J Neurosci. 10 Μαΐου 2006;26(19):5131-42.
Ulery PG , Rudenko G , Nestler EJ.
Πηγή
Department of Psychiatry, Center for Basic Neuroscience, The University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas 75390-9070, USA.
Περίληψη
Ο μεταγραφικός παράγοντας DeltaFosB (επίσης γνωστός ως FosB2 ή FosB [σύντομη μορφή]) είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής της μακροπρόθεσμης πλαστικότητας που προκαλείται στον εγκέφαλο από τη χρόνια έκθεση σε διάφορους τύπους ψυχοδραστικών ερεθισμάτων, συμπεριλαμβανομένων των ναρκωτικών ουσιών, του στρες και των ηλεκτροσπασμών. Ένα ξεχωριστό χαρακτηριστικό του DeltaFosB είναι ότι, μόλις προκληθεί, παραμένει στον εγκέφαλο για σχετικά μεγάλα χρονικά διαστήματα απουσία περαιτέρω διέγερσης. Οι μηχανισμοί που διέπουν αυτή τη φαινομενική σταθερότητα, ωστόσο, παραμένουν άγνωστοι. Εδώ, αποδεικνύουμε ότι το DeltaFosB είναι ένας σχετικά σταθερός μεταγραφικός παράγοντας, με χρόνο ημιζωής περίπου 10 ωρών σε κυτταροκαλλιέργεια. Επιπλέον, δείχνουμε ότι το DeltaFosB είναι μια φωσφοπρωτεΐνη στον εγκέφαλο και ότι η φωσφορυλίωση ενός εξαιρετικά συντηρημένου υπολείμματος σερίνης (Ser27) στο DeltaFosB το προστατεύει από την πρωτεασοματική αποικοδόμηση. Παρέχουμε αρκετές ενδείξεις που υποδηλώνουν ότι αυτή η φωσφορυλίωση προκαλείται από την κινάση καζεΐνης 2. Αυτά τα ευρήματα αποτελούν την πρώτη απόδειξη ότι το DeltaFosB φωσφορυλιώνεται και καταδεικνύουν ότι η φωσφορυλίωση συμβάλλει στη σταθερότητά του, η οποία βρίσκεται στον πυρήνα της ικανότητάς του να μεσολαβεί σε μακροχρόνιες προσαρμογές στον εγκέφαλο.
Εισαγωγή
Ο μεταγραφικός παράγοντας ΔFosB, που ονομάζεται επίσης FosB2 ή FosB [σύντομη μορφή], είναι μια παραλλαγή συρραφής με κολοβωμένο άκρο του άμεσου πρώιμου γονιδίου fosb ( Dobrazanski et al., 1991 ; Nakabeppu and Nathans, 1991 ; Yen et al., 1991 ). Όπως και το FosB πλήρους μήκους, το ΔFosB έχει μια βασική περιοχή δέσμευσης DNA και ένα φερμουάρ λευκίνης μέσω του οποίου διμερίζεται με τις πρωτεΐνες Jun για να σχηματίσει σύμπλοκα μεταγραφικού παράγοντα πρωτεΐνης ενεργοποιητή-1 (AP-1), τα οποία ρυθμίζουν την έκφραση πολλών γονιδίων ( Morgan and Curran, 1995 ; Rylski and Kaczmarek, 2004 ). Παρά την έλλειψη μέρους του τομέα διενεργοποίησης που βρίσκεται στο C άκρο του FosB, το ΔFosB λειτουργεί τόσο ως ισχυρός ενεργοποιητής όσο και ως καταστολέας μεταγραφής σε καλλιεργημένα κύτταρα και στον εγκέφαλο ( Dobrazanski et al., 1991 ; Nakabeppu and Nathans, 1991 ; Chen et al., 1997 ; McClung and Nestler, 2003 ; Kumar et al., 2005 ).
ΔΤο FosB προκαλείται σε υψηλά επίπεδα με έναν ειδικό για την περιοχή τρόπο στον εγκέφαλο μετά από χρόνια, αλλά όχι οξεία, έκθεση σε μια ποικιλία ψυχοδραστικών ερεθισμάτων, όπως στρες, ορισμένες βλάβες, αντιψυχωσικά και αντικαταθλιπτικά φάρμακα, φάρμακα κατάχρησης και φυσικές ανταμοιβές (Hope et αϊ., 1994b; Hiroi και Graybiel, 1996; Moratalla et αϊ., 1996; Bing et al., 1997; Mandelzys et αϊ., 1997; Kelz et αϊ., 1999; Werme κ.ά., 2002; Andersson et αϊ., 2003; Colby et αϊ., 2003; Peakman et αϊ., 2003; Perrotti et αϊ., 2004; Zachariou et αϊ., 2006). Η επαγωγή του ΔFosB έχει συνδεθεί άμεσα με τις λειτουργικές επιδράσεις αρκετών από αυτά τα ερεθίσματα στον εγκέφαλο. Η επιμονή του ΔFosB ακόμη και απουσία πρόσθετης διέγερσης το διακρίνει από όλους τους άλλους μεταγραφικούς παράγοντες της οικογένειας Fos, οι οποίοι επάγονται γρήγορα ως απόκριση σε οξέα ερεθίσματα, φθείρονται στα βασικά επίπεδα μέσα σε λίγες ώρες και γενικά παρουσιάζουν απευαισθητοποίηση μετά από χρόνια διέγερση.Hope et αϊ., 1992; Daunais et αϊ., 1993; Persico et al., 1993; Hiroi και Graybiel, 1996; Perrotti et αϊ., 2004). Αυτό καθιστά το ΔFosB ελκυστικό υποψήφιο για να μεσολαβήσει μερικές από τις μακροχρόνιες αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση που αποτελούν τη βάση των σταθερών νευρωνικών προσαρμογών που προκαλούνται από ορισμένα χρόνια ερεθίσματα.
