.

Yếu tố phiên mã ΔFosB và protein kinase II phụ thuộc canxi/calmodulin (CaMKIIα) giàu trong não được cảm ứng trong nhân accumbens (NAc) do tiếp xúc mãn tính với cocaine hoặc các loại thuốc kích thích tâm thần khác, trong đó hai protein này đóng vai trò trung gian trong các phản ứng nhạy cảm với thuốc. Mặc dù cả ΔFosB và CaMKIIα đều điều chỉnh sự biểu hiện và chức năng của thụ thể glutamate AMPA trong NAc, sự hình thành gai dendrite trên các tế bào thần kinh gai trung bình (MSN) trong NAc, và sự nhạy cảm vận động đối với cocaine, nhưng cho đến nay vẫn chưa có mối liên hệ trực tiếp nào giữa các phân tử này được khám phá. Ở đây, chúng tôi chứng minh rằng ΔFosB được phosphoryl hóa bởi CaMKIIα tại Ser27 ổn định protein và CaMKII là cần thiết cho sự tích lũy ΔFosB do cocaine gây ra trong NAc của chuột.

Ngược lại, chúng tôi chứng minh rằng ΔFosB vừa cần thiết vừa đủ để cocaine gây ra sự biểu hiện gen CaMKIIα in vivo, một hiệu ứng chọn lọc đối với các tế bào thần kinh MSN loại D1 _trong vùng vỏ NAc.

Hơn nữa, việc tạo ra các gai gai trên NAc MSN và tăng khả năng đáp ứng hành vi với cocaine sau khi NAc biểu hiện quá mức FosB đều phụ thuộc CaMKII.

Điều quan trọng là, chúng tôi lần đầu tiên chứng minh sự cảm ứng của ΔFosB và CaMKII trong nhân accumbens (NAc) của người nghiện cocaine , gợi ý những mục tiêu tiềm năng cho can thiệp điều trị trong tương lai. Dữ liệu này cho thấy ΔFosB và CaMKII tham gia vào một vòng phản hồi tích cực đặc hiệu theo loại tế bào và vùng não như một cơ chế quan trọng để điều chỉnh mạch phần thưởng của não bộ khi sử dụng cocaine mãn tính.

Giới thiệu

Ngày càng có nhiều bằng chứng ủng hộ quan điểm cho rằng những thay đổi trong biểu hiện gen góp phần vào cơ chế gây nghiện ma túy ( Robison và Nestler, 2011 ). Một chất trung gian quan trọng của những thay đổi này là ΔFosB, một yếu tố phiên mã thuộc họ Fos ( Nestler, 2008 ). Việc sử dụng mãn tính hầu như bất kỳ loại ma túy nào đều gây ra sự tích lũy lâu dài của ΔFosB trong nhân accumbens (NAc), một vùng limbic thiết yếu cho các hành vi khen thưởng. Sự cảm ứng này dường như đặc hiệu đối với loại tế bào thần kinh gai trung bình (MSN) NAc biểu hiện thụ thể dopamine D1. Sự biểu hiện quá mức có thể cảm ứng của ΔFosB trong các MSN NAc loại D1 này làm tăng phản ứng vận động và khen thưởng đối với cocaine và morphine ( Kelz et al., 1999 ; Zachariou et al., 2006 ), bao gồm cả việc tăng cường tự sử dụng cocaine ( Colby et al., 2003 ). Hơn nữa, việc ngăn chặn hoạt động phiên mã của ΔFosB bằng phương pháp di truyền hoặc virus làm giảm tác dụng gây hưng phấn của các loại thuốc này ( Zachariou et al., 2006 ), cho thấy rằng sự cảm ứng ΔFosB kéo dài này là một yếu tố trung gian quan trọng gây ra những thay đổi lâu dài ở NAc do sử dụng thuốc mãn tính.

Tính ổn định bất thường của ΔFosB (so với tất cả các protein khác trong họ Fos) vừa là đặc tính nội tại của phân tử, do sự cắt ngắn các miền degron có trong FosB toàn chiều dài ( Carle et al., 2007 ), vừa là một quá trình được điều chỉnh. ΔFosB được phosphoryl hóa trong ống nghiệm và trong cơ thể sống tại Ser27, và phản ứng này làm ổn định ΔFosB hơn nữa, khoảng 10 lần, trong nuôi cấy tế bào và NAc trong cơ thể sống ( Ulery-Reynolds et al., 2009 ). Mặc dù Ser27-ΔFosB đã được chứng minh là chất nền cho casein kinase-2 trong ống nghiệm ( Ulery et al., 2006 ), cơ chế phosphoryl hóa trong cơ thể sống của nó vẫn chưa được biết.

Protein kinase II phụ thuộc canxi/calmodulin (CaMKII) là một loại kinase serine/threonine được biểu hiện mạnh mẽ, trong đó các dạng α và β tạo thành các homo- và hetero-holoenzyme mười hai tiểu đơn vị trong cơ thể sống , và rất cần thiết cho nhiều dạng dẻo dai thần kinh ( Lisman et al., 2002 ; Colbran và Brown, 2004 ). CaMKIIα được cảm ứng chọn lọc trong vỏ nhân accumbens (NAc shell) bởi amphetamine mãn tính ( Loweth et al., 2010 ), và việc phong tỏa dược lý hoạt động của CaMKII trong NAc shell làm giảm sự nhạy cảm về hành vi đối với amphetamine ( Loweth et al., 2008 ) và cocaine ( Pierce et al., 1998 ), trong khi sự biểu hiện quá mức của CaMKIIα bằng virus trong vùng phụ NAc này làm tăng sự nhạy cảm vận động và tự sử dụng amphetamine ( Loweth et al., 2010 ). CaMKIIα có thể ảnh hưởng đến các hành vi khen thưởng thông qua việc điều chỉnh các tiểu đơn vị thụ thể glutamate AMPA ( Pierce et al., 1998 ), vì hoạt động của CaMKIIα từ lâu đã được liên kết với chức năng thụ thể AMPA và nhắm mục tiêu vào khớp thần kinh trong một số dạng dẻo dai thần kinh ( Malinow và Malenka, 2002 ).

Các tài liệu này chỉ ra một số điểm tương đồng giữa ΔFosB và CaMKII: cả hai đều cần thiết và đủ để gây ra nhiều tác động hành vi của các loại thuốc gây nghiện, cả hai đều điều hòa tăng cường gai thần kinh ở nhiều loại tế bào thần kinh khác nhau trong cơ thể sống ( Jourdain et al., 2003 ; Maze et al., 2010 ), và cả hai đều tạo ra ít nhất một số tác động hành vi của chúng thông qua điều hòa thụ thể AMPA ( Kelz et al., 1999 ; Malinow và Malenka, 2002 ; Vialou et al., 2010 ). Mặc dù có những điểm tương đồng này, nhưng chưa có mối liên hệ chức năng nào được biết đến giữa ΔFosB và CaMKII. Ở đây, chúng tôi thiết lập sự điều hòa tương hỗ giữa ΔFosB và CaMKII, và chứng minh rằng hai protein này tạo thành một vòng phản hồi tiến về phía trước đặc hiệu cho tế bào thần kinh MSN loại D1 trong vỏ NAc được kích hoạt bởi cocaine và điều chỉnh một loạt các phản ứng với cocaine trong cơ thể sống.

Go to:

Vật liệu và phương pháp

Thí nghiệm 1: Phân tích protein iTRAQ của vỏ và lõi NAc sau khi điều trị bằng cocaine ( Hình 1A )

Chuột đực trưởng thành (8 tuần tuổi) được tiêm phúc mạc 20 mg/kg cocaine hoặc dung dịch muối sinh lý mỗi ngày một lần trong bảy ngày. 24 giờ sau lần tiêm cuối cùng, vỏ và lõi NAc được vi phẫu ( Hình 1A ) và đông lạnh nhanh. Phân tích iTRAQ được thực hiện như đã mô tả trước đây ( Ross et al., 2004 ; Davalos et al., 2010 ).

Hình 1

Cảm ứng vỏ đặc hiệu của CaMKII trong NAc bởi cocaine

Thí nghiệm 2: Định lượng sự thay đổi protein trong nhân accumbens (NAc) vùng lõi và vỏ của chuột sau khi điều trị bằng cocaine ( Hình 1B–D )

Chuột đực trưởng thành (8 tuần tuổi) được tiêm 10 mg/kg cocaine hoặc dung dịch muối sinh lý vào phúc mạc mỗi ngày một lần trong bảy ngày trong buồng ghi hoạt động vận động. Phản ứng vận động với một mũi tiêm cocaine duy nhất (5 mg/kg tiêm phúc mạc) được ghi lại ở những con vật đã được điều trị bằng cocaine trước đó (gọi là “mãn tính”) và một phần những con vật được điều trị bằng dung dịch muối sinh lý (gọi là “cấp tính”), và phản ứng vận động với chỉ dung dịch muối sinh lý được ghi lại ở những con vật còn lại được điều trị bằng dung dịch muối sinh lý mãn tính (gọi là “dung dịch muối sinh lý”). Các thử nghiệm hoạt động vận động được thực hiện như mô tả ( Hiroi et al., 1997 ). Tóm lại, chuột đực trưởng thành được đặt trong hộp ghi hoạt động vận động ngoài trời PAS 18”×24” (San Diego Instruments) trong 30 phút để làm quen, được tiêm một mũi dung dịch muối sinh lý vào phúc mạc và theo dõi thêm 30 phút, và được tiêm một mũi cocaine 5 mg/kg vào phúc mạc và theo dõi trong 30 phút.

24 giờ sau lần tiêm cuối cùng này, chuột được chặt đầu mà không gây mê để tránh ảnh hưởng của thuốc gây mê lên mức độ protein thần kinh và trạng thái phospho. Não được cắt lát liên tục trong ma trận 1.2 mm (Braintree Scientific) và mô đích được lấy ra trong dung dịch muối đệm phosphat chứa chất ức chế protease (Roche) và phosphatase (Sigma Aldrich) bằng cách sử dụng dụng cụ đục lỗ cỡ 14 cho lõi NAc và dụng cụ đục lỗ cỡ 12 cho phần mô còn lại để lấy vỏ NAc (Xem Hình 1A ) và được đông lạnh ngay lập tức trên đá khô. Các mẫu được đồng nhất hóa bằng siêu âm nhẹ trong dung dịch đệm RIPA đã được điều chỉnh: 10 mM Tris base, 150 mM natri clorua, 1 mM EDTA, 0.1% natri dodecyl sulfat, 1% Triton X-100, 1% natri deoxycholate, pH 7.4, chất ức chế protease và phosphatase như trên. Sau khi thêm dung dịch đệm Laemmli, các protein được tách trên gel polyacrylamide gradient 4–15% (Hệ thống Criterion, BioRad), và phương pháp Western blotting được thực hiện bằng hệ thống Odyssey (Li-Cor) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Thí nghiệm 3: Định lượng sự thay đổi protein trong nhân accumbens (NAc) vùng lõi và vỏ của chuột sau khi cai nghiện cocaine ( Hình 1E )

Chuột đực trưởng thành (8 tuần tuổi) được tiêm phúc mạc 10 mg/kg cocaine hoặc dung dịch muối sinh lý mỗi ngày một lần trong bảy ngày. 14 ngày sau lần tiêm cuối cùng, những con vật được điều trị bằng dung dịch muối sinh lý được tiêm thêm một mũi dung dịch muối sinh lý nữa (gọi là “saline”), và những con vật được điều trị bằng cocaine được tiêm thêm một mũi dung dịch muối sinh lý nữa (gọi là cai nghiện 14 ngày hoặc “14d WD”) hoặc một mũi tiêm cocaine duy nhất (gọi là “14d WD Chal” để thử thách). Một giờ sau lần tiêm cuối cùng, các con vật được chặt đầu và tiến hành phân tích Western blotting như trong Thí nghiệm 2.

