatsiyalanish tezligida sezilarli o'sish va oqsilning yarim umrida (Anjir. 6A). Keyinchalik, ushbu tartibga solish mexanizmi ham neyronga o'xshash PC12 hujayra chizig'ida paydo bo'ladimi-yo'qmi tekshirildi. Ushbu tajribalar, HeLa hujayralarida kuzatganimizdek, S27A nuqta mutatsiyasining PC12 hujayralarida DFOSBning yarim umrida keskin pasayishiga sabab bo'ladi (~11dan ~4 gacha) (Anjir. 6B). Ushbu beqarorlik CK2 ning oldini olish yoki taqiqlash oqibatida o'xshashligi (Anjir. 4) SerxNUMX ning CK2-vositachiligi bilan fosforilatsiyalanishi DFBning barqarorligini tartibga soladigan g'oyani yanada qo'llab-quvvatlaydi. SerfNOMX fosforilatsiyasining DFOSB protein aylanmasidagi tartibga soluvchi roli uchun qo'shimcha dalillar fosfomimetik SerxNUMX yordamida Asp mutatsiyasiga (S27D) erishildi. S27D mutatsion fosfomimetik hisoblanadi, chunki u 27 amino kislotasida katta salbiy zaryadlangan (karboksil) guruhni joylashtiradi va shuning uchun qisman SerxNUMX ning fosforilatsiyasini taqlid qiladi. Ko'rsatilganidek Shakl 6C, S27D mutatsion S27A mutatsiyasining teskari ta'sirini keltirib chiqardi va WT proteinga nisbatan ancha oqilona oqimga olib keldi. Shu bilan CK2 aktivatsiyasidan keyin olingan ta'sirga (Anjir. 4D), S27D mutatsion jamg'arilishga olib keldi va shunday qilib, dastlabki soatlarda DFB darajasini oshirdi.
Ko'rinishni kengaytirish:
Shakl 6.
Ser27 ning fosforillanishida DFBning barqarorligi belgilanadi. A, C, SerFNSF fosforilatsiyasining DFBning aylanish tezligiga ta'sirini ko'rsatadigan zarba-ta'qiblar tahlili. Yovvoyi tipdagi DF (WT), SerxNUMX to Ala mutant (S27A) va Fosfomimetrik SerxNUMX ning Asp mutantiga (S27D) ajralib chiqishi va yaroqlilik muddati ko'rsatilgan. Xuddi shu topilmalar HeLa hujayralaridaA) va PC12 xujayralari (B, C).
Ser27 fosforillanishining proteazomal buzilishining oldini olish orqali DFOSB stabillashadi
Ser27 ning fosforilatsiyasini DFSB stabillashtiradigan mexanizmni tushuntirishni boshlash uchun biz proteazom inhibitörleri MG132 (Palombella va boshq., 1994; Tsubuki va boshq., 1996) va epoksomitsin (Hanada va boshq., 1992; Kim va uning hamkorlari, 1999) WT va S27A mutant DFB ning degradatsiya tezligini modulyatsiya qilish. Pulse-chase tajribalari WT yoki S12A DFB eksprese qiladigan rekombinat HSV bilan kasallangan va DMSO yoki ikkita proteazome inhibitorlaridan biri bilan davolangan PC27 hujayralari yordamida o'tkazildi. Ushbu tajribalar, WT proteininin degradasyon tezligi, ikki proteazom inhibitöründen biriga nisbatan nisbatan befarq bo'lsa-da,Anjir. 7A), S27A mutantining bu dori-darmonlarga sezgirligi (Anjir. 7B). Bu WT proteinininkinden farqli o'laroq, S27A mutantı proteazomal bozunma maqsadidir. Darhaqiqat, MG132 yoki epoxomicin bilan hujayralardagi davo S27A mutatsiyasining DFosB ning degradatsiyaga nisbati ta'sirini butunlay teskari qildi, bu S27A mutantining MX4dan 9 dan xNUMX soatgacha bo'lgan yarmining umrini va MG132 uchun ~ Epoxomicin uchun 12 soat (Anjir. 7B). Birgalikda, bu topilmalar DFOSB ning SerxNUMXdagi fosforilatsiyasini oqsilni proteazomal degradatsiyadan himoya qiladi va shuning uchun uning o'zgacha stabilligi uchun juda muhimdir.
Ko'rinishni kengaytirish:
Shakl 7.
Ser27ning fosforillanish jarayoni uning proteazomal tanazzulini oldini olish orqali DFOSBni barqarorlashtiradi. A, B, HSV bilan kasallangan PC12 xujayralari bilan zarba-ta'qiblarni tahlil qilish, degradatsiya profilini va yovvoyi turdagi DFB (A) yoki S27A DFB (B) ikki proteazom inhibitöründen biri yoki yo'qligi [MG132 va epoxomicin (Epoxo)] mavjud. DF-ning yovvoyi tipdagi DFB-ning aylanishiga sezilarli ta'sir ko'rsatmasligini ta'kidlang, ammo proteazome inhibitori bilan hujayralarni davolash S27A-DFBning barqarorlashishiga olib keldi. C, DFFning uzoq muddatli miya plastinkasiga vositachilik qilish qobiliyatiga ega bo'lgan SerxNUMX fosforilatsiyasining roli uchun model. Ta'sir qilinganidan so'ng, DFOSBning bir qismi S27 ning CK2-vositachiligi bilan fosforillanishi tomonidan miyada barqarorlanadi. Bu uning to'planishiga olib keladi, bu esa o'z navbatida gen ekspressionida uzoq vaqt davom etadigan o'zgarishlarga olib keladi. Gen ekspozitsiyasidagi ushbu barqaror o'zgarishlar barqaror harakatlarga moslashishga yordam beradi. Aksincha, S27 ning Ser / Thr fosfatazlari PP27 va / yoki PP1A tomonidan deposforilatsiyasi proteazning muvozanatlashuviga va proteazomal mashinalar tomonidan qayta ishlashga olib keladi.
