D1 va D2 dopinli retseptorlari o'z ichiga olgan kokainga asoslangan dendritik orqa miya hosilasi yadro akumbens (2006)

Proc Natl Acad Sci AQSh A. Feb 28, 2006; 103 (9): 3399-3404.
Onlayn nashr etilgan Fevral 21, 2006. doi:  10.1073 / pnas.0511244103
PMCID: PMC1413917
Neuroscience
Ushbu maqola tomonidan keltiriladi PMCdagi boshqa maqolalar.

mavhum

Nucleus accumbens (NAcc) dopaminotseptiv neyronlarga dendritik spinalarning psixostimulyatsiyaga bog'liq o'zgarishi uzoq vaqt davom etadigan qo'shadi xatti-harakatlari bilan bog'liq bo'lgan adaptiv neyronal javob sifatida faraz qilindi. NAcc asosan dopamin D1 yoki D2 retseptorlari yuqori darajada ifodalangan o'rta bo'g'inli neyronlarning ikkita alohida subpopulyatsiyaidan iborat. Ushbu tadqiqotda NAcc'dagi turli xil D1 yoki D2 retseptorlari o'z ichiga olgan o'rta o'lchamli o'murtqa neyronlarda surunkali kokainni davolashdan so'ng dendritik orqa miya zichligini tahlil qildik. Ushbu tadqiqotlar EGFPni D1 yoki D2 retseptorlari promoteri (Drd1-EGFP yoki Drd2-EGFP) nazorati ostida ifodalovchi transgenik sichqonlardan foydalandi. 28 kunlik kokainni davolashdan va 2 kundan so'ng olib tashlangandan so'ng, Drd1-EGFP- va Drd2-EGFP-musbat neyronlarda o'murtqa zichligi oshdi. Biroq, o'murtqa zichligi oshganligi faqatgina DrN1-EGFP-musbat neyronlarda saqlanib qoldi. Ayniqsa 30 kunlik dori chiqarishdan so'ng Drn1-EGFP- va Drd2-EGFP-musbat neyronlarda DFFB ekspresyoni ortdi, ammo 2 kundan so'ng dori-darmonlarni olishdan keyin Drd1-EGFP-pozitiv neyronlarda kuzatildi. Ushbu natijalar, surunkali giyohni davolashdan keyin ortib borgan ommaviy zichligi faqat D30-retseptorlari o'z ichiga olgan neyronlarda barqaror ekanligini va DFNBX ekspresyonunun D1 da dendritik o'ramlarning shakllanishi va / yoki parvarishi bilan bog'liqligini va D1 retseptorlari o'z ichiga olgan nöronların NAcc da.

Mezolimbik dopaminerjik yo'l, ventral tegmental hududdagi neyronlardan (NAcc), olfaktor tuberkli, prefrontal korteks va amigdala (innervatsiya)1), shunga qaramay, asosan nigra (pars kompaktada) nigrostriatal dopaminerjik neyronlar dorsal striatumga ko'tarilish proektsiyasi (2). Psychostimulants NAcc dopaminning sinaptik kontsentratsiyasini ko'taradi: kokain, sinoptik bo'shliqdan dopamin olishni va amfetaminni nerv terminallerinden dopamin salınmasını da'vat qilib (3-5). Psistostimulyatorlarni takroriy, intervalgacha buyurish ushbu dorilarning o'tkir stimulyatsion ta'siriga (xatti-harakatni) kuchaytiradi.6-8). Ko'pgina dalillar, ventral tegmental hududdagi adaptiv o'zgarishlar - NAcc dopaminerjik tizimining dori vositasida paydo bo'ladigan xulq-atvor asosida tajribaga bog'liq bo'lgan plastisitada o'zgarishlarga olib kelishi mumkinligini ko'rsatadi.

Dopaminga qo'shimcha ravishda, glutamat psixostimulyatorlarga javob tarzida xulq-atvorli bo'lishni talab qiladi (9, 10). Ventral striatumdagi o'rta bo'g'inli neyronlar (MSNlar) dendritik uzuklarning boshlariga sinapsini o'tkazadigan prefrontal korteksdan eksitatori glutamaterjik proektsiyalarni oladi. MSN-lar, shuningdek, orqa miya bo'yinlariga sinapsisan dopaminerjik aksonlar uchun ham asosiy maqsaddir (1, 11, 12). Shuning uchun, MSNdagi dendritik zarralar dopaminerjik va glutamaterjik transmissiya dastlab inobatga olingan uyali xonani ifodalaydi.

Dopamin ikkita asosiy retseptorlari subfamillari, D1 subfamily (D1 va D5 subtiplari) va D2 subfamili (D2, D3 va D4 subtiplari) ustida ishlaydi (13). Dorsal striatumda anatomik tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki striatonigral MSNlar yuqori darajadagi D1 retseptorlari (modda P va dynorphin bilan birga), striatopallidal MSNlar asosan D2 retseptorlarini (enkephalin bilan birga) ifodalaydi14-17). NAcc'dan keltirilgan proektsiyalar dorsal striatumga qaraganda murakkabroqdir. NAccning qobiq va yadro qismlari ventral pallidumning alohida pastki hududlariga, ventral tegmental maydoniga va asosan nigraga (18). D2 retseptorlari va enkefalin ventral pallidi uchun proektsiyalarda yuqori ifoda etilgan bo'lsa, D1 retseptorlari va R moddasi ventral pallidi va ventral tegmental maydoniga proektorlarda teng ravishda taqsimlanadi19). D1 yoki D2 retseptorlari uchun tanlangan agonistlar va antagonistlarni o'rganish psixostimulyatsiyaga bog'liq bo'lgan xatti-harakatlar uchun ham D1, ham D2 retseptorlari uchun zarur bo'lganligini ko'rsatdi (20-25). Biroq, ushbu retseptorlarning roli boshqacha ko'rinadi. Misol uchun, D1 retseptorlarini rag'batlantirish kokainga qarshi vositalar va kokain bilan bog'liq ekologik tovarlarni keltirib chiqaradigan kokainga talabni kuchaytiradi, D2 retseptorlarining stimulyatsiyasi esa kokainga sabab bo'lgan qayta tiklanishni osonlashtiradi (26-28).