Thí nghiệm 4: Định lượng sự thay đổi protein trong nhân accumbens (NAc) vùng lõi và vỏ của chuột sau khi tự sử dụng cocaine ( Hình 2A–C )

Chuột được huấn luyện để tự quản lý 0.5 mg / kg / lần truyền cocaine trong các buổi một giờ theo lịch trình 1 tỷ lệ cố định trong chín ngày. Sau chín phiên cơ bản, những con chuột được chia thành hai nhóm được cân bằng bởi lượng cocaine trong hai phiên cuối cùng. Một nhóm chuột được phép tự uống cocaine (0.5 mg / kg / lần tiêm truyền) trong các phiên một giờ (truy cập ngắn, ShA) trong khi nhóm chuột khác tự uống cocaine trong các phiên sáu giờ (truy cập dài, LgA ) trong mười ngày nữa (phiên leo thang).

Các lát cắt não được xử lý để nhuộm miễn dịch như đã mô tả ( Perrotti et al., 2004 ). Não được tưới máu 18–24 giờ sau lần tiếp xúc cuối cùng với thuốc, dẫn đến sự phân hủy bất kỳ protein FosB toàn phần còn sót lại nào, sao cho tất cả phản ứng miễn dịch còn lại phản ánh ΔFosB. Sự phân hủy này được xác nhận bằng phương pháp Western blotting, cho thấy không có sự nhuộm màu đáng kể với kháng thể hướng vào đầu C của FosB toàn phần mà không nhận diện ΔFosB (dữ liệu không được hiển thị). Sau khi cắt thành các lát dày 35 µm, số lượng tế bào dương tính với ΔFosB được định lượng bởi một người quan sát không biết trước kết quả trong hai lát cắt qua NAc của mỗi con chuột, và giá trị trung bình trên mỗi trường 40× sau đó được tính toán theo vùng cho mỗi con vật. Mỗi con vật được coi là một quan sát riêng lẻ để phân tích thống kê. Các vùng quan tâm được xác định bằng cách sử dụng Paxinos và Watson ( Paxinos và Watson, 2007 ).

Việc định lượng khả năng phản ứng miễn dịch của CaMKIIα được thực hiện bằng hệ thống Licor như đã mô tả ( Covington et al., 2009 ). Cường độ tích hợp của CaMKII và GAPDH được xác định bằng phần mềm Odyssey. Kết quả được trình bày dưới dạng giá trị cường độ tích hợp trên mm² ^và được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn ( n = 4–10 mỗi nhóm). Giá trị của GAPDH được sử dụng làm tham chiếu để chuẩn hóa cường độ CaMKII theo độ dày lát cắt và điều kiện.

Hình 2

Cảm ứng CaMKII trong vỏ NAc của chuột tự quản và người nghiện cocaine ở người

Thí nghiệm 5: Định lượng nồng độ protein ở người nghiện cocaine ( Hình 2D )

Thủ tục

Mô não người sau khi chết được lấy từ Ngân hàng Não Tự tử Quebec (Viện Đại học Sức khỏe Tâm thần Douglas, Montreal, Quebec, Canada). Quá trình bảo quản mô về cơ bản được tiến hành như mô tả ( Quirion et al., 1987 ). Tóm lại, sau khi được lấy ra, não được đặt trên đá ướt trong hộp xốp và nhanh chóng chuyển đến cơ sở của Ngân hàng Não Tự tử Quebec. Hai bán cầu được tách ngay lập tức bằng một vết cắt dọc ở giữa não, thân não và tiểu não. Các mạch máu, tuyến tùng, đám rối màng mạch, một nửa tiểu não và một nửa thân não thường được tách ra từ bán cầu trái, sau đó được cắt ngang thành các lát dày 1 cm trước khi đông lạnh. Nửa còn lại của tiểu não được cắt dọc thành các lát dày 1 cm trước khi đông lạnh. Mô được đông lạnh nhanh trong 2-methylbutane ở -40°C trong khoảng 60 giây. Tất cả các mô đông lạnh được giữ riêng biệt trong túi nhựa ở -80°C để bảo quản lâu dài. Các vùng não cụ thể được tách ra từ các lát cắt ngang đông lạnh trên một tấm thép không gỉ có đá khô bao quanh để kiểm soát nhiệt độ môi trường. Phương pháp Western blotting được thực hiện như mô tả trong Thí nghiệm 2.

Đội quân

Nhóm nghiên cứu bao gồm 37 nam và 3 nữ, độ tuổi từ 15 đến 66 tuổi. Tất cả các đối tượng đều tử vong đột ngột mà không có giai đoạn hấp hối kéo dài hoặc bệnh lý kéo dài . Trong mỗi trường hợp, nguyên nhân tử vong được xác định bởi Văn phòng Giám định pháp y Quebec, và một xét nghiệm độc chất được tiến hành với các mẫu mô để thu thập thông tin về việc sử dụng thuốc và chất cấm tại thời điểm tử vong. Nhóm đối tượng gồm 20 cá nhân đáp ứng tiêu chí SCID-I về nghiện cocaine. Nhóm đối chứng gồm 20 người không có tiền sử nghiện cocaine và không có chẩn đoán tâm thần nghiêm trọng. Tất cả các đối tượng đều tử vong đột ngột do các nguyên nhân không ảnh hưởng trực tiếp đến mô não. Các nhóm được ghép cặp theo độ tuổi trung bình, thời gian bảo quản lạnh và độ pH. Đối với tất cả các đối tượng, khám nghiệm tử thi tâm lý được thực hiện như đã mô tả trước đây ( Dumais et al., 2005 ), cho phép chúng tôi tiếp cận thông tin chi tiết về tiền sử bệnh tâm thần và y tế, cũng như các dữ liệu lâm sàng và nhân khẩu học liên quan khác. Tóm lại, một người phỏng vấn được đào tạo đã tiến hành Cuộc phỏng vấn lâm sàng có cấu trúc về các rối loạn tâm thần theo DSM-IV (SCID-I) với một hoặc nhiều người cung cấp thông tin về người đã khuất. Một hội đồng các bác sĩ lâm sàng đã xem xét các đánh giá SCID-I, báo cáo trường hợp, ghi chú của nhân viên điều tra và hồ sơ y tế để đưa ra chẩn đoán tâm thần thống nhất.

Thí nghiệm 6: Kết tủa miễn dịch chromatin đối với NAc của chuột ( Hình 3A–C )

Chuột đực trưởng thành (8 tuần) được tiêm 10 mg / kg cocaine hoặc IP xe nước muối một lần mỗi ngày trong bảy ngày. 24 giờ sau lần tiêm cuối cùng, vỏ NAc và lõi đã được bảo vệ siêu nhỏ. Giảm hấp thu miễn dịch Chromatin (ChIP) đã được thực hiện gộp các cú đấm vỏ hoặc lõi NAc song phương từ bảy con chuột mỗi nhóm trong tổng số nhóm 14 (tổng số động vật 98, bể cocaine 7, bể nước muối 7). Các mô được liên kết chéo, rửa sạch và được lưu trữ ở −80 ° C cho đến khi cắt nhiễm sắc thể bằng cách siêu âm. Chromatin bị cắt được ủ qua đêm với các kháng thể trước đây gắn với hạt từ tính (Dynabeads M-280, Invitrogen). IgG không miễn dịch được sử dụng như một biện pháp kiểm soát. Sau khi liên kết ngang và tinh chế DNA, qPCR đã được sử dụng để đo mức DNA của trình xúc tiến CaMKIIα. Các đoạn mồi được thiết kế để khuếch đại một vùng chứa trình tự đồng thuận AP-1 nằm ở vị trí bắt đầu phiên mã (Chuyển tiếp: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Đảo ngược: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

Hình 3

Loại tế bào và vùng cảm ứng ΔFosB đặc hiệu của CaMKIIα trong cơ thể

Thí nghiệm 7: Đo lường biểu hiện mRNA và protein CaMKII với sự biểu hiện quá mức ΔFosB đặc hiệu theo loại tế bào ( Hình 3D )

Chuột đực biến đổi gen kép có nguồn gốc từ chuột NSE-tTA (dòng A) × TetOp-ΔfosB (dòng 11) và NSE-tTA (dòng B) × TetOp-FLAG-ΔfosB (dòng 11) ( Chen et al., 1998 ; Kelz et al., 1999 ; Werme et al., 2002 ; Zachariou et al., 2006 ) được thụ thai và nuôi dưỡng bằng 100 µg/ml doxycycline để ức chế biểu hiện ΔFosB trong quá trình phát triển. Chuột con được chia làm hai nhóm khi cai sữa: một nửa tiếp tục dùng doxycycline và một nửa chuyển sang uống nước, và các con vật được sử dụng sau 8 đến 11 tuần khi tác dụng phiên mã của ΔFosB đạt mức tối đa ( Kelz et al., 1999 ; McClung và Nestler, 2003 ). Để phân tích phiên mã, chuột được nhanh chóng chặt đầu, não được lấy ra và đặt trên đá. Vùng nhân accumbens (NAc) được lấy mẫu bằng kim bấm cỡ 14 và nhanh chóng đông lạnh trên đá khô cho đến khi RNA được chiết xuất. Quá trình phân lập RNA, qPCR và phân tích dữ liệu được thực hiện như đã mô tả trước đây ( LaPlant et al., 2009 ). Tóm lại, RNA được phân lập bằng thuốc thử TriZol (Invitrogen), tinh chế thêm bằng bộ kit RNAeasy micro của Qiagen và kiểm tra chất lượng bằng máy Bioanalyzer của Agilent. Quá trình phiên mã ngược được thực hiện bằng iScript (BioRad). qPCR được thực hiện với hệ thống RT PCR Applied Biosystems 7900HT với các thông số chu kỳ sau: 10 phút ở 95°C; 40 chu kỳ gồm 95°C trong 1 phút, 60°C trong 30 giây, 72°C trong 30 giây; gia nhiệt tăng dần đến 95°C để tạo ra đường cong phân ly nhằm xác nhận các sản phẩm PCR đơn lẻ. Phân tích miễn dịch mô học về biểu hiện protein ΔFosB và CaMKIIα được thực hiện như mô tả trong Thí nghiệm 4.

Thí nghiệm 8: Tác dụng của chất đối kháng thụ thể dopamine D1 và D2 ​​trong nhân accumbens lên sự thay đổi protein do cocaine gây ra ( Hình 3H )

Chuột đực trưởng thành (8 tuần tuổi) được tiêm phúc mạc 10 mg/kg cocaine hoặc dung dịch muối sinh lý (“nhóm đối chứng”) mỗi ngày một lần trong bảy ngày. 30 phút trước mỗi lần tiêm cocaine, chuột được tiêm phúc mạc chất đối kháng thụ thể D1 SCH 23390 (0.5 mg/kg, “nhóm đối kháng D1”) hoặc chất đối kháng thụ thể D2 eticlopride (0.5 mg/kg, “nhóm đối chứng D2”), hoặc tiêm dung dịch muối sinh lý làm đối chứng (“nhóm cocaine”). 24 giờ sau lần tiêm cuối cùng, các con vật được chặt đầu và lượng protein được định lượng bằng phương pháp Western blotting như trong Thí nghiệm 2.

Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của việc biểu hiện quá mức ΔFosB thông qua AAV lên sự biểu hiện protein ( Hình 4 A–C )

Phẫu thuật định vị não được thực hiện trên chuột đực trưởng thành (8 tuần tuổi) để tiêm AAV-GFP (protein huỳnh quang xanh) hoặc AAV-GFP-ΔFosB ( Maze et al., 2010 ). Kim tiêm cỡ 33 (Hamilton) được sử dụng cho tất cả các ca phẫu thuật, trong đó 0.5 µl virus tinh khiết có hiệu giá cao được truyền vào cả hai bên trong khoảng thời gian 5 phút, tiếp theo là thời gian nghỉ 5 phút sau khi truyền. Tất cả các khoảng cách được đo tương đối so với Bregma: góc 10°, AP = +1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = −6.7 mm. 14 ngày sau phẫu thuật, động vật được tiêm một mũi tiêm phúc mạc duy nhất 10 mg/kg cocaine trong buồng theo dõi vận động để đánh giá tác động hành vi của sự biểu hiện quá mức ΔFosB. 24 giờ sau mũi tiêm cuối cùng này, chuột được chặt đầu theo Thí nghiệm 2 , và vi phẫu mô được thực hiện dưới sự hướng dẫn của kính hiển vi huỳnh quang để thu được mô NAc dương tính với GFP. Sau đó, phương pháp Western blotting được thực hiện như trong Thí nghiệm 2.