muhokama
Ushbu tadqiqotda DFosB ning hujayra madaniyatida xNUMX soatlik yarim umrga ega ekanligini ko'rsatib turibmiz va u to'liq uzunlikdagi FosB va ko'plab boshqa indüktiv transkriptsiya omillari bilan solishtiradigan barqarorligini ta'minlaydi, hujayra madaniyatida yarim umr qisqa bo'lishi mumkin bir necha daqiqagacha bo'lib, kamdan-kam 10 soatdan oshib ketadi (Xann va Eisenman, 1984; Dobrazanski va boshq., 1991; Roberts va Whitelaw, 1999; Ferrara va boshq., 2003; Xirata va boshq., 2004). Bundan tashqari, biz DFOSB ning miyada fosforlanishi va uning fosforlanishining PP1 / PP2A inhibitörü okadaik kislotaga sezgir ekanligini topamiz. Hujayra madaniyati tadqiqotlarimiz DFOSBning barqarorligi CK2 tomonidan modulyatsiya qilinganligini, bu esa oqsilni barqarorlashtiradigan CK2 faolligini ko'rsatdi. Nihoyat, biz topilgan ma'lumotlar CK2 fosforilatining DFosB ni yuqori darajada saqlanib qolgan N terminali seriyasida (S27) ko'rsatadi va S27 ning fosforilatsiyasini proteosomal degradatsiyadan himoya qiladi. Shuning uchun, DFOSB ning S27 bo'yicha CK2 fosforilatsiyasini DFOSB (Anjir. 7C). DFOSBning bunday fosforilatsiyani stabillashtirishi funktsional ahamiyatga ega, chunki DFOSBning, ayniqsa miya hududlarining ko'payishi, ko'p sonli neyronal genlarni to'g'ridan-to'g'ri tartibga solish uchun berilgan ning Vivo jonli va bir nechta nöropsikiyatrik kasalliklarning hayvon modellarida kuchli yurish-turish ta'sirini ko'rsatish (Kirishga qarang).
Fosforilasyon, CREB (cAMP javob elementi majburiy protein) kabi ba'zi transkripsiyonel omillar transkripsiyonel faoliyatini tartibga solishning tez va orqaga qaytish usuli bo'lsa-da,Bohmann, 1990), transkriptsiya omillarining degradatsiyasini modulyatsiya qilish yanada kuchliroq (kamroq osonlik bilan teskari) tartibga solishni ta'minlaydiDesterro va boshq., 2000). Funktsional faoliyati ularning tanazzul darajasida tartibga solinadigan transkripsiyalik omillarga NFKB (Desterro va boshq., 2000), c-Myc (Sears va boshq., 1999) va c-Fos (Ferrara va boshq., 2003), Boshqalar orasida. Ko'pgina hollarda fosforillanish trans-faktor faktori barqarorligining asosiy regulyatoridir, chunki c-Fos (Okazaki va Sagata, 1995; Tsurumi va boshq., 1995), Fos bilan bog'liq antijen-1 (Fra-1) (Vial va Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe va boshq., 2001), c-iyun (Fuchs va boshq., 1996), JunB (Fuchs va boshq., 1997), ATF2 (Fuchs va boshq., 2000) va p53 (Buschmann va boshq., 2001). Bizning tadqiqotlarimiz shu bilan birga, fosforilatlangan qarshilik barqarorligi orqali funktsional faoliyatni tartibga soladigan transkripsiya faktorlari ro'yxatiga DFB qo'shiladi.
CK2 - hamma joyda tarqalgan va doimiy ravishda faol bo'lgan Ser / Thr kinazasi, shu paytgacha aniqlangan> 300 ta substratga ega substratlar mavjud va ko'plab biologik jarayonlarda, shu jumladan hujayraning o'lishi va omon qolishida ishtirok etadi (Litchfield, 2003; Unger va boshq., 2004), hujayralardagi stressning javoblari (Yanagawa va boshq., 1997; Kato va uning hamkorlari, 2003), DNK ta'mirlash va kromatinni qayta tuzish (Barz va boshq., 2003; Krohn va boshq., 2003). CK2 ning taxminiy substratlarining uchdan biridan ortig'i gen ekspresyonini boshqarishda ishtirok etadigan oqsillardir (Meggio va Pinna, 2003). Aslida, CK2 ning mashhur yadro kinazi (Krek va uning hamkorlari, 1992) (o'rganish uchun qarang Yu va boshqalar, 2001) va bir nechta transkriptsiya omillarining bZIP domenlari bilan o'zaro bog'lanish (Yamaguchi va boshq., 1998). CK2-mediatsiyaviy fosforilatsiyani, shuningdek, ko'plab oqsillarning degradatsiyasini (yaxshilash yoki kamaytirish)Schwarz va boshq., 1996), PTEN (Torres va Pulido, 2001), lens connexin (Yin va boshq., 2000), kromatin bilan bog'langan protein HMG1 (Wisniewski va boshq., 1999) va HMGB (masalan,Stemmer va boshq., 2002), Myf-5 (Winter va boshq., 1997) va c-Myc (Channavajhala va Seldin, 2002). CK2 eng ko'p miya (Alcazar va boshq., 1988; Girault va boshq., 1990) va uning faoliyati miya funktsiyasining ko'p jihatlariga, jumladan, nöronal omon qolish (Boehning va boshq., 2003), farqlash (Nuthall va boshq., 2004), ion kanali funksiyasi (Jones va Yakel, 2003; Bildl va boshq., 2004) va uzoq muddatli potensiatsiya va neyronal plastisit (Diaz-Nido va boshq., 1992; Lieberman va Mody, 1999; Reikhardt va boshq., 2003).
Neyronal funktsiyani tartibga solishda CK2ning rolini kuchaytirganiga qaramay, uning faoliyatini nazorat qiladigan narsa kam. CK2 asosan hujayra ichidagi lokalizatsiya (masalan, sitosol va yadro) o'zgarishlariga asoslanib, muayyan substratlarni fosforilashga qobiliyatini tartibga solish bilan tashkiliy jihatdan faol deb hisoblanadi (Ahmad va Tavfik, 1994; Yu va boshqalar, 1999). Ushbu ma'lumot surunkali stimullashdan so'ng miyada mushaklardagi DFB to'planishini keltirib chiqarishi uchun qanday signallarni talab qilish kerakligi haqida muhim savol tug'diradi (Anjir. 7C). Bitta talab bir necha marta faollashtiriladi fosB gen va DFOSB mRNA indüksiyonu (Chen va boshq., 1995). Bizning ma'lumotlarimiz DFOSB ning CK2 fosforilatsiyasining uning barqarorligi uchun juda muhim ekanligini ko'rsatib turibdi, shuning uchun DFOSB ning gen ekspresifikatsiyasidagi uzoq muddatli ta'siri uchun ikkinchi signal talab qilinishi mumkinligini ko'rsatib turibdi, ya'ni CK2 tomonidan oqsilni fosforillanishini ogohlantiruvchi signal. Bu ba'zi noma'lum mexanizmlar yoki uning yadroga translokatsiyasi orqali CK2ni faollashtirishni o'z ichiga olishi mumkin. Shu bilan bir qatorda, DFOSB ning CK2 fosforillashishi, DFOSB oqsillari har bir ogohlantirgichga javob sifatida tarjima qilingan bo'lishi mumkin, chunki uning bir qismi fosforilatlangan va shu bilan barqarorlashadi, shuning uchun takroran stimullanish bilan ta'sirlangan neyronlarda yuqori darajada to'planadi.