Επειδή η παρατεταμένη παρουσία του ΔFosB συμβαίνει απουσία περαιτέρω επαγωγής του mRNA του ( Chen et al., 1995 ), υποθέσαμε ότι, σε αντίθεση με το FosB πλήρους μήκους και όλες τις άλλες πρωτεΐνες της οικογένειας Fos, οι οποίες είναι εγγενώς ασταθείς, το ΔFosB μπορεί να είναι ένας ασυνήθιστα σταθερός παράγοντας μεταγραφής ( Hope et al., 1994b ; Chen et al., 1997 ; Nestler et al., 2001 ; McClung et al., 2004 ). Επιπλέον, η ανάλυση ανοσοστύπωσης εγκεφαλικού ιστού που διεγείρεται σε οξεία έναντι χρόνιας φάσης υπέδειξε ότι το ΔFosB μετατοπίζεται σε φαινομενική Mr ( μοριακή μάζα) από ~33 kDa στην οξεία κατάσταση σε ~35-37 kDa κατά τη διάρκεια χρόνιας θεραπείας ( Hope et al., 1994a ; Chen et al., 1995 ). Επειδή δεν υπάρχουν στοιχεία για την ύπαρξη πρόσθετων mRNA που θα μπορούσαν να κωδικοποιήσουν αυτές τις διάφορες ισομορφές, υποθέσαμε περαιτέρω ότι το ΔFosB τροποποιείται μετα-μεταφραστικά και ότι ίσως αυτό συμβάλλει στην ασυνήθιστη σταθερότητά του. Μέχρι σήμερα, ωστόσο, δεν έχουν αναφερθεί βιοχημικές αναλύσεις της ανακύκλωσης ή των μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων του ΔFosB. Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να προσδιοριστεί εάν το ΔFosB είναι μια φωσφοπρωτεΐνη και εάν η φωσφορυλίωση παίζει ρόλο στη σταθερότητά της.
Προηγούμενη Ενότητα Επόμενη Ενότητα
Υλικά και Μέθοδοι
Κυτταρικές σειρές θηλαστικών και κατασκευές DNA.
Κύτταρα PC12 (Clontech, Mountainview, CA) καλλιεργήθηκαν σε DMEM υψηλής περιεκτικότητας σε γλυκόζη που περιείχε l-γλουταμίνη (L-Gln) και συμπληρώθηκε με 5% εμβρυϊκό ορό βοοειδών (FBS), 10% ορό αλόγου (και τα δύο από την Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 U/ml πενικιλίνη και 100 μg/ml στρεπτομυκίνη (και τα δύο από την Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Κύτταρα HeLa (American Type Culture Collection, Manassas, VA) καλλιεργήθηκαν σε DMEM υψηλής περιεκτικότητας σε γλυκόζη που περιείχε L-Gln και συμπληρώθηκε με 10% FBS, πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη. Και οι δύο κυτταρικές σειρές διατηρήθηκαν στους 37°C σε υγρή ατμόσφαιρα 5% CO2.
Για τις παροδικές μεταμοσχεύσεις με DNA, τα κύτταρα PC12 ή HeLa τοποθετήθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων (επικαλυμμένες με κολλαγόνο Ι για κύτταρα PC12) έτσι ώστε να επιτευχθεί συρροή 90-100% την επόμενη ημέρα και στη συνέχεια μεταμοσχεύθηκαν χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Σε ορισμένα πειράματα (βλ . Σχήματα 1 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ – 7 ), το ΔFosB εκφράστηκε παροδικά σε κύτταρα PC12 μέσω μόλυνσης με ανασυνδυασμένο ιό απλού έρπητα (HSV).
Τα ΔFosB και τα cDNA FosB ελήφθησαν από τα δικά μας κατασκευάσματα pTetop ( Chen et al., 1997 ) και υποκλωνοποιήθηκαν σε έναν φορέα pcDNA3.1 (Invitrogen). Αυτά τα κατασκευάσματα pcDNA3.1-ΔFosB/FosB χρησιμοποιήθηκαν για έκφραση σε κύτταρα θηλαστικών και ως πρότυπο για μεταλλαξιογένεση κατευθυνόμενη σε θέση. Ο ανασυνδυασμένος HSV-ΔFosB παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως ( Neve et al., 1997 ) και το παρασκεύασμα είχε τίτλο ~1 × 108 pfu/ml.
Πειράματα καταδίωξης παλμών.