Psikostimülanslı giyohvandlik bilan bog'liq bo'lgan qiziqishlariga qarama-qarshiliklar juda uzoq umr ko'rishadi. Shuning uchun dopamin va glutamat bilan regulyatsiya qilingan nöronal davrda molekulyar va tizimli darajada uzoq muddatli dori-darmonlar o'zgarishini aniqlashda katta qiziqish uyg'otdi (29-32). Ayniqsa, kokain yoki amfetaminning uzoq muddatli ta'siri, NAcc (MSN) dendritik nuqta nuqtalari va MSN33-35). Ushbu tuzilish o'zgarishlari oxirgi dori ta'siridan so'ng ≈ 1-3.5 oygacha davom etishi ko'rsatilgan (30, 35) va psixostimulant ta'sir qilish bilan bog'liq bo'lgan sinaptik plastisitada uzoq muddatli o'zgarishlarga asoslangan holda taklif qilingan.

Ushbu tadqiqotning maqsadi D1 yoki D2 retseptorlarini ifodalovchi accumballi MSN-larning subpopulyatsiyalarida dendritik uzuklarning kokainga bog'liq tuzilmaviy o'zgarishlarini o'rganishdir. Ushbu tadkikotlar EGFP ni D1 (Drd1-EGFP) yoki D2 (Drd2-EGFP) dopamin retseptorlari promoteri (yoki DXNUMX (DdXNUMX-EGFP)) nazorati ostida ifodalovchi bakterial sun'iy xromosoma (BAC) transgenik sichqonlardan36). Natijalar dastlab D1 retseptorlari o'z ichiga olgan MSNlar va D2 retseptorlari o'z ichiga olgan MSNlarda ortib borgan omillar zichligi, o'zgargan omurilik zichligi faqat D1 retseptorlari o'z ichiga olgan nöronlarda barqarorligini ko'rsatadi. Bundan tashqari, biz DFNBX dendritik pog'onalarni shakllantirish va / yoki parvarishlashda, shuningdek, D1 retseptorlari o'z ichiga olgan neyronlarning NAcc da shakllanishida ishtirok etishi mumkinligini ta'kidlaydigan transkripsiyalik faktori DFBning o'xshashligini topamiz.

natijalar

Drd1-EGFP va Drd2-EGFP BAC transgenik sichqonlardagi MSNlarni tahlil qilish.

Drd1-EGFP yoki Drd2-EGFP BAC transjenik sichqonlarida dorsal va ventral striatumdan olingan MSNning proksion naqshlari GFP ifodasini tahlil qilish (36). Dorsal striatumdagi MSNda GFP ning differentsial ifodasi asosan endogen D1 yoki D2 retseptorlari bilan mos keladi (36). Bundan tashqari, Drd1-EGFP yoki Drd2-EGFP sichqonlarida NAccda GFP ning differentsial ifodasini ham tahlil qildik (Anjir. 1a va b). Naccdagi neyronlarning ≈58% -i DrD1-EGFP sichqonlarida GFPni ifodalagan bo'lsa-daAnjir. 1a), NAccdagi neuronlarning ≈48% lari Drd-2-EGFP sichqonlarida GFPni ifodalashdi (Anjir. 1b). MSNlar NAccdagi barcha neyronlarning 90-95% ni ifodalaydi (12, 37). D1 retseptorlari faqat MSNda ifodalanadi va D2 retseptorlari MSN va xolinergik internoronlarda ifodalanadi, bu esa striatal neyronlarning 1-3%37). Ushbu omillarni hisobga olsak, natijalar, NAccdagi MSN ning minimal ravishda ≈ 10-15% ni D1 va D2 retseptorlarini bildirishi ehtimoldan holi emas.

Shakl 1. 

Drd1-EGFP va Drd2-EGFP sichqonlarida MSNni tahlil qilish. (a va b) Drd1-EGFP ning NAcc dan sobit miya bo'laklari (a) yoki Drd2-EGFP (b) BAC transgenli sichqonlari GFP va NeuN (umumiy neyronal belgilar sifatida) uchun immunostained qilindi. Birlashtirilgan tasvirlar sariq, kolokalizatsiya ko'rinishida ...

Drd1-EGFP va Drd2-EGFP sichqonchalarida Dendritik Spinlarni tahlil qilish.

Drd1-EGFP va Drd2-EGFP sichqonlarida GFP ifodasi, nöronal hujayra jismlarini lekelemede foydalidir. Ammo, dendrit va dendritik spinalarda GFP signallari anti-GFP antikorlari bilan immundan keyin tahlil qilish uchun juda zaif edi. Yaqinda neyronal populyatsiyalarni tez va samarali tarzda yoritishda floresan bo'yoqlardan partikulyar vositalar orqali ballistik etkazib berish qo'llanildi38). Barcha neyronlarni bu usul yordamida etiketlash mumkin va usul Golgi-Coxning bo'yalishi bilan solishtirish mumkin. NAccdagi neyronlarning dendritik morfologiyasini tahlil qilish uchun qattiq akkumulyat tilimlari gen tabancasi yordamida lipofil floresansli bo'yoq 1,1'-diotadesil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindokarbosiyanin perklorat (DiI) bilan etiketlanadi. DiI-contained MSN misolida ko'rsatiladi Anjir. 1c. Qo'llaniladigan sharoitda biz odatda neyronlarning markali neyronlardan hech qanday to'siqsiz dendritlarisiz belgilangan. Yuqori darajada kattalashganida dendritik morfologiya, jumladan, dendritik uzuklar kuzatilishi mumkin (Anjir. 1d).

