PLoS One. 2010; 5(10): e15401.
mavhum
Chizma tugallangach, qisman takliflar bilan boshlangan to'liq xotiralarni olish qobiliyati xotira jarayonining muhim xususiyati hisoblanadi. Ammo, bu jarayonning negizida joylashgan molekulyar va hujayrali mexanizmlar haqida juda kam narsa ma'lum. Dopaminni yodga olishda rolini o'rganish uchun dopamin transporterini heterozigotli nokaut sichqonlarini (DAT+/-) ni aniqladilarki, ushbu sichqonlar odatiy o'rganish, konsolidatsiya va to'liq xotirali sharoitda xotirani qayta tiklash qobiliyatiga ega bo'lsalar-da, qisman kiyinish sharoitida naqshni to'ldirishda aniq kamchiliklarga ega. Dopamin tashuvchisi heterozigotli nokaut sichqonlaridagi xotira etishmasligining ushbu shakli dopamin antagonisti haloperidolning past dozasi bilan tiklanishi mumkin, bu esa xotira namunalarini olishning imkoni bo'lmaganligi dopamin muvozanatining natijasi ekanligini tasdiqlaydi. Shunday qilib, bizning natijalarimiz miyaning dofamin darajasini aniq nazorat qilish assotsiativ xotirani tiklash paytida naqshni to'ldirishda muhim ahamiyatga ega ekanligini ko'rsatdi.
Kirish
Xotirani eslab qolish oldindan olingan ma'lumotni qayta takrorlashni o'z ichiga oladi [1], [2]. Qayta eslash holatiga qarab, xotira olish avval o'rganilgan (masalan, odamni ko'rish va uning ovozini bir vaqtning o'zida eshitish yoki o'z shahrini qayta ko'rib chiqish bilan bog'liq ko'p narsalarni o'zgartirmagan) bilan bog'liq bo'lgan barcha yoki barcha muammolar bilan sodir bo'lishi mumkin. Boshqa tomondan, aksariyat hollarda, xotirani tiklash odatda boshlang'ich ko'rinishlarning kichik qismi mavjud bo'lganda amalga oshiriladi (masalan, ona shahrining eski ko'chalari xaritalarini faqat bir nechta eski joylar o'zgarishsiz qolganida tiklash). Bu miya qayta tiklanadigan va butun xotira naqshlarini qisman tashqi ta'sirlardan yoki o'z-o'zidan boshlangan ichki jarayonlardan chiqaradigan naqshni yakunlash deb nomlanadi. Hozirgi vaqtda xotirani tiklash rejimini yaratishga asoslangan haqiqiy molekulyar va hujayrali mexanizmlar to'g'risida deyarli hech narsa ma'lum emas. Biroq, yangi tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, monoamin signallari xotira olishda rol o'ynashi mumkin [3].
Ushbu, modülatör nörotransmitter dopaminin, qisman replikatsiya chaqiruv paytida xotira naqshini bajarilishini tartibga solishda qanday rol o'ynashini o'rganib chiqdik. Dopamin - bu ongga, hissiyotga va harakatga ta'sir qilishi mumkin bo'lgan asosiy neyrotransmitter. G'ayritabiiy dopaminergik yuqtirish bir qator psixiatrik va nevrologik kasalliklarda, shu jumladan diqqat etishmasligi va giperaktivlik (ADHD), Shizofreniya va Parkinson kasalliklarida ta'sir ko'rsatdi. [4]-[8]. Dopaminerjik neyronlar nafaqat ventral tegmental hududdan va asosan nigrada kompaktalardan kelib chiqqan bo'lsada, ularning natijalari miyadagi deyarli hamma joylarda, shu jumladan prefrontal korteks, medial temporal lob va hippokampus, shu jumladan, xotira retrieval [3], [9]-[14].
Shuni ta'kidlash kerakki, dopaminni yuqorida miya mintaqalari vositasida ishlaydigan diqqat va ish xotirasi uchun funktsional jihatdan o'ta muhim deb hisoblash mumkin [15]-[18], ikkalasi ham qisman moslama shartlari ostida xotira olish jarayonida nazarda tutilgan [19]. Dopamin signalizatsiyasini to'xtatish uchun asosiy hujayra mexanizmi sifatida, neyronal presinaptik terminali joylashgan dopamin transporter (DAT) sinoptik yaraning dopaminini dopaminerjik neyronlarga qaytaradi. Shunday qilib DAT sinoptik dopamin darajasini tartibga soluvchi muhim bir molekuladir va natijada mahalliy neyron davrlarda dopamin harakatlarining vaqtinchalik davomiyligini belgilaydi. Darhaqiqat, dopamin transporter genining genetik naqllari chuqur tanqisliklarga olib keladi. Homozigot DAT-KO sichqonlari rivojlanish susayishi, kuchli lokomotor giperaktivlik va boshqa ko'plab nuqsonlar, shu jumladan, odatiy va ijtimoiy ta'sirlarda kamchiliklar, shuningdek, ichakning harakatchanligi, nafas olishni nazorat qilish va hokazo. [6], [20], [21]. Homozigot DAT-KO sichqonlarining umumiy kamchiliklari xotira jarayonlarini tartibga solishda dopaminning rolini tekshirish uchun kamroq qulaylik yaratdi.
