ΣΧΟΛΙΑ: Αποδεικτικά στοιχεία ότι το deltafosb αφήνει πίσω του ίχνη πολύ καιρό μετά την αποκατάσταση από τον εθισμό. Συγκεκριμένα, ο εθισμός προκαλεί επιγενετικές αλλαγές, οι οποίες οδηγούν σε πολύ ταχύτερη επαγωγή του deltafosb όταν εμφανιστεί υποτροπή. Αυτό εξηγεί πώς το υποτροπιάζον, ακόμα και μετά από χρόνια, μπορεί να κλιμακωθεί γρήγορα σε μια κατάσταση πλήρους εμφυσήσεως.
J Neurosci. Συντάκτης χειρόγραφο? διαθέσιμη στο PMC 2013 Ιανουαρίου 25.
Περίληψη
ΔFosB, α Fosb γονιδιακού προϊόντος, επάγεται στον πυρήνα accumbens (NAc) και στον caudate putamen (CPu) με επανειλημμένη έκθεση σε φάρμακα κατάχρησης όπως η κοκαΐνη. Αυτή η διέγερση συμβάλλει σε παρεκκλίνουσες μορφές έκφρασης γονιδίων και ανωμαλιών συμπεριφοράς που παρατηρούνται με επαναλαμβανόμενη έκθεση φαρμάκου.
Εδώ, αξιολογήσαμε εάν ένα απομακρυσμένο ιστορικό έκθεσης φαρμάκου σε αρουραίους θα μπορούσε να μεταβάλει την επαγωγικότητα του Fosb γονίδιο που προκαλείται από επακόλουθη έκθεση στην κοκαΐνη. Δείχνουμε ότι η προηγούμενη χορήγηση κοκαΐνης, ακολουθούμενη από παρατεταμένη απόσυρση, αυξάνει την επαγωγιμότητα του Fosb σε NAc όπως αποδεικνύεται από την αύξηση της οξείας επαγωγής του mRNA του ΔFosB και την ταχύτερη συσσώρευση της πρωτεΐνης ΔFosB μετά από επανειλημμένη επανεμφάνιση της κοκαΐνης. Κανένα τέτοιο πρόβλημα Fosb παρατηρήθηκε επαγωγή στην CPu, στην πραγματικότητα, επακόλουθη οξεία επαγωγή του mRNA του ΔFosB καταστάλθηκε σε CPu.
Αυτά τα μη φυσιολογικά πρότυπα Fosb έκφρασης σχετίζονται με τροποποιήσεις της χρωματίνης στο Fosb προαγωγέα γονιδίου. Η προηγούμενη χορήγηση χρόνιας κοκαΐνης επάγει μία μακροχρόνια αύξηση στην δέσμευση του RNA πολυμεράσης II (Pol II) στο Fosb υποκινητή μόνο στο NAc, γεγονός που υποδηλώνει ότι το Pol II "παγώνει" αρχικά Fosb για επαγωγή στην περιοχή αυτή κατά την εκ νέου έκθεση σε κοκαΐνη. Μια πρόκληση κοκαΐνης ενεργοποιεί στη συνέχεια την απελευθέρωση Pol II από τον γονιδιακό προαγωγό, επιτρέποντας ταχύτερη Fosb μεταγραφή. Μια πρόκληση κοκαΐνης μειώνει επίσης τις κατασταλτικές μεταβολές της ιστόνης στη χώρα Fosb υποκινητή στο NAc, αλλά αυξάνει τέτοια κατασταλτικά σημάδια και μειώνει τα σημεία ενεργοποίησης στο CPu.
Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν νέα στοιχεία για τη δυναμική της χρωματίνης στο Fosb υποκινητή και αποκαλύπτουν έναν νέο μηχανισμό για την εκκίνηση Fosb επαγωγή στο NAc κατά την εκ νέου έκθεση σε κοκαΐνη.
Εισαγωγή
Ο εθισμός στα ναρκωτικά χαρακτηρίζεται από καταναγκαστική αναζήτηση και λήψη φαρμάκων παρά τις σοβαρές αρνητικές επιπτώσεις (Kalivas et αϊ., 2005; Hyman et αϊ., 2006). Η χρόνια έκθεση σε φάρμακο προκαλεί επίμονες μεταβολές στην έκφραση γονιδίων στο κοιλιακό ραβδωτό σώμα (ή nucleus accumbens, NAc) και στο ραχιαίο ραβδωτό σώμα (ή στο caudate putamen, CPu), στις ραβδωτές δομές που εμπλέκονται στην ανταμοιβή και την εξάρτηση από τα ναρκωτικά (Freeman et αϊ., 2001; Robinson και Kolb, 2004; Σάχαμ και Ελπίδα, 2005; Maze και Nestler, 2011). ΔFosB, μια κολοβωμένη και σταθερή πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το άμεσο πρώιμο γονίδιο, Fosb, είναι ένας καλά χαρακτηρισμένος παράγοντας μεταγραφής που επάγεται σε NAc και CPu με χρόνια έκθεση σε σχεδόν όλα τα φάρμακα κατάχρησης, όπου μεσολαβεί σε ευαισθητοποιημένες συμπεριφορικές αποκρίσεις σε επαναλαμβανόμενη χορήγηση φαρμάκου (Nestler, 2008). Ωστόσο, αν η προηγούμενη χρόνια έκθεση σε ένα φάρμακο κατάχρησης μεταβάλλει την επακόλουθη επαγωγή του ΔFosB παραμένει άγνωστη.