Keyinchalik GFP uchun DiI markirovkasi va immunohistokimyosi kombinatsiyasini Drd1-EGFP yoki Drd2-EGFP transgenik sichqonlarida ishlatilgan. Bu sintetik to'qimalarning o'tkazuvchanligi uchun past konsentratsiyali deterjan yordamida tuzilgan. usullari). DiS leynini va GFP ekss- tsiyasini MSNning hujayra jismlarida mukammal taqqoslash usuli yordamida Drd1-EGFP (DiI- va GFP-musbat yoki DiI-pozitiv va GFP-salbiy neyronlarni aniqlash mumkin)Anjir. 2a) yoki Drd2-EGFP (Anjir. 2b) Sichqoncha. Quyidagi tadqiqotlar uchun Drd1-EGFP yoki Drd2-EGFP sichqonlaridan faqat DiI- va GFP-musbat neyronlarda dendritik morfologiyani tahlil qildik.

Shakl 2. 

Drd1-EGFP va Drd2-EGFP sichqonlarida dendritik bellarni tahlil qilish. Drd1-EGFP sichqonlarining NAccdagi neyronlar (a) yoki Drd2-EGFP sichqonchasi (b) birinchi DiI (qizil) bilan etiketlenmiş va keyin anti-GFP antikoru (EGFP, yashil) yordamida immunohistokimya ta'siri ostiga olingan. Faqat ...

Virusli MSN-larda surunkali kokainning davolash natijalari Drd1-EGFP yoki Drd2-EGFP deb ataladi.

Drd1-EGFP yoki Drd2-EGFP sichqonlari ketma-ket to'rt marta kokain (30 mg / kg) yoki sho'r suv bilan bir necha marta AOK qilindi usullari). Oxirgi dori davolashdan keyin ikki kun (2WD) yoki 30 kun (30WD), yuqorida ta'riflanganidek, DiI etiketleme va immunohistokimiya uchun miya ishlov berildi. O'tgan ishda amfetamin bilan surunkali davolash NACC-da distal, ammo proksimal bo'lmagan dendritlarda prognozli o'murtqa zichligi oshdi35). Biz shuning uchun tahlilimizni distal dendritlarga (ya'ni, ikkinchi yoki uchinchi darajali filiallari bo'lganlar), shu jumladan terminal hududlarga cheklab qo'ydik. 2WD da tahlil qilinganida, Drd1-EGFP-pozitiv MSNlardagi (128% sho'rlangan guruh) orqa miya zichligiAnjir. 3a va c) va Drd2-EGFP-musbat neyronlarda (sho'rlangan guruhning 115%)Anjir. 3 b va d). 30WD dan so'ng ortikcha orqa miya zichligi Drd1-EGFP-musbat neyronlarda (xNUMX% sho'rlanishni nazorat qilish) saqlandi (Anjir. 3 a va c), ammo Drd2-EGFP-musbat neyronlarda (Anjir. 3 b va d).

Shakl 3. 

NAcc dagi Drd1-EGFP- yoki Drd2-EGFP-positive MSN-larda surunkali kokainga sabab bo'lgan omillar zichligi. (a va b) Drd1-EGFP (a) yoki Drd2-EGFP (b) sichqonchani 30 hafta davomida sho'r suv bilan yoki kokain (Coc, 4 mg / kg) bilan davolashdi. Sichqoncha miyalari 2WD yoki 30WD ishlov berildi ...

Dendritik qirralarning morfologiyasi ularning uzunligi va orqa miya boshining kengligi jihatidan o'zgarmoqda. Shuning uchun 2WD-da kokaindan to'rtta orqa mushak (stubby, qo'ziqorin, ingichka va filopodiya) dendritik oqimlarni tasnifladik (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). Qo'ziqorin tipidagi zichlik (119.7 ± 4.0%, P <0.01) va ingichka tikanlar (120.0 ± 3.4%, P Drd0.01-EGFP-musbat MSNlarda kokain bilan davolash orqali <1) ko'paytirildi, ammo zichligi zichligi (182.4 ± 21.6%, P <0.05) va qo'ziqorin tikanlar (122.5 ± 5.0%, P Drd0.01-EGFP-musbat MSNlarda <2) ko'paygan. Drd1-EGFP musbat neyronlarda yoki Drd2-EGFP musbat neyronlarda ingichka umurtqa pog'onalarida sezilarli o'sish kuzatilmadi.

Surunkali Kokain, NAcc'ta Drd1-EGFP- yoki Drd2-EGFP-ijobiy MSN'larda DFosB Expressionni indultiradi.

DFOSB transkriptsiya omillarining Fos oilasining a'zosi hisoblanadi. Qo'qonni o'tkir tarzda qo'llash, NAccda bir necha Fos izoformini tez va vaqtinchalik indüksiyasini keltirib chiqaradi, ammo takroriy giyoh ta'siriga DFF darajasini oshiradi. Bundan tashZari, DFOSB ifodasi NAcc da dori ta'sirini to'xtatganidan keyin bir necha oylar davomida davom etadi va giyohvand uzilishdan keyin ham gen uzoilishini uzluksiz tartibga solishda ishtirok etishni taklif kilinadi (29, 39, 40).

Doc1-EGFP yoki Drd2-EGFP sichqonlaridan NAcc da DFOSB indekslarini kokainni davolashdan keyin o'rganish uchun FosB va GFP ifodasini er-xotin etiketlash (Anjir. 4 va 1 stol) Fosbga qarshi antikor FOS ning barcha shakllarini taniydi, ammo biz ko'proq immunostinni DF (B) usullari batafsil muhokamalar uchun). Sho'r bilan davolash qilingan sichqonlarda Drd16-EGFP-pozitiv neyronlarning 1% va Drd15-EGFP-musbat neyronlarning 2% nisbiy zaifligi bilan FosB immunoreaktivligini ifoda etdi (Anjir. 4 a va b va 1 stol). 2WD tomonidan takrorlangan kokainli davolanish natijasi DFXB (1% GFP-musbat neyronlarning) bilan birlashtirilgan Drd55-EGFP-pozitiv neyronlar sonining sezilarli o'sishiga olib keldi (Anjir. 4c va 1 stol). DrFX2-EGFP-pozitiv neyronlarda (GFP-musbat neyronlarning 25%) DFOSB ifodasi kichikroq, lekin hali ham sezilarli darajada oshgan (Anjir. 4d va 1 stol). Orqa miya zichligi o'zgarishida bo'lgani kabi, DFXBning oshganligi ekspluatatsiyasi Drd1-EGFP-pozitiv neyronlarda (GNPX-pozitiv neyronlarning 46%) saqlanadi, ammo Drd2-EGFP-pozitiv neyronlarda (GFP-musbat neyronlarning 15%) 30WD (Anjir. 4 e va f va 1 stol). Qilingan DFF ekspresyonu ortdi Anjir. 4f Drd2-EGFP-negativ neyronlarda mavjud.