Περίπου 24 ώρες μετά τη μόλυνση/μεταμόλυνση, τα κύτταρα (PC12 ή HeLa) σε πλάκες έξι φρεατίων πλύθηκαν δύο έως τρεις φορές με 2 ml PBS και επωάστηκαν στους 37°C για ~1 ώρα σε 2 ml DMEM χωρίς Cys/Met (Invitrogen) συμπληρωμένο με 5% διαλυμένο FBS (Hyclone, Logan, UT) για την εξάντληση των ενδοκυτταρικών δεξαμενών Met και Cys. Στο τέλος αυτής της περιόδου «λιμοκτονίας», προστέθηκαν φάρμακα (εάν τα κύτταρα επρόκειτο να υποβληθούν σε αγωγή) και τα κύτταρα επισημάνθηκαν (παλμικά) με 12-25 μCi 35S Protein Labeling Mix ( PerkinElmer , Wellesley, MA) για ~1 ώρα στους 37°C για την επισήμανση όλων των νεοσυντιθέμενων πρωτεϊνών. Η ραδιοσήμανση στη συνέχεια απομακρύνθηκε πλένοντας τα κύτταρα δύο έως τρεις φορές με 2 ml PBS και οι πρωτεΐνες που είχαν επισημανθεί με 35S ακολουθήθηκαν (αναδίωξη) με αντικατάσταση του μέσου με «ψυχρό» (μη ραδιενεργό) μέσο συμπληρωμένο με 5% FBS και συλλογή των κυττάρων σε διάφορα χρονικά σημεία. Οι κυτταρικές επεξεργασίες διατηρήθηκαν καθ' όλη τη διάρκεια της αναδίπλωσης. Όλα τα σχήματα αυτών των πειραμάτων δείχνουν παρόμοιες αρχικές ποσότητες των διαφόρων πρωτεϊνών για τη βελτιστοποίηση των συγκρίσεων των ρυθμών ανακύκλωσής τους.
Ζώα και θεραπεία χρόνιων ηλεκτροσπασμωδικών κρίσεων.
Ενήλικοι αρσενικοί αρουραίοι Sprague Dawley (200-300 g· Charles River Laboratories, Kingston, RI) υποβλήθηκαν σε θεραπεία μία φορά την ημέρα με ηλεκτροσπασμωδικές κρίσεις (ECS) για 7-9 ημέρες. Η ECS πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως ( Hope et al., 1994a ) χρησιμοποιώντας μια μονάδα ECS Ugo Basile (Comerio VA, Ιταλία) με τις ακόλουθες ρυθμίσεις: συχνότητα, 100 παλμοί/s· παλμός με, 0.5 ms· διάρκεια σοκ, 1.0 s· και ρεύμα, 75 mA. Τα εικονικά ζώα ελέγχου υποβλήθηκαν σε θεραπεία παράλληλα με την εφαρμογή των ηλεκτροδίων κλιπ αυτιών χωρίς ηλεκτρικό ρεύμα.
32 P μεταβολική επισήμανση.
Για την επισήμανση των εγκεφαλικών τομών, οι αρουραίοι αποκεφαλίστηκαν, οι εγκέφαλοι ανατέμθηκαν γρήγορα και παρασκευάστηκαν μετωπιαίες φλοιώδεις τομές 300 μm με μικροκόπτη DSK (Ted Pella, Redding, CA). Οι τομές επωάστηκαν μέσα σε πλαστικούς σωλήνες σε 2 ml τεχνητού ΕΝΥ με έλλειψη φωσφορικών (ACSF) και διατηρήθηκαν στους 30°C υπό συνεχή ήπια ανάδευση με μείγμα O2/CO2 ( Hemmings et al ., 1989 ). Οι τομές (δύο τομές ανά σωλήνα) επισημάνθηκαν με 1.3 mCi για 8-10 ώρες παρουσία ή απουσία οκαδαϊκού οξέος (100 ng/ml). Στο τέλος αυτής της επώασης, οι φέτες ξεπλύθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές με κρύο ACSF και στη συνέχεια ομογενοποιήθηκαν με υπερήχους σε 250 μl ψυχρού ρυθμιστικού διαλύματος δοκιμασίας ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (v/v) Igepal, 0.5% (w/v) δεοξυχολικό νάτριο, 0.1% (w/v) SDS, 1 mm EDTA], συμπληρωμένο πριν από τη χρήση με SDS έως 0.6%, κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης για κύτταρα θηλαστικών (χρησιμοποιημένο στα 5 μl/ml· Sigma-Aldrich), κοκτέιλ αναστολέων φωσφατάσης I και II (χρησιμοποιούμενα στα 1:100· Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF και 2% γλυκερόλη. Τα ομογενοποιημένα προϊόντα στη συνέχεια βράστηκαν για 15 λεπτά και διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση στις 15,000 × g για 15 λεπτά. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης στα προκύπτοντα υπερκείμενα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πρωτεΐνης BCA (Pierce, Holmdel, NJ).
Για την επισήμανση με 32P των καλλιεργημένων κυττάρων, ∼24 ώρες μετά τη μόλυνση/μεταμόλυνση, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο έως τρεις φορές με μέσο χωρίς φωσφορικά και επωάστηκαν σε αυτό το μέσο για ∼1 ώρα. Μετά από αυτήν την περίοδο νηστείας, προστέθηκαν 0.2–0.3 mCi 32P - H3PO4 ( PerkinElmer ) σε κάθε φρεάτιο και τα κύτταρα επισημάνθηκαν για 4–12 ώρες ανάλογα με το είδος του πειράματος (βλ. Σχήματα 1–7 για προδιαγραφές). Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και λύθηκαν σε πάγο για 15 λεπτά με 50 μl συμπληρωμένου ρυθμιστικού διαλύματος RIPA. Τα λύματα συλλέχθηκαν με απόξεση και διοχετεύθηκαν 10 φορές μέσω βελόνας 25 ga για διάτμηση DNA, βράστηκαν για 10 λεπτά και φυγοκεντρήθηκαν στις 15,000 rpm για 15–30 λεπτά στους 4°C. Τα καθαρισμένα λύματα (υπερκείμενα) μεταφέρθηκαν σε νέο σωλήνα και πραγματοποιήθηκε δοκιμασία πρωτεΐνης BCA (Pierce). Όλα τα σχήματα αυτών των πειραμάτων δείχνουν παρόμοιες ποσότητες συνολικών πρωτεϊνών άγριου τύπου (WT) και S27A ΔFosB για τη βελτιστοποίηση των συγκρίσεων των σχετικών επιπέδων φωσφορυλίωσης.