Hình 4

FosB là cần thiết và đủ cho cảm ứng CaMKIIα phụ thuộc thụ thể cocaine trong vỏ NAc

Thí nghiệm 10: Ảnh hưởng của việc biểu hiện quá mức ΔJunD qua trung gian AAV lên sự biểu hiện protein phụ thuộc cocaine ( Hình 4 D–F )

Tiêm AAV-GFP hoặc AAV-GFP-ΔJunD bằng phương pháp định vị không gian được thực hiện như trong Thí nghiệm 8. 14 ngày sau phẫu thuật, động vật được tiêm 10 mg/kg cocaine hoặc dung dịch muối sinh lý vào phúc mạc mỗi ngày một lần trong bảy ngày trong buồng ghi hoạt động vận động. Phản ứng vận động đối với một lần tiêm cocaine (5 mg/kg tiêm phúc mạc) hoặc dung dịch muối sinh lý được ghi lại. 24 giờ sau lần tiêm cuối cùng này, chuột được chặt đầu, thu thập mô và tiến hành phân tích Western blot như trong Thí nghiệm 9.

Thí nghiệm 11: Thử nghiệm hoạt tính protein kinase trong ống nghiệm ( Hình 5A–D )

Protein CaMKIIα tái tổ hợp và ΔFosB được tinh chế từ tế bào côn trùng ( Brickey et al., 1990 ; Jorissen et al., 2007 ), và các xét nghiệm hoạt tính protein kinase được thực hiện ( Colbran, 1993 ), như đã mô tả trước đây. Tóm lại, CaMKII được ủ trước trên đá với 2.5 µM (hoặc nồng độ được chỉ định) ΔFosB, 1 mM Ca2 ⁺ , 40 mM Mg2 ⁺ , 15 µM calmodulin và 200 mM HEPES pH 7.5. Quá trình phosphoryl hóa được bắt đầu bằng cách thêm 200 µM ATP có hoặc không có [γ- ^32P ]ATP và được tiến hành trong 10 phút ở nhiệt độ phòng ( Hình 5A&B ) hoặc 2 phút trên đá ( Hình 5C&D ). Các sản phẩm được phân tách bằng phương pháp Western blotting ( Hình 5A&B ) hoặc bằng phương pháp chụp ảnh phóng xạ và đếm nhấp nháy (Hình B–D).

Hình 5

FosB là chất nền mạnh cho CaMKIIα

Thí nghiệm 12: Xác định sự phosphoryl hóa ΔFosB tại Ser27 ( Hình 5E )

Các thí nghiệm kinase trong ống nghiệm được thực hiện theo Thí nghiệm 11 , protein được tách bằng SDS-PAGE, và các dải tương ứng với ΔFosB được cắt ra và phân tích bằng phương pháp phổ khối lượng song song. Các giá trị m/z của các mảnh ion tương ứng trong tất cả các bảng được ghi nhãn phía trên các đỉnh ion. Không phải tất cả các mảnh ion đều được ghi nhãn do hạn chế về không gian. Nói chung, văn bản cho các nhãn mảnh ion được tô màu đen, trừ khi chúng trực tiếp xác nhận hoặc bổ sung bằng chứng về sự hiện diện của các vị trí phosphoryl hóa cần quan tâm, trong trường hợp đó chúng được đánh dấu màu đỏ. Bằng chứng về các sản phẩm phân mảnh khung xương được trình bày trong trình tự đọc của phosphopeptide với vị trí dư lượng phosphoryl hóa được phát hiện được chỉ ra màu đỏ bằng một chữ cái của axit amin. Mô tả số của các mảnh ion quan sát được cũng được đánh dấu trên trình tự peptide dưới dạng ion b và y. Hệ số phóng to cho các phần của trục m/z để hiển thị các mảnh ion có cường độ thấp hơn được đánh dấu ở phía trên cùng của mỗi phổ khối lượng mảnh. Các ion phân mảnh được hiển thị trong hình H xác nhận sự hiện diện của dạng phosphoryl hóa Ser27, tuy nhiên, nó nằm trong hỗn hợp các dạng phosphoryl hóa khác tại các vị trí Ser28, Ser31, Ser34 và Thr37. Sự hiện diện của các ion pa5, pa5-P, pb5 và pb5-P xác nhận duy nhất sự phosphoryl hóa của gốc Ser27.

Thí nghiệm 13: Định lượng quá trình phosphoryl hóa Ser27 ( Hình 5F )

Các peptide tiêu chuẩn được thiết kế bắt chước các dạng phospho và không phospho của Ser27 FosB. Sau khi tổng hợp và tinh chế, từng peptide idiotypic nặng nặng đã được hòa tan trong dung dịch đệm acetonitrile / nước 50 / 50 và được gửi để phân tích axit amin để xác định nồng độ tuyệt đối trên dung dịch peptide tổng hợp. Sau đó, mỗi peptide hạng nặng của Nus đã được truyền trực tiếp vào máy quang phổ khối lượng 4000 QTRAP (MS) để xác định năng lượng va chạm tốt nhất cho phân mảnh MS / MS và hai đến bốn lần chuyển tiếp MRM. Tiếp theo, các peptide hạng nặng, gọn gàng đã được LCMS trên 4000 QTRAP để đảm bảo tách peptide. Thiết bị được chạy ở chế độ bốn cực, với Q1 được đặt trên giá trị m / z tiền thân cụ thể (Q1 không quét) và Q3 được đặt thành giá trị m / z cụ thể tương ứng với một đoạn cụ thể của peptide đó. Trong chế độ MRM, một loạt các phản ứng đơn (chuyển đổi ion tiền chất / mảnh trong đó năng lượng va chạm được điều chỉnh để tối ưu hóa cường độ của các ion quan tâm) được đo liên tục và chu kỳ (điển hình là 1 Thẻ 2 giây) được lặp lại trong suốt toàn bộ thời gian tách HPLC. Chuyển đổi MRM được xác định từ phổ MS / MS của các peptide hiện có. Hai chuyển tiếp trên mỗi peptide, tương ứng với các ion mảnh cường độ cao, sau đó đã được chọn và năng lượng va chạm được tối ưu hóa để tối đa hóa cường độ tín hiệu của các chuyển tiếp MRM bằng phần mềm tự động hóa. Các đỉnh tạo ra từ các peptide tiêu chuẩn và mẫu ΔFosB tiếp xúc với CaMKII hoặc đối chứng sau đó được so sánh để xác định sự phong phú tuyệt đối của từng dạng peptide trong phản ứng. Phân tích dữ liệu trên dữ liệu LC-MRM được thực hiện bằng phần mềm AB Multiquant 1.1.

Thí nghiệm 14: Gây cảm ứng ΔFosB ở chuột biểu hiện quá mức CaMKII ( Hình 5G&H )

Chuột chuyển gen biểu hiện quá mức T286D CaMKII ( Mayford et al., 1996 ; Kourrich et al., 2012 ) và chuột hoang dại cùng lứa được nuôi trong điều kiện không có doxycycline để cho phép biểu hiện gen chuyển. Chuột trưởng thành được tiêm 20 mg/kg cocaine hoặc dung dịch muối sinh lý vào phúc mạc mỗi ngày một lần trong 14 ngày. 24 giờ sau lần tiêm cuối cùng, các con vật được chặt đầu và tiến hành phân tích mô miễn dịch và định lượng biểu hiện ΔFosB như trong Thí nghiệm 4.

Thí nghiệm 15: Tác động của sự biểu hiện quá mức ΔFosB do HSV gây ra và sự ức chế CaMKII lên gai thần kinh NAc ( Hình 6A–E )

Chuột đực trưởng thành (8 tuần tuổi) được tiêm vào vùng nhân accumbens (NAc) bằng phương pháp định vị không gian với HSV-GFP, HSV-GFP-ΔFosB ( Olausson et al., 2006 ), HSV-GFPAC3I hoặc HSV-GFPAC3I-ΔFosB. Trong các cấu trúc này, AC3I, một chất ức chế hoạt động CaMKII dựa trên peptide, được gắn vào đầu C của GFP. GFPAC3I được nhân bản bằng PCR sử dụng vector pMM400 chứa GFPAC3I làm khuôn mẫu với các mồi sau: GFP-AC3I-F: 5' CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3' (clampNheIKozakmet); GFP-AC3I-R: 5' CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3' (clampBspEIstop). Sản phẩm PCR thu được đã được chèn vào các vector p1005+ và p1005+-Δ FosB bằng cách sử dụng các vị trí NheI và BspEI. Cấu trúc được xác nhận bằng cách giải trình tự. Tọa độ định vị không gian là: góc 10°, AP = +1.6 mm, Lat = +1.5 mm, DV = −4.4 mm (Barrot et al., 2002). Quá trình tưới máu và cắt lát não được thực hiện theo Thí nghiệm 4.

Phân tích gai thần kinh được thực hiện như mô tả ( Christoffel et al., 2011 ). Tóm lại, các đoạn nhánh thần kinh cách thân tế bào 50–150 µm được chọn ngẫu nhiên từ các tế bào nhiễm HSV biểu hiện GFP. Hình ảnh được thu thập trên kính hiển vi confocal LSM 710 (Carl Zeiss) để phân tích hình thái bằng NeuronStudio với thuật toán tia bùng. NeuronStudio phân loại gai thần kinh là mỏng, hình nấm hoặc ngắn dựa trên các giá trị sau: (1) tỷ lệ khung hình, (2) tỷ lệ đầu/cổ và (3) đường kính đầu. Gai thần kinh có cổ có thể được phân loại là mỏng hoặc hình nấm, và những gai không có cổ đáng kể được phân loại là ngắn. Gai thần kinh có cổ được dán nhãn là mỏng hoặc hình nấm dựa trên đường kính đầu.

Hình 6

Phong tỏa hoạt động CaMKII ngăn chặn các tác động hình thái và hành vi của ΔFosB trong NAc

Thí nghiệm 16: Tác động của sự biểu hiện quá mức ΔFosB do HSV gây ra và sự ức chế CaMKII lên phản ứng với cocaine ( Hình 6F )

Chuột đực trưởng thành được tiêm virus theo Thí nghiệm 15 , và phản ứng vận động đối với một liều tiêm cocaine 5 mg/kg duy nhất được đo theo Thí nghiệm 9. Dữ liệu vận động được biểu thị bằng tổng số lần ngắt tia sáng trong 30 phút sau khi tiêm cocaine.

thông tin bổ sung

Nhà ở động vật

Chuột Sprague Dawley đực (250–275 g; Charles River Laboratories) được nuôi nhốt theo cặp. Chuột C57BL/6J đực 8 tuần tuổi (The Jackson Laboratory) được nuôi nhốt theo nhóm, tối đa 5 con mỗi lồng. Tất cả động vật đều được làm quen với khu nuôi nhốt động vật trong ≥1 tuần trước khi tiến hành thí nghiệm và được nuôi trong phòng điều hòa nhiệt độ (23–25°C) với chu kỳ sáng/tối 12 giờ (bật đèn lúc 7:00 sáng) và được cung cấp thức ăn và nước uống tự do . Các thí nghiệm được tiến hành theo hướng dẫn của Hiệp hội Khoa học Thần kinh và Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật Thí nghiệm (IACUC) tại Mount Sinai.

Thuốc

Các loại thuốc được quản lý IP và hòa tan trong nước muối vô trùng, bao gồm cocaine (5, 20 mg / kg mỗi 10, đối với chuột, mỗi 1 ml đối với chuột, NIDA) và SCH 23390 hoặc eticlopride hydrochloride (0.5 mg / kg) . Đối với phẫu thuật stereotaxic, chuột được gây mê bằng một loại cocktail cocktail ketamine (1 mg / kg) và xylazine (100 mg / kg) (Henry Schein) trong nước muối vô trùng.