Shakl 4. 

Surunkali kokain NAcc'ta Drd1-EGFP- yoki Drd2-EGFP-pozitiv MSN'larda DFosB ifodasini keltirib chiqaradi. Drd1-EGFP (a, cva e) yoki Drd2-EGFP (b, dva f) sichqonchani sho'r yoki surunkali kokain bilan davolash qilingan Anjir. 3. 2WD (c va d) yoki 30WD (e va ...
Jadval 1. 

EGFP-pozitiv neyronlarning A miqdorini aniqlashFosB

muhokama

Dopaminerjik nörotransmisyonda uzoq muddatli adaptasyonlar, psikostimulant dorilar bilan bog'liq bo'lgan qaramlik harakatlariga asoslangan. Xususan, NAccdagi MSNlardagi dendritik orqa miya zichligi psistostimulyatsiyani keltirib chiqaradigan o'sishlari sinaptik ulanishni qayta tashkil qilish bilan bog'liq deb faraz qilindi (30). NAcc asosan D1 yoki D2 dopamin retseptorlari yuqori darajada ifodalangan MSNning ikkita alohida subpopulationsidan iborat. Biz ushbu tadqiqotda surunkali kokainni davolashdan keyin NAcc'teki turli D1 yoki D2 retseptorlari o'z ichiga olgan MSNlardagi orqa zichligini tahlil qildik. Olingan natijalar dastlab D1 retseptorlari o'z ichiga olgan MSN va D2 retseptorlari o'z ichiga olgan MSNlarda tashkil topgan bo'lsa-da, orqa miya zichligi faqat D1-retseptorlari o'z ichiga olgan nöronlarda barqarorligini ko'rsatadi. Bundan tashqari, biz D1 va D2 retseptorlari o'z ichiga olgan MSN-larda DFosB transkriptsion faktori ifodasini o'zgartirishga o'xshash o'zgarishlarni topamiz.

Ushbu ishlar D1 yoki D2 retseptorlari promoteri nazorati ostida MSNning o'ziga xos subpopulyatsiyalarida GFPni ifodalovchi BAC transgenik sichqonlardan foydalanishni amalga oshirdi. Bundan tashqari, biz GFP uchun immunohistokimyani DiI yordamida neyronlarning balistik markirovkasi bilan birlashtirgan ikkita etiketli usulni ishlab chiqdik. Avvalgi tadqiqotlar psixostimulyatorlarni orqa zichlikka ta'sirini tahlil qilish uchun Golgi-Cox usulini qo'llagan (34) va bu erda ishlatiladigan DiI usuli, solishtirish mumkin bo'lgan natijalarni berdi. Ikkala etiketli usulni ishlab chiqdik, chunki Golgi binoni immunohistokimyo bilan mos kelmaydi. Immunostinatsiya odatda yuvish vositalar bilan to'qimalarni o'tkazuvchanlikni talab qiladi, bu odatda lipofil rangini membranadan chiqarib yuboradigan jarayondir (38). Biroq bizning hozirgi tadkikotlarimizda GFP immun tizimini yaratish jarayoni to'qimalarning o'tkazuvchanligi uchun deterjanning yuqori konsentratsiyasini talab qilmasdan, lipofil rangli bo'yoq etiketkasi bilan birgalikda ishlatilishi mumkin edi. Er-xotin etiketli usuli odatda dendritik uzuklarda tizimli o'zgarishlarni o'rganish uchun foydali bo'lishi kerak, masalan, GFP korteksdagi neyronlarning aniq populyatsiyalarida ifodalangan BAC transgenik sichqoncha bosqichlarini tahlil qilish uchun foydalanilganda36).

Garchi biroz bahsli bo'lsa-da, D1 va D2 retseptorlari asosan anatomik ravishda (striatiragral) va bilvosita (striatopallidal) striatal proektsion neyronlarga ajratilgan deb hisoblanadi (17, 41). Drd1-EGFP va Drd2-EGFP sichqonlarida GFPni lokalizatsiyalashning dastlabki tavsifi ushbu xulosaga (36). Bundan tashqari, Drcc1-EGFP va Drd2-EGFP sichqonlaridan NAccdagi GFP-pozitiv neyronlar sonini tahlil qilish, ≈50% MSNning faqat D1 retseptorlarini ifodalagan degan xulosaga mos keladi, ya'ni ≈35-40% faqat D2 retseptorlari, va ≈10-15% ham D1 va D2 retseptorlari bilan birga ishlaydi. Bu umumiylik qiymati mRNAlarni ajratish va kuchaytirish uchun RT-PCR texnikasi bilan bir striatal neyronlarning yamoq-qisqich tahlilini birlashtiradigan dorsal striatumning ishlariga o'xshaydi (≈17% Enkefalin va P moddasi bilan birga namoyon bo'lishi) (42). Shuni ta'kidlash kerakki, bizning hozirgi tadkikotlar D3, D4 va D5 retseptorlari ifodasi masalasini hal etmaydi va ular MSNda D1 retseptorlari yuqori darajalari ifoda etgan past darajadagi D2 retseptorlari masalasini hal qilishmaydi yoki aksincha.