Qizig'i shundaki, heterozigot nekroz sichqonlari (DAT+/- sichqonchani) ishlab funktsional DAT geni alleliga ega bo'lsa ham, ularning umumiy umumiy xatti-harakatlarida odatiy ko'rinadi [6], [20], [21]. Shunday qilib, DAT+/- sichqonlarga assotsiativ xotira jarayonlari va dopaminerjik devirli mexanizmlar kabi nozik, ammo muhim fenotiplarni o'rganish uchun qimmatli modelni taqdim etishi mumkin. Bu erda biz dopamin muvozanatining funktsional natijalarini assotsiativ xotirani eslash vaqtida naqsh ishlari tugashiga baholash uchun bir qator qiziqishlarga asoslangan paradigmalardan foydalanganmiz.
natijalar
Dopaminning xotirani olishda rolini o'rganish uchun heterozigotli dopamin transporterini nokaut sichqonlaridan (DAT+/-). Biz ochiq maydonda lokomotor harakatlarni baholash uchun asosiy xatti-o'lchovlar akkumulyatoridan foydalanganmiz (Shakl 1A), rotarod chiqishlari (Shakl 1B va 1C) va bu heterozigot nekroz sichqonlari butunlay normal ekanligini aniqladi. Biz DATni ham tasdiqladik+/- sichqonchalar yuqori plyus labirinti bilan o'lchanadigan tashvish darajasida aniqlanmaganShakl 1D).
Bundan tashqari, DAT da asosiy o'rganish va xotira funktsiyalarini baholadik+/- sichqonlar. Birinchidan, biz ob'ektni aniqlash bo'yicha yangi testdan foydalanganmiz va bu sichqonlarning 1 kunlik saqlash testlarida normal yuqumli harakatlar ko'rsatganini kuzatdik.Shakl 1E). Bundan tashqari, bu sichqonchalar 1-kunlik qorin bo'shlig'idagi qo'zg'atuvchi sichqonlarga ajralib turadigan xavfli holatni saqlab qolishadiShakl 1F). Shuning uchun, bu natijalar DAT+/- sichqonlarning asosiy xotira testlarining bu ikki shaklida normal o'rganish va xotira funktsiyasi mavjud.
Xotirani qayta chaqirishning naqshli bajarilishini baholash uchun masofaviy ma'lumot xotirasi testi avvaldan ishlatilgan. Biz DATni bo'yniga oldik+/- sichqonchani va yovvoyi turdagi tekshiruvlarni bajarish. Oldindan tavsiflangan kengaytirilgan mos yozuvlar xotira protokolini ishlatish [22], biz bu sichqonchani yashirin platformadagi suv labirintasiga o'rgandik. Trening mashg'ulotlar orasida bir soatlik interval bilan kuniga to'rtta sinovdan iborat edi. Biz DATni ham topdik+/- sichqonchani va yovvoyi turdagi sichqonchani 10 kunlik mashg'ulotlar davomida va shunga o'xshash suzish tezligiShakl 2A va 2B).
Keyinchalik, so'nggi mashg'ulotlar tashkil etilganidan bir kun o'tib, 1 kunida prob sinovini (P11) foydalanib, maxfiy platformadagi joylashuvi haqidagi xotiralarini ko'rib chiqdik. Kvadrantlarning bo'sh joylari bilan o'lchangan DAT ham+/- sichqonchani va ularning nazoratidagi littermateslar o'zlarining qidirishni maqsadli kadranda to'liq so'rovlar bilanShakl 3A). Bundan tashqari, DAT+/- sichqonlar, shuningdek, xayoliy platforma maydonida katta ustunlikni namoyish etdilar va boshqaruv elementlarining platformasi bilan solishtirganda hech qanday farq yo'q edi (Shakl 3B). Bundan tashqari, kutilganidek, DAT ham+/- sichqonchani va yovvoyi tipdagi littermatelar o'tish joylariningShakl 3C). Shunday qilib, ushbu o'lchovlarning barchasi DAT ni ko'rsatadi+/- sichqon bu vazifani an'anaviy ravishda o'rganishi va odatdagidek to'la-to'kis shartlar ostida bu biriktiruvchi xotirani olishlari mumkin.