Kháng thể

CaMKIIα (tổng cộng): Ngoại tuyến 05, 532, 1: 5,000

CaMKII phospho-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

FosB (tổng cộng): Tín hiệu tế bào 5G4, 1: 250

ΔFosB phospho-Ser27: Phosphosolutions, 1: 500

GlamA1 (tổng cộng): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GlamA1 phospho-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GlamA1 phospho-Ser845: Chemiaon Ab5849, 1: 2,000

GlamA2: Millipore 07 ĐẦU 598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Phân tích thống kê

Tất cả các phân tích thống kê được thực hiện bằng gói phần mềm Prism 6 (GraphPad). Các bài kiểm tra t của học sinh đã được sử dụng cho tất cả các phép so sánh theo cặp (được chỉ định trong Kết quả có giá trị t được đưa ra) và ANOVA một chiều được sử dụng cho tất cả các phép so sánh (được chỉ ra trong phần kết quả có giá trị F được đưa ra).

Go to:

Kết quả

Cocaine mãn tính gây ra CaMKII trong NAc Shell

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các tế bào thần kinh MSN ở vùng vỏ và lõi NAc có phản ứng sinh hóa và sinh lý khác nhau đối với việc tiếp xúc mãn tính với các loại thuốc gây nghiện ( Kourrich và Thomas, 2009 ; Loweth et al., 2010 ) và hai vùng phụ này điều chỉnh hành vi tìm kiếm ma túy một cách khác nhau ( Ito et al., 2004 ). Để xác định tác động khác biệt của cocaine lên các thành phần protein của vùng vỏ so với lõi NAc, chúng tôi đã sử dụng phương pháp gắn thẻ đồng vị đa kênh (iTRAQ) và quang phổ khối song song (MS/MS). Chuột đực trưởng thành được tiêm cocaine (20 mg/kg) hoặc dung dịch muối sinh lý vào phúc mạc hàng ngày trong 7 ngày; 24 giờ sau lần tiêm cuối cùng, vùng vỏ và lõi NAc được vi phẫu ( Hình 1A ) và đông lạnh nhanh. Sau đó, protein trong các mẫu này được định lượng bằng iTRAQ. Cả bốn dạng đồng phân CaMKII đều cho thấy sự gia tăng đáng kể về biểu hiện sau khi điều trị bằng cocaine, đặc biệt là ở vùng vỏ NAc so với lõi. Một số phosphatase protein, bao gồm các tiểu đơn vị xúc tác và điều hòa PP1 và PP2A, vốn trước đây đã được liên kết với nhiều chất nền CaMKII trong các hệ thống khác ( Colbran, 2004 ), cũng tuân theo một mô hình tương tự. Những phát hiện này cung cấp bằng chứng mới, khách quan cho thấy con đường tín hiệu CaMKII được điều chỉnh mạnh mẽ bởi cocaine trong NAc theo cách đặc hiệu vùng vỏ.

Để xác thực kết quả này một cách định lượng hơn, chúng tôi đã điều trị chuột như trên bằng cocaine (ở các liều lượng khác nhau) hoặc dung dịch muối sinh lý và đo phản ứng vận động đối với liều thử thách cocaine (5 mg/kg) hoặc dung dịch muối sinh lý. Tiếp xúc lặp đi lặp lại với 10 mg/kg cocaine dẫn đến mô hình nhạy cảm vận động điển hình ( Hình 1B ). Các nghiên cứu tiếp theo với chế độ liều lượng này đã tiết lộ, bằng phương pháp Western blotting, rằng việc sử dụng cocaine lặp đi lặp lại gây ra sự sản sinh CaMKIIα một cách chọn lọc ở vỏ NAc 24 giờ sau lần tiêm cocaine cuối cùng ( Hình 1C và D ; p=0.0019; F=7.943; df=29). Ngoài ra, sự phosphoryl hóa chất nền CaMKII điển hình Ser831 của tiểu đơn vị GluA1 của thụ thể AMPA tăng lên đáng kể ở vùng vỏ NAc chứ không phải vùng lõi (p=0.0261; F=4.208; df=28), trong khi sự tự phosphoryl hóa CaMKIIα Thr286 có xu hướng mạnh nhưng không đáng kể về sự cảm ứng chỉ ở vùng vỏ ( Hình 1D ). Một số thụ thể glutamate khác không bị ảnh hưởng. Trái ngược với các phép đo CaMKII này, các mẫu mô tương tự cho thấy sự cảm ứng ΔFosB ở cả vùng vỏ (p=0.0260; F=4.189; df=29) và vùng lõi (p=0.0350; F=3.807; df=29) của NAc ( Hình 1C và D ), phù hợp với các phát hiện trước đó ( Perrotti et al., 2008 ).

Vì một số nghiên cứu trước đây về sự điều hòa thụ thể AMPA của cocaine đã phân tích động vật sau khoảng 14 ngày cai nghiện cocaine mãn tính (xem Thảo luận), chúng tôi đã lặp lại các phân tích sinh hóa này tại thời điểm này. Chúng tôi nhận thấy rằng, 14 ngày sau lần tiêm cocaine cuối cùng, ΔFosB vẫn tăng cao trong NAc (p=0.0288; F=4.258; df=22), trong khi cả CaMKII lẫn sự phosphoryl hóa GluA1 Ser831 đều không còn tăng ( Hình 1E ). Tuy nhiên, 1 giờ sau khi dùng liều cocaine 10 mg/kg, mức độ tổng CaMKII (p=0.0330; F=3.947; df=26) và sự phosphoryl hóa GluA1 Ser831 (p=0.0213; F=4.509; df=27) đều tăng lên ở mức độ tương tự như sau khi tiếp xúc cocaine mãn tính ban đầu ( Hình 1E ). Những dữ liệu này cho thấy các tế bào thần kinh vùng vỏ NAc được chuẩn bị sẵn sàng cho sự cảm ứng CaMKII trong thời gian dài kiêng cữ, có thể thông qua việc kích hoạt trực tiếp promoter gen CaMKII (xem phần Thảo luận). Hơn nữa, việc cảm ứng ΔFosB kéo dài hơn so với cảm ứng CaMKII cho thấy sự tồn tại của các cơ chế bổ sung, dù dựa trên chromatin hay cơ chế khác, có tác dụng "kìm hãm" sự điều hòa CaMKII, như đã đề cập trong phần Thảo luận.

Để củng cố thêm những quan sát này, chúng tôi đã nghiên cứu các mô hình tự sử dụng cocaine, bao gồm việc sử dụng thuốc một cách tự nguyện. Chuột đực trưởng thành được cho tiếp cận cocaine trong thời gian ngắn hoặc dài; như dự đoán ( Ahmed và Koob, 1998 ), chỉ điều kiện tiếp cận dài mới dẫn đến việc tự sử dụng thuốc ngày càng tăng ( Hình 2A ). ΔFosB được cảm ứng ở mức độ lớn hơn khi tiếp cận cocaine trong thời gian dài so với thời gian ngắn ở cả vùng vỏ NAc (p=0.0011; F=11.12; df=17) và vùng lõi (p=0.0004; F=13.86; df=17). Ngược lại, CaMKIIα chỉ được cảm ứng ở vùng vỏ NAc khi tiếp cận cocaine trong thời gian dài ( Hình 2B và C ; p=0.0236; F=4.957; df=16). Thật thú vị khi so sánh lượng cocaine trung bình hàng ngày mà động vật tiếp cận trong thời gian ngắn (~12 mg/kg tiêm tĩnh mạch), động vật tiếp cận trong thời gian dài (~70 mg/kg tiêm tĩnh mạch) và động vật được người thí nghiệm tiêm (10 mg/kg), và đặt câu hỏi tại sao nhóm sau lại gây ra sự cảm ứng mạnh mẽ của ΔFosB và CaMKII trong khi nhóm tiếp cận ngắn thì không. Sự khác biệt này có thể là do sự khác nhau về nồng độ cocaine đạt đỉnh (cocaine do người thí nghiệm tiêm được tiêm một liều duy nhất vào phúc mạc, trong khi cocaine tự sử dụng được tiêm nhiều liều tĩnh mạch), hoặc do sự khác biệt về thời gian tiếp xúc với thuốc (7 ngày đối với nhóm do người thí nghiệm tiêm, 19 ngày đối với nhóm tự sử dụng).

Mặc dù có nhiều tài liệu nghiên cứu về ΔFosB và CaMKII trong tác động của cocaine, nhưng chưa có nghiên cứu nào về các protein này ở người sử dụng cocaine. Ở đây, chúng tôi trình bày bằng chứng đầu tiên cho thấy mức độ của cả ΔFosB (p=0.0316; t=1.921; df=34) và CaMKII (p=0.0444; t=1.755; df=32) đều tăng lên trong NAc của người nghiện cocaine ( Hình 2D , Bảng 1 ). Dữ liệu này cho thấy việc chúng tôi kiểm tra sự cảm ứng ΔFosB và CaMKII do cocaine gây ra trong NAc của loài gặm nhấm có ý nghĩa lâm sàng đối với chứng nghiện cocaine ở người.

Bảng 1

Đặc điểm mẫu từ người nghiện cocaine ở người và nhóm đối chứng phù hợp

FosB điều chỉnh sao chép CaMKII có chọn lọc trong MSN loại D1 của NAc Shell

Phát hiện cả CaMKII và ΔFosB đều được điều hòa tăng lên bởi cocaine trong NAc của loài gặm nhấm đã dẫn chúng tôi đến việc xác định xem ΔFosB có thể điều hòa quá trình phiên mã của gen CaMKII hay không. Trước đây, chúng tôi đã báo cáo CaMKIIα là mục tiêu tiềm năng của ΔFosB trong phân tích microarray không thiên vị của NAc ( McClung và Nestler, 2003 ), nhưng phát hiện này không được xác nhận thêm trong nghiên cứu đó. Đầu tiên, chúng tôi sử dụng ChIP định lượng (qChIP—ChIP tiếp theo là PCR định lượng) để xác định xem ΔFosB có liên kết với vùng khởi động gen CaMKIIα trong NAc của chuột đực trưởng thành hay không, và nhận thấy một cách đáng chú ý rằng sự liên kết này tăng lên đáng kể do sử dụng cocaine mãn tính ở vùng vỏ (p=0.0133; t=2.901; df=12), nhưng không phải ở vùng lõi ( Hình 3A ). Để hiểu rõ hơn các cơ chế liên quan đến sự khác biệt cụ thể theo vùng này trong liên kết ΔFosB với promoter CaMKIIα, chúng tôi đã sử dụng qChIP để mô tả trạng thái biến đổi histone tại vùng gen này. Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh cocaine gây ra sự acetyl hóa H3 tại promoter CaMKIIα trong toàn bộ NAc của chuột ( Wang et al., 2010 ). Ngược lại, chúng tôi nhận thấy rằng cocaine làm giảm sự acetyl hóa H3 tại promoter CaMKIIα một cách chọn lọc ở vùng lõi NAc ( Hình 3B ; p=0.0213; t=2.726; df=10), mà không có sự thay đổi rõ rệt nào ở vùng vỏ, phù hợp với những thay đổi chromatin cụ thể theo vùng ngoài liên kết ΔFosB. qChIP đối với dấu hiệu ức chế, dimethyl hóa lysine 9 của H3 (H3K9me2), cho thấy xu hướng giảm ở cả vùng vỏ và vùng lõi ( Hình 3C ).

Để xác định xem ΔFosB có điều hòa quá trình phiên mã CaMKIIα in vivo hay không , chúng tôi đã sử dụng hai dòng chuột chuyển gen kép biểu hiện quá mức ΔFosB một cách cảm ứng, đặc hiệu ở các tế bào thần kinh MSN loại D1 so với loại D2, theo cách được kiểm soát bằng cách cho uống doxycycline trong nước uống ( Chen et al., 1998 ; Kelz et al., 1999 ; Werme et al., 2002 ). Chuột đực trưởng thành biểu hiện quá mức ΔFosB chỉ ở các tế bào thần kinh MSN loại D1 có mức độ mRNA CaMKIIα tăng đáng kể ở NAc (p=0.0337; t=1.996; df=13), một hiệu ứng không thấy ở chuột biểu hiện quá mức ΔFosB chủ yếu ở các tế bào thần kinh MSN loại D2 ( Hình 3D ). Sự gia tăng mRNA CaMKIIα, được gây ra bởi sự biểu hiện ΔFosB trong các tế bào thần kinh MSN loại D1, đi kèm với sự gia tăng đồng thời protein CaMKIIα ở cả vùng vỏ NAc (p=0.0030; t=3.578; df=14) và vùng lõi (p=0.0392; t=2.275; df=14; Hình 3E và F ). Những dữ liệu này chứng minh rằng ΔFosB có khả năng thúc đẩy sự biểu hiện gen CaMKIIα trong các tế bào thần kinh MSN loại D1 ở cả hai vùng phụ, mặc dù Hình 3B cho thấy những thay đổi chromatin do cocaine gây ra tại vùng promoter CaMKIIα (ví dụ: giảm acetylation) ngăn cản ΔFosB điều chỉnh tăng CaMKII ở vùng lõi sau khi sử dụng cocaine.