Ko'pgina avvalgi tadqiqotlar psevdostimulyatsiyaga asoslangan Fos ifodasi va D1 va D2 retseptorlari rolini neyronal lokalizatsiya bilan43-45). Ushbu tadqiqotlar Fos va DFOSB induksiyasini D1 retseptorlarining aktivlashtirilishi orqali amalga oshirilganligi haqidagi xulosani qo'llab-quvvatladi. Shu bilan birga, Fos ifodasi hujayrali lokalizatsiyasiga psixostimulyator dorilar qo'llaniladigan ekologik kontekst ta'sir qiladi (46, 47). Masalan, uy qafasida berilgan amfetamin yoki kokain D1 retseptorlarini bir-biriga bog'laydigan modda P-musbat hujayralarida afzalroq ravishda erta genlarni (Fos) o'z ichiga oladi. Buning aksincha, ushbu dorilar DOSNUMX va D1 retseptorlari tarkibidagi MSN-larda Fos ifodasini yangi muhitda qo'llanganda indamasligi mumkin. Joriy tadḱiḱotlarimizda foydalaniladigan protokolga yangi atrof-muhitga ta'sir ḱilish bilan juft ḱo'rsatishni kiritmagan. Biroq, biz D2 retseptorlari mavjud bo'lgan MSNlarda DFOSB ifodasini bajarish uchun javobgar bo'lgan kontekstga bog'liq bo'lgan bir qator stressni bekor qila olmaymiz.

Ushbu natijalarning muhim xususiyati ortikcha orqa miya zichligi va DFB ekspresyonunun parallel namunasi edi. Ortiqcha orqa miya zichligi va DFOSB ifodasi boshida Drs1-EGFP va Drd2-EGFP ifodalaydigan MSNlarda sodir bo'lgan. Biroq, bu o'zgarishlar faqat D1 retseptorlari o'z ichiga olgan nöronlarda barqaror edi. D2 retseptorlari o'z ichiga olgan neyronlarda ortikcha orqa miya zichligi va DFosB ifodasi vaqtinchalik topilganligini kuzatish uchun mumkin bo'lgan tushuntirishlar, bu D1 va D2 dopamin retseptorlarini birgalikda ishlatadigan MSNsning kichik qismida sodir bo'lishidir. Shunday qilib, bu ortishning o'tkinchi tabiati D2 retseptorlari faollashuvining D1ga bog'liq signalizatsiya yo'llari ustida antagonistik ta'sirlari bilan bog'liq bo'lishi mumkin (48). Shunisi qiziqki, orqa miya zichligi va DFosB ekspressionlari o'zgarishi mumkin, bu D2 retseptorlari bog'liq signalizatsiya yo'llarining DFBning barqarorligiga ta'sir ko'rsatish qobiliyatini aks ettirishi mumkin.

DFOSB va o'murtqa zichligi ekspresyonidagi parallel o'zgarishlarning mavjudligini kuzatish DFOSB ning NAX ning D1 retseptorlari o'z ichiga olgan neyronlaridagi dastlabki hosil bo'lishida va keyinchalik dendritik uzumlarni ta'mirlash bilan shug'ullanish fikriga mos keladi. DFOSB ning ifodasi MSNlardagi D1 / DARPP-32 / PP1ga bog'liq signalizatsiya yo'li bilan boshqariladi (49). Ko'pgina tadqiqotlar DFOSning psostostimulyatorlarni samarali va samarali harakatga keltiruvchi harakatlarida muhim rol o'ynaganligini ko'rsatdi (39), ehtimol, neyrotransmiter retseptorlari, signalizatsiya oqsillari va neyronal morfologiyani tartibga soluvchi oqsillarni o'z ichiga olgan bir nechta genlarni ifodalashga ta'sir qilish orqali50). Biroq, surunkali giyohga bog'liq omurgada hosil bo'lgan muayyan molekulyar mexanizmlar hali ma'lum emas. Bizning avvalgi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, Cdk5 inhibitori roscovitinning ichakdagi infuziyasi o'murtqa zichligi51). Bundan tashqari, Cdk5 DFOSB uchun pastga yo'naltirilgan bir maqsad gendir va surunkali giyoh davolash bilan bog'liq kompensatsiyaga uchragan adaptiv o'zgarishlar52). Shuning uchun Cdk5-ga bog'liq bo'lgan fosforillanishning o'zgarishi kokain bilan indikatsiyalangan orqa moyilligi va / yoki umurtqa barqarorligi asosida asoslangan mexanizm hisoblanadi. PAK (53), b-katenin (54), PSD-95 (55) va spinofilin (56) Cdk5 uchun substrat bo'lib, barcha omurilik morfogenezini (57-60). Ushbu va boshqa Cdk5 substratlarini spinalarda yanada aniqlashtirish, umid bilan, umurtqali psixostimulyatorlarning ommaviy shakllanishi bilan bog'liq mexanizmlarni yoritib beradi.

usullari

Hayvonlar.

D1 yoki D2 dopamin retseptorlari nazorati ostida EGFP transgenini olib boruvchi sichqon Gensat BAC transgenli loyihasi (36). Ushbu tadqiqotda ishlatilgan transgenik sichqon 4-5 haftalik va Shveysariya-Webster fonida bo'lgan. Sichqoncha 12: 12-h nurli / quyuq aylanish jarayonida saqlanib, oziq-ovqat va suv bilan ta'minlangan 2-5 guruhlarida joylashgan. Barcha hayvon protokollari laboratoriya hayvonlarini saqlash va ulardan foydalanish bo'yicha Milliy Sog'liqni saqlash qo'llanma institutiga muvofiq bo'lgan va Rokfeller Universiteti Institutional hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish bo'yicha qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan.

Giyohvand moddalarni davolash.

Kronik surunkali giyohni davolash (30 mg / kg) kundalik nikotinaning yadrosida ham, NaCKning qobig'ida ham MSNning orqa miya zichligida kuchli o'sishiga olib keldi, ammo past dozada (15 mg / kg) faqatgina o'murtqa zichligi ortdi qobiq (61). Shuning uchun NAcc ning har ikkala qismida tizimli modifikatsiyani induktsiyalash uchun yuqori dozada kokain ishlatilgan. Sichqoncha har kuni 30 kun davomida 5 mg / kg kokain-HCl (yoki sho'r) bilan bir marta in'ektsiya (ip) oldi, keyin 2 qarshi kuni o'tkazildi va bu tartib 4 ketma-ket hafta uchun takrorlandi. Injillar uy qafasida o'tkazildi. 2WD yoki 30WD, sichqonchani miyalari DII markalash va / yoki immunohistokimya uchun qayta ishlangan.