Υποθέσαμε πρόσφατα ότι οι τροποποιήσεις της χρωματίνης σε απόκριση της χρόνιας έκθεσης του φαρμάκου μπορεί να μεταβάλλουν την επαγωγικότητα συγκεκριμένων γονιδίων στις περιοχές του εγκεφάλου στόχου (Robison και Nestler, 2011). Αυξανόμενες αποδείξεις έδειξαν ότι τα φάρμακα κατάχρησης μετά από χρόνια χορήγηση μεταβάλλουν τη δομή και τη μεταγραφική προσβασιμότητα της χρωματίνης μέσω πολυάριθμων τύπων τροποποιήσεων, συμπεριλαμβανομένης της φωσφορυλίωσης, της ακετυλίωσης και της μεθυλίωσης ουρών ιστόνης. Πιο πρόσφατη εργασία σε συστήματα κυτταροκαλλιέργειας εστιάστηκε στην πρόσληψη RNA πολυμεράσης II (Pol II) στον προαγωγό των "επαγώγιμων" γονιδίων πριν από την έκφρασή τους, με το Pol II να συνδέεται επίμονα με τις εγγύς περιοχές προαγωγού και γύρω από την θέση έναρξης της μεταγραφής (TSS ) σε κατάσταση «καθυστέρησης» (Core και Lis, 2008; Nechaev και Adelman, 2008). Η ενεργοποίηση του παγιδευμένου Pol II θεωρείται τότε ότι είναι υπεύθυνη για τη διαφυγή του από τις περιοχές προαγωγού και TSS και την μεταγραφή αυτών των γονιδίων "ασταθών" (Zeitlinger et αϊ., 2007; Saha et αϊ., 2011; Bataille et αϊ., 2012).
Εδώ, αποδεικνύουμε ότι η προηγούμενη χρόνια έκθεση στην κοκαΐνη, ακολουθούμενη από παρατεταμένη περίοδο διακοπής, μεταβάλλει την επαγωγικότητα του Fosb γονιδίου σε μετέπειτα χορήγηση κοκαΐνης, με το ΝΑο να προετοιμάζεται για επαγωγή ενώ το CPu δεν είναι. Κατόπιν εντοπίζουμε διακριτές υπογραφές χρωματίνης στο Fosb γονιδιακό προαγωγό σε NAc και CPu που σχετίζονται με τέτοια ανώμαλη επαγωγικότητα του Fosb γονιδίου, συμπεριλαμβανομένης της πρόσληψης του Pol II στη θέση του Fosb εγγύς προαγωγέα στο ΝΑο μόνο καθώς και αλλαγές σε αρκετές ενεργοποιούμενες ή κατασταλτικές τροποποιήσεις ιστονίου και στις δύο περιοχές του εγκεφάλου. Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν νέα γνώση της δυναμικής της χρωματίνης στο Fosb γονιδίου και υποδεικνύουν για πρώτη φορά έναν μηχανισμό με τον οποίο παγιδεύονται τα Pol II αρχικά Fosb για μεγαλύτερη ενεργοποίηση στο NAc κατά την εκ νέου έκθεση σε κοκαΐνη.
Υλικά και Μέθοδοι
Των ζώων
Αρσενικοί αρουραίοι Sprague Dawley (250-275 g, Charles River Laboratories), που χρησιμοποιήθηκαν σε όλα τα πειράματα, στεγάστηκαν με ζεύγη σε ένα κλιματιζόμενο δωμάτιο σε έναν κύκλο 12 h light / dark (φωτισμός στο 7 AM) νερό ad libitum. Όλα τα ζώα εγχύθηκαν δύο φορές την ημέρα για δέκα ημέρες με κοκαΐνη (15 mg / kg, ip) ή φυσιολογικό ορό (ip) στους κλωβούς τους. Τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεραπείας και Χρήσης Θεσμικών Ζώων (IACUC) στο Όρος Σινά.
Μετεωρολογικές μετρήσεις
Τα ζώα ζευγαρώθηκαν στον κινητικό θάλαμο την πρώτη ημέρα για 1 hr και έπειτα παρακολουθήθηκαν για κινητική δραστηριότητα μετά από ένεση αλατόνερου χρησιμοποιώντας το σύστημα δραστηριότητας Photobeam (San Diego Instruments). Μετά την συνήθεια του 1 hr στους κινητικούς θαλάμους κάθε ημέρα, χορηγήθηκε κοκαΐνη (15 mg / kg, ip) ημερησίως για τις ημέρες 2 και τα ζώα παρακολουθήθηκαν και πάλι για κινητική δραστηριότητα για 1 hr.
Ανοσοϊστοχημεία
Τα ζώα εγχύθηκαν 24 hr μετά την τελευταία έκθεση φαρμάκου. Η ανοσοδραστικότητα ΔFosB / FosB ανιχνεύθηκε όπως περιγράφηκε (Perrotti et αϊ., 2004). Η κηλίδωση Western επιβεβαίωσε ότι όλη η ανοσοαντιδραστικότητα τύπου ΔFosB / FosB παρατηρήθηκε 24 hr ή περισσότερο μετά από ενέσεις κοκαΐνης που αντικατόπτριζαν ΔFosB, ενώ η FosB ήταν μη ανιχνεύσιμη (δεν φαίνεται).
Απομόνωση RNA, ανάστροφη μεταγραφή και PCR
Διμερείς διατρήσεις XCUMX-gauge της NAc και δωδεκαλάστρα /Perrotti et αϊ., 2004), κατεψυγμένα σε ξηρό πάγο και επεξεργασμένα σύμφωνα με δημοσιευμένα πρωτόκολλα (Covington et αϊ., 2011). Το mRNA του ΔFosB και του FosB μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR (qPCR) με εκκινητές DFosB και FosB ειδικούς για ισομορφές (Alibhai κ.ά., 2007). Τα επίπεδα mFNA ΔFosB και FosB ομαλοποιήθηκαν σε επίπεδα mRNA GAPDH, τα οποία δεν επηρεάστηκαν από την έκθεση σε κοκαΐνη (δεν παρουσιάζεται).