Bizning topilmalarimiz CK2 va S27 ning DFOSB fosforillanish uchun javobgar bo'lgan yagona kinaza va sayt emasligidan dalolat beradi, chunki CK2 yoki S27A mutatsiyasining inhibisyoni DFOSB fosforillanishini butunlay to'xtata olmaydi. Shunga o'xshash, S27A mutatsiyasining fosfo-FFBdagi 30% kamayishi natijasida S27 proteindagi asosiy fosforillanish joyidir. Shunga qaramay, biz DFOSBda boshqa noaniq kinazlarni va fosforlanish joylarini tadqiq qilmoqdamiz. Natijada, S27 va boshqa fosforlanish joylaridagi fosfordagi fosforlanishni tahlil qilish muhim ahamiyatga ega bo'ladi. ning Vivo jonli masalan, mass-spektrometriya yoki fosfospesifik antikorlarni qo'llash orqali turli xil surunkali stimulyatsiyalardan so'ng.
Yuqorida ta'kidlab o'tilganidek, DFOSB dagi S27 evolyutsiyada va boshqa Fos oila oqsillari orasida juda himoyalangan. Biroq, CK2 uchun konsensus sayti: emas Shakl 5B, C-Fos yoki Fra-2 emas, faqat FosB / DFosB (va Zebrafish xenolog), + 3 da kislotali qoldiqqa ega, CK2 fosforillanishning asosiy determinanti (Marin va boshq., 1986; Meggio va boshq., 1994). Shunday qilib, S2 bo'yicha CK27 fosforillanishining yo'qligi boshqa Fos oilaviy oqsillari nima uchun DFB kabi barqaror emasligini tushuntirishi mumkin. Ammo, bu nima uchun DFOSB kabi bir xil CK2 konsensus saytiga ega bo'lgan to'liq uzunlikdagi FosB shunga o'xshash tarzda barqaror emasligini tushuntirmaydi. To'liq uzunlikdagi FosB bu konservalangan qoldiqda CK2 tomonidan fosforilatlanganmi yo'qligini bilmaymiz. FosB ning yagona hisobotlari (Skinner va boshq., 1997) va c-Fos (Okazaki va Sagata, 1995; Chen va boshq., 1996) fosforillanish DFF ichida bo'lmagan bu oqsillarning C-terminalida joylashgan joylarni ta'riflaydi. To'liq uzunlikdagi FosB va boshqa Fos oilaviy oqsillarining CK2 tomonidan potentsial fosforlanishi to'g'ridan-to'g'ri tekshiruvni talab qiladi. Biroq, fosforilatlansa ham, boshqa Fos oilaviy oqsillari, tezda buzilish uchun oqsillarni maqsad qilib olgan o'zlarining C iboralarida motiflar mavjudligi ma'lum (Papavassiliou va boshq., 1992; Jariel-Encontre va boshq., 1997; Acquaviva va boshq., 2002). Misol uchun, Fosning barcha oqsillari C terminasida mavjud bo'lgan, lekin DFBda bo'lmagan, C-Fos (- Fos) uchun barqarorlashtiruvchi domen sifatida ish tutganligi ko'rsatilgan.Acquaviva va boshq., 2001). Shunga qaramay, ushbu ketma-ketlik FosBning to'liq uzunliginiCarle va boshq., 2004), DF dagi bu domenning yo'qligi uning barqarorligini to'liq hisobga olmaydi. Aksincha, bu C terminusi domenining yo'qligi va SerxNUMX fosforillanishining kombinatsiyasi DF va FosB o'rtasidagi barqarorlikning taxminan besh barobar farqini aniqlaydi.
Fosning oilaviy oqsillarining degradatsiyasi murakkab va to'liq tushunilmagan bo'lsa-da, proteazomal buzilish asosiy yo'ldir.Salvat va boshq., 1999; Acquaviva va boshq., 2002; Ferrara va boshq., 2003). Bu erda keltirilgan ma'lumotlar, bu proteazomal inhibitorlar DFOSB degradatsiyasining tezligini sezilarli darajada o'zgartirmaydilar, boshqa Fos oilaviy proteynlaridan farqli o'laroq, DFB 26S proteazomadan voz kechadi va bu uning barqarorlashida markaziy rol o'ynaydi. Shuning uchun DFOSBning mustahkamligi barqarorligi ikkita asosiy omilni birlashtirishi mumkin: (1) C-terminalining barqarorlashtiruvchi domenining yo'qligi va (2) S27 ning CK2 tomonidan fosforilashishi.
Xulosa qilib aytganda, ushbu tadqiqot mexanik tushunchani nima uchun darhol erta genining mahsuloti bo'lgan DFBga bog'liq fosB, boshqa barcha Fos oila a'zolaridan farqli o'laroq, nisbatan uzoq umr ko'rgan oqsil. Boshqa Fos oilaviy oqsillari tezkor, ammo vaqtinchalik stimulyatsiya-transkripsiyalashuvga (Morgan va Curran, 1995), DFBning nisbatan barqarorligi unga surunkali stimulyatsiya tufayli yuzaga kelgan uzoq muddatli transkripsiyatsion o'zgarishlar vositachiligini keltirib chiqaradi. Bu esa, DFOSBning miya uzluksiz molekulyar almashinuvi vazifasini bajarishini va surunkali moslashishga o'tkir javoblarni asta-sekin aylantirilishini qo'llab-quvvatlaydi. DFOSBning barqarorligi uchun SerxNUMX fosforillanishni aniqlash mexanizmi DFF funktsiyasini tartibga solish uchun vositalarni ishlab chiqish uchun yangi yo'llarni ochib beradi va shu bilan uzoq muddatli ta'sirlarni neyral va xulq-atvorli plastisiyaga moslashtiradi.
Izohlar
- Noyabr 21, 2005.
- Tahrir fevral 21, 2006 bo'ldi.
- Aprel qabul qilingan 2, 2006.