Χημικές ουσίες και θεραπείες κυτταροκαλλιέργειας.
Το οκαδαϊκό οξύ (OA· Sigma-Aldrich) διαλύθηκε σε αιθανόλη και χρησιμοποιήθηκε σε τελική συγκέντρωση 100 ng/ml. Η 5,6-διχλωρο-1-β-d-ριβοφουρανοζυλο-βενζιμιδαζόλη (DRB· Biomol, Plymouth Meeting, PA) διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO· Sigma-Aldrich) και χρησιμοποιήθηκε σε κυτταροκαλλιέργεια σε τελική συγκέντρωση 50 μm. Η σπερμίνη (Sigma-Aldrich) διαλύθηκε σε νερό και χρησιμοποιήθηκε σε τελική συγκέντρωση 200 μm. Η καλφοστίνη-C (Biomol) διαλύθηκε σε DMSO και χρησιμοποιήθηκε στα 0.2 μm, ενώ η φορβόλη 12-μυριστική 13-οξική (PMA· Promega, Madison, WI) διαλύθηκε σε DMSO και χρησιμοποιήθηκε στα 0.1 μm. Το ανασταλτικό πεπτίδιο που σχετίζεται με την μυριστοϋλιωμένη αυτοκαμτίδη-2 (m-AIP; Biomol) διαλύθηκε σε νερό και χρησιμοποιήθηκε σε τελική συγκέντρωση 1 και 10 μm. Οι αναστολείς πρωτεϊνικής κινάσης ευρέος φάσματος H-7 και H-8 (Biomol) διαλύθηκαν σε νερό και χρησιμοποιήθηκαν σε τελική συγκέντρωση 150 και 200 μm, αντίστοιχα. Η MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) και η εποξομυκίνη (Peptides International, Louisville, KY) διαλύθηκαν και οι δύο σε DMSO και χρησιμοποιήθηκαν σε τελική συγκέντρωση 12.5 και 7.5 μm, αντίστοιχα. Σε όλα τα πειράματα, προστέθηκε DMSO (φορέας) στα κύτταρα όπως ήταν απαραίτητο για να διατηρηθεί μια σταθερή ποσότητα DMSO σε όλες τις θεραπείες. Για τα πειράματα σήμανσης με 32P , τα φάρμακα προστέθηκαν αμέσως πριν από την ετικέτα και διατηρήθηκαν για το υπόλοιπο της περιόδου σήμανσης. Για τα πειράματα παλμικής καταδίωξης, τα φάρμακα προστέθηκαν κατά τη στιγμή της «λιμοκτονίας» Cys/Met, διατηρήθηκαν καθ' όλη τη διάρκεια της περιόδου σήμανσης και στη συνέχεια προστέθηκαν ξανά στο μέσο καταδίωξης. Οι αναστολείς πρωτεασώματος ενισχύθηκαν κάθε 3-4 ώρες καθ' όλη τη διάρκεια της καταδίωξης για να αντισταθμιστεί η γρήγορη ανακύκλωση αυτών των πεπτιδίων.
Ανοσοκαθίζηση ΔFosB, ανοσοκηλίδωση και αυτοραδιογραφία.
Για τις ανοσοκαθιζήσεις, τα λύματα αραιώθηκαν 1:5 με απλό RIPA για να μειωθεί η συγκέντρωση SDS στο 0.1% πριν προχωρήσουν στην ανοσοκαθίζηση (IP). Για τον περιορισμό της μη ειδικής σύνδεσης, τα λύματα πρώτα καθαρίστηκαν με ανοσοκαθίζηση με μη ανοσοποιητική IgG και πρωτεΐνη G-Sepharose (Sigma-Aldrich) για τουλάχιστον 4 ώρες. Το ΔFosB στη συνέχεια ανοσοκαθιζάνει από τα καθαρισμένα λύματα χρησιμοποιώντας ένα πολυκλωνικό αντίσωμα κατσίκας που αναγνωρίζει ένα εσωτερικό επίτοπο που υπάρχει τόσο στο FosB όσο και στο ΔFosB (SC-48G; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) σε 0.5-1 μg IgG ανά 10 μg πρωτεΐνης λύματος (50-300 μg συνολικής πρωτεΐνης) σε συνολικό όγκο 0.5 ml. Τα IP αναμίχθηκαν απαλά στους 4°C σε έναν ρότορα για τουλάχιστον 8 ώρες και στη συνέχεια προστέθηκαν 15 μl πρωτεΐνης G-Sepharose και τα IP αναμίχθηκαν για τουλάχιστον άλλες 4 ώρες. Τα IPs σφαιροποιήθηκαν με περιδίνηση στα 3000 × g για 3-5 λεπτά στους 4°C, πλύθηκαν τρεις φορές με 0.5 ml κρύου απλού RIPA και δύο φορές με κρύο PBS που περιείχε 0.1% Tween 20. Τα IPs στη συνέχεια επαναιωρήθηκαν σε 0.5 ml κρύου PBS, μεταφέρθηκαν, σφαιροποιήθηκαν σε νέο σωλήνα και οι ανοσοκατακρημνισμένες πρωτεΐνες εκλούστηκαν στη συνέχεια με την προσθήκη 15-25 μl 2× αναγωγικού ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος πρωτεΐνης Laemmli. Αυτό το πρωτόκολλο IP είχε ως αποτέλεσμα την ειδική και αποτελεσματική καθίζηση σχεδόν όλου του ΔFosB στο προϊόν λύσης. Οι ανοσοκατακρημνισμένες πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE φορτώνοντας ολόκληρο το IP σε ένα πήκτωμα Criterion 12.5% Tris-HCl (Bio-Rad, Hercules, CA) και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε PVDF ή νιτροκυτταρίνη. Μετά τη μεταφορά, η μεμβράνη ξηράνθηκε στον αέρα και οι ραδιοσημασμένες με 32P και 35S ζώνες πρωτεΐνης παρατηρήθηκαν με αυτοραδιογραφία χρησιμοποιώντας αυτοραδιογραφικό φιλμ Kodak (Rochester, NY), καθώς και με φωσφοριοποίηση χρησιμοποιώντας ένα Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) PhosphorImager. Το συνολικό (μη φωσφορυλιωμένο και φωσφορυλιωμένο) ΔFosB σε κυτταρικά λύματα ή ομογενοποιήματα εγκεφάλου ανιχνεύθηκε με ανοσοστύπωμα είτε της ανοσοκατακρημνισμένης πρωτεΐνης (χρησιμοποιώντας την ίδια μεμβράνη που χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της πρωτεΐνης με 32P ), είτε ίσων ποσοτήτων πρωτεΐνης λύματος/ομογενοποιημένου που υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε PVDF ή νιτροκυτταρίνη. Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε πρώτα με επώασή της με 1% (w/v) άπαχο γάλα σε σκόνη (Bio-Rad) σε PBS συμπληρωμένο με 0.1% (v/v) Tween 20 (Sigma) για 1 ώρα στους 25°C. Η μεμβράνη στη συνέχεια ανοσοστυπώθηκε όλη τη νύχτα στους 4°C με το δικό μας πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού κατά του FosB που δημιουργήθηκε έναντι των αμινοξέων 1-16 του FosB/ΔFosB (χρησιμοποιήθηκε σε αναλογία 1:10,000). Μετά την πρωτογενή επώαση, οι μεμβράνες πλύθηκαν τέσσερις φορές για 5 λεπτά με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 25°C για ~1 ώρα με αντι-IgG κουνελιού κατσίκας συζευγμένο με υπεροξειδάση χρένου (χρησιμοποιήθηκε σε αναλογία 1:5000 σε ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού, από την Vector Laboratories, Burlingame, CA). Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές για 10 λεπτά με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού και μία φορά για 5 λεπτά με PBS. Οι συνολικές ζώνες πρωτεΐνης ΔFosB απεικονίστηκαν σε φιλμ Kodak MR με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Pierce) ή/και με ανίχνευση φθορισμού χρησιμοποιώντας τα αντιδραστήρια ECL-Plus (Amersham Biosciences) και το Storm PhosphorImager.
Υπερέκφραση και καθαρισμός ανασυνδυασμένου ΔFosB από κύτταρα εντόμων.
Το ΔFosB υπερεκφράστηκε σε κύτταρα εντόμου Sf9 ως πρωτεΐνη με σήμανση Ν-τελικού εξα-His (N-His(6)ΔFosB) χρησιμοποιώντας το σύστημα έκφρασης βακουλοϊού Bac-to-Bac (Invitrogen) και ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, το cDNA ΔFosB (υπολείμματα 2-237) του οποίου προηγήθηκε η Ν-τελική ετικέτα συγγένειας MGHHHHHHHAG υποκλωνοποιήθηκε στον φορέα pFASTBacTM1, ο οποίος χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία ανασυνδυασμένου βακουλοϊού. Τα κύτταρα Sf9 μολύνθηκαν με ανασυνδυασμένο ιό και το N-His(6)ΔFosB καθαρίστηκε από κυτταρολύματα με διάφορα χρωματογραφικά στάδια, συμπεριλαμβανομένης της χρωματογραφίας συγγένειας χρησιμοποιώντας στήλη νικελίου (Qiagen, Valencia, CA), ανταλλαγή ανιόντων χρησιμοποιώντας στήλη mono-Q (Amersham Biosciences) και αποκλεισμός μεγέθους χρησιμοποιώντας στήλη διήθησης γέλης (Amersham Biosciences).
In vitro μελέτες φωσφορυλίωσης.
In vitro phosphorylation reactions for time course and stoichiometry analysis were performed in a volume of 30 μl containing 10 μm substrate (N-His(6)ΔFosB or a positive control substrate), 250 μm ATP, and 1 μCi/μl [γ- 32 P]ATP, the buffer supplied by the kinase manufacturer, and one of the following kinases: CK2 (20 ng/μl; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng/μl; Upstate), PKC (1.6 ng/μl; Calbiochem) or p70S6K (2.5 mU/μl; Upstate). Time course reactions were performed by removing 5 μl aliquots from the reaction solution at the designated time points and adding an equal volume of 4× reducing Laemmli protein sample buffer. Michaelis-Menten kinetic parameters for the CK2 reaction were determined under empirically defined linear steady-state conditions. Αυτές οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν για 15 λεπτά σε όγκο 10 μl που περιείχε 2 ng/μl ενζύμου, 250 μm ATP, 1 μCi/μl [γ- 32P ]ATP και συγκεντρώσεις N-His(6)ΔFosB που κυμαίνονταν από 2.5–30 μm. Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν στους 30°C σε υδατόλουτρο. Μετά από SDS-PAGE και χρώση της γέλης με Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad), η γέλη ξηράνθηκε και η ενσωμάτωση του 32P -φωσφορικού αξιολογήθηκε με ανάλυση φωσφορικής απεικόνισης (βλ. παρακάτω, Ποσοτικοποίηση δεδομένων, υπολογισμοί και στατιστικά στοιχεία).