Western blotting
Οι διατρητήρες NAc και CPu συλλέχθηκαν όπως παραπάνω και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για κηλίδωση Western όπως περιγράφεται (Covington et αϊ., 2011), χρησιμοποιώντας αντισώματα ενάντια σε ERK44 / 42 [εξωκυτταρικό σήμα ρυθμιζόμενης κινάσης-44 / 42] και φωσφοΕΚΚΝΝΧΧ / ΧΝΥΜΧ (ρΕΚΚ), ΑΚΤ [ιικό πρωτο-ογκογόνο] και ρ-ΑΚΤ, SRF, CREB [πρωτεΐνη δέσμευσης στοιχείου απόκρισης cAMP] και pCREB. Η ποσότητα της πρωτεΐνης που στυπώθηκε σε κάθε λωρίδα κανονικοποιήθηκε σε επίπεδα ακτίνης ή τουμπουλίνης, τα οποία δεν επηρεάστηκαν από την έκθεση στην κοκαΐνη.
Η ανοσοκατακρήμνιση χρωματοτίνης (ChIP)
Προστέθηκαν πρόσφατα διαχωρισμένες διατρήσεις ΝΑο και CPu για ChIP όπως περιγράφεται (Maze et αϊ., 2010). Κάθε πειραματική κατάσταση αναλύθηκε εις τριπλούν από ανεξάρτητες ομάδες ζώων. Για κάθε δείγμα ChIP, οι διμερείς διατρήσεις των ΝΑο και CPu συλλέχθηκαν από πέντε αρουραίους (διατρήσεις 10). Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται για συγκεκριμένες τροποποιήσεις ιστονών είναι τα ίδια με αυτά που έχουν δημοσιευτεί (Maze et αϊ., 2010) · αντισώματα έναντι Pol II φωσφορυλιωμένα στο Ser5 της περιοχής επανάληψης καρβοξυλικής τερματικής περιοχής (CTD) (Pol II-pSer5) ελήφθησαν από το abcam 5131. Τέσσερα σύνολα εκκινητών ChIP σχεδιάστηκαν για Fosb (Lazo κ.ά., 1992; Mandelzys et αϊ., 1997): 1F: GTACAGCGGAGGTCTGAAGG, 1R: GAGTGGGATGAGATGCGAGT. 2F: CATCCCACTCGGCCATAG, 2R: CCACCGAAGACAGGTACTGAG. 3F: GCTGCCTTTAGCCAATCAAC, 3R: CCAGGTCCAAAGAAAGTCCTC; 4F: GGGTGTTTGTGTGTGAGTGG, 4R: AGAGGAGGCTGGACAGAACC. Τα επίπεδα των τροποποιήσεων της χρωματίνης συγκρίνονται με εκείνα για το DNA εισόδου όπως περιγράφηκε (Maze et αϊ., 2010).
Στατιστική ανάλυση
Όλες οι αναφερόμενες τιμές είναι μέσος όρος ± sem Τα δεδομένα για την κινητική δραστηριότητα και η μέτρηση των κυττάρων αναλύθηκαν με αμφίδρομους ANOVAs με θεραπεία και ένεση ως παράγοντες. Τα πειράματα qPCR αναλύθηκαν ανά χρονικό σημείο από μονόδρομα ANOVAs με θεραπεία ως παράγοντα. Όταν παρατηρήθηκαν σημαντικές κύριες επιδράσεις (p <0.05), διεξήχθησαν δοκιμές Bonferroni post-hoc για συγκρίσεις με ζώα που είχαν υποστεί αγωγή με αλατούχο διάλυμα χωρίς ναρκωτικά (^ σε σχήματα) και ζώα που δεν είχαν λάβει θεραπεία με κοκαΐνη (* σε σχήματα). Χρησιμοποιήθηκαν δύο ζευγαρώματα t-test Student για δυο στυπώματα και δεδομένα ChIP, με διορθώσεις για πολλαπλές συγκρίσεις.
Αποτελέσματα
Μεγαλύτερη Διεγέρσιμη σε Fosb σε NAc, αλλά όχι σε CPu, έμπειρων επίμυων με κοκαΐνη
Για να εξεταστεί η επίδραση προηγούμενης χρόνιας πορείας κοκαΐνης, ακολουθούμενη από παρατεταμένη περίοδο απόσυρσης, σχετικά με την επαγωγιμότητα του Fosb (15 mg / kg) για ημέρες 10 χορηγήθηκαν δόσεις πρόκλησης του φαρμάκου μετά από 28 ημέρες απόσυρσης (Εικ. 1A). Αρχικά μετρήσαμε τις κινητικές αποκρίσεις σε μία ομάδα ζώων για να επιβεβαιώσουμε την επαγωγή της κινητικής ευαισθητοποίησης με προηγούμενη έκθεση στην κοκαΐνη, μια αναμενόμενη μόνιμη συνέπεια της χορήγησης του φαρμάκου. Οι έμπειροι και οι κοκαΐνοι που έλαβαν κοκαΐνη εμφάνισαν ισοδύναμη κινητική δραστηριότητα βασικής γραμμής, με πρόκληση κοκαΐνης σε ζώα που δεν είχαν λάβει φάρμακα, αυξάνοντας την κινητική τους κίνηση (Εικ. 1B. Επαναλαμβανόμενα μέτρα αμφίδρομης ANOVA, θεραπεία: F1,66 = 30.42, p <0.0001; πρόκληση κοκαΐνης: ΣΤ2,66= 58.39, p <0.0001; θεραπεία x πρόκληση κοκαΐνης: F2,66= 8.56, ρ = 0.0005, Bonferroni μετα-δοκιμές ^ρ <0.001). Αυτή η πρόκληση για την κοκαΐνη προκάλεσε σημαντικά μεγαλύτερη κινητική δραστηριότητα, δηλαδή ευαισθητοποίηση, σε αρουραίους με εμπειρία στην κοκαΐνη (Bonferroni post-test * p <0.001).