- Ushbu ish PGUga Milliy Psixologiya Instituti, NIGA Milliy Tadqiqot Xizmati mukofoti va Milliy ruhshunoslik instituti va NIDA Milliy Assotsiatsiyasi tomonidan EJNga grantlar ajratish bo'yicha milliy shizofreniya va depressiya yosh tergovchilar mukofoti, doktor Jeyms Bibbga yordami uchun rahmat in vitro doktor Ming-Xu Xan, metabolik etiketlash uchun ishlatiladigan miya bo'laklarini tayyorlashda yordam bergani va doktor Rachael Neve bilan rekombinat HSV'larning qadoqlash bo'yicha yordami uchun.
- G. Rudenkoning hozirgi manzili: Hayot fanlari instituti va Farmakologiya bo'limi, Michigan universiteti, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
- Xat yozishni Erik J. Nestler, 5323 Harri Hines Bulvar, Dallas, TX 75390-9070 manzillariga yuborish kerak. E-pochta: [elektron pochta bilan himoyalangan]
Manbalar
Acquaviva C, Brockly F, Ferrara R, Bossis G, Salvat S, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) C-Fos proto-onkoproteinining G (0) dan to-S fazasi almashinuvi vaqtida tez proteazomal degradatsiyasini nazorat qilishda ishtirok etgan S-terminalli tripeptid motifini aniqlash. Onkogene 20:7563-7572.
Acquaviva C, Bossis G, Ferrara R, Brokly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2002) Fos oilasi oqsillari uchun ko'plab degradatsiya yo'llari. Ann NY Acad Sci 973:426-434.
Ahmad K, Tavfiq S (1994) Protein kinazining hujayra ichidagi regulyatsiyasi mexanizmi CK2: stimulga asoslangan subnuclear assotsiatsiyasining roli. Hujayra Mol Biol Res 40:539-545.
Alkazar A, Martin E, Lopez-Fando J, Salinas M (1988) Miyadan kazein kinaz II ning yaxshilangan tozalash usuli va xususiyatlari. Neurochem Res 13:829-836.
Andersson M, West JE, Cenci Ma (2003) Surunkali dopaminomimetik davolanishni to'xtatib bo'lgach, striatal DeltaFosB kabi immunoreaktivlik va prodinorfin mRNA darajalarining vaqti. Eur J Neurosci 17:661-666.
Barz T, Ackermann K, Dubois G, Eils R, Pyerin Vt (2003) Genom bo'yi ekspression ekranlari kromatinni qayta tuzishda protein kinaz CK2 uchun global rolni ko'rsatadi. J Cell Sci 116:1563-1577.
Beh, I, Schmidt R, Hekker E (1989) HL-60 hujayralarida topilgan PKC ning ikki izoizimi prokaryotik ester TPA tomonidan faollashtirishda farq qiladi. FEBS Lett 249:264-266.
Bildl V, Strassmaier T, Thurm H, Andersen J, Eble S, Oliver D, Knipper M, Mann M, Schulte U, Adelman JP, Fakler B (2004) Protein kinaz CK2 kichik o'tkazuvchanlik Ca (2 +) bilan birgalikda - faol K + kanali va kanal eshiklarini boshqaradi. Neyron 43:847-858.
Bing G, Vang V, Qi Q, Feng Z, Hudson P, Djin L, Zhang Vt, Bing R, Xong Gs (1997) Fos bilan bog'liq antigenning uzoq muddatli ifodasi va sichqonchani hippokampus va striatumda tutilishlar bilan bog'liq Delta FosB ning vaqtinchalik ifodasi. J Neurochem 68:272-279.
Blom N, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Gammeltoft S, Brunak S (2004) Aminokislota ketma-ketligidan oqsillarni fosforilatsiyalash va post-translasyonal glikozilatsiyani prognoz qilish. Proteomika 4:1633-1649.
Boehning D, Moon S, Sharma S, Hurt KJ, Hester LD, Ronnett GV, Shugar D, Snyder SH (2003) Karbon monoksit nörotransmisyonu, heme oksigenaz-2'in CK2 fosforilasyonu bilan faollashtirilgan. Neyron 40:129-137.
Bohmann D (1990) Transkriptsion faktor fosforillanish: signalni uzatish va genin ifodasini tartibga solish o'rtasidagi bog'liqlik. Saraton xujayralari 2:337-344.
Buschmann T, Potapova O, Bar-Shira A, Ivanov VN, Fuchs SY, Xenderson S, Frid V, Minamoto T, Alarcon-Vargas D, Pincus MR, Gaarde WA, Holbrook NJ, Shiloh Y, Ronai Z (2001) P2 ning Thr-53-da NH81-terminal kinaz fosforillashuvi stressga javoban p53 stabilizatsiyasi va transkripsiyonuniy faoliyati uchun muhim ahamiyatga ega. Mol hujayrali Biol 21:2743-2754.
Carle sh.b., Ulery PG, Nestler EJ (2004) Konservalangan Fos oilaviy C-terminal domenining yo'qligi deltaFosB-ning noyob barqarorligiga yordam beradi. Soc Neurosci Abstr 30: 692.2.
Channavajhala P, Seldin shahar (2002) Lenfomagenezda protein kinaz CK2 va c-Myc ning funktsional o'zaro ta'siri. Onkogene 21:5280-5288.
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Xiroi N, Nakabeppu Y, Umid BT, Nestler EJ (1995) Delta FosB va FosB-shunga o'xshash oqsillarni elektrokonsivulseptiv tutilish va kokain bilan davolash orqali tartibga solish. Mol Pharmacol 48:880-889.
Chen J, Kelz MB, Hope BT, Nakabeppu Y, Nestler EJ (1997) Surunkali Fos bilan bog'liq antijenler: surunkali davolanish orqali miyada boshlangan DFBning barqaror variantlari. J Neurosci 17:4933-4941.
Chen RH, Juo PC, Curran T, Blenis J. (1996) C-terminasidagi c-Fosning fosforillanish jarayoni uning transformator faoliyatini oshiradi. Onkogene 12:1493-1502.
Choe ES, Parelkar NK, Kim JY, Cho HW, Kang HS, Mao L, Vang JQ (2004) Protein fosfataz 1 / 2A inhibitori okadaik kislota CREB va Elk-1 fosforillanishni va v-fos ifloslanishini in vivo jonli striatumda oshiradi. J Neurochem 89:383-390.