Flüoresan Bo'yoq Di bilan Balistik Etiketleme.

Sichqoncha 80 mg / kg natriy pentobarbital bilan behushlik bilan o'tdi va 5 ml PBS bilan transkardial perfuziyalangan, keyin PBS (40 ml / min) ichida 4 ml 20% paraformaldehid bilan tez perfuziya. Brayinlar tezda bosh suyagidan olib tashlandi va 4 daqiqada paraformaldehiddan so'ng 10 daqiqa davomida yuborildi. Brain chiziqlari (100 μm) ref shaklida tavsiflangan lyuminestsent bo'yoq diI (Molecular Probes) ni ballistik etkazib berish bilan belgilandi. 38. Aralashtirilgan DiI markalash-immunohistokimyoviy usul past detarjen kontsentratsiyasi bilan ishlab chiqilgan. DiI-etiketli bo'limlar 0.01% 100% Triton X-15 bilan 0.01 min uchun permeabilizatsiya qilindi va 100% Triton X-10 va 1% 1% normal echki sarumlari PBS ichida 0.01 h uchun maxsus bo'lmagan belgilarni kamaytirish uchun inkübe qilindi. Keyinchalik to'qimalar bo'limlari xona haroratida 100 h uchun 2% oddiy echki sarum / 1% Triton X-1,000 va anti-GFP antikorlari (Abcam, Kembrij, Ma) bilan inkübe qilindi, yuvilgan va XNUMX: XNUMX dilimida FITC- konjuge ikkinchi antikor (Molecular Probes). Bo'limlar mikroskop slaydlarida joylashtirildi va montaj vositasi bilan qoplandi. Balistik etiketlash usullari dendritik orqa miya tuzilishini batafsil tahlil qilishga imkon berdi va olingan natijalar sifatli va miqdor jihatidan oldingi tadkikotlar bilan taqqoslaganda, rat miya bo'laklarida Golgi-Coxni emdirish usuli (34). Ammo, avvalgi tadqiqotlarimizdan farqli o'laroq, biz Di-bo'yli neyronlarda ikki boshli o'roqlarni kamdan kam kuzatdik. Ushbu farq, binoni usullari yoki sichqon (bu ish) va farelere nisbatan o'zgaruvchanligi34).

Immunohistokimyo.

Hayvonlar yuqorida aytib o'tilganidek, behushlik va perfüze qilindi. Meynalar 4% paraformaldehidda xNUMX ° C darajasida olib tashlandi va kechasi davomida saqlandi. Bronlar, kriyoprotektsiya uchun PBS eritmasida 4% sukrozaga o'tkazildi. Qorin bo'shlig'i qismlari (30 mmm) muzlatuvchi mikrotom (Leika) ustida kesilgan va keyin immunohistokimyoviy moddalar uchun qayta ishlangan. Keyinchalik, 12% Triton X-0.3 da 100 min uchun PBSda miya qismlari o'tkazildi va PBSda ikki marta yuvildi. 15 sutkada 10 sutkalik echki sarumida 1 sutkada 37 ° C darajasida, 1 ° C da birlamchi antikorlarga (PBS ichida 4% normal echki sarlavhasi bilan seyreltildi) ta'siri ostiga olingan, keyin PBS bilan yuvilgan va o'rta 1 ° da 37 ° C da antikorlar. Quyidagi antikorlar qo'llanildi: quyon antivan-pan-FosB (SC-48, 1: 500, Santa Cruz biotexnologiyasi), sichqonchani qarshi NeuN (Chemicon), quyon anti-GFP, FITC-konjugatsiyalangan piyodalarga qarshi quyon IgG va rodonin- konjuge anti-sichqonchani IgG (Molecular Probes). Uch belgilar (DFOSB, NeuN va GFP) uchun miya qismlari anti-pan FosB antikoru va anti-NeuN antikorlari bilan birinchi marta immunostained qilindi va keyin ikkinchi darajali antikorlar (rhodamin konjugatsiyalangan piyodalarga qarshi quyon IgG va cyan-konjuge anti-mouse IgG ). Zenon etiketleme texnologiyasi (Zenon Alexa Fluor 488, Molecular Probes) yordamida GFP immun tizimini yaratish uchun ikkita koplangan miya qismlari ham qayta ishlandi. Anti-pan-FosB antikoru FosB ning N-terminasiga ko'tarildi va DF va F-B uzunligini aniqladi62). Surunkali giyohni davolashdan keyin FOSB yoki Fosb yoki boshqa Fos bilan bog'liq antijenlerning barqaror ravishda ifodalanmaganligini ko'rsatadigan avvalgi tadqiqotlar asosida, immunoreaktivlikdagi uzoq muddatli o'sish DFBning barqaror ifodasini ko'rsatadi. Biroq, sho'rlangan davolangan sichqonlarda kuzatilgan immunoreaktiv FosB signalining kimligi noma'lum. Statistik tahlil 1 stol Talabalar tomonidan foydalanilgan t sinov.

Dendritik o'pka analizi.