Dopaminning nozik muvozanatining qisman replikatsiya sharoitida naqsh bajarilishi uchun hal qiluvchi ahamiyatga ega ekanligini aniqlash uchun ertasi kuni ikkita prob tekshiruvini (P2) to'rtta distal uchburchaklardan (kun 12) olib tashlash yo'li bilan o'tkazdik. Avvalgi chaqiruv seansidan yuzaga keladigan har qanday yo'qolishning oldini olish uchun P4 prob tekshirilgandan so'ng, yana bir blok (1 sinovlar) 1 soat davomida yetkazildi. Ushbu qisman tekshiruv jarayonida tekshiruv sichqonlari qidirish vaqtini boshqa kvadrantlardan ko'ra maqsadli kvadrantga jamlashni davom ettirganda, DAT+/- sichqonchalar maqsadli kadrandan foydalanish darajasi bo'yichaShakl 3D). Bundan tashqari, hayoliy platformalar joylarini egallashni o'lchash ham bu DATni tasdiqladi+/- platformadagi joyni eslab qolish uchun sichqoncha buzilgan (Shakl 3E). Ushbu qidirish kamligi, shuningdek, platformalar o'tish joylari sonining ortishiShakl 3F), ammo yovvoyi turdagi zaharli moddalar to'liq qisman xotira chaqiruvini to'liq bajarishga qodir. Shuning uchun, bu ma'lumotlar DAT+/- Sichqoncha qisman moslama sharoitida masofaviy mos yozuvlar xotiralarini olishda kam.
Va nihoyat, biz ushbu DATda naqshni to'ldirishni qayta tiklash mumkinmi, deb so'radik+/- farmakologik metodlardan foydalangan sichqon. Dopamin antagonisti, haloperidolning past dozasi ma'lum dopamin buzilishlarini bartaraf etishda foydali bo'lishi mumkinligi ma'lum qilindi [20]. Mazmunga ko'ra, haloperidolning kam dozasi oddiy dopamin tashuvchisi genining bitta allelini yo'qotishi tufayli dopaminni qayta tiklashning etarli emasligi bilan yuqori dopaminning heterozigot sichqonlardagi ta'sirini biroz pasaytirishi mumkin. Biz qutqarish tajribasiga o'xshash sichqonchani to'plamini qo'lladik. Kunduzi 13 va 14 kunida yuqorida ko'rsatilgan sichqonchani uchinchi prob uskuna (P3) va to'liq probatsiya shartlari ostida va to'rtinchi prob uskuna (P4) qisman nusxadagi shartlar ostida o'tkazdik. Shunga qaramay, prob tekshiruvi vaqtida yuz berishi mumkin bo'lgan har qanday yo'qotishlarni bartaraf etish uchun, biz P4 yoki P1 prob usuli bajarilgandan so'ng 2 soatlik mashg'ulotning yana bir blokini (3 sinovlar) o'tkazdik. P3 prob tekshiruvi bo'yicha maqsadli kadrandan foydalanishni o'lchash bizning DATni ham ko'rsatadi+/- sichqonchani va nazorat qiladigan littermateslar maqsadli kadranda qidirishni to'liq belgilashda (Shakl 4A). Bundan tashqari, oddiy xotira qayta chaqiruvi platforma to'lishining o'lchovi bilan yana bir bor tasdiqlandi (Shakl 4B), shuningdek, platformalardagi o'tish joylarining soni (Shakl 4C). Shunday qilib, bu mutant sichqonchalar to'liq kontsentratsion sharoitlarda bo'shliq xotirasini to'liq olishga qodir.
14 kuni biz to'rtta distal uchburchakdan uchtasini olib tashladik va qisman nusxadagi vaziyat bo'yicha to'rtinchi prob uskuna (P4) o'tkazdik. DATni AOK qildik+/- past dozda haloperidol (tana vazniga 0.002 mg / kg) bilan retraktsion tekshiruvdan oldin 30 daqiqadan so'ng intraperitoneal yo'l bilan sichqon. Yirtqich tipli littermates sho'rlangan in'ektsiyani nazorat sifatida oldi. Biz DATni topdik+/- sichqonchalar maqsadli kvadrantda qidirish vaqtini jamladi va yovvoyi turdagi sheriklarga nisbatan statistik jihatdan o'xshash ko'rsatuvlarni ko'rsatdi (Shakl 4E). Bundan tashqari, hayoliy platformalar joylarini egallashni o'lchash ham bu DATning asosli ekanligini isbotladi+/- sichqonchani platformaning joyini eslashi mumkin (Shakl 4F). Ularning normal xotirasini qayta chaqirish, yovvoyi turdagi sichqonlarga o'xshash darajada bo'lgan platformalar o'tishlari sonining ortishi bilan yana tasdiqlandi (Shakl 4G). Shunday qilib, bu tajribalar DAT da namuna nihoyasiga yetishmasligi aniqlandi+/- sichqonlar dopamin muvozanati bilan bog'liq bo'lishi mumkin.