Για να αξιολογηθούν οι επιδράσεις αυτής της θεραπείας με προθεραπεία κοκαΐνης στην έκφραση του ΔFosB σε NAc και CPu, μετρήσαμε πρωτεΐνη ΔFosB με ανοσοϊστοχημικές μεθόδους 24 hr μετά από προηγούμενη χορήγηση κοκαΐνης 0, 1, 3 ή 6 από κοκαΐνη Ενέσεις (15 mg / kg · βλέπε Εικ. 1A). Όπως καθιερώθηκε προηγουμένως (Nye κ.ά., 1995), Οι ενέσεις κοκαΐνης 3 ήταν επαρκείς για να επάγουν σημαντικά την πρωτεΐνη ΔFosB σε NAc και CPu των ζώων που δεν είχαν λάβει φάρμακα και η συσσώρευσή τους παρέμεινε σημαντική μετά από 6 ημέρες εγχύσεων κοκαΐνης (Εικ. 1C. Επαναλαμβανόμενα μέτρα διπλής κατεύθυνσης ANOVA, NAc core, επεξεργασία: F1,28= 23.5, p <0.0001; πρόκληση κοκαΐνης: ΣΤ3,28= 49.16, p <0.0001; θεραπεία x πρόκληση κοκαΐνης: F3,28= 6.83, ρ = 0.0014. Κέλυφος NAc, επεξεργασία: F1,28= 18.69, p <0.0001; πρόκληση κοκαΐνης: ΣΤ3,28= 31.52, p <0.0001; θεραπεία x πρόκληση κοκαΐνης: F3,28= 3.21, p <0.05; CPu, θεραπεία: F1,28= 9.47, p <0.001; πρόκληση κοκαΐνης: ΣΤ3,28= 19.74, p <0.0001; θεραπεία x πρόκληση κοκαΐνης: F3,28= 0.94, p> 0.05. Σε NAc core, shell και CPu, Bonferroni post-test ^ρ <0.05). Σε ζώα με εμπειρία σε κοκαΐνη, δεν υπήρχαν ενδείξεις για διαρκή επαγωγή ΔFosB σε NAc ή CPu μετά από 28 ημέρες απόσυρσης, σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές ότι το σήμα ΔFosB διαλύεται πλήρως μέχρι αυτό το χρονικό σημείο (Nye κ.ά., 1995), ο λόγος που χρησιμοποιήθηκε αυτή η χρονική στιγμή σε αυτή τη μελέτη. Εντυπωσιακά, όμως, οι έμπειροι αρουραίοι οι οποίοι έλαβαν ενέσεις πρόκλησης κοκαΐνης 3 ή 6 εμφάνισαν σημαντικά μεγαλύτερη επαγωγή πρωτεΐνης ΔFosB στο ΝΑο, φαινόμενο φαινόμενο και στις δύο υποπεριοχές πυρήνα και κελύφους (Εικ. 1C. Bonferroni μετά τις δοκιμές * p <0.05). Αντιθέτως, δεν παρατηρήθηκε τόσο μεγαλύτερη επαγωγή πρωτεΐνης ΔFosB στο CPu. Αντίθετα, η ισοδύναμη επαγωγή ΔFosB παρατηρήθηκε σε αυτήν την περιοχή μετά από 3 ή 6 ημέρες ενέσεων πρόκλησης κοκαΐνης σε αρουραίους που δεν είχαν προηγουμένως κοκαΐνη και έχουν εμπειρίαΕικ. 1C).
Για να κατανοήσουμε τις μεταγραφικές αλλοιώσεις που συμβαίνουν σε NAc και CPu σε απόκριση πρόκλησης κοκαΐνης, μελετήσαμε την χρονική πορεία (45, 90 και 180 min) της επαγωγιμότητας των μεταγραφικών αντιγράφων mRNA του ΔFosB και του FosB μετά από μία εφάπαξ χορήγηση κοκαΐνης ή φυσιολογικού ορού σε αρουραίους που δεν είχαν λάβει προηγουμένως κοκαΐνη και είχαν εμπειρία μετά από 28 ημέρες απόσυρσης (βλ Εικ. 1A). Σε σχέση με πρόκληση αλατόνερου, η πρόκληση κοκαΐνης προκάλεσε μια ταχεία αύξηση των επιπέδων mRNA του ΔFosB και του FosB και στα τρία χρονικά σημεία τόσο στα NAc όσο και στο CPu των ζώων που δεν έλαβαν κοκαΐνη (Εικ. 1D. Επαναλαμβανόμενες μετρήσεις ANOVA ανά χρονικό σημείο. Bonferroni μετα-δοκιμές ^ρ <0.05). Στο NAc, παρατηρήσαμε μεγαλύτερη επαγωγή mFNA ΔFosB και FosB σε ζώα με εμπειρία σε κοκαΐνη σε σύγκριση με ζώα που δεν είχαν λάβει κοκαΐνη μετά την πρόκληση της κοκαΐνης, η επίδραση ήταν σημαντική στα 90 λεπτά ενώ, σε αντίθεση, η επαγωγιμότητα του mFNA ΔFosB και FosB στο CPu ήταν σημαντικά μειωμένη σε κοκαΐνη ζώα (Εικ. 1D. Bonferroni μετα-δοκιμές %p = 0.08, * p <0.05).