Δισδιάστατος χάρτης φωσφοπεπτιδίου και ανάλυση φωσφοαμινοξέων.
Και οι δύο αυτές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται από τους Ploegh και Dunn (2000) . Εν συντομία, θραύσματα ξηρής γέλης που περιείχαν ΔFosB επισημασμένο με 32P (είτε από αντιδράσεις in vitro είτε από ανοσοιζήματα μεταβολικά επισημασμένων κυττάρων), αποκόπηκαν, επανυδατώθηκαν, πλύθηκαν και υποβλήθηκαν σε τρυπτική πέψη. Το υπερκείμενο υγρό που περιείχε τα προϊόντα τρυπτικής πέψης λυοφιλοποιήθηκε και το λυοφιλοποιημένο υλικό πλύθηκε αρκετές φορές και επαναιωρήθηκε σε 10 μl ρυθμιστικού διαλύματος ηλεκτροφόρησης, pH 1.9. Δείγμα (3 μl) τοποθετήθηκε σε πλάκα χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας κυτταρίνης (TLC) (Analtech, Newark, DE) και διαχωρίστηκε σε μία διάσταση με ηλεκτροφόρηση και στην άλλη διάσταση με ανιούσα TLC. Οι προκύπτοντες χάρτες φωσφοπεπτιδίων απεικονίστηκαν με αυτοραδιογραφία και φωσφοροαπεικόνιση. Για την ανάλυση φωσφοαμινοξέων, 2 μl των θρυπτικών προϊόντων πέψης που είχαν επαναιωρηθεί σε ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης διασπάστηκαν περαιτέρω με υδρόλυση HCl στους 105°C για 25 λεπτά σε 3 m HCl υπό ατμόσφαιρα N2 . Η αντίδραση διακόπηκε με εξαπλάσια αραίωση σε νερό και το μείγμα λυοφιλοποιήθηκε. Το λυοφιλοποιημένο προϊόν επαναιωρήθηκε σε 5 μl ρυθμιστικού διαλύματος ηλεκτροφόρησης, pH 1.9, και τοποθετήθηκε σε πλάκα TLC κυτταρίνης μαζί με πρότυπα φωσφο-Ser, -Thr και -Tyr. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιήθηκε στο μισό μήκος της πλάκας TLC χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης, pH 1.9, και στη συνέχεια η πλάκα μεταφέρθηκε στο ρυθμιστικό διάλυμα pH 3.5, και η ηλεκτροφόρηση ολοκληρώθηκε. Τα πρότυπα φωσφοαμινοξέων απεικονίστηκαν με ψεκασμό της πλάκας TLC με διάλυμα νινυδρίνης 1% (v/v) σε ακετόνη και τα δείγματα αμινοξέων με σήμανση 32P απεικονίστηκαν τόσο με αυτοραδιογραφία όσο και με φωσφοροαπεικόνιση.
Καταστροφή CK2α που προκαλείται από siRNA.
Χρησιμοποιήσαμε μια μέθοδο παρεμβολής RNA για να μειώσουμε επιλεκτικά τα επίπεδα της CK2 ( Di Maira et al., 2005 ). Τα κύτταρα PC12 τοποθετήθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων επικαλυμμένες με κολλαγόνο Ι για να επιτύχουν συρροή ~70-80% την επόμενη ημέρα, όταν μεταμοσχεύθηκαν παροδικά με 20 nm (τελική συγκέντρωση) είτε μη στοχευμένου siRNA είτε siRNA κατευθυνόμενου προς το mRNA της καταλυτικής α υπομονάδας της CK2 Rat, χρησιμοποιώντας 5 μl του παράγοντα μεταμόσχευσης SilentFectin (Bio-Rad) και ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Περίπου 24 ώρες αργότερα, τα κύτταρα μεταμοσχεύθηκαν παροδικά με πλασμίδιο ΔFosB, όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Περίπου 24 ώρες αργότερα (~48 ώρες μετά τη μεταμόσχευση siRNA), τα κύτταρα υποβλήθηκαν είτε σε μεταβολική σήμανση 32P είτε σε ανάλυση παλμικής παρακολούθησης όπως περιγράφεται παραπάνω. Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα τέσσερα siRNA CK2α με παρόμοια αποτελέσματα: 5′P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3′, 5′P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3′, 5′P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUU3′, 5′P-AAAUCCCUG ACAUCAUAUUUU3′ (Dharmacon, Lafayette, CO). Ως αρνητικό μάρτυρα, χρησιμοποιήσαμε το siRNA αρνητικού μάρτυρα Silencer #3 από την Ambion (Austin, TX). Η έκταση της καταστολής της CK2 παρακολουθήθηκε με ανοσοαποτύπωση χρησιμοποιώντας ένα πολυκλωνικό αντίσωμα κατά της CK2 (κατάλογος #06-873 από την Upstate) όλη τη νύχτα σε αραίωση 1:1000. Η β-τουμπουλίνη χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης και ανιχνεύθηκε με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα (κατάλογος #05-661 από την Upstate) όλη τη νύχτα σε αραίωση 1:20,000.
Τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξιογένεση.
Η μετάλλαξη της Ser27 σε Ala ή σε Asp πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ γρήγορης αλλαγής θέσης κατευθυνόμενης μεταλλαξιογένεσης (Stratagene, La Jolla, CA) και ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για την εισαγωγή των μεταλλάξεων Ser27 στην πρωτεΐνη ΔFosB ποντικού, χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθοι εκκινητές μεταλλαξιογένεσης. Ser27 σε Ala: (αντίστροφος εκκινητής) 5′GCCGAAGGAGTCCACCGA AG C CAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3′. Ser27 σε Asp (προωθούμενος εκκινητής) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTG GA T TCGGTGGACTCCTTCGGC3′. Οι μεταλλαγμένες βάσεις είναι με έντονη γραφή και το κωδικόνιο Ser27 είναι με πλάγια γραφή.
Βιοπληροφορική.
Πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης και κινάσες για το ΔFosB αναζητήθηκαν υποβάλλοντας την αλληλουχία πρωτεΐνης ποντικού σε εξειδικευμένες βάσεις δεδομένων, όπως οι ProSite ( http://www.expasy.org/prosite/ ), PredictProtein ( Rost et al., 2004 ) και NetPhosK ( Blom et al., 2004 ).
Ποσοτικοποίηση δεδομένων, υπολογισμοί και στατιστικές.
Η ποσότητα πρωτεΐνης που υπάρχει στη μεμβράνη PVDF ή νιτροκυτταρίνης ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Storm PhosphorImager και το συνοδευτικό λογισμικό ImageQuant (Amersham Biosciences/Molecular Dynamics). Στις μελέτες φωσφορυλίωσης κυτταροκαλλιέργειας και εγκεφαλικής φέτας, οι τιμές που ελήφθησαν για το 32Η σημασμένη με Ρ πρωτεΐνη στη συνέχεια διαιρέθηκε με τις τιμές που ελήφθησαν για το συνολικό ΔFosB και εκφράστηκαν ως αναλογία. Στο in vitro μελέτες φωσφορυλίωσης, η ποσότητα των 32Το σημασμένο με P ΔFosB ανά mole ΔFosB (στοιχειομετρία) υπολογίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Sahin et αϊ., 2004). Όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν εντός του εύρους γραμμικότητας του χρησιμοποιούμενου οργάνου. Οι κινητικές παράμετροι υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το μοντέλο Michaelis-Menten, όπου V = VΜέγ.[S]/([S]+KM) Και VΜέγ. = k2[EΣύνολο]. Ο χρόνος ημιζωής (t1/2) των ΔFosB και FosB υπολογίστηκαν από τις γραφικές παραστάσεις παλμικής καταδίωξης (χρησιμοποιώντας τη μη γραμμική παλινδρόμηση που ταίριαζε καλύτερα στα σημεία δεδομένων) και αντιστοιχούν στον χρόνο κατά τον οποίο η ποσότητα της πρωτεΐνης που απομένει είναι 50% της αρχικής. Σε όλα τα σχήματα, τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον δύο έως τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Σε όλα τα γραφήματα, τα δεδομένα που εμφανίζονται είναι μέσοι όροι ± SEM (3 ≤ n ≤16). Η στατιστική σημασία των διαφορών αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μη ζευγαρωμένο t δοκιμή, διορθώθηκε για πολλαπλές συγκρίσεις και οι αστερίσκοι δείχνουν p ≤ 0.05.
Προηγούμενη Ενότητα Επόμενη Ενότητα
Αποτελέσματα
Το ΔFosB είναι ένας ασυνήθιστα σταθερός μεταγραφικός παράγοντας
Παρόλο που έχουμε υποθέσει προηγουμένως ότι το ΔFosB είναι ένας σχετικά σταθερός παράγοντας μεταγραφής ( Nestler et al., 2001 ), μέχρι σήμερα δεν έχει πραγματοποιηθεί άμεση ανάλυση του προφίλ ανακύκλωσης της πρωτεΐνης. Για να απαντήσουμε σε αυτό το ερώτημα, πραγματοποιήσαμε πειράματα παλμικής παρακολούθησης χρησιμοποιώντας κύτταρα PC12, τα οποία έχουν χρησιμοποιηθεί εκτενώς ως κυτταρική σειρά που μοιάζει με νευρώνα, στην οποία το ΔFosB εκφράστηκε παροδικά μέσω μόλυνσης με έναν ανασυνδυασμένο ιό απλού έρπητα (HSV-ΔFosB). Οι νεοσυντιθέμενες πρωτεΐνες επισημάνθηκαν μεταβολικά με 35S -Met/Cys και το πρότυπο αποικοδόμησης του 35S -σημασμένου ΔFosB ( 35S -ΔFosB) παρακολουθήθηκε με ανοσοκαθίζησή του από κυτταρικά λύματα που ελήφθησαν σε διάφορα χρονικά σημεία μετά την αφαίρεση των ραδιοσημασμένων αμινοξέων. Η ανάλυση των ανοσοκαθιζημάτων με SDS-PAGE και αυτοραδιογραφία αποκάλυψε ότι ο χρόνος ημιζωής του ΔFosB στα κύτταρα PC12 είναι ~10 ώρες ( Εικ. 1 ). Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι ο χρόνος ημιζωής του ΔFosB είναι υψηλότερος από αυτόν των περισσότερων επαγώγιμων παραγόντων μεταγραφής (βλ. Συζήτηση), συμπεριλαμβανομένου του FosB πλήρους μήκους, του οποίου ο χρόνος ημιζωής σε κυτταροκαλλιέργεια έχει αναφερθεί ότι είναι ~90 λεπτά ( Dobrazanski et al., 1991 ; Carle et al. 2004 ). Επιπλέον, αξίζει να σημειωθεί ότι η αποικοδόμηση του ΔFosB δεν ταιριάζει με μια καμπύλη εκθετικής αποσύνθεσης πρώτου βαθμού, αλλά μάλλον είναι διφασική, ξεκινώντας με βραδύτερο ρυθμό αποικοδόμησης. Αυτό υποδηλώνει την ύπαρξη περισσότερων από ενός ειδών ΔFosB ή/και περισσότερων από μία οδών αποικοδόμησης.