P4 prob probirkasida haloperidol bilan kiritilgan fenotipning natijalari takrorlangan prob probirkalarida o'ta olish natijasida yuzaga kelishi ehtimolini istisno qilish uchun boshqa DAT+/- va littermates nazorat qilish va barcha tajriba takrorladi. Kutilganidek, DAT ham+/- sichqonlar va ularning yovvoyi turdagi sichqonlari 10 kunlik mashg'ulotlar davomida yaxshi o'qitish stavkalarini namoyish etdi (Shakl 5A). Kunduzi 11da biz ushbu sichqonlarni to'liq replikatsiya chaqirish testlariga o'tkazdik, DAT o'rtasidagi xotirani saqlash test natijalari bo'yicha sezilarli farq yo'q+/- sichqonchani va kvadrant ishg'ol qilish bilan o'lchanadiganShakl 5B), maqsadli kadrandan foydalanish (Shakl 5C) va platformalar o'tish joylarining soni (Shakl 5D). To'liq nishonli prob tekshirilgandan so'ng bir soat o'tgach, biz bu sichqonlarni yo'q qilish ta'sirini oldini olish uchun yana bir mashq blok bilan qayta ishlab chiqdik. 12 kunida, bu sichqonchalar qisman replikatsiya chaqirish testlariga bo'ysindi. Tekshiruvlar uchun past dozada haloperidol (yoki sho'r suv) sichqonlarga intraperitonal ravishda 30 daqiqada yuborildi. Ushbu davolash mutatsiyaga uchragan sichqonlarning normal ishlashiga olib keldi. Mutant va nazorat sichqonlari, kvadrant to'lishingiz bilan solishtirishShakl 5E), maqsadli kadrandan foydalanish (Shakl 5F) va platformalar o'tish joylarining soni (Shakl 5G). Ularning suzish tezligining o'lchami ham hech qanday farqShakl 5H). Shuning uchun, bu ma'lumotlar DAT da saqlanayotgan qisman-nishona olish kamchiligini aniq ko'rsatdi+/- haloperidolning sichqonlari ko'plab problar jarayonida takroriy takrorlanish tufayli emas edi.
muhokama
Dopamin tizimi ko'plab bilim jarayonlarini tartibga solish uchun juda muhim ekanligi yaxshi ma'lum [8], [16]-[18], [23]-[25], bizning hozirgi ishda oddiy dopamin transporter genining bir allelini yo'qotishdan kelib chiqqan dopamin muvozanati birinchi marta assotsiativ bo'shliqni qayta chaqirish paytida naqsh bajarilishida aniq bir kamchilikka sabab bo'lgan. Ushbu xotira qayta chaqiruvi tanqisligi faqat qisman-bo'shliqqa moslashuv sharoitida aniq ko'rinadi, ammo to'liq ko'rsatgich shartlari ostida emas. Bundan tashqari, bu xotira qayta chaqiruv defitsiti o'ziga xos xotira kamchiligini aks ettiradi, chunki asosiy xatti-harakatlarning keng doiralari (ochiq-oydin lokomotiv, rotarod va xavotir) va kontekstual xavf-xarakteristikalar va yangi obyektni aniqlash kabi boshqa xotira shakllari odatiy holdir.
Dopaminning ushbu xotira jarayonining asosiy namunali molekulasi deb hisoblanadigan keng tarqalgan bo'shliqni qisqartirishga chaqirgan qayta chaqiriq defitsitiga birgalikda hissa qo'shishi mumkin bo'lgan bir necha potentsial molekulalar va hujayra stsenariylari mavjud. Buning sababi, birinchi navbatda, dopamin signallari, bo'shliqqa oid xotiralarni olish uchun juda muhimdir [15]-[18], [26]. Ma'lumki, faqatgina ventral tegmental hududidan kelib chiqqan va asosan nigrada kompaktalardan kelib chiqqan dopaminerjik neyronlar prefrontal korteks, medial temporal lob va hipokampus [5], [19], [27]-[28], ma'lum bo'lgan hududlar xotirani qidirish va faollashtirish jarayonlarida faollashadi [3], [9]-[14], [29], [30]. Dopamin e'tibor va ish xotirasi uchun juda muhim bo'lgan dalillarni hisobga olgan holda [15]-[18] va DAT genidagi genetik polimorfizmning DEHBga aloqador deb hisoblanadi [31]-[33], DAT vositasida boshqariladigan dopamin boshqaruvi yordamida qisman-shartli sharoitda xotira olishni namunaviy to'ldirishda diqqat va ishlaydigan xotira ham rol o'ynashi mumkin. Shunday qilib, DAT heterozigotli mutant sichqonlarida xotira naqshini to'ldirish etishmovchiligi sichqonchaning sinaptik dopamin buzilishi natijasida qisman kupaga asoslangan xotirani qayta tiklash paytida ortib borayotgan e'tibor talablarini qondira olmasligi bilan bog'liq bo'lishi mumkin.