Χαρακτηρισμός ανάντη σηματοδοτικών μονοπατιών σε NAc και CPu επίμυων που έζησαν κοκαΐνη
Μια πιθανή εξήγηση για την αλλοιωμένη επαγωγιμότητα του Fosb γονιδίου σε NAc και CPu μετά από μια προηγούμενη χρόνια πορεία κοκαΐνης είναι ότι ένα απομακρυσμένο ιστορικό έκθεσης στην κοκαΐνη θα μπορούσε να προκαλέσει διαρκή αλλαγές στις οδούς σηματοδότησης που είναι ανάντη του Fosb γονιδιακή διέγερση έτσι ώστε η πρόκληση κοκαΐνης να επάγει τότε το γονίδιο σε αποκλίνοντα βαθμό. Για να μελετήσουμε αυτή την υπόθεση, αναλύσαμε τους δύο παράγοντες μεταγραφής, SRF και CREB, οι οποίοι έχουν πρόσφατα δειχθεί ότι είναι απαραίτητοι για την επαγωγή κοκαΐνης του ΔFosB σε αυτές τις περιοχές του εγκεφάλου (Vialou et αϊ., 2012) μαζί με ανάντι πρωτεϊνικές κινάσες, ERK και AKT, που επίσης εμπλέκονται σε δράση κοκαΐνης (Valjent et αϊ., 2000; Lu et αϊ., 2006; Boudreau et αϊ., 2009). Απέτυχα να ανιχνεύσουμε οποιεσδήποτε αλλαγές στα ολικά ή φωσφορυλιωμένα επίπεδα αυτών των διαφόρων πρωτεϊνών που θα μπορούσαν να εξηγήσουν την αλλοιωμένη επαγωγικότητα του Fosb παρατηρήθηκαν, χωρίς να συμπεριληφθούν αλλαγές στα SRF, CREB ή AKT (Εικ. 2B, C). Η έλλειψη μεταβολής των pSRF και pCREB στο NAc σε απάντηση σε πρόκληση κοκαΐνης είναι σύμφωνη με μια πρόσφατη έκθεση, η οποία διαπίστωσε ότι και οι δύο προκλήθηκαν σημαντικά μόνο από τη χρόνια κοκαΐνη (Vialou et αϊ., 2012).
Σε NAc και CPu των ζώων που δεν είχαν λάβει φάρμακα, το 20 λεπτό μετά από μια αρχική έκθεση στο φάρμακο (Εικ. 2A), μια μοναδική πρόκληση κοκαΐνης μείωσε τα επίπεδα του pERK42 / 44 (Εικ. 2B, C. Δίχρωμη δοκιμή Student t: * p <0.05). Υπάρχουν προηγούμενες αναφορές για αυξημένα επίπεδα pERK σε αυτές τις περιοχές μετά από οξεία χορήγηση κοκαΐνης (Valjent et αϊ., 2000). Αυτό είναι δύσκολο να συγκριθεί με άλλα έγγραφα που εξετάζουν τη φωσφορυλίωση ERK στο NAc κατά τη διάρκεια της απόσυρσης από επανειλημμένες ενέσεις κοκαΐνης (Boudreau et αϊ., 2007; Shen et αϊ., 2009), όπως στη μελέτη μας το pERK ποσοτικοποιήθηκε μετά από 28 ημέρες απόσυρσης και μετά από πρόκληση κοκαΐνης ή αλατούχου. Σε σχέση με τα ζώα που δεν έλαβαν φάρμακα και τα οποία έζησαν κοκαΐνη για πρώτη φορά, η επανεμφάνιση της κοκαΐνης σε ποντίκια που έζησαν κοκαΐνη μετά από 28 ημέρες απόσυρσης προκάλεσε σημαντική αύξηση στα επίπεδα pERK42 / 44 σε CPu (Εικ. 2B, C. Δοκιμασία t δύο μαθητών: * p <0.05).
Χρωματοποιημένο τοπίο στο Προαγωγέα γονιδίου Fosb σε NAc και CPu επίμυων που βιώνουν κοκαΐνη
Στη συνέχεια ερευνήσαμε αν οι αλλαγές στο Fosb γονιδιακή επαγωγή συνδυάζονται με μεταβολές στη δομή της χρωματίνης. Η ChIP πραγματοποιήθηκε σε NAc και CPu χρησιμοποιώντας αντισώματα κατευθυνόμενα έναντι τριών καλά χαρακτηρισμένων μορφών τροποποιήσεων ιστόνης: η τριμεθυλίωση της Lys4 της ιστόνης H3 (H3K4me3) που σχετίζεται με γονιδιακή ενεργοποίηση και H3K27me3 και H3K9me2 που σχετίζονται με καταστολή γονιδίων. Αναλύσαμε αρουραίους που δεν είχαν λάβει προηγουμένως κοκαΐνη και είχαν εμπειρία μετά από 28 ημέρες απόσυρσης είτε χωρίς είτε με πρόκληση ένεσης κοκαΐνης, με ζώα που εξετάστηκαν 1 hr αργότερα (Εικ. 3A). Σε NAc, δεν βρήκαμε σημαντικές αλλαγές στη δέσμευση οποιασδήποτε από αυτές τις τρεις τροποποιήσεις ιστόνης στο Fosb γονιδιακού υποκινητή απουσία πρόκλησης κοκαΐνης, παρόλο που υπήρχε μια τάση για μειωμένα επίπεδα H3K9me2 (Εικ. 3B-D. Δοκιμασία t-Student. #p = 0.2 σε σύγκριση με αντίστοιχους μάρτυρες που δεν έλαβαν φάρμακα). Αυτό το αποτέλεσμα κατέστη σημαντικό μετά από πρόκληση κοκαΐνης και ήταν ειδικό για την εγγύς περιοχή προαγωγού του γονιδίου (Εικ. 3C. * p <0.05). Ενώ τα επίπεδα του H3K9me2 είναι πολύ χαμηλά σε ορισμένα γονίδια, το Fosb προαγωγέα γονιδίου παρουσιάζει αξιοσημείωτα επίπεδα αυτού του σημείου στο ΝΑο υπό συνθήκες ελέγχου (Maze et αϊ., 2010, τα δεδομένα δεν εμφανίζονται). Αντίθετα, στην CPu, βρήκαμε μικρές αλλά σημαντικές μειώσεις στην δέσμευση H3K4me3 και αυξήθηκαν στη δέσμευση H3K27me3, στο Fosb υποκινητή απουσία πρόκλησης κοκαΐνης, αποτελέσματα που χάνονται μετά την πρόκληση (Εικ. 3D. * p <0.05).