Vì dữ liệu từ chuột chuyển gen của chúng tôi cho thấy sự cảm ứng ΔFosB đối với biểu hiện gen CaMKII là đặc hiệu đối với các tế bào thần kinh MSN loại D1 trong NAc, nên tiếp theo chúng tôi tìm cách xác định xem sự điều hòa tăng CaMKII phụ thuộc vào cocaine có cần sự hoạt hóa của thụ thể dopamine D1 hay không. Chuột đực trưởng thành được cho dùng cocaine mãn tính hoặc dung dịch muối sinh lý như trước, nhưng 30 phút trước mỗi lần tiêm, chuột trong nhóm cocaine được tiêm phúc mạc dung dịch muối sinh lý, chất đối kháng D1 SCH 23390 (0.5 mg/kg) hoặc chất đối kháng thụ thể D2 eticlopride (0.5 mg/kg). Các con vật được phân tích 24 giờ sau lần tiêm cocaine cuối cùng. Phân tích Western blotting cho thấy chất đối kháng D1, chứ không phải D2, đã ngăn chặn hoàn toàn sự gia tăng ΔFosB do cocaine gây ra (p<0.0001; F=18.96; df=18), như đã được báo cáo trước đây ( Nye et al., 1995 ), cũng như sự gia tăng CaMKII (p=0.0005; F=10.99; df=18; Hình 3G và H ). Những dữ liệu này ủng hộ giả thuyết rằng cocaine tác động đến sự gia tăng biểu hiện gen CaMKII thông qua ΔFosB, đặc biệt là ở các tế bào thần kinh MSN loại D1 của vỏ NAc. Trong các nghiên cứu tương lai, việc chứng minh trực tiếp tác động đặc hiệu theo loại tế bào này của cocaine lên biểu hiện CaMKII trong vùng não này là rất quan trọng.

FosB là cả cần thiết và đủ cho cocaine cảm ứng CaMKII trong NAc Shell

Để bổ sung cho việc sử dụng chuột biến đổi gen kép, tiếp theo chúng tôi nghiên cứu vai trò của ΔFosB trong việc trung gian gây cảm ứng CaMKIIα bởi cocaine bằng cách sử dụng phương pháp chuyển gen qua virus ở chuột. Chúng tôi tiêm các hạt virus adeno-associated (AAV) vào vỏ NAc của chuột đực trưởng thành (nơi có thể nhắm mục tiêu chọn lọc) để biểu hiện quá mức ΔFosB cộng với GFP hoặc chỉ GFP. Sau đó, các con vật được tiêm một liều cocaine 10 mg/kg vào phúc mạc. Những con vật biểu hiện quá mức ΔFosB/GFP cho thấy phản ứng vận động tăng lên so với những con vật chỉ biểu hiện quá mức GFP ( Hình 4A ). 24 giờ sau khi tiêm cocaine liều duy nhất, mô NAc dương tính với GFP được cắt bỏ từ những con vật này bằng cách mổ xẻ dưới nguồn sáng huỳnh quang. Phân tích Western blotting của mô này ( Hình 4B và C ) cho thấy sự biểu hiện quá mức mạnh mẽ của ΔFosB cũng như sự gia tăng đáng kể tổng lượng protein CaMKIIα so với động vật GFP (p=0.0070; t=2.894; df=30), tương tự như sự cảm ứng được thấy khi sử dụng cocaine mãn tính. Ngoài ra, sự tự phosphoryl hóa CaMKIIα tại Thr286 (chỉ thị cho sự hoạt hóa enzyme) đã tăng lên do sự biểu hiện quá mức của ΔFosB (p=0.0330; t=2.243; df=28), cũng như sự phosphoryl hóa chất nền CaMKII, Ser831 của GluA1 (p=0.0540; t=2.012; df=28), một lần nữa bắt chước tác động của cocaine mãn tính ( Hình 1C và D ). Tóm lại, những dữ liệu này cung cấp thêm bằng chứng cho thấy sự biểu hiện ΔFosB trong vỏ NAc là đủ để gây ra hiện tượng nhạy cảm vận động với cocaine và để gây ra sự cảm ứng và hoạt hóa CaMKII trong vùng phụ này.

Chúng tôi đã sử dụng một phương pháp tương tự để xác định xem ΔFosB có cần thiết cho sự cảm ứng CaMKIIα do cocaine gây ra trong vỏ NAc hay không. AAV được sử dụng để biểu hiện quá mức một protein JunD bị cắt ngắn, được gọi là ΔJunD, là một chất điều hòa âm tính của sự hoạt hóa phiên mã ΔFosB ( Winstanley et al., 2007 ) cùng với GFP hoặc chỉ GFP. Hai tuần sau, khi sự biểu hiện gen chuyển đạt mức tối đa, động vật được cho dùng cocaine (10 mg/kg) hoặc dung dịch muối sinh lý hàng ngày trong 7 ngày, và được kiểm tra phản ứng vận động đối với thử thách cocaine (5 mg/kg) 24 giờ sau lần tiêm mãn tính cuối cùng ( Hình 4D ). Sự biểu hiện quá mức của ΔJunD đã ngăn chặn sự nhạy cảm vận động đối với cocaine, đồng thời ngăn chặn sự cảm ứng và hoạt hóa CaMKIIα trong vỏ NAc ( Hình 4E và F ; p=0.0437; F=2.997; tổng df=38), cho thấy hoạt động phiên mã của ΔFosB là cần thiết cho sự cảm ứng CaMKIIα do cocaine gây ra trong vùng phụ này. Điều thú vị là, chúng tôi nhận thấy rằng ΔJunD làm giảm mức độ ΔFosB trong cả điều kiện dùng dung dịch muối và điều kiện dùng cocaine (p=0.0004; F=8.110; df=35), làm dấy lên khả năng mới rằng ΔFosB phụ thuộc vào hoạt động của AP-1 để duy trì mức độ biểu hiện của chính nó.

Phosphorylates CaMKII ΔFosB tại Ser27

Sử dụng ống nghiệm Xét nghiệm protein kinase, chúng tôi đã xác định rằng ΔFosB tinh khiết là chất nền mạnh mẽ cho CaMKIIα. Ủ của anh ấy₆-ΔFosB với CaMKIIα và ATP đã gây ra sự thay đổi tăng lên trong khả năng di động điện di của ΔFosB (Hình 5A); một số ban nhạc kết quả đề xuất nhiều trang web phosphoryl hóa. Giống ống nghiệm xét nghiệm kinase bằng [γ-³²P] ATP cho thấy sự kết hợp của phosphate phóng xạ vào các dải ΔFosB đã thay đổi (Hình 5B), chứng minh sự phosphoryl hóa trực tiếp của protein. Chúng tôi đã tạo ra một kháng thể đặc hiệu phospho với Ser27 đặc trưng trước đó của ΔFosB (Ulery và cộng sự, 2006). Mặc dù kháng thể này không tạo ra tín hiệu chống lại các chất chiết xuất từ ​​não có chứa Ser27-phosphorylated FosB (dữ liệu không được hiển thị), chúng tôi đã có thể phát hiện sự phosphoryl hóa Ser27 trong ống nghiệm xét nghiệm kinase bằng CaMKII (Hình 5B). Các phân tích động học của quá trình phosphoryl hóa CaMKII của ΔFosB chỉ ra rằng nó là chất nền mạnh cho kinase (Hình 5C), với K rõ ràng_M của 5.7 ± 2.0 Điên và K_{CON MÈO} của 2.3 ± 0.3min^-1. Những kết quả này tương đương với nhiều đặc điểm tốt trong cơ thể chất nền của CaMKII (Colbran và Brown, 2004). Ngoài ra, chúng tôi đã xác định rằng phosphorylates CaMKII ΔFosB với phép cân bằng hóa học là 2.27 ± 0.07 mol / mol (Hình 5D), chỉ ra rằng có ít nhất ba vị trí phosphoryl hóa CaMKII trong Ngài₆-ΔFosB protein, phù hợp với Hình 5A.

Để nghiên cứu các vị trí phosphoryl hóa riêng lẻ, chúng tôi đã sử dụng phân tích MS trên các mẫu từ các thí nghiệm kinase in vitro của chúng tôi. Hình 5E minh họa sự phosphoryl hóa ΔFosB tại Ser27 đã được xác định trước đó và tại một số vị trí bổ sung khác (dữ liệu không được hiển thị). Với đặc điểm chức năng đã được xác định trước đó của Ser27, chúng tôi tập trung vào vị trí này bằng cách tạo ra các peptide tổng hợp được đánh dấu bắt chước trạng thái phosphoryl hóa và không phosphoryl hóa của Ser27, sau đó sử dụng lượng peptide đã biết làm chuẩn trong phân tích MRM của ΔFosB trước và sau khi phosphoryl hóa in vitro bởi CaMKII. Định lượng tiếp theo ( Hình 5F ) xác nhận rằng Ser27 là chất nền mạnh cho CaMKII. Những kết quả này cho thấy rằng, trong số nhiều dư lượng được phosphoryl hóa trong ΔFosB, Ser27 là chất nền đặc biệt hiệu quả cho CaMKII.

CaMKII Mediates Cocaine Tích lũy ΔFosB trong NAc Shell

Vì CaMKII có thể phosphoryl hóa ΔFosB trong ống nghiệm tại một vị trí làm tăng đáng kể tính ổn định của nó trong ống nghiệm và trong cơ thể sống ( Ulery et al., 2006 ; Ulery-Reynolds et al., 2009 ), chúng tôi đã xác định xem hoạt động của CaMKII có kiểm soát mức độ ΔFosB trong NAc trong cơ thể sống hay không. Để giải quyết câu hỏi này, trước tiên chúng tôi đã sử dụng một dòng chuột biểu hiện quá mức đột biến không phụ thuộc canxi của CaMKIIα (T286D) ở nhiều vùng não bao gồm NAc ( Mayford et al., 1996 ; Kourrich et al., 2012 ). Chúng tôi tiêm cho những con chuột đực trưởng thành cùng tuổi, cả chuột đột biến và chuột hoang dã, 20 mg/kg cocaine hoặc dung dịch muối sinh lý mỗi ngày một lần trong 14 ngày, sau đó phân tích các con vật một ngày sau lần tiêm cuối cùng. Chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ ΔFosB cơ bản tăng lên ở các động vật đột biến trong vùng vỏ NAc (p=0.0001; F=9.207; df=37), nhưng không tăng ở vùng lõi ( Hình 5G và H ). Điều đáng ngạc nhiên là, sự cảm ứng ΔFosB phụ thuộc vào cocaine đã bị chặn ở các động vật đột biến ở cả vùng vỏ và vùng lõi, cho thấy rằng, mặc dù CaMKII có thể điều chỉnh trực tiếp sự ổn định của ΔFosB trong vùng vỏ NAc, nó cũng có thể nằm ở thượng nguồn của ΔFosB trong các con đường được kích hoạt bởi cocaine ở cả hai vùng phụ của NAc.