Dopamin nomutanosibligi natijasida xotira qaytarilish etishmovchiligi yuzaga kelganligi, Parkinson bemorlarida kuzatilgan klinik demans nuqtai nazaridan ham qiziq. Bunday bemorlar odatda yangi xotirani o'rganish, konsolidatsiya qilish va saqlash qobiliyatini saqlab qolishganga o'xshaydi, ammo qisman tashqi niqob ostida yoki o'z-o'zidan eslab qolish sharoitida xotiralarni olishda juda zaiflashadi. [34], [35]. Bu ochiq-oydin nuqsonlar ochiq-oydin ko'rsatmalarni yo'qotganda ayniqsa chuqurroqdir [8], [23], [34]-[36], shu bilan qo'shimcha ravishda dopamin xotirani qayta tiklash jarayonida qatnashishi mumkinligini ko'rsatadi. Parkinson bemorlarida xotirani qayta tiklashdagi bunday kamchiliklar boshqa neyrotransmitter tizimlaridagi xotira etishmasligidan keskin farq qiladi. [37] yoki Altsgeymer kasalligi bilan og'rigan bemorlarning demansi odatda yangi xotiralarni o'rganish va birlashtirishda buziladi, eski xotiralarni esga olish qobiliyatini saqlab qoladi. [34], [35]. Bu xotira qurilmalari ichida turli molekulyar va vaqtinchalik jarayonlarga turli xil zaifliklar sababli turli terapevtik strategiyalarni ishlab chiqish zarurligini ko'rsatadi.
Qayta eslatish vaqtida haloperiodolni in'ektsiya qilish yo'li bilan naqshni yakunlashni butunlay qutqara oladigan namoyishimiz xotira olishda muvozanatli dopamin darajasining roli haqida fikrni kuchaytiradi. Ushbu iqtisodiyotni qutqarish tajribasi vaqtinchalik o'ziga xoslik uchun qo'shimcha dalillarni keltirib chiqaradi, bu qisman replikatsiya negiziga asoslangan qayta chaqiruv tanqisligiga sabab bo'ladi. Shuni ta'kidlash kerakki, DATda dopamin buzilishi+/- sichqonlar va Parkinsondagi bemorlar bir-birlaridan tubdan farq qiladi, ammo ikkalasi ham namunalarni olish etishmasligiga olib keladi. Ushbu umumiylik, dofamin tizimining nozik muvozanati xotirani tiklash uchun juda muhim, degan fikrni kollektiv qo'llab-quvvatlaydi va har ikki yo'nalishda (yuqoriga yoki pastga) nomutanosiblik eslash paytida xotira namunasini to'ldirishda nuqsonlarni keltirib chiqaradi. Muhimi, biz hozirgi tahlilimiz DAT mutant sichqonlarini Parkinson kasalligi modeli sifatida ishlatish uchun dalil sifatida talqin qilinmasligi kerakligini ta'kidlamoqchimiz. Boshqa tarafdan, ning Vivo jonli DAT homozigot nekroz sichqonlarida dopaminning o'lchovi portlashni stimulyatsiya qilish orqali tetiklenen dopamin salınımında muhim kamayish ko'rsatadi [38]-[40]. Bu shuni ko'rsatadiki, nokaut sichqonlarining miya turli hududlarida paydo bo'lgan nerv faolligini dopamin signallariga tarjima qilish qobiliyati etishmasligi mumkin. Dopamin nisbatining pasayishi xotirani qayta ishlash bilan shug'ullanadigan neyronlar doirasidagi otish shaklidagi o'zgargan fiziologik o'zgarishlarga olib kelishi mumkinligi tushunarli. Hozirgi vaqtda shunga o'xshash o'zgarishlar DAT heterozigotli nokaut sichqonlarida yoki Parkinson kasalligi bilan og'rigan bemorlarda ham sodir bo'ladimi, ma'lum emas.