Στη συνέχεια ερευνήσαμε τη δέσμευση του Pol II στην Fosb γονιδίου, που βασίζεται σε πρόσφατα ευρήματα στην κυτταρική καλλιέργεια, ότι η παύση του Pol II στα TSS, η οποία χαρακτηρίζεται από τη φωσφορυλίωση του στο Ser 5 στην περιοχή επανάληψης CTD, σχετίζεται με την εκκίνηση των γονιδίων (βλέπε Εισαγωγή). Αναλύσαμε συνεπώς την δέσμευση Pol II-pSer5 σε Fosb σε τέσσερις διαφορετικές περιοχές του γονιδίου (Εικ. 3B). Η ανάλυση αυτή αποκάλυψε έναν σημαντικό εμπλουτισμό του Pol II-pSer5 στο Fosb γονιδίου στην εγγύς περιοχή προαγωγού και γύρω από το TSS του σε ΝΑο των πειραματόζωων που έπασχαν από κοκαΐνη, μετά από παρατεταμένη απόσυρση, απουσία πρόκλησης κοκαΐνης σε σύγκριση με μάρτυρες (Εικ. 3E. * p <0.05). Αυτός ο εμπλουτισμός δεν ήταν εμφανής σε δύο περιοχές σώματος γονιδίου του Fosb, σύμφωνα με το Pol II stalling που περιγράφεται σε απλούστερα πειραματικά συστήματα. Είναι ενδιαφέρον ότι, μετά από πρόκληση κοκαΐνης, η δέσμευση Pol II-pSer5 εξακολουθούσε να εμφανίζει σημάδια εμπλουτισμού, αν και όχι πλέον σημαντικά, στην Fosb εγγύς περιοχή προαγωγού (Εικ. 3E. %p = 0.1), αλλά επέστρεψε στα επίπεδα ελέγχου στο TSS. Τα ευρήματα στην CPu ήταν πιο μεταβλητά, χωρίς να παρατηρείται σαφής πρότυπο δέσμευσης Pol II-pSer5.
Ερωτήσεις - Συζήτηση
Η παρούσα μελέτη παρέχει νέα στοιχεία για τη συνεχή ρύθμιση της Fosb εβδομάδες μετά την επανειλημμένη έκθεση σε κοκαΐνη. Δείχνουμε ότι προηγούμενη χορήγηση χρόνιας κοκαΐνης καθιστά το Fosb γονίδιο περισσότερο επαγώγιμο στο ΝΑο, με αποτέλεσμα ταχύτερη συσσώρευση ΔFosB κατά την εκ νέου έκθεση στο φάρμακο. Δεδομένης της υπεροχής της απόδειξης ότι η επαγωγή ΔFosB στο NAc προκαλεί ευαισθητοποιημένες συμπεριφορικές αποκρίσεις στην κοκαΐνη (Nestler, 2008), τα ευρήματά μας αποκαλύπτουν ένα νέο μηχανισμό για την ταχύτερη αποκατάσταση τέτοιων ευαισθητοποιημένων αποκρίσεων μετά από παρατεταμένη απόσυρση.
Επιδεικνύουμε ότι η ενισχυμένη διέγερση του ΔFosB στο NAc σχετίζεται με αλλαγές στη χρωματίνη στο Fosb γονίδιο που αναμένεται να το προωθήσει για μεγαλύτερη επαγωγή. Έτσι, παρουσιάζουμε αυξημένη δέσμευση Pol II στον εγγύς προαγωγό και τις περιοχές TSS του γονιδίου που υπάρχουν μετά από εβδομάδες 4 απόσυρσης από προηγούμενη χορήγηση χρόνιας κοκαΐνης. Τέτοιος εμπλουτισμός Pol II στο TSS χάνεται γρήγορα μετά την πρόκληση κοκαΐνης και Fosb επαγωγή, σύμφωνη με ένα μοντέλο στην κυτταρική καλλιέργεια που σταματά το Pol II απελευθερώνεται από τα TSSs μετά την ενεργοποίηση του γονιδίου (βλέπε Εισαγωγή). Μια πρόκληση κοκαΐνης προκαλεί επίσης μια ταχεία μείωση της δέσμευσης του H3K9me2-ενός σημείου καταστολής γονιδίου- στην Fosb υποστηρικτής. Αντίθετα, δεν ανιχνεύσαμε την επακόλουθη πρόκληση αρκετών παραγόντων μεταγραφής ή των ανάντη κινάσες τους, οι οποίες είναι γνωστό ότι μεσολαβούν Fosb επαγωγή με κοκαΐνη. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την υπόθεση μας ότι η ενισχυμένη διέγερση του ΔFosB στο NAc διαμεσολαβείται μέσω επιγενετικής εκκίνησης του Fosb και όχι μέσω της ρύθμισης των ανάντη γεγονότων.