Hoạt động CaMKII là bắt buộc đối với độ dẻo cấu trúc và hành vi qua trung gian ΔFosB

Sự cảm ứng gai thần kinh trên các tế bào thần kinh MSN ở NAc do cocaine gây ra là một trong những sự thích nghi do thuốc gây ra được chứng minh rõ ràng nhất trong vùng não này, và sự cảm ứng gai thần kinh như vậy có liên quan đến các phản ứng hành vi nhạy cảm với thuốc ( Robinson và Kolb, 2004 ; Russo et al., 2010 ) và được báo cáo là có tính chọn lọc đối với các tế bào thần kinh MSN loại D1 ( Lee et al., 2006 ). Gần đây, chúng tôi đã chứng minh rằng sự cảm ứng gai thần kinh ở NAc do cocaine gây ra phụ thuộc vào ΔFosB và chương trình phiên mã hạ nguồn của nó ( Maze et al., 2010 ). Mặc dù có rất nhiều tài liệu liên quan đến sự tham gia của CaMKII trong hình thái và sự cảm ứng gai thần kinh ở các vùng não khác và các hệ thống thí nghiệm ( Jourdain et al., 2003 ; Penzes et al., 2008 ; Okamoto et al., 2009 ), vai trò của nó trong sự hình thành gai thần kinh ở các tế bào thần kinh MSN ở NAc vẫn chưa được nghiên cứu. Do đó, chúng tôi đã xác định xem hoạt động của CaMKII có cần thiết cho sự cảm ứng gai nhánh tế bào thần kinh MSN do ΔFosB trung gian hay không bằng cách sử dụng sự biểu hiện quá mức peptide ức chế CaMKII AC3I được gắn với GFP thông qua HSV, một cấu trúc trước đây đã được chứng minh là có khả năng ức chế hoạt động của CaMKII in vivo ( Zhang et al., 2005 ; Klug et al., 2012 ). Sự biểu hiện quá mức của ΔFosB do virus gây ra trong vỏ NAc của chuột trưởng thành đã dẫn đến sự gia tăng đáng kể mật độ gai thần kinh MSN (p<0.0001; F=8.558; df=59; Hình 6A và B ) như đã được báo cáo trước đây ( Maze et al., 2010 ), và sự gia tăng này chủ yếu được thúc đẩy bởi các loại gai mỏng (p=0.0027; F=5.319; df=59) và gai ngắn (p=0.0378; F=2.988; df=59) (cả hai đều được cho là gai chưa trưởng thành) ( Hình 6C–E ). Không thấy tác động nào trên các gai trưởng thành hơn, có hình dạng nấm. Tuy nhiên, khi GFP-AC3I được biểu hiện đồng thời, sự cảm ứng gai thần kinh của ΔFosB đã bị loại bỏ hoàn toàn ( Hình 6A–E ), cho thấy hoạt động của CaMKII là cần thiết cho sự cảm ứng gai thần kinh của ΔFosB trong vỏ NAc.

Tiếp theo, chúng tôi sử dụng cùng các công cụ virus để xác định xem hoạt động của CaMKII có cần thiết cho tác động của ΔFosB lên độ nhạy cảm hành vi với cocaine hay không. 72 giờ sau khi tiêm virus vào vỏ NAc, động vật được tiêm một liều duy nhất 5 mg/kg cocaine và hoạt động vận động của chúng được ghi lại. Như đã được chứng minh trước đây với sự biểu hiện quá mức ΔFosB bằng AAV kéo dài hơn ( Hình 4A ), sự biểu hiện quá mức ΔFosB qua trung gian HSV làm tăng độ nhạy cảm vận động với cocaine (p=0.0002; F=8.823; df=37; Hình 6F ). Cũng như với sự cảm ứng gai dendrite, việc ức chế hoạt động của CaMKII bằng cách đồng biểu hiện GFP-AC3I đã ngăn chặn hoàn toàn sự gia tăng độ nhạy cảm với cocaine do ΔFosB gây ra, cho thấy hoạt động của CaMKII là cần thiết cho những thay đổi do ΔFosB gây ra trong tác động hành vi của cocaine.

Go to:

Thảo luận

Nghiên cứu hiện tại mô tả một cơ chế phản hồi tích cực mới, trong đó cocaine gây ra sự hình thành ΔFosB trong NAc, điều này làm tăng cường phiên mã gen CaMKIIα một cách chọn lọc trong vỏ NAc . Sau đó, CaMKIIα phosphoryl hóa và ổn định ΔFosB dẫn đến sự tích lũy ΔFosB nhiều hơn và sự cảm ứng CaMKIIα mạnh hơn ( Hình 6G ). Mức độ gia tăng đồng thời của hai protein này trong quá trình tiếp xúc mãn tính với cocaine sau đó góp phần quan trọng vào các phản ứng hành vi nhạy cảm với thuốc. Đây là một giả thuyết đặc biệt hấp dẫn vì cả ΔFosB và CaMKII đều đã được chứng minh trước đây là cần thiết cho các phản ứng hành vi tăng lên đối với cocaine ( Pierce et al., 1998 ; Peakman et al., 2003 ), và chúng tôi tái tạo lại phát hiện này đối với ΔFosB trong vỏ NAc cụ thể bằng cách sử dụng phương pháp virus ( Hình 4 và 66 ).

Mặc dù sự biểu hiện quá mức ΔFosB chuyển gen trong các tế bào thần kinh MSN loại D1 có thể thúc đẩy sự cảm ứng CaMKII ở cả vùng vỏ và lõi NAc của động vật chưa từng tiếp xúc với cocaine, nhưng trong bối cảnh sử dụng cocaine, sự tích lũy ΔFosB nội sinh, xảy ra ở cả hai vùng phụ, thúc đẩy sự cảm ứng CaMKII đặc hiệu ở vùng vỏ NAc. Sự khác biệt này có thể liên quan đến mức độ ΔFosB cao hơn được cảm ứng trong mô hình chuyển gen kép của chúng tôi, tuy nhiên, nó cũng có thể phản ánh khả năng của cocaine trong việc làm thay đổi khác biệt vùng promoter CaMKIIα ở các tế bào thần kinh MSN vùng vỏ so với vùng lõi, để thúc đẩy sự gắn kết ΔFosB ở vùng vỏ hoặc loại trừ nó ở vùng lõi. Trên thực tế, dữ liệu ChIP của chúng tôi, cho thấy sự khử acetyl hóa histon do cocaine gây ra tại vùng promoter gen CaMKIIα chỉ ở vùng lõi NAc, ủng hộ khả năng liên quan đến cơ chế chromatin. Phù hợp với giả thuyết này, sự biểu hiện quá mức ΔFosB trong các tế bào thần kinh MSN loại D1 có thể thúc đẩy sự cảm ứng CaMKIIα trong nhân NAc khi không có cocaine ( Hình 3F ), cho thấy có những sửa đổi tích cực của vùng khởi động CaMKIIα ngăn chặn sự cảm ứng này trong quá trình tiếp xúc cocaine mãn tính. Sự điều chỉnh cấu trúc chromatin tại vùng khởi động CaMKII cũng có thể giải thích tại sao CaMKII được cảm ứng bởi một liều cocaine thử thách trong vỏ NAc của chuột cai nghiện cocaine mãn tính ( Hình 1E ) nhưng không phải ở động vật chưa từng dùng thuốc ( Hình 1D ). Điều này có thể đại diện cho hiệu ứng "mồi gen" biểu sinh của ΔFosB ( Robison và Nestler, 2011 ), và do đó có thể là một cơ chế phân tử của sự ủ bệnh thèm cocaine ( Pickens et al., 2011 ). Tuy nhiên, để sự thay đổi chromatin này có liên quan đến sự ủ bệnh thèm thuốc, nó phải tăng lên theo thời gian. Sẽ rất thú vị để xác định xem liệu điều này có đúng hay không, và nghiên cứu xem các gen khác có biểu hiện sự điều hòa phụ thuộc vào ΔFosB, đặc hiệu theo vùng bởi cocaine hay không. Điều quan trọng cần lưu ý là vòng phản hồi tích cực mà chúng tôi mô tả không dẫn đến sự tích lũy vô tận của CaMKII hoặc ΔFosB ( Hình 1E ); việc khám phá ra "phanh" phân tử chịu trách nhiệm cho điều này là một mục tiêu quan trọng của các nghiên cứu trong tương lai.

Các chức năng đã biết của FosB và CaMKII trong một số hệ thống thử nghiệm và vùng não hội tụ ở nhiều cấp độ (Hình 6F). Cả hai phân tử có liên quan mật thiết đến sự phát triển cột sống đuôi gai: CaMKII tương tác với các tế bào actin (tế bàoOkamoto và cộng sự, 2009), điều chỉnh kích thước đầu cột sống (Matsuzaki và cộng sự, 2004), và là cả cần thiết và đủ cho sự gia tăng do độ dẻo của filmaia và số lượng khớp thần kinh trong nuôi cấy lát cắt vùng đồi thị (Jourdain và cộng sự, 2003), wHile ΔFosB là cần thiết và đủ để hình thành gai cột sống do cocaine trong NAc MSNs (Mê cung và cộng sự, 2010). Ngoài ra, cả hai phân tử có liên quan đến sự điều hòa các thụ thể glutamate AMPA. CaMKII không điều chỉnh tổng mức các tiểu đơn vị thụ thể AMPA, nhưng thúc đẩy việc chèn các thụ thể AMPA vào các khớp thần kinh và làm tăng độ dẫn kênh AMPA bằng cách phosphoryl hóa GlamA1 tại Ser831 trong các tế bào thần kinh hình chóp hippocampal trong nuôi cấy và trong cơ thể (được xem xét trong (Malinow và Malenka, 2002; Colbran và Brown, 2004)). Sự gia tăng buôn bán như vậy của GlamA1 đến khớp thần kinh cũng có liên quan đến hành động cocaine mạn tính (Boudreau và Sói, 2005). Hơn nữa, các phản ứng hành vi đối với kích hoạt thụ thể AMPA trong NAc được tăng cường nhờ sự biểu hiện quá mức CaMKIIα theo cách phụ thuộc thụ thể dopamine D1 (Ca sĩ và cộng sự, 2010). Sự biểu hiện quá mức đặc hiệu D1 dài hạn của ΔFosB đã được chứng minh là gây ra sự phiên mã của GlamA2 trong NAc (Kelz và cộng sự, 1999), làm giảm bớt các phản ứng AMPA qua trung gian thông qua GlamA1, trong khi chúng tôi chỉ ra ở đây rằng ΔFosB ngắn hạn quá mức cũng như phơi nhiễm cocaine ngắn hạn không ảnh hưởng đến tiểu đơn vị này (Hình 1). Tuy nhiên, gần đây chúng tôi đã phát hiện ra rằng sự biểu hiện quá mức ΔFosB ngắn hạn tuy nhiên làm giảm phản ứng AMPA trong MSN loại D1 trong NAc (Grueter và cộng sự, 2013). Những dữ liệu này cho thấy các cơ chế khác biệt theo thời gian có thể tạo thành một chuỗi các phản ứng thần kinh phụ thuộc vào thời gian đối với cocaine, điều này làm cho các khía cạnh khác nhau của tiến triển nghiện chưa được hiểu rõ. Ở cấp độ hành vi, cả CaMKII và ΔFosB đều cần thiết cho sự nhạy cảm vận động với cocaine (xem ở trên) và cả hai đều được yêu cầu để tự uống cocaine bền vững ở loài gặm nhấm (Colby và cộng sự, 2003; Wang và cộng sự, 2010), gợi ý rằng hai protein rất quan trọng đối với cả sự thích ứng hành vi ngắn và dài hạn đối với phơi nhiễm thuốc, mặc dù thông qua các cơ chế cơ bản khác biệt. Có lẽ, ΔFosB và CaMKII điều chỉnh các thích ứng hành vi phức tạp như vậy thông qua các thay đổi trong chức năng synap NAc, mặc dù cần nhiều công việc hơn nữa để liên kết trực tiếp các hiện tượng synap với thay đổi hành vi.

Enzyme CaMKII đồng thời tương tác với nhiều protein liên kết với khớp thần kinh ( Robison et al., 2005 ), được cho là điều chỉnh sự định vị của nó đến mật độ sau khớp thần kinh (PSD), một hiện tượng được cho là quan trọng đối với tính dẻo dai của khớp thần kinh. Cụ thể, sự tương tác của CaMKII với tiểu đơn vị GluN2B của thụ thể glutamate loại NMDA gần đây đã được chứng minh là điều chỉnh cả tính dẻo dai của khớp thần kinh và quá trình học tập ( Halt et al., 2012 ). Trong khi peptide AC3I bắt chước miền tự ức chế của CaMKII, và do đó ức chế hoạt động xúc tác của enzyme, nó cũng ngăn chặn nhiều tương tác protein-protein ( Strack et al., 2000 ; Robison et al., 2005 ). Do đó, các tác động về hành vi và hình thái của HSV-GFP-AC3I được báo cáo ở đây có thể xảy ra thông qua việc giảm quá trình phosphoryl hóa các protein đích của CaMKII, thay đổi trong việc nhắm mục tiêu của CaMKII, hoặc thay đổi vai trò cấu trúc được đề xuất của CaMKII tại các khớp thần kinh ( Lisman et al., 2002 ).