Maydondagi bo'shliqni chaqirish vaqtida faollashtirilgan neyron davrlar haqida kam ma'lumotga ega bo'lishiga qaramasdan, u prefrontal korteks, medial temporal korteks va hipokampni o'z ichiga olgan bir nechta hududlarni chaqirishi mumkin. Bu ventral tegmental sohadan olingan dopaminerjik chiqindilarning ventral CA1 maydoniga va teshik korteksiga katta miqdorda loyihalashi haqidagi anatomik dalillarga mos keladi[13], [28]. Ushbu prefrontal-hippocampal-VTA loopi kontekstual tanishlar yaratish uchun juda muhim rol o'ynashi mumkin, bu esa, o'z navbatida, dopamin bilan regulyatsiya qilingan e'tiborni kuchaytirish orqali qisman replikatsiya asosidagi masofaviy xotirani qayta chaqirishda naqshli bajarilishni qo'llab-quvvatlaydi [3], [14], [26], [28]. Kelajakda olib borilgan tadkikotlar anatomik lokuslarni aniqlashda muhim ahamiyatga ega bo'ladi. Vivo jonzotlarni ro'yxatga olish metodlari bo'yicha farmakologik, genetik va keng ko'lamli usullardan foydalangan holda oldingi kingover korteks, temporal korteks va hipokampus kabi nomzodlarni o'rganish ayniqsa qiziqarli bo'ladi. [11], [41]-[44]. Mutatsiyalarning genetik kompensatsiyasi yoki mutanosib miyada sekin o'zgarishi kuzatilgan chaqiruv tanqisligiga o'z ta'sirini o'tkazishga yordam berishi mumkinmi? Bundan tashqari, boshqa neyrotransmiter tizimlarining ham xotira olishni boshqarishda tanqidiy ravishda ishtirok etishi mumkinligi haqida ko'rsatmalar mavjud [3], [37], [45], [46]va qisman belgilanadigan naqshli naqshni yakunlash va to'liq nishonga asoslangan xotira qurilmalari o'rtasidagi dinamik o'zaro ta'sirlarni o'rganish va solishtirish juda qiziqarli bo'ladi. Natijada, bizning ishimiz dopamin darajasida nozik bir muvozanat assotsiativ bo'shliqni qayta chaqirishda naqsh ishlari uchun juda muhimdir.
Materiallar va usullari
Axloqiy bayonotlar
Tadqiqotda ta'riflangan barcha hayvon ishlari NIH yo'riqnomalariga asosan amalga oshirilgan va Gruziya Tibbiyot kolleji Institutional IACUC qo'mitasi tomonidan ma'qullangan (Approval AUP raqami: BR07-11-001).
Mutant sichqonchalarini ishlab chiqarish va genotiplash
DAT sichqonlari Chikago universiteti doktor XiaoXi Zhuang laboratoriyasidan saxiy sovg'a bo'lgan. DAT heterozigot nekroz sichqonlarining naslga olinishi va genotiplanishi ta'rif etilganidek bir xildir [6]. Bizning eksperimentlarimiz uchun erkak va urg'ochi sichqon 1 nisbatida teng ravishda ishlatilgan![[nisbat]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif){kind=small}
1. DAT uchun PCR+/- sichqonchani ta'rif etilganidek protokol bilan ta'qib qilgan [6]. Barcha sichqonchani Gurjiston tibbiyot kolleji hayvonotxonasida standart sharoitda (23.1 ° C, 50.5% namlik) saqlab turishdi. Barcha tajribalar ovoz yalıtımlı va ixtisoslashgan bir xatti xonasida o'tkazildi. Barcha eksperimentchilar hayvonning genotipiga ko'r bo'lgan.
Yangi obyektni aniqlash vazifasi
Tajriba protokoli ilgari ta'riflanganidek bir xil edi [37], [47]. Qisqacha aytganda, sichqon 20 kun davomida alohida maydonda (20 × 10 × 3 yuqori dyuym) odatiy holga keltirildi. O'quv mashg'ulotlarida ochiq maydonda ikkita yangi narsalar joylashtirildi va hayvonga 15 daqiqada kashf etildi. Har bir obyektni o'rganish uchun sarf qilingan vaqt qayd etildi. Bir soatlik qayta ishlash sinovlari davomida hayvon yana bir xil qutiga joylashtirildi, unda mashq paytida taniqli narsalardan biri yangi ob'ekt bilan almashtirildi va 15 min uchun erkin o'rganishga ruxsat berdi. Ikkala moslamani o'rganish uchun sarflangan umumiy vaqt davomida ikkita ob'ektni (mashg'ulotni) o'rganish uchun sarflangan vaqtning nisbati va tanlangan xotirani o'lchash uchun afzallik indeksi ishlatilgan.
Ochiq maydon va yo'nalish-novda testlari
Protokollar ta'rif etilganidek bir xil edi [48]. Ochiq maydon faolligini o'lchash uchun sichqonchani 14 × 14 dyuymli qora qutidan qilingan ochiq maydonga joylashtirildi. Ushbu qutida 2 × 2 dyuymli kichik kvadrat ribonlar (7 kvadratchalar bilan 7 kvadratchalar jami 49 kvadratchalar) bilan belgilangan. Hayvonlarning ochiq maydondagi faolligi sichqonlar 3 daqiqada o'tib ketgan xochlar soni bilan o'lchanardi. Rota-rod o'lchovlarini o'lchash uchun sichqonlar tezlashtirilgan aylanadigan o'rmon tayoqchasiga joylashtirildi. Uning uzunligi 12 uzunligi va diametri 1 dyuym. Dastlabki aylanish tezligi 4 rpmda bo'lib, so'ngra 40 aylanish tezligiga tezlashdi. Ishlash besh daqiqali yoki bir soatlik qayta chaqiruv sinovlari vaqtida sichqonchaning qaytib panada qolishiga muvaffaq bo'lgan vaqt miqdori (sekundlarda) bilan o'lchanardi.