Πολύ διαφορετικά αποτελέσματα ελήφθησαν για CPu. Δεν υπήρχαν αποδείξεις για την αποτυχία του Pol II Fosb σε πειραματόζωα που έζησαν κοκαΐνη πριν από πρόκληση κοκαΐνης, παρόλο που υπήρχαν μικρές αλλά σημαντικές τροποποιήσεις ιστονών που ήταν σύμφωνες με την καταστολή γονιδίων: αυξημένη δέσμευση H3K27me3 και μειωμένη δέσμευση H3K4me3. Δεν υπήρξε επίσης καμία αλλαγή στους αντίθετα προς την αντίθετη κατεύθυνση παράγοντες μεταγραφής ή κινάσες σύμφωνα με την μειωμένη Fosb επαγωγή. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι μετά από χρόνια χορήγηση κοκαΐνης, οι επιγενετικές τροποποιήσεις χρησιμεύουν για την επιβράδυνση Fosb γονιδιακή επαγωγή σε CPu, σε αντίθεση με τη γέλη που παρατηρήθηκε στο ΝΑο. Ωστόσο, παρόλο που αυτά τα αποτελέσματα καταστέλλουν την επαγωγή του ΔFosB mRNA κατά την επανεμφάνιση της κοκαΐνης, δεν υπάρχει απώλεια συσσώρευσης της ΔFosB πρωτεΐνης. Ο μηχανισμός που διέπει αυτό το παράδοξο απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση.
Γενικότερα, τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν ένα μοντέλο όπου οι αλλοιώσεις στο τοπίο της χρωματίνης σε συγκεκριμένα γονίδια σε απόκριση της χρόνιας χορήγησης κοκαΐνης χρησιμεύουν για την εκκίνηση ή την αμβλύνιση αυτών των γονιδίων για επακόλουθη επαγωγή κατά την εκ νέου έκθεση στο φάρμακο. Τέτοιες αλλαγές χρωματίνης, οι οποίες μπορούν να θεωρηθούν ως "επιγενετικές ουλές", θα χάνονταν στις αναλύσεις σταθερών επιπέδων mRNA γονιδίων. Με αυτόν τον τρόπο, ο χαρακτηρισμός του επιγονιδίου του εθισμού υπόσχεται να αποκαλύψει νέες πληροφορίες σχετικά με τη μοριακή παθογένεση της διαταραχής, η οποία μπορεί να εξορύσσεται για την ανάπτυξη νέων θεραπειών.
Ευχαριστίες
Το έργο αυτό υποστηρίχθηκε με επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ινστιτούτο για την κατάχρηση ναρκωτικών.
αναφορές
- Alibhai ΙΝ, Πράσινο ΤΑ, Potashkin JA, Nestler EJ. Ρύθμιση έκφρασης mRNA fosB και DeltafosB: μελέτες in vivo και in vitro. Brain Res. 2007?1143: 22-33. [PMC δωρεάν άρθρο] [PubMed]
- Bataille AR, Jeramimo C, Jacques ΡΕ, Laramee L, Fortin ME, Δάσος Α, Bergeron Μ, Hanes SD, Robert F. Ο κύκλος καθολικού RNA πολυμεράσης II CTD ενορχηστρώνεται με πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις μεταξύ ενζύμων κινάσης, φωσφατάσης και ισομεράσης κατά μήκος των γονιδίων. Mol Cell. 2012?45: 158-170. [PubMed]
- Boudreau AC, Reimers JM, Milovanovic Μ, Wolf ME. Οι υποδοχείς ΑΜΡΑ κυτταρικής επιφάνειας στον πυρήνα των αρουραίων αυξάνονται κατά τη διάρκεια της απόσυρσης κοκαΐνης, αλλά εσωτερικοποιούνται μετά από πρόκληση κοκαΐνης σε συνδυασμό με αλλοιωμένη ενεργοποίηση ενεργοποιημένων από μιτογόνο πρωτεϊνικών κινασών. J Neurosci. 2007?27: 10621-10635. [PMC δωρεάν άρθρο] [PubMed]
- Boudreau AC, Ferrario CR, Glucksman MJ, Wolf ME. Προσαρμογές διαδρομής σηματοδότησης και νέα υποστρώματα πρωτεϊνικής κινάσης Α που σχετίζονται με την ευαισθητοποίηση της συμπεριφοράς στην κοκαΐνη. J Neurochem. 2009?110: 363-377. [PMC δωρεάν άρθρο] [PubMed]
- Core LJ, Lis JT. Ρύθμιση μεταγραφής μέσω προαγωγού-εγγύς παύσης της RNA πολυμεράσης II. Επιστήμη. 2008?319: 1791-1792. [PMC δωρεάν άρθρο] [PubMed]
- Covington HE, 3rd, Maze Ι, Sun H, Bomze HM, DeMaio KD, Wu EY, Dietz DM, Lobo MK, Ghose S, Mouzon Ε, Neve RL, Tamminga CA, Nestler EJ. Ένας ρόλος για την κατασταλτική μεθυλίωση ιστόνης στην ευαισθησία στο άγχος που προκαλείται από την κοκαΐνη. Νευρώνας. 2011?71: 656-670. [PMC δωρεάν άρθρο] [PubMed]
- Freeman WM, Nader ΜΑ, Nader SH, Robertson DJ, Gioia L, Mitchell SM, Daunais JB, Porrino LJ, Friedman DP, Vrana ΚΕ. Χρονικές μεταβολές που προκαλούνται από την κοκαΐνη στην έκφραση γονιδίου μη ανθρώπινου πρωτεύοντος πυρήνα accumbens. J Neurochem. 2001?77: 542-549. [PubMed]
- Hyman SE, Malenka RC, Nestler EJ. Νευρωνικοί μηχανισμοί εθισμού: ο ρόλος της μάθησης και της μνήμης που σχετίζονται με τη ανταμοιβή. Annu Rev Neurosci. 2006?29: 565-598. [PubMed]