NAccdagi alohida MSNlar bir nechta mezonlarga asoslanib umurtqali tahlil qilish uchun tanlangan. (i) Turli hujayralardagi jarayonlar aralashmasligi uchun boshqa etiketlenmiş xujayralar bilan minimal yoki hech qanday qoplama yo'q edi. (ii) Kamera uchta asosiy dendrita hujayralarni tahlil qilish uchun ishlatilishi mumkin bo'lishi kerak edi. (iii) Distal dendritlar (terminal dendritlar yoki terminal dendritga yaqin) tekshirildi. NAcc yadrosi va qobig'idagi ikkala MSN dan dendritlar tahlil qilindi. Biz siyrak o'ralgan MSNlarni (tikanli II tip) kuzatgan bo'lsak-da, faqat zich o'ralgan MSNlarni (tikanli I tip) tahlil qildik. Orqa miya zichligini hisoblash uchun dendritning uzunligi (> 20 mkm uzunlikdagi) konfokal mikroskop (Zeiss LSM 510) yordamida moyga botiriladigan ob'ektiv (× 40) yordamida aniqlandi. Dendritlarning barcha tasvirlari boshqacha olingan z (0.5-1 mm chuqurlik oralig'ida) dendritik qirralarning morfologiyasini o'rganish. Barcha o'lchovlar metamorf tasvirni tahlil qilish dasturi (Universal Imaging, Downingtown, PA) bilan amalga oshirildi. Statistik tahlil Kolmogorov-Smirnov testidan foydalangan.

Dendritsiyadan olingan protrusionlar refleksda ta'rif etilganidek, ularning uzunligiga qarab to'rt turga bo'linadi. 63 va 64. 1-sinf o'simtalari, shuningdek, dag'al o'simtalar deb ham ataladi, uzunligi <0.5 mkm, umurtqa pog'onasi katta bo'lmagan va bo'yniga o'xshamagan; 2-sinf yoki qo'ziqorin shaklidagi tikanlar, uzunligi 0.5 dan 1.25 mm gacha bo'lgan va qisqa bo'yin va katta umurtqa pog'onasi bilan ajralib turardi; 3-sinf yoki ingichka tikanlar, 1.25 dan 3.0 mkm gacha bo'lgan va boshlari uzun bo'yli bo'yinlari cho'zilgan; 4-sinf yoki filopodial kengaytmalar umurtqa pog'onasi sezilmaydigan uzun filamentli o'simtalar edi.

rahmat

Ushbu ish Amerika Qo'shma Shtatlari Jamoat salomatligi Xizmati Grant DA10044 (PG va ACN uchun) va Simons fondi, Piter J. Sharp fondi, Picower fondi va FM Kirby fondi tomonidan qo'llab-quvvatlandi.

Qisqartmalar

  • NAcc
  • yadroli akumbenslar
  • MSN
  • o'rta bo'g'inli neyron
  • BAC
  • bakterial sun'iy xromosomalar
  • Drd1
  • DPAMIN retseptorlari D1 promoter bilan boshqariladi
  • Drd2
  • DPAMIN retseptorlari D2 promoter bilan boshqariladi
  • DiI
  • 1,1'-diotadesil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindokarbosiyanin perklorat
  • 2WD
  • Oxirgi narkologik davolanishdan so'ng 2 kun
  • 30WD
  • Oxirgi narkologik davolanishdan so'ng 30 kun.

Izohlar

 

Foiz hisoboti to'qnashuvi: nizolar e'lon qilinmadi.