Elevated Plus Maze testlari
Protokollar ta'rif etilganidek bir xil edi [49]. Yuqori plyus labirinti qora mato bo'yalgan zanglamaydigan po'latdan yasalgan va to'rtta qo'ldan (ikkitasi devorsiz va ikkitasi 15.25 sm baland devorlar bilan qoplangan) 30 sm uzunlikda va 5 sm kengligidan iborat. Labirentning har bir qo'li mustahkam metall oyoqlarga biriktirilgan bo'lib, uning ustida joylashgan stol ustidagi 40 sm balandlikda bo'ladi. Faoliyat raqamli kamera (Logitech Camera, Model N231) tomonidan labirintadan 130 sm balandlikda yozilgan. Sinov lampochkasida (40 va 60 soat oralig'idagi) yorug'lik bosqichida yorug'lik nurida (bir 0900-W va bitta 1400-Vt yumshoq oq lampochka, labda labida yorug'lik hosil qilish uchun burchakli) sodir bo'ldi. Labirent sinovlari orasida 5% sirka kislotasi bilan tozalandi. Oq shovqin (30 dB) begona fon shovqinini maskitadi. Sinov kuni hayvonlar hayvon hujayralarida sinov xonasiga olib kelindi va har bir juft hayvon o'z uyi qafasidan olib tashlandi va labirintga joylashtirishdan oldin 5 min uchun alohida tutqichga joylashtirildi. Hayvonlarni labirinti markazida alohida joylashtirildi, sichqonlar orasida muvozanatning bosh pozitsiyasi va 5 min uchun xulq qayd etildi. ochiq qo'lda va yopiq qo'lda o'tkaziladigan vaqt (kemiruvchining barcha to'rtta pog'onasi ochiq yoki yopiq qo'lda bo'lsa) qayd etilgan va tahlil qilingan.
Kontextural qo'rqinchli shamollash
Qo'rqinchli shamollatish ilgari tasvirlanganidek amalga oshirildi [45]. Eksperiment kondensatsiyalanish tizimida amalga oshirildi, shiftdagi uy nurlari va zanglamaydigan po'latdan yasalgan panjarali (Coulbourn Instruments, Whitehall, PA) tovushli zaryadlangan qutida joylashgan xona. To'rt qavati shok generatoriga ulangan edi va eshitish devori devoriga biriktirilgan karnaydan chiqqan eshitish signali bo'ldi. Barcha stimulyatorlar Grafik Davlat dasturi bilan shaxsiy kompyuter yordamida avtomatik ravishda nazorat qilingan. Xulq-atvorni yozish uchun kameraning old tomoniga videokamera qo'yildi. Sichqoncha 3 kun mobaynida muhokama qilindi va keyin 5 daqiqa davomida ta'lim xonasiga joylashdi. Konditsioner stimulyator (KS) 85 kHzda 2.8 dB ovozi, konditsioner stimulyator (US) esa 0.8 s uchun 2 mA da doimo shifrlangan oyoq zarbasi bo'lgan. Bir vaqtning o'zida to'xtab turuvchi CS / AQSh paragrafidan so'ng hayvon zudlik bilan muzlashni o'lchash uchun kamerada yana bir 30 s uchun qoladi. Saqlash sinovida har bir sichqoncha bir xonaga joylashtirildi va muzlatish javoblari 5 min (kontekstli muzlatish javobi) uchun saqlandi. Barcha testlar qizil nur ostida videotasmaga tushirilgan. Umumiy muzlash vaqti qo'rquv xotirasi indeksi sifatida o'lchandi. Muzlash xatti-harakatlari nafas olishdan tashqari harakatning to'liq etishmasligi sifatida aniqlandi. Muzlatish xatti-harakati dasturiy ta'minot (Coulbourn Instruments) tomonidan baholandi va muzlatuvchi javobga aylandi [muzlatuvchi javob 
= (jami muzlash vaqti / jami sinov vaqti) × 100%].