Cochet C, Chambaz em (1983) Polyamin vositasida oqsilli fosforillanishlar: hujayra ichidagi poliamin ta'sirida mumkin bo'lgan maqsad. Mol hujayra endokrinol 30:247-266.
Cochet C, Feige JJ, Chambaz Em (1983) Yuqori saflangan G tipidagi kazein kinazining katalvatiyaviy va molekulyar xususiyatlari. Biochim Biophys Acta 743:1-12.
Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) DeltaFosBning striatal hujayra tipidagi maxsus ekspressionlari kokain uchun rag'batlanishni kuchaytiradi. J Neurosci 23:2488-2493.
Daunais JB, Roberts DC, McGinty JF (1993) Kokainga o'z-o'zidan administratsiya preprodinorfini oshiradi, ammo sichqonchani striatumda c-fos, mRNA emas. NeuroReport 4:543-546.
Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT (2000) Protein buzilishi bilan transkriptsiya omillarini tartibga solish. Hujayra Mol hayot Sci 57:1207-1219.
Diaz-Nido J, Armas-Portela R, Avila J. (1992) NIA-103 neyroblastoma hujayralarida DNK sintezining inhibisyonundan keyin sitoplazmik xolesterin kinaz II-tipli faoliyatning ortishi nevritning o'sishi bilan birga keladi. J Neurochem 58:1820-1828.
Di Maira G, Salvi M, Arrigoni G, Marin U, Sarno S, Brustolon F, Pinna LA, Ruzzene M (2005) Protein kinaz CK2 fosforilatlar va Akt / PKB ni ko'taradi. O'lik hujayra farq qiladi 12:668-677.
Dobrazanski P, Noguchi T, Kovary K, Rizzo CA, Lazo PS, Bravo R (1991) FosB genining ikkala mahsuloti, FosB va uning qisqa shakli FosB / SF fibroblastlarda transkripsiya faollashtiruvchidir. Mol hujayrali Biol 11:5470-5478.
Ferrara P, Andermarcher E, Bossis G, Acquaviva C, Brokly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2003) C-Fos protein proteazomal buzilishidan mas'ul bo'lgan strukturaviy determinantlar ifoda shartlariga ko'ra farqlanadi. Onkogene 22:1461-1474.
Fuchs SY, Dolan L, Davis RJ, Ronai Z. (1996) Jun-N-kinaz bilan c-Jun-ubikuatsiya jarayoniga fosforillanishga bog'liq. Onkogene 13:1531-1535.
Fuchs SY, Xie B, Adler V, Frid VA, Davis RJ, Ronai Z. (1997) c-Jun NH2-terminal kinazlari ularning o'zaro bog'liq transkriptsion omillarini ommaviylashtirishga mo'ljallangan. J Biol Chem 272:32163-32168.
Fuchs SY, Tappin I, Ronai Z. (2000) ATF2 transkripsiyasi faktori barqarorligi fosforillanish va fosforilashish bilan tartibga solinadi. J Biol Chem 275:12560-12564.
Girault JA, Hemmings HC Jr, Uilyam KR, Nairn AC, Greengard P. (1989) Dapin kinaz II tomonidan DAPP-32ning fosforillanishi va cAMP bilan boshqariladigan fosfoprotein. J Biol Chem 264:21748-21759.
Girault JA, Hemmings HC Jr, Zorn SH, Gustafson EL, Greengard P. (1990) Darin kinaz II bilan bir xil bo'lgan DARPP-32 serin kinazining darrandalar miyasida xarakterlash. J Neurochem 55:1772-1783.
Hanada M, Sugawara K, Kaneta K, Toda S, Nishiyama Y, Tomita K, Yamamoto H, Konishi M, Oki T (1992) Epoksomisin, mikrobiologik kelib chiqishning yangi antitumor agenti. J Antibiot (Tokio) 45:1746-1752.
Hann SR, Eisenman RN (1984) Inson c-myc onkogen tomonidan kodlangan proteinlar: neoplastik hujayralardagi differentsial ifoda. Mol hujayrali Biol 4:2486-2497.
Hemmings HC Jr, Girault JA, Uilyam KR, LoPresti MB, Greengard P. (1989) ARPP-21, dopamin-innervatsiya qilingan miya hududlarida boyitilgan siklli AMP bilan boshqariladigan fosfoprotein (Mr = 21,000). Tuzli hujayralardagi siklli AMP bilan fosforitlanadigan va uning in-vitro fosforilatsiyasining kinetik tadkikotlari mavjud bo'lgan saytning aminokislota ketma-ketligi. J Biol Chem 264:7726-7733.
Hidaka X, Kobayashi R. (1992) Protein kinaz inhibitörlerinin farmakolojisi. Annu Rev Farmakol Toksikol 32:377-397.
Hirata H, Bessho Y, Kokubu H, Masamizu Y, Yamada S, Lyuis J, Kageyama R (2004) HesxNUMX oqsilining beqarorligi aniq segmentirovka soati uchun juda muhimdir. Nat Genet 36:750-754.
Xiroy N, Graybiel AM (1996) Atipik va odatiy nöroleptik muolajalar striatumda transkripsiyadan faktor ekspresatsiyasining alohida dasturlarini yaratadi. J Comp neurol 374:70-83.
Hope B, Kosofskiy B, Hyman SE, Nestler EJ (1992) Surunkali kokaindan surunkali erta gen ekspiratsiyasini va AP-1 ulanishini rat yadrosidagi accumbenslar bilan tartibga solish. Proc Natl Acad Sci AQSh 89:5764-5768.
Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ (1994a) Surunkali elektrokonsivulseptiv (EKS) terapiyasi o'zgaruvchan tarkibi va xarakteristikalari bo'lgan miyada mo''tadil uzoq muddatli AP-1 majmuasini ifodalaydi. J Neurosci 14:4318-4328.
Hope BT, Nye HE, Kelz MB, O'z DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ (1994b) Surunkali kokain va boshqa surunkali muolajalarda miyada mushakdagi o'zgargan Fos kabi oqsillardan tashkil topgan uzoq muddatli AP-1 kompleksining paydo bo'lishi. Neyron 13:1235-1244.
Ishida A, Fujisawa H. (1995) Calmodulinga qaram protein kinaz II ni avtoinhibitor ta'sir doirasidan barqarorlashtirish. J Biol Chem 270:2163-2170.
Jariel-Encontre I, Salvat C, Steff AM, Pariat M, Acquaviva C, Furstoss O, Piechaczyk M (1997) C-fos va c-jun degradatsiyasining kompleks mexanizmlari. Mol Biol Rep 24:51-56.