Việc giới hạn vòng lặp ΔFosB-CaMKII được đề xuất ở vùng vỏ NAc là điều đáng chú ý, vì các nghiên cứu gần đây đã chứng minh một số khác biệt về sinh lý giữa vùng vỏ và lõi NAc khi phản ứng với việc sử dụng cocaine, một quan điểm được xác nhận bởi dữ liệu iTRAQ không thiên vị của chúng tôi (Bảng S1). Các tế bào thần kinh MSN ở vùng vỏ NAc cho thấy sự suy giảm khả năng phát xung sau khi sử dụng cocaine mãn tính kéo dài trong nhiều tuần, trong khi các tế bào thần kinh MSN ở lõi của cùng một nhóm động vật lại cho thấy sự gia tăng khả năng phát xung tạm thời (1-3 ngày) và trở lại mức cơ bản trong vòng 2 tuần ( Kourrich và Thomas, 2009 ). Ngoài ra, nhiều protein synap được điều chỉnh khác nhau ở vùng vỏ NAc so với lõi của động vật tiếp xúc với cocaine mãn tính, bao gồm cả GluA2 ( Knackstedt et al., 2010 ). Vì amphetamine mãn tính gây ra sự tăng sinh CaMKIIα đặc hiệu ở vùng vỏ NAc ( Loweth et al., 2010 ), nên không có gì đáng ngạc nhiên khi chúng tôi tìm thấy hiệu ứng tương tự với cocaine. Tuy nhiên, vì ΔFosB được cảm ứng ở cả vùng vỏ và lõi NAc do sử dụng cocaine mãn tính ( Perrotti et al., 2008 ), và vì chúng tôi chứng minh rằng sự cảm ứng CaMKIIα ở vùng vỏ phụ thuộc vào ΔFosB, nên phát hiện của chúng tôi cung cấp bằng chứng mới về các cơ chế phiên mã khác nhau tại vùng khởi động CaMKIIα giữa hai vùng phụ này, chịu trách nhiệm cho sự cảm ứng chọn lọc của CaMKIIα ở vùng vỏ.

Nhiều nghiên cứu gần đây tập trung vào việc phân định sự khác biệt giữa các tế bào thần kinh MSN loại D1 và D2 ​​ở nhân accumbens (NAc). Mặc dù cả thụ thể D1 và D2 ​​đều tham gia vào tác dụng gây hưng phấn của cocaine ( Self, 2010 ), nhưng các nghiên cứu gần đây cho thấy việc kích hoạt quang di truyền các tế bào thần kinh MSN loại D1 làm tăng phản ứng hành vi đối với cocaine, trong khi việc kích hoạt các tế bào thần kinh MSN loại D2 lại có tác dụng ngược lại ( Lobo et al., 2010 ). Phù hợp với những phát hiện này, chuột bị loại bỏ thụ thể D1 bị thiếu khả năng tự sử dụng cocaine ( Caine et al., 2007 ), trong khi chuột bị loại bỏ thụ thể D2 thì không ( Caine et al., 2002 ). Việc tiêm trực tiếp chất chủ vận D1 vào NAc kích hoạt hành vi tìm kiếm cocaine trong các mô hình tái nghiện ( Self, 2010 ). Điều thú vị là, hiệu ứng này đòi hỏi sự gia tăng hoạt động CaMKII phụ thuộc vào thụ thể D1 ở vùng vỏ NAc, nhưng không phải vùng lõi ( Anderson et al., 2008 ), một kết quả phù hợp với vòng lặp ΔFosB-CaMKII đặc hiệu cho D1 và vùng vỏ được đề xuất ở đây.

Trước đây chúng tôi đã báo cáo rằng Ser27 trong ΔFosB có thể được phosphoryl hóa bởi casein kinase-2 ( Ulery et al., 2006 ), tuy nhiên, ở đây chúng tôi chứng minh rằng CaMKII phosphoryl hóa ΔFosB tại vị trí này và các vị trí khác với động học và tỷ lệ phản ứng cao hơn nhiều và có thể tái tạo lại giá trị M _r biểu kiến ​​cao hơn được quan sát thấy đối với ΔFosB ( Hình 5A ) khi tiếp xúc với cocaine in vivo ( Nestler, 2008 ). Chúng ta đã biết rằng sự phosphoryl hóa Ser27 làm tăng tính ổn định và hoạt động phiên mã của ΔFosB ( Ulery et al., 2006 ; Ulery và Nestler, 2007 ; Ulery-Reynolds et al., 2009 ). Công việc tiếp theo sẽ tập trung vào việc xác định và hậu quả chức năng của các vị trí phosphoryl hóa ΔFosB mới được chỉ ra bởi nghiên cứu hiện tại.

Vòng phản hồi tích cực được mô tả ở đây cung cấp một cơ chế mới khả thi giải thích cách sử dụng cocaine lặp đi lặp lại dẫn đến những bất thường ngày càng trầm trọng ở nhân accumbens (NAc). Như vậy, con đường sinh hóa này có thể là mục tiêu quan trọng cho các can thiệp điều trị trong tương lai đối với các rối loạn nghiện. Vì CaMKII có mặt khắp nơi và cần thiết cho nhiều chức năng thần kinh và hành vi cơ bản, nên việc sử dụng trực tiếp các chất ức chế CaMKII đã được tránh trong điều trị nghiện. Dữ liệu của chúng tôi cho thấy rằng việc nhắm mục tiêu tinh tế hơn vào cơ chế cảm ứng CaMKII, đặc hiệu cho từng loại tế bào và vùng phụ của mạch khen thưởng trong não, có thể cung cấp một mục tiêu điều trị giúp tránh được những biến chứng của việc ức chế CaMKII toàn thân.

Go to:

Lời cảm ơn

Công việc này được hỗ trợ bởi các khoản tài trợ từ Viện quốc gia về lạm dụng ma túy (EJN), Trung tâm Proteomics NIDA-Yale DA018343 (AJR và EJN), và Quỹ Hartwell (AJR). Các tác giả xin cảm ơn Gabby Rundenko vì món quà hào phóng của FosB và Roger Colbran vì món quà hào phóng của CaMKIIα tinh khiết.

Go to:

dự án

1. Ahmed SH, Koob GF. Chuyển từ lượng thuốc vừa phải sang quá mức: thay đổi điểm đặt hedonic. Khoa học. 1998; 282: 298 tầm 300. [PubMed]
2. Anderson SM, KR nổi tiếng, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, Bass CE, Terwilliger EF, Cha JH, Pierce RC. CaMKII: một cây cầu sinh hóa liên kết các hệ thống dumbamine và glutamate trong việc tìm kiếm cocaine. Nat Neurosci. 2008; 11: 344 tầm 353. [PubMed]
3. Boudreau AC, Sói ME. Nhạy cảm hành vi với cocaine có liên quan đến tăng biểu hiện bề mặt thụ thể AMPA trong nhân tế bào. J Neurosci. 2005; 25: 9144 tầm 9151. [PubMed]
4. Brickey DA, Colbran RJ, Fong YL, Sodumming TR. Biểu hiện và đặc tính của tiểu đơn vị alpha của protein kinase II phụ thuộc Ca2 + / peaceodulin bằng hệ thống biểu hiện baculovirus. BioCH Biophys Res Cộng đồng. 1990; 173: 578 tầm 584. [PubMed]
5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, Kulagowski J, Vallone D, Saiardi A, Borrelli E. Vai trò của thụ thể giống dopamine D2 trong tự quản cocaine: nghiên cứu với chuột đột biến thụ thể D2 nhân vật phản diện. J Neurosci. 2; 2002: 22 tầm 2977. [PubMed]
6. Caine SB, Thomsen M, Gabriel KI, Berkowitz JS, Gold LH, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. Thiếu tự quản cocaine ở chuột hạ gục thụ thể dopamine D1. J Neurosci. 2007; 27: 13140 tầm 13150. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
7. Carle TL, Ohqueri YN, Ohqueri YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ. Các cơ chế phụ thuộc và phụ thuộc đáng tin cậy cho sự mất ổn định của FosB: xác định các miền khử FosB và ý nghĩa đối với sự ổn định của DeltaFosB. Ne J Neurosci. 2007; 25: 3009 tầm 3019. [PubMed]
8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Động vật chuyển gen với biểu hiện gen mục tiêu, cảm ứng trong não. Dược điển Mol. 1998; 54: 495 tầm 503. [PubMed]
9. Christoffel DJ, Golden SA, Dumitriu D, Robison AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Able JL, Eisch AJ, Dietz DM, Ferguson D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH , Russo SJ. IkappaB kinase điều chỉnh sự thất bại xã hội gây ra bởi khớp thần kinh và tính dẻo hành vi. J Neurosci. 2011; 31: 314 tầm 321. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
10. Colbran RJ. Bất hoạt protein kinase II phụ thuộc Ca2 + / peaceodulin bằng cách tự động phosphoryl hóa cơ bản. J Biol Hóa. 1993; 268: 7163 tầm 7170. [PubMed]
11. Colbran RJ. Phosphatase protein và chất dẻo synap phụ thuộc canxi / peaceodulin. J Neurosci. 2004; 24: 8404 tầm 8409. [PubMed]
12. Colbran RJ, Nâu AM. Protein kinase II phụ thuộc canxi / peaceodulin và độ dẻo synap. Curr Opin Neurobiol. 2004; 14: 318 tầm 327. [PubMed]
13. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Tự DW. Sự biểu hiện quá mức của loại tế bào đặc biệt của DeltaFosB giúp tăng cường khuyến khích cocaine. J Neurosci. 2003; 23: 2488 tầm 2493. [PubMed]
14. Covington HE, 3rd, Mê cung I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohqueri YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3rd, Wu EY, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Hag EJ. Tác dụng chống trầm cảm của thuốc ức chế histone deacetylase. J Neurosci. 2009; 29: 11451 tầm 11460. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
15. Davalos A, Fernandez-Hernando C, Sowa G, Derakhshan B, Lin MI, Lee JY, Zhao H, Luo R, Colangelo C, Sessa WC. Định lượng protein của protein điều hòa caveolin-1: đặc tính của polymerase i và yếu tố giải phóng phiên mã / CAVIN-1 IN trong các tế bào nội mô. Mol tế bào Proteomics. 2010; 9: 2109 tầm 2124. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
16. Dumais A, Lesage AD, Alda M, Rouleau G, Dumont M, Chawky N, Roy M, Mann JJ, Benkelfat C, Turecki G. Các yếu tố nguy cơ để hoàn thành tự tử trong trầm cảm lớn: một nghiên cứu kiểm soát trường hợp về hành vi bốc đồng và hung hăng trong đàn ông. Am J Tâm thần học. 2005; 162: 2116 tầm 2124. [PubMed]
17. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC. FosB điều chỉnh khác nhau hạt nhân accumbens chức năng con đường trực tiếp và gián tiếp. Proc Natl Acad Sci Hoa Kỳ. 2013 trong báo chí. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
18. Halt AR, Dallap Square RF, Zhou Y, Stein IS, Qian H, Juntti S, Wojcik S, Brose N, Silva AJ, Hell JW. CaMKII liên kết với GlamN2B rất quan trọng trong quá trình củng cố bộ nhớ. EMBO J. 2012; 31: 1203 tầm 1216. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. Chuột đột biến FosB: mất cảm ứng cocaine mãn tính đối với các protein liên quan đến Fos và tăng độ nhạy cảm với các tác động tâm lý và bổ ích của cocaine. Proc Natl Acad Sci Hoa Kỳ A. 1997; 94: 10397–10402. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
20. Ito R, Robbins TW, Everitt BJ. Kiểm soát khác biệt đối với hành vi tìm kiếm cocaine bằng nhân và vỏ. Nat Neurosci. 2004; 7: 389 tầm 397. [PubMed]
21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henry L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. Thuộc tính kích thước và liên kết DNA của yếu tố phiên mã DeltaFosB. Hóa sinh. 2007; 46: 8360 tầm 8372. [PubMed]
22. Jourdain P, Fukunaga K, Muller D. Protein kinase II phụ thuộc canxi / peaceodulin góp phần vào sự tăng trưởng filmaia phụ thuộc vào hoạt động và hình thành cột sống. J Neurosci. 2003; 23: 10645 tầm 10649. [PubMed]
23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picci Nestler EJ. Biểu hiện của yếu tố phiên mã deltaFosB trong não kiểm soát độ nhạy cảm với cocaine. Thiên nhiên. 1999; 401: 272 tầm 276. [PubMed]
24. Klug JR, Mathur BN, Kash TL, Wang HD, Matthews RT, Robison AJ, Anderson ME, Deutch AY, Lovinger DM, Colbran RJ, Winder DG. Sự ức chế di truyền của CaMKII trong các tế bào thần kinh trung bình Dorsal Spiny Neurons làm giảm các khớp thần kinh kích thích chức năng và tăng cường khả năng kích thích nội tại. PLoS Một. 2012; 7: e45323. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW. Huấn luyện tuyệt chủng sau khi tự uống cocaine gây ra tính dẻo glutamatergic để ức chế tìm kiếm cocaine. J Neurosci. 2010; 30: 7984 tầm 7992. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
26. Kourrich S, Thomas MJ. Các tế bào thần kinh tương tự, thích nghi ngược lại: kinh nghiệm kích thích tâm thần khác nhau làm thay đổi các đặc tính bắn trong lõi accumbens so với vỏ. J Neurosci. 2009; 29: 12275 tầm 12283. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
27. Kourrich S, Klug JR, Mayford M, Thomas MJ. Tác dụng độc lập của AMPAR của alphaCaMKII tiền đình thúc đẩy sự nhạy cảm của phần thưởng cocaine. J Neurosci. 2012; 32: 6578 tầm 6586. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, Koo JW, Kalahasti G, Bradbury KR, Taylor SV, Mê cung I, Kumar A, Graham A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Nestler EJ, . Vai trò của yếu tố hạt nhân kappaB trong quá mẫn do căng thẳng qua trung gian hormone ở chuột cái. Tâm thần sinh học. 2009; 65: 874 tầm 880. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
29. Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Cocaine gây ra sự hình thành gai cột sống trong D1 và D2 chứa các tế bào thần kinh gai trung bình chứa thụ thể dopamine trong nhân tế bào. Proc Natl Acad Sci US A. 2006; 103: 3399 XN 3404. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
30. Lisman J, Schulman H, Cline H. Cơ sở phân tử của chức năng CaMKII trong bộ nhớ synap và hành vi. Nat Rev Neurosci. 2002; 3: 175 tầm 190. [PubMed]
31. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Sun H, Damez-Werno D, Dietz DM, Zaman S, Koo JW, Kennedy PJ, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler EJ. Mất loại đặc hiệu tế bào của tín hiệu BDNF bắt chước kiểm soát quang sinh của phần thưởng cocaine. Khoa học. 2010; 330: 385 tầm 390. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
32. Loweth JA, Baker LK, Guptaa T, Guillory AM, Vezina P. Ức chế CaMKII trong vỏ accumbens hạt nhân làm giảm lượng amphetamine tăng cường ở chuột nhạy cảm. Thần kinh Lett. 2008; 444: 157 tầm 160. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
33. Loweth JA, Ca sĩ BF, Baker LK, Wilke G, Inamine H, Bubula N, Alexander JK, Carlezon WA, Jr, Neve RL, Vezina P. Sự biểu hiện quá mức của protein kinase II phụ thuộc vào alpha-Ca2 + / peaceodulin tăng cường đáp ứng hành vi với amphetamine. J Neurosci. 2010; 30: 939 tầm 949. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
34. Malinow R, Malenka RC. Buôn bán thụ thể AMPA và dẻo khớp. Annu Rev Neurosci. 2002; 25: 103 tầm 126. [PubMed]
35. Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. Cơ sở cấu trúc của tiềm lực lâu dài trong các gai đuôi đơn. Thiên nhiên. 2004; 429: 761 tầm 766. [PubMed]
36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, Hawkins RD, Kandel ER. Kiểm soát sự hình thành bộ nhớ thông qua sự biểu hiện quy định của gen chuyển CaMKII. Khoa học. 1996; 274: 1678 tầm 1683. [PubMed]
37. Mê cung I, Covington HE, 3rd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, Cơ khí M, Mouzon E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Scha Nestler EJ. Vai trò thiết yếu của histone methyltransferase G9a trong độ dẻo gây ra bởi cocaine. Khoa học. 2010; 327: 213 tầm 216. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
38. McClung CA, Nestler EJ. Quy định biểu hiện gen và phần thưởng cocaine của CREB và DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208 tầm 1215. [PubMed]
39. Nestler EJ. Ôn tập. Cơ chế phiên mã của nghiện: vai trò của DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245 tầm 3255. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
40. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Các nghiên cứu dược lý về việc điều chỉnh cảm ứng kháng nguyên mãn tính liên quan đến FOS bằng cocaine ở vùng vân và hạt nhân. J Pharmacol Exp Ther. 1995; 275: 1671 tầm 1680. [PubMed]
41. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. Vai trò của CaMKII và F-actin trong tính dẻo cấu trúc của gai gai: một bản sắc phân tử tiềm năng của thẻ synap? Sinh lý học (Bethesda) 2009; 24: 357 XN 366. [PubMed]
42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Taylor JR. DeltaFosB trong nhân accumbens điều chỉnh hành vi và động lực của công cụ gia cố thực phẩm. J Neurosci. 2006; 26: 9196 tầm 9204. [PubMed]
43. Paxinos G, Watson C. Bộ não chuột trong tọa độ lập thể. Phiên bản 6th. Amsterdam; Boston: Nhà xuất bản Học thuật / Elsevier; XUẤT KHẨU.
44. MC đỉnh cao, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Biểu hiện cụ thể ở vùng não của một đột biến âm tính chi phối của c-Jun ở chuột biến đổi gen làm giảm độ nhạy cảm với cocaine. Não Res. 2003; 970: 73 tầm 86. [PubMed]
45. Penze P, Cahill ME, Jones KA, Srivastava DP. Tín hiệu hội tụ CaMK và RacGEF kiểm soát cấu trúc và chức năng đuôi gai. Xu hướng Biol di động. 2008; 18: 405 tầm 413. [PubMed]
46. Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ. Cảm ứng deltaFosB trong các cấu trúc não liên quan đến phần thưởng sau khi bị căng thẳng mãn tính. J Neurosci. 2004; 24: 10594 tầm 10602. [PubMed]
47. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Mê cung I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Mô hình khác biệt của cảm ứng DeltaFosB trong não bằng thuốc lạm dụng. Khớp thần kinh. 2008; 62: 358 tầm 369. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, Fanous S, Hope BT, Shaham Y. Neurobiology của sự ươm mầm của sự thèm thuốc. Xu hướng Neurosci. 2011; 34: 411 tầm 420. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
49. Pierc RC, EA nhanh, Sậy DC, Morgan ZR, Kalivas PW. Các sứ giả thứ hai qua trung gian canxi điều chỉnh biểu hiện của sự nhạy cảm hành vi với cocaine. J Pharmacol Exp Ther. 1998; 286: 1171 tầm 1176. [PubMed]
50. Quirion R, Robitaille Y, Martial J, Chabot JG, Lemoine P, Pilapil C, Dalpe M. Chụp tự động thụ thể não người bằng cách sử dụng toàn bộ phần bán cầu: một phương pháp chung giúp giảm thiểu tối đa các mô. Khớp thần kinh. 1987; 1: 446 tầm 454. [PubMed]
51. Robinson TE, Kolb B. Độ dẻo cấu trúc liên quan đến phơi nhiễm với thuốc lạm dụng. Thần kinh học. 2004; 47 (Cung cấp 1): 33 XN XNX. [PubMed]
52. Robison AJ, Nestler EJ. Cơ chế phiên mã và biểu sinh của nghiện. Nat Rev Neurosci. 2011; 12: 623 tầm 637. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
53. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ. Tương tác đa trị của protein kinase II phụ thuộc canxi / peaceodulin với các protein mật độ sau synap NR2B, densin-180 và alpha-actinin-2. J Biol Hóa. 2005; 280: 35329 tầm 35336. [PubMed]
54. Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A, DJ Pappin. Định lượng protein đa thành phần trong Saccharomyces cerevisiae bằng cách sử dụng thuốc thử gắn thẻ isobaric phản ứng amin. Mol tế bào Proteomics. 2004; 3: 1154 tầm 1169. [PubMed]
55. Russo SJ, Dietz DM, Dumitriu D, Morrison JH, Malenka RC, Nestler EJ. Các khớp thần kinh nghiện: cơ chế của khớp thần kinh và độ dẻo cấu trúc trong accumbens hạt nhân. Xu hướng Neurosci. 2010; 33: 267 tầm 276. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
56. Tự DW. Trong: Các Receptor Dopamine. Neve KA, biên tập viên. New York: Báo chí Humana; XUẤT KHẨU. Trang 2010 tầm 479.
57. Ca sĩ BF, Loweth JA, Neve RL, Vezina P. Sự biểu hiện quá mức qua trung gian virus của protein kinase II phụ thuộc alpha-canxi / peaceodulin trong vỏ accumbens dẫn đến sự điều hòa chức năng lâu dài của alpha-amino-3-hydroxUM-XNUM thụ thể -methyl-5-isoxazole-propionate: thụ thể dopamine loại-4 và protein kinase Một sự phụ thuộc. Ne J Neurosci. 1; 2010: 31 tầm 1243. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ. Cơ chế và sự điều hòa của protein kinase II phụ thuộc canxi / peaceodulin nhắm vào tiểu đơn vị NR2B của thụ thể N-methyl-D-aspartate. J Biol Hóa. 2000; 275: 23798 tầm 23806. [PubMed]
59. Ulery-Reynold PG, Castillo MA, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. Phosphoryl hóa của DeltaFosB làm trung gian sự ổn định của nó trong vivo. Khoa học thần kinh. 2009; 158: 369 tầm 372. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
60. Ulery PG, Nestler EJ. Điều chỉnh hoạt động phiên mã DeltaFosB bằng cách phosphoryl hóa Ser27. Ne J Neurosci. 2007; 25: 224 tầm 230. [PubMed]
61. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ. Điều chỉnh sự ổn định của DeltaFosB bằng cách phosphoryl hóa. J Neurosci. 2006; 26: 5131 tầm 5142. [PubMed]
62. Vialou V, et al. DeltaFosB trong các mạch thưởng cho não làm trung gian cho khả năng phục hồi đối với các phản ứng căng thẳng và chống trầm cảm. Nat Neurosci. 2010; 13: 745 tầm 752. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
63. Wang L, Lv Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Sun J, Ma L. acetyl hóa H3 mãn tính do cocaine và hoạt hóa phiên mã của CaMKIIalpha trong các hạt nhân là rất quan trọng để thúc đẩy tăng cường thuốc. Thần kinh thực vật. 2010; 35: 913 tầm 928. [Bài viết miễn phí của PMC] [PubMed]
64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S. Delta FosB điều chỉnh bánh xe chạy. J Neurosci. 2002; 22: 8133 tầm 8138. [PubMed]
65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, Green TA, Bachtell RK, Perrotti LI, DiLeone RJ, Russo SJ, Garth WJ, Self DW, Nestler EJ. Cảm ứng DeltaFosB ở vỏ não orbitofrontal làm trung gian dung nạp rối loạn chức năng nhận thức do cocaine. J Neurosci. 2007; 27: 10497 tầm 10507. [PubMed]
66. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. Một vai trò thiết yếu cho DeltaFosB trong nhân accumbens trong hành động morphin. Nat Neurosci. 2006; 9: 205 tầm 211. [PubMed]
67. Zhang R, Khoo MS, Wu Y, Yang Y, Grueter CE, Ni G, Price EE, Jr, Thiel W, Guatimosim S, T LS Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME. Ức chế Calmodulin kinase II bảo vệ chống lại bệnh tim cấu trúc. Nat Med. 2005; 11: 409 tầm 417. [PubMed]