Mekansal ma'lumot xotirasi testlari
Mekansal mos yozuvlar xotirasi testi yashirin platformadagi suv labirinti edi. Biz ilgari Nakazawa va boshq. [22]. Trening kuniga to'rtta sinovdan iborat bo'lib, sinovlar orasida bir soat davom etdi. Sichqonlarning harakati videokamera tomonidan kuzatilgan va dasturiy ta'minot bilan o'lchanilgan (Noldul Information Technology, Niderlandiya). Plitaga qochish kechiktirilishi, shuningdek, kadrandan foydalanish joylari va platformalar kesishuvi qayd etildi va tahlil qilindi. Hovuzning diametri 118 santimetrga va platforma 9.5 sm diametrga teng. To'rt prob tekshiruvi o'tkazildi. Birinchi prob tekshiruvi (P1) oxirgi mashg'ulotlardan so'ng kunduzgi to'liq nishon shartlari ostida (Day 11) o'tdi. Ikkinchi prob tekshiruvi (P2) kunning 12 kunida qora parda devoriga osilgan to'rtta ingl. Belgilarning uchini olib tashlash yo'li bilan qisman moslashuv sharoitida o'tkazildi. DAT uchun+/- 3 kunida kunning uchinchi probasini (P13) to'liq nishon shartlari va 4 da kunning to'rtinchi proba sinovi (P14) ostida qisman to'xtatish sharoitida bajarganmiz. Sinov jarayonida yuzaga kelishi mumkin bo'lgan har qanday yo'qotishlarni bartaraf etish uchun, P4, P1 va P1 prob tekshiruvlaridan so'ng, 2 soatlik mashg'ulotlardan yana bitta blok (3 sinov) o'tdi. Bundan tashqari, P4 (partial-igna va haloperidol inyeksiyasi yordamida proba tekshiruvidan oldin) ehtimoldan tashqari o'ta mashq qilishning aralashma ta'sirini istisno qilish uchun biz boshqa DAT guruhi+/- sichqonlar va ularni boshqarish yovvoyi tipidagi axlatlarni ikkita qo'shimcha sinov sinovlariga (P3 P va P4 ′ sinovlari). P3 be zond sinovi oxirgi mashg'ulotdan bir kun o'tib, to'la-to'kis sharoitda o'tkazildi (10 kun). P4 ′ zond sinovi 11-kuni qisman kyuent sharoitida o'tkazildi. Barcha sinov sinovlari davomida platforma olib tashlandi va sichqonlarga mashq paytida ishlatilgan vaqtga (60 sek) suzishga ruxsat berildi. Har bir kvadrantda sarf qilingan vaqt qayd etildi. Dopamin darajasini tiklash uchun [6], [20], [21], DAT dan fareler+/- va nazorat guruhlarining barchasiga tomir ichiga yoki haloperidol (tana vazniga 0.002 mg / kg) yoki R30 va P4 prob sinovlaridan 4 daqiqa oldin sho'rlangan holda yuborilgan.
Ma'lumotlarni tahlil qilish
Takroriy o'lchovlar orasidagi hayvonlarning korrelyatsiyasini hisoblash uchun Morris suv labirintasida, yangi ob'yektlarni aniqlashda, konstruktiv qo'rquv sharoitida va rotator-roddagi testlarda xatti-harakatlarni baholash uchun chiziqli aralash modellar ishlatilgan. TUQ-Kramer usuli DAT o'rtasidagi ushbu qiziqish o'lchovlarining ahamiyatini aniqlash uchun ishlatilgan+/- sichqonlar va nazorat qiluvchi axlatdoshlar. Genotip ta'sirini aniqlash uchun ochiq maydonda va baland plyusli labirint testlarida bir tomonlama ANOVA va post-hok Dunnett testi ishlatilgan. Doimiy o'zgaruvchilar o'rtacha (SEM) o'rtacha va standart xatosi sifatida taqdim etiladi. Ma'lumotlar SPSS versiyasi 13.0 (SPSS Inc., Chikago, IL) yordamida tahlil qilindi. P <0.05 bo'lganda farqlar muhim deb hisoblandi.
rahmat
DATni taqdim qilish uchun Chikago universitetidan Dr. Xiaoxi Zhuangga minnatdorchilik bildiramiz+/- KO sichqonlari va Brianna Klein tajribalar uchun texnik yordam uchun.
Izohlar
Raqobatchilarning qiziqishlari: Mualliflar hech qanday raqobatbardosh manfaatlar mavjud emasligini e'lon qildilar.
Moliyalashtirish: Ushbu tadqiqot NIMH (MH060236), NIA (AG024022, AG034663 & AG025918), USAMRA00002, Jorjiya tadqiqot alyansi va Shanxay munitsipalitetining Fan va Texnologiya Komissiyasi (10140900500) mablag'lari (barchasi JZTga) tomonidan qo'llab-quvvatlandi. Xitoy milliy ilmiy jamg'armasi (81000592), Shanxay munitsipalitetining fan va texnologiyalar bo'yicha komissiyasi (10DZ2272200, 09DZ2200900, 10PJ1407500 va 10JC1411200), Shanxay munitsipal ta'lim komissiyasi (11ZZ103) FL va XMS. Mablag'larni o'rganish, ma'lumotlarni yig'ish va tahlil qilish, nashr etish to'g'risida qaror yoki qo'lyozmani tayyorlashda hech qanday rol o'ynamagan.
;