Jones S, Yakel JL (2003) Katein kinaz II (protein kinaz ck2) ng5-3 hujayralarida serotonin 108-ht (15) retseptorlari kanali funksiyasini boshqaradi. Neuroscience 119:629-634.
Kato T Jr, Delxase M, Hoffmann A, Karin M (2003) CK2 - UF ta'sirida NF-kappaB aktivatsiyasidan mas'ul C-terminal IkappaB kinaz. Mol hujayralari 12:829-839.
Kelz MB, Chen J, Carlezon VV Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen S, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Smoke RS, Picciotto MR, Nestler EJ (1999) Miya ichidagi transkripsiyon faktor deltaFosB ning ifodasi kokainga sezgirlikni nazorat qiladi. tabiat 401:272-276.
Kim KB, Myung J, Sin N, Crews CM (1999) Epoxomicin va dihydroeponemycin tabiiy mahsulotlar tomonidan oqsillarni inhibe qilish: o'ziga xoslik va kuchga tushunarli. Bioorg Med Chem Lett 9:3335-3340.
Kobayashi E, Nakano X, Morimoto M, Tamaoki T. (1989) Kalfostin C (UCN-1028C), yangi mikrobial birikma, protein kinaz S ning juda kuchli va o'ziga xos inhibitori. Biochem Biophys Res Commun 159:548-553.
Krek Vt, Maridor G, Nigg EA (1992) Katein kinaz II asosan yadroviy ferment hisoblanadi. J Cell Biol 116:43-55.
Krohn NM, Stemmer S, Fojan R, Grim R, Grasser KD (2003) Protein kinaz CK2 yuqori harakatlantiruvchi guruh domen oqmasi SSRP1ni fosforitlaydi, bu UBBga zarar etkazgan DNKning tan olinishiga sabab bo'ladi. J Biol Chem 278:12710-12715.
Gumar A, Choy KH, Renthal Vt, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, Russo SJ, LaPlant Q, Whistler K, Neve RL, Self DW, Nestler EJ (2005) Kromatinni qayta tuzish striatumda kokain bilan indikatsiyalangan plyonkali asosiy mexanizmdir. Neyron 48:303-314.
Lieberman DN, Mody I (1999) Katein kinaz-II hipokampal neyronlarda NMDA kanali funksiyasini tartibga soladi. Nat Neurosci 2:125-132.
Litchfild DW (2003) Protein kinaz CK2: hayot va o'limning uyali qarorlarida tuzilma, tartibga solish va roli. Biochem J. 369:1-15.
Manabe T, Kuramoto N, Nakamichi N, Aramachi K, Ota K, Xiray T, Yoneyama M, Yoneda Y (2001) V-Fos oqsilining N-metil-dSichqoncha hippokampusining yadro qismida-spartik kislota. Brain Res 905:34-43.
Mandelzys A, Gruda Ma, Bravo R, Morgan JI (1997) Kinetik kislota bilan muomala qilingan fosB null sichqon miyalarida doimiy ravishda ko'tarilgan 37 kDa fos bilan bog'liq antigen va AP-1 kabi DNKni majburiy faoliyatning yo'qligi. J Neurosci 17:5407-5415.
Marin O, Meggio F, Marchiori F, Borin G, Pinna LA (1986) Sichqon jigari sitosolidan kazein kinaz-2 (TS) ning o'ziga xosligi. Model peptid substratlar bilan ishlash. Eur J Biochem 160:239-244.
McClung CA, Nestler EJ (2003) CREB va DeltaFosB tomonidan gen ekspression va kokain mukofotini tartibga solish. Nat Neurosci 6:1208-1215.
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton U, Nestler EJ (2004) DeltaFosB: miyada uzoq muddatli moslashish uchun molekulyar kalit. Brain Res Mol Brain Res 132:146-154.
Meggio F, Pinna LA (2003) Protein kinazining CK2dan bir mingtadan ortiq substratlari bormi? FASEB J 17:349-368.
Meggio F, Donella-Deana A, Pinna LA, Moret V (1977) Sichqoncha jigari "fosvitin kinaz" bilan kazein fraktsiyalarining fosforlanishi. FEBS Lett 75:192-196.
Meggio F, Brunati AM, Pinna LA (1983) Uning alfa va beta-bo'linmalarida 2 xolosin kinaz TS ning autofosforilash. Turli efektorlarning ta'siri. FEBS Lett 160:203-208.
Meggio F, Shugar D, Pinna LA (1990) Rinofuranosil-benzimidazol tuplamlari kasin kinaz-2 inhibitörleri va kazein kinaz-1 kabi. Eur J Biochem 187:89-94.
Meggio F, Marin O, Pinna LA (1994) Protein kinazining subkastratik spesifikligi CK2. Hujayra Mol Biol Res 40:401-409.
Miller C, Jang M, Yo Y, Zhao J, Pelletier JP, Martel-Pelletier J, Di Battista JA (1998) Inson kondrositlarida fosfatazning okajaik kislota inhibisyonunun siklooksijenaz-2 geni transkripsiyadan indeksatsiyasi: AP-1 va CRE yadroli biriktiruvchi oqsillarni birgalikda stimulyatsiya qilish. J Cell Biochem 69:392-413.
Moratalla R, Elibol B, Vallejo M, Graybiel AM (1996) Surunkali kokainni davolash va olib tashlash vaqtida striatumda indulged Fos-Jun oqsillarini ifodalovchi tarmoq darajasidagi o'zgarishlar. Neyron 17:147-156.
Morgan JI, Curran T. (1995) Erta-erta genlar: o'n yil. Trends Neurosci 18:66-67.
Nakabeppu Y, Nathans D (1991) Fos / Jun transkripsiyasi ta'sirini inhibe qiluvchi tabiiy ravishda uchraydigan FosB shakli. hujayra 64:751-759.
Nestler EJ, Barrot M, Self DW (2001) Delta FosB: giyohvandlik uchun doimiy molekulyar kalit. Proc Natl Acad Sci AQSh 98:11042-11046.
Neve RL, Howe JR, Xong S, Kalb RG (1997) 1 ning glutamat retseptorlari subunitini vosita va in vivo jonli rekombinatli herpes simplex virusi yordamida motor neuronlariga kiritish. Neuroscience 79:435-447.