Manbalar

1. Totterdell shahri Rabva mahallasi, Smit ADJ Chem. Neyroanat. 1989; 2: 285-298. [PubMed]
2. Smit Y., Bevan MD, Shink E., Bolam JP Neuroscience. 1998; 86: 353-387. [PubMed]
3. Heikkila RE, Orlansky H., Cohen G. Biochem. Farmakol. 1975; 24: 847-852. [PubMed]
4. Ritz MC, Lamb RJ, Goldberg SR, Kuhar MJ Ilmiy. 1987; 237: 1219-1223. [PubMed]
5. Nestler EJ Trends Pharmacol. Sci. 2004; 25: 210-218. [PubMed]
6. Kalivas PW, Styuart J. Brain Res. Rev. 1991; 16: 223-244. [PubMed]
7. Pirs RC, Kalivas PW Brain Res. Rev. 1997; 25: 192-216. [PubMed]
8. Robinson TE, Berridge KC Annu. Rev. Psychol. 2003; 54: 25-53. [PubMed]
9. Wolf ME, Xansa MR Brain Res. 1991; 562: 164-168. [PubMed]
10. Vanderschuren LJ, Kalivas PW Psixofarmakologiya. 2000; 151: 99-120. [PubMed]
11. Sesack SR, Pickel VMJ Komp. Neurol. 1992; 320: 145-160. [PubMed]
12. Smit AD, Bolam JP Trends Neurosci. 1990; 13: 259-265. [PubMed]
13. Sibley DR, Monsma FJ, Jr. Trends Pharmacol. Sci. 1992; 13: 61-69. [PubMed]
14. Beckstead RM, Cruz CJ neuroscience. 1986; 19: 147-158. [PubMed]
16. Gerfen CR, Young WS, III Brain Res. 1988; 460: 161-167. [PubMed]
16. Gerfen CR Trends Neurosci. 2000; 23: S64-S70. [PubMed]
17. Gerfen CR, Engber TM, Mahan LC, Susel Z., Chase TN, Monsma FJ, Jr., Sibley doktor. 1990; 250: 1429-1432. [PubMed]
18. Zahm DS Neurosci. Biobehav. Rev. 2000; 24: 85-105. [PubMed]
19. Lu X.Y., Ghasemzadeh MB, Kalivas PW Neuroscience. 1998; 82: 767-780. [PubMed]
20. Koob GF, Le ht, Creese I. Neurosci. Lett. 1987; 79: 315-320. [PubMed]
21. Woolverton WL, Virus RM Pharmacol. Biochem. Behav. 1989; 32: 691-697. [PubMed]
22. Bergman J., Kamien JB, Spealman RD Behav. Farmakol. 1990; 1: 355-363. [PubMed]
23. Epping-Jordan MP, Marko A., Koob GF Brain Res. 1998; 784: 105-115. [PubMed]
24. Caine SB, Najuz SS, Mello NK, Bergman JJ Pharmacol. Exp. Ther. 1999; 291: 353-360. [PubMed]
25. De Vries TJ, Cools AR, Shippenberg TS NeuroReport. 1998; 9: 1763-1768. [PubMed]
26. Self DW, Barnhart WJ, Lehman DA, Nestler EJ Fanlar. 1996; 271: 1586-1589. [PubMed]
27. Xroyan TV, Barrett-Larimor RL, Rowlett JK, Spealman RDJ Pharmacol. Exp. Ther. 2000; 294: 680-687. [PubMed]
28. Alleweireldt AT, Weber SM, Kirschner KF, Bullock BL, Neisewander JL Psixofarmakologiya. 2002; 159: 284-293. [PubMed]
29. Nestler EJ Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 119-128. [PubMed]
30. Robinson TE, Kolb B. Neuropharmacology. 2004; 47: 33-46. [PubMed]
31. Kalivas PW Curr. Opin. Farmakol. 2004; 4: 23-29. [PubMed]
32. Hyman Yil, Malenka RC Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 695-703. [PubMed]
33. Robinson TE, Kolb BJ Neurosci. 1997; 17: 8491-8497. [PubMed]
34. Robinson TE, Kolb B. Eur. J. Neurosci. 1999; 11: 1598-1604. [PubMed]
35. Li Y., Kolb B., Robinson TE Nöropsikofarmakologiya. 2003; 28: 1082-1085. [PubMed]
36. Gong S., Zheng S, Doughty ML, Losos K., Didkovsky N., Schambra UB, Novak NJ, Joyner A., ​​Leblanc G., Hatten ME va boshq. Tabiat. 2003; 425: 917-925. [PubMed]
37. Jou FM, Wilson CJ, Dani JAJ Neurobiol. 2002; 53: 590-605. [PubMed]
38. Grutzendler J., Tsai J., Gan WB usullari. 2003; 30: 79-85. [PubMed]
39. Kelz MB, Chen J., Carlezon VV, Jr., Whisler K., Gilden L., Beckmann AM, Steffen S, Chjan YJ, Marotti L., Self DW va boshq. Tabiat. 1999; 401: 272-276. [PubMed]
40. Nestler EJ neurofarmakologiya. 2004; 47: 24-32. [PubMed]
41. Le Moin S, Bloch BJ Komp. Neurol. 1995; 355: 418-426. [PubMed]
42. Surmeier DJ, Song WJ, Yan ZJ Neurosci. 1996; 16: 6579-6591. [PubMed]
43. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M., Nestler EJJ Pharmacol. Exp. Ther. 1995; 275: 1671-1680. [PubMed]
44. Gerfen CR, Keefe KA, Gauda EBJ Neurosci. 1995; 15: 8167-8176. [PubMed]
45. Moratalla R., Elibol B., Vallejo M., Graybiel AM Neuron. 1996; 17: 147-156. [PubMed]
46. Badiani A., Oates MM, Day HE, Watson SJ, Akil H., Robinson Te Behav. Miya. Res. 1999; 103: 203-209. [PubMed]
47. Uslaner J., Badiani A., Norton CS, Day HE, Watson SJ, Akil H., Robinson TE Eur. J. Neurosci. 2001; 13: 1977-1983. [PubMed]
48. Huff RM, Chio CL, Lajiness ME, Goodman LV Adv. Farmakol. 1998; 42: 454-457. [PubMed]
49. Zachariou V., Sgambato-Faure V., Sasaki T., Svenningsson P., Berton O., Fienberg AA, Nairn AC, Greengard P., Nestler EJ Neuropsychopharmacology. 2005 Yanvar 3; 10.1038 / sj.npp.1300832.
50. McClung CA, Nestler EJ Nat. Neurosci. 2003; 6: 1208-1215. [PubMed]
51. Norrgum SD, Bibb JA, Nestler EJ, Ouimet CC, Teylor JR, Greengard P. Neuroscience. 2003; 116: 19-22. [PubMed]
52. Bibb JA, Chen J., Teylor JR, Svenningsson P., Nishi A., Snyder GL, Yan Z., Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC va boshq. Tabiat. 2001; 410: 376-380. [PubMed]
53. Nikolich M., Chou MM, Lu W., Mayer BJ, Tsai LH Tabiat. 1998; 395: 194-198. [PubMed]
54. Kesavapany S., Lau KF, McLoughlin DM, Brownlees J., Ackerley shahri Rabva mahallasi, Ley PN, Shaw Idoralar, Miller CC Eur. J. Neurosci. 2001; 13: 241-247. [PubMed]
55. Morabito Ma, Sheng M., Tsai LHJ Neurosci. 2004; 24: 865-876. [PubMed]
56. Futter M., Uematsu K., Bullock SA, Kim Y., Hemmings HC, Jr., Nishi A., Greengard P., Nairn AC Proc. Natl. Akad. Sci. AQSH. 2005; 102: 3489-3494. [PMC bepul maqola] [PubMed]
57. Hayashi ML, Choy SY, Rao BS, Jung HY, Li HK, Chjan D., Chattarji S., Kirkwood A., Tonegawa S. Neuron. 2004; 42: 773-787. [PubMed]
58. Murase S., Mosser E., Schuman EM Neuron. 2002; 35: 91-105. [PubMed]
59. Prange O., Murphy THJ Neurosci. 2001; 21: 9325-9333. [PubMed]
60. Feng J., Yan Z., Ferreira A., Tomizawa K., Liauw JA, Zhuo M., Allen PB, Ouimet CC, Greengard P. Proc. Natl. Akad. Sci. AQSH. 2000; 97: 9287-9292. [PMC bepul maqola] [PubMed]
61. Li Y., Acerbo MJ, Robinson da Eur. J. Neurosci. 2004; 20: 1647-1654. [PubMed]
62. Perrotti LI, Bolanos CA, Choi KH, Russo SJ, Edvards S., Ulery PG, Wallace DL, Self DW, Nestler EJ, Barrot M. Eur. J. Neurosci. 2005; 21: 2817-2824. [PubMed]
63. Xarris KM, Jensen FE, Tsao BJ Neurosci. 1992; 12: 2685-2705. [PubMed]
64. Vanderklish PW, Edelman GM Proc. Natl. Akad. Sci. AQSH. 2002; 99: 1639-1644. [PMC bepul maqola] [PubMed]