- Kalivas PW, Volkow Ν, Seamans J. Μη διαχειρίσιμο κίνητρο στην εξάρτηση: μια παθολογία στην μετάδοση προ-πρόσθιου-ακουμπένου γλουταμινικού. Νευρώνας. 2005?45: 647-650. [PubMed]
- Lazo PS, Dorfman Κ, Noguchi Τ, Mattei MG, Bravo R. Δομή και χαρτογράφηση του γονιδίου fosB. Η FosB μειώνει την δραστικότητα του fosB προαγωγού. Nucleic Acids Res. 1992?20: 343-350. [PMC δωρεάν άρθρο] [PubMed]
- Lu L, Koya Ε, Zhai H, Ελπίδα ΒΤ, Shaham Y. Ρόλος του ERK στον εθισμό στην κοκαΐνη. Τάσεις Neurosci. 2006?29: 695-703. [PubMed]
- Mandelzys Α, Gruda ΜΑ, Bravo R, Morgan JI. Απουσία ενός επίμονα αυξημένου 37 kDa φωσφο-σχετιζόμενου αντιγόνου και δραστικότητας πρόσδεσης DNA που ομοιάζει με AP-1 στους εγκεφάλους ποντικών fosB null που υποβλήθηκαν σε αγωγή με καϊνικό οξύ. J Neurosci. 1997?17: 5407-5415. [PubMed]
- Λαβύρινθος Ι, Nestler EJ. Το επιγενετικό τοπίο του εθισμού. Ann ΝΥ Acad Sci. 2011?1216: 99-113. [PMC δωρεάν άρθρο] [PubMed]
- Οι Mazer I, Covington ΗΕ, 3rd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, Mechanic Μ, Mouzon Ε, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard Ρ, Tarakhovsky Α, Schaefer Α, Nestler EJ. Βασικός ρόλος της μεθυλοτρανσφεράσης ιστόνης G9a στην πλαστικότητα που προκαλείται από την κοκαΐνη. Επιστήμη. 2010?327: 213-216. [PMC δωρεάν άρθρο] [PubMed]
- Nechaev S, Adelman Κ. Προαγωγός-εγγύς Pol II: όταν σταματάει τα πράγματα ταχύτητα. Κυτταρικός κύκλος. 2008?7: 1539-1544. [PubMed]
- Nestler EJ. Ανασκόπηση. Μεταγραφικοί μηχανισμοί εθισμού: ο ρόλος της DeltaFosB. Philos Trans R. Soc. London Β Biol Sci. 2008?363: 3245-3255. [PMC δωρεάν άρθρο] [PubMed]
- Nye ΗΕ, Ελπίδα ΒΤ, Kelz MB, Iadarola Μ, Nestler EJ. Φαρμακολογικές μελέτες της ρύθμισης της χρόνιας επαγωγής του αντιγόνου που σχετίζεται με το FOS από την κοκαΐνη στο ραβδωτό σώμα και στον πυρήνα του πυρήνα. J Pharmacol Εχρ Ther. 1995?275: 1671-1680. [PubMed]
- Perrotti LI, Hadeishi Υ, Ulery PG, Barrot Μ, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ. Επαγωγή του deltaFosB σε δομές εγκεφάλου σχετιζόμενες με ανταμοιβή μετά από χρόνιο στρες. J Neurosci. 2004?24: 10594-10602. [PubMed]
- Robinson TE, Kolb B. Δομική πλαστικότητα που σχετίζεται με την έκθεση σε φάρμακα κατάχρησης. Neuropharmacology 47 Suppl. 2004?1: 33-46. [PubMed]
- Robison ΑΙ, Nestler EJ. Μεταγραφικοί και επιγενετικοί μηχανισμοί εθισμού. Nat Rev Neurosci. 2011?12: 623-637. [PMC δωρεάν άρθρο] [PubMed]
- Saha RN, Wissink ΕΜ, Bailey ER, Zhao Μ, Fargo DC, Hwang JY, Daigle ΚΚ, Fenn JD, Adelman Κ, Dudek SM. Η γρήγορη επαγόμενη από τη δραστηριότητα μεταγραφή του Arc και άλλων IEGs βασίζεται στην καταγεγραμμένη RNA πολυμεράση II. Ντε Νευροσκι. 2011?14: 848-856. [PMC δωρεάν άρθρο] [PubMed]
- Shaham Y, Ελπίδα ΒΤ. Ο ρόλος των νευροπροσαρμογών στην υποτροπή της αναζήτησης φαρμάκων. Ντε Νευροσκι. 2005?8: 1437-1439. [PubMed]
- Shen HW, Toda δ, Moussawi Κ, Bouknight Α, Zahm DS, Kalivas PW. Τροποποίηση της πλαστικότητας της δενδριτικής σπονδυλικής στήλης σε αρουραίους που αποσύρθηκαν από την κοκαΐνη. J Neurosci. 2009?29: 2876-2884. [PMC δωρεάν άρθρο] [PubMed]
- Valjent Ε, Corvol JC, Pages C, Besson MJ, Maldonado R, Caboche J. Συμπερίληψη του εξωκυτταρικού καταρράκτη κινάσης που ελέγχεται από σήματα για τις ιδιότητες επιβράβευσης της κοκαΐνης. J Neurosci. 2000?20: 8701-8709. [PubMed]
- Zeitlinger J, Stark Α, Kellis Μ, Hong JW, Nechaev S, Adelman Κ, Levine Μ, Young RA. RNA πολυμεράση που καταστέλλεται σε γονίδια ανάπτυξης ελέγχου στο έμβρυο Drosophila melanogaster. Nat Genet. 2007?39: 1512-1516. [PMC δωρεάν άρθρο] [PubMed]
- Vialou VF, Feng J, Robison AJ, Ferguson D, Scobie ΚΝ, Mazei-Robison Μ, Mouzon Ε, Nestler EJ. Ο παράγοντας απόκρισης στον ορό και η πρωτεΐνη δέσμευσης στοιχείου απόκρισης cAMP απαιτούνται και οι δύο για την επαγωγή κοκαΐνης του ΔFosB. J Neurosci. 2012 αποδεκτό. [PMC δωρεάν άρθρο] [PubMed]
;