Nuthall HN, Joachim K, Stifani S (2004) Protein kinazli CK239 tomonidan Groucho / TLE1 ning serine 2 ning fosforillanishlari nöronal differentsiatsiyani inhibe qilish uchun muhimdir. Mol hujayrali Biol 24:8395-8407.
Okazaki K, Sagata N (1995) Mos / Map kinaz yo'llari fosforillanish orqali c-Fosni stabillashtiradi va NIH 3T3 hujayralarida uning transformatsion faolligini oshiradi. EMBO J. 14:5048-5059.
Palombella VJ, Rando OJ, Goldberg AL, Maniatis T. (1994) Ubikitin-proteazom yo'llari NF-kappa B1 kashshofli proteini va NF-kappa B ni faollashtirish uchun talab qilinadi. hujayra 78:773-785.
Papavassiliou AG, Treier M, Chavrier C, Bohmann D (1992) C-Fosning maqsadli degradatsiyasi, v-Fos emas, balki c-iyunda fosforilatsiyaga bog'liq signal orqali. fan 258:1941-1944.
Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Uliya R, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E (2003) Transgenik sichqonlardagi c-Jun ning dominant mutatsion mutanti, individuatsiyalangan, miya mintaqasiga xos ifodasi kokainga sezuvchanlikni pasaytiradi. Brain Res 970:73-86.
Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ (2004) Surunkali stressdan keyin mukofotga bog'liq miya strukturalarida DeltaFosB ning indüksiyasini. J Neurosci 24:10594-10602.
Persico AM, Shindler CW, O'Hara BF, Brannock MT, Uhl GR (1993) Miya transkripsiyasi faktori ifodasi: O'tkir va surunkali amfetamin va in'ektsion stress ta'siri. Brain Res Mol Brain Res 20:91-100.
Ploegh HL, Dann BM (2000) Post-translasyonal o'zgarishlar: fosforillanish va fosfatazalar. In: Protein ilmining joriy protokollari (Dann Bm, ed.) S. 13.01-13.02. Nyu-York: Wiley va Sons.
Pyerin V, Burow E, Michaely K, Kubler D, Kinzel V. (1987) Madaniyatdagi (HeLa) inson epiteliya hujayralarida yuqori darajada toblangan fosvitin / kazein kinaz turi II ning katalitik va molekulyar xossalari va ekto protein kinaziga aloqador. Biol Chem Hoppe Seyler 368:215-227.
Reikhardt BA, Kulikova OG, Borisova GY, Aleksandrova IY, Sapronov NS (2003) Sichqoncha bilan yoshga bog'liq amneziyada "protein kinaz CK2-HMG14" tizimining holati. Neurosci Behav Physiol 33:799-804.
Roberts BJ, Whitelaw ml (1999) Ubikitin / proteazome yo'li orqali asosiy heliks-loop-spirti / Per-ARNT-Sim homologiyasi domen dioksin retseptorining buzilishi. J Biol Chem 274:36351-36356.
Rost B, Yachdav G, Liu J. (2004) PredictProtein server. Nuklein kislotalar 32:W321-V326.
Rylski M, Kaczmarek L. (2004) Ap-1 maqsadlari miyada. Old Biosci 9:8-23.
Shaxin B, Kansy JW, Nairn AC, Spychala J, Ealick SE, Fienberg AA, Greene RW, Bibb JA (2004) Rekombinat sichqon adenozin kinazining molekulyar xarakteristikasi va protein fosforillanish uchun maqsad sifatida baholash. Eur J Biochem 271:3547-3555.
Salvat S, Aquaviva C, Jariel-Encontre I, Ferrara R, Pariat M, Steff AM, Carillo S, Piechaczyk M (1999) C-Fos, c-Jun va p53 proteinlarini tanazzulga olib keladigan ko'plab proteolitik usullar in vivo jonli mavjudmi? Mol Biol Rep 26:45-51.
Shmidt R, Hekker E (1975) Oddiy saqlash sharoitida farforli esterlarni avtoksidlanish. Saraton kasalligi 35:1375-1377.
Schwarz EM, Van Antwerp D, Verma IM (1996) Ikinbaxalfa preparatining kationin kinaz II tomonidan asosli fosforilash darajasi imtiyozli ravishda serine 293da sodir bo'ladi: erkin IkappaBalfa degradatsiyasi talabi. Mol hujayrali Biol 16:3554-3559.
Sears R, Lion G, DeGregori J, Nevins JR (1999) Ras, Myc protein barqarorligini oshiradi. Mol hujayralari 3:169-179.
Silva-Neto MA, Fialo E, Paes MC, Oliveira PL, Masuda H. (2002) Ketin kinaz II tomonidan vitellinning nukleotiddan mustaqil fosforilatsiyasini Rhodni prolixus oositlerden tozalangan. Hasharotlar Biochem Mol Biol 32:847-857.
Skinner M, Qu S, Mur C, Wisdom R. (1997) Fosb oqsili bilan transkripsiyadan foydalanish va transformatsiya qilish karboksil terminali aktivatsiya maydonini fosforilashni talab qiladi. Mol hujayrali Biol 17:2372-2380.
Stemmer C, Schwander A, Bauw G, Fojan P, Grasser KD (2002) Protein kinaz CK2 turli qatlamlarida stabillik va DNKning o'zaro bog'liqligini modellashtirish uchun makkajo'xori kromozomali yuqori harakatlanish guruhi B (HMGB) oqsillarini fosforilatlaydi. J Biol Chem 277:1092-1098.
Stevens I, Derua R, Rondelez E, Waelkens E, Merlevede V, Goris J (1999) Yangi kaltsiy / kalmodulinga bog'liq protein kinaz II va uning Xenopus laevis oosit rivojlanishidagi roli sifatida cyk, siklin B2 kinazni aniqlash. Exp Res 252:303-318.
Suh HW, Choi SS, Lee JK, Lee XK, Han EJ, Lee J. (2004) Primer madaniyatli astrositlarda lipopolisakkarid va sitokinlar tomonidan c-fos va c-jun genini ifodalashni tartibga solish: PKA va PKK yo'llarining ta'siri. Arch Pharm Res 27:396-401.
Szyszka R, Boguszewska A, Grankowski N, Ballesta JP (1995) Ribozomal kislotali oqsillarni xamirturush hujayrasidan ikki endogen protein kinaz bilan differensial fosforilash: kazein kinaz-2 va 60S kinaz. Acta Biochim Pol 42:357-362.
Tamaoki T, Takahashi I, Kobayashi E, Nakano H, Akinaga S, Suzuki K (1990) Calphostin (UCN1028) va calfostin bilan bog'liq birikmalar, o'ziga xos va kuchli protein kinaz S inhibitörlerinin yangi bir turi. Avvalgi Ikkinchi Fosfoprotein Res 24:497-501.
Torres J, Pulido R. (2001) PTEN o'simtasini bartaraf qilish vositasi C terminusida protein kinaz CK2 tomonidan fosforilanadi. PTEN barqarorligi uchun proteazome-vositachilik degradatsiyasi. J Biol Chem 276:993-998.
Tsubuki S, Saito Y, Tomioka M, Ito H, Kavashima S (1996) Di-leusin va tri-leusinning peptidil aldegidlari tomonidan kalfa va proteazom faoliyatining differentsial inhibatsiyasi. J Biochem (Tokio) 119:572-576.
Tsurumi C, Ishida N, Tamura T, Kakizuka A, Nishida E, Okumura E, Kishimoto T, Inagaki M, Okazaki K, Sagata N (1995) C-Fosning 26S proteazomlari bilan parchalanishi c-Jun va ko'p oqsil kinazlari bilan tezlashadi. Mol hujayrali Biol 15:5682-5687.
Unger GM, Davis AT, Slaton JW, Ahmad K. (2004) Protein kinaz CK2 hujayra omon qolish regulyatori sifatida: saraton davolash uchun oqibatlar. Sarimsoq saraton dori maqsadlari 4:77-84.
Vial E, Marshal CJ (2003) ERK-MAP kinazining balandligi FOS oila a'zolari FRA-1 ni kolon karsinoma hujayralarida proteazomal degradatsiyaga qarshi himoya qiladi. J Cell Sci 116:4957-4963.
Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S (2002) DFF g'ildirak harakatini tartibga soladi. J Neurosci 22:8133-8138.
Whitmarsh AJ, Davis RJ (2000) Fosforillanish orqali transkriptsion faktor funktsiyasini tartibga solish. Hujayra Mol hayot Sci 57:1172-1183.
Qish B, Kautzner I, Issinger OG, Arnold H. (1997) Myf-2 faoliyati uchun ikkita potentsial protein kinaz CK5 fosforillanish joylari muhimdir. Biol Chem 378:1445-1456.
Wisniewski JR, Szewczuk Z, Petry I, Schwanbeck R, Renner U (1999) Xozum kinaz II ning yuqori mobillik guruhidagi 1 oqsillarining kislotali quyrug'larining asosli fosforillanishlari ularning konformatsiyasi, barqarorligi va DNKning ulanish xususiyatlarini o'zgartiradi. J Biol Chem 274:20116-20122.
Yamaguchi Y, Wada T, Suzuki F, Takagi T, Hasegawa J, Xanda X. (1998) Katein kinaz II bir necha transkriptsiya omillarining bZIP domenlari bilan o'zaro ta'sir qiladi. Nuklein kislotalar 26:3854-3861.
Yanagava T, Yuki K, Yoshida H, Bannay S, Ishii T (1997) A170 stress oqsili fosforilatsiyasini makinafazalarda kasein kinaz II-shunga o'xshash faoliyat. Biochem Biophys Res Commun 241:157-163.
Yankulov K, Yamashita K, Roy R, Egly JM, Bentley DL (1995) Transkritral uzayishi inhibitori 5,6-dichloro-1-beta-d-ribofuranosilbenzimidazol transkriptsiya faktor IIH bilan bog'liq protein kinazini inhibe qiladi. J Biol Chem 270:23922-23925.
Yen J, Wisdom RM, Tratner I, Verma IM (1991) Fosbning muqobillashtirilgan shakli Fos proteynlar tomonidan transkripsiyadan o'tish va transformation jarayonining salbiy regulyatori hisoblanadi. Proc Natl Acad Sci AQSh 88:5077-5081.
Yin X, Jedrzejewski PT, Jiang JX (2000) Katein kinaz II fosforli lentani 45.6 bilan bog'laydi va uning tanazzulga uchrashi bilan shug'ullanadi. J Biol Chem 275:6850-6856.
Yoza BK, Brooks JW, Mizel SB (1992) Interleukin 1 va farforbol esterlar tomonidan T-hujayrasini faollashtirishda AP-1 transkriptsion faktor komponentlarini indüksiyalash. Tarqalishi farq qiladi 3:677-684.
Yu S, Vang X, Davis A, Ahmad K. (2001) Yadro matritsasiga CK2 signalizatsiyasi natijalari. Mol hujayra biokimyosi 227:67-71.
Yu S, Davis AT, Guo S, Yashil JE, Ahmad K. (1999) Protein kinazining CK2 ning yadro matritsasiga ajratib bo'linib, uning subunitsiyalarini vaqtincha haddan tashqari ekspresatsiyalashiga qarab ajratish. J Cell Biochem 74:127-134.
Zachariu V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton U, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ (2006) DFOSB: Morfin ta'siridagi yadrodagi akushtenlarda DFOSB uchun muhim rol. Nat Neurosci 9:205-211.
Ushbu maqolaga asoslanib maqola
- Surunkali Qo'qonga Behayo va Strukturaviy javoblar Nucleus Accumbens Shell (Delta) FosB va Calcium / Calmodulin-Aloqador Protein Kinazning II Nörobilim jurnali, 6 mart 2013, 33(10):4295-4307
- Delta Fosbning Striatal Ekspertizasi Surunkali Levodopaning Tuxmati Harakatsiz harakatlari Nörobilim jurnali, 26 May 2010, 30(21):7335-7343
- mavhum
- To'liq matn
- To'liq matn (PDF)
- mavhum
- To'liq matn
- To'liq matn (PDF)
- mavhum
- To'liq matn
- To'liq matn (PDF)
- mavhum
- To'liq matn
- To'liq matn (PDF)
- Narkomaniyaning transkripsiya mexanizmlari: Delta FosB ning ahamiyati Royal Society B falsafiy operatsiyalari: Biologiya fanlari, 12 oktyabr 2008, 363(1507):3245-3255
- Glial hujayra chizig'idan olingan neyrotrofik faktor mutant sichqonlarida metamfetamin izlash qobiliyatini tiklash uchun mustahkam zaiflik FASEB jurnali, 1 iyul 2007, 21(9):1994-2004
- Nafas olish epiteliyasi karsinogenezidagi aktivator Protein-1 transkriptsiyasi omili Molekulyar rak tekshiruvi, 1 Fevral 2007, 5(2):109-120
;