Προβολή μεγαλύτερης έκδοσης:
Εικόνα 1.
Το ΔFosB είναι ένας ασυνήθιστα σταθερός μεταγραφικός παράγοντας. Ο χρόνος ημιζωής του ΔFosB είναι ~10 ώρες σε κυτταρική καλλιέργεια. Το ΔFosB εκφράστηκε σε κύτταρα PC12 είτε με μόλυνση με HSV-ΔFosB είτε με παροδική επιμόλυνση με πλασμίδιο που περιέχει ΔFosB και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε πειράματα καταδίωξης παλμών όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Λήφθηκαν ισοδύναμα αποτελέσματα ανεξάρτητα από τη μέθοδο που χρησιμοποιήθηκε για την υπερέκφραση του ΔFosB. Το σχήμα δείχνει τη χρονική πορεία (και αντιπροσωπευτικό αυτοραδιόγραμμα) της υποβάθμισης του ΔFosB. Τα δεδομένα που απεικονίζονται είναι ο μέσος όρος ± SEM τουλάχιστον 15 μεμονωμένων σημείων δεδομένων που λαμβάνονται από τουλάχιστον πέντε ανεξάρτητα πειράματα. Για σύγκριση, υποδεικνύεται ο αναφερόμενος χρόνος ημιζωής του πλήρους μήκους FosB.
Το ΔFosB είναι μια φωσφοπρωτεΐνη στον εγκέφαλο
Έχουμε υποθέσει ότι η μεταμεταφραστική τροποποίηση του ΔFosB μπορεί να συμβάλλει στην φαινομενική του σταθερότητα. Επειδή η φωσφορυλίωση έχει αποδειχθεί ότι τροποποιεί τη δραστηριότητα των παραγόντων μεταγραφής με πολλούς τρόπους, συμπεριλαμβανομένης της σταθερότητάς τους (για ανασκόπηση, βλ. Desterro et al., 2000 ; Whitmarsh and Davis, 2000 ), ερευνήσαμε εάν το ΔFosB είναι μια φωσφοπρωτεΐνη. Για το σκοπό αυτό, η έκφραση ΔFosB προκλήθηκε σε εγκέφαλο αρουραίου χρησιμοποιώντας χρόνια εξωκυτταρική κυστίτιδα (ECS), μια θεραπεία που είναι γνωστό ότι προκαλεί υψηλά επίπεδα ΔFosB, ιδιαίτερα στον μετωπιαίο φλοιό ( Hope et al., 1994a ). Μία ημέρα μετά την τελευταία θεραπεία με ECS, όταν τα επίπεδα ΔFosB παραμένουν υψηλά, παρασκευάστηκαν λεπτές φλοιώδεις φλοιώδεις φλοιοί του μετωπιαίου τμήματος και επισημάνθηκαν μεταβολικά με 32P -ορθοφωσφορικό. Ένα παράλληλο σύνολο φετών δεν ραδιοσημάνθηκε και αυτές χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των συνολικών επιπέδων ΔFosB. Μετά από ανοσοκαθίζηση με ένα ειδικό αντίσωμα κατά του FosB/ΔFosB και διαχωρισμό των ανοσοκαθιζημένων πρωτεϊνών με SDS-PAGE, η φωσφορυλιωμένη ΔFosB με σήμανση 32P ανιχνεύθηκε με αυτοραδιογραφία, ενώ η συνολική ΔFosB ανιχνεύθηκε με ανοσοστύπωμα. Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε ότι η ΔFosB φωσφορυλιώνεται στον εγκέφαλο, όπως αποδεικνύεται από μια ειδική ζώνη με σήμανση 32P περίπου 35 kDa που υπάρχει στα χρόνια θεραπευμένα δείγματα εγκεφάλου, αλλά είναι ουσιαστικά μη ανιχνεύσιμη στους εικονικά θεραπευμένους μάρτυρες ( Εικ. 2 Α ). Αυτό συνάδει με το γεγονός ότι, απουσία χρόνιας διέγερσης, τα βασικά επίπεδα ΔFosB είναι πολύ χαμηλά. Η εξειδίκευση της αντίδρασης ανοσοκαθίζησης καταδεικνύεται από την έλλειψη σήματος στο μη ανοσοποιητικό ίζημα IgG.
Προβολή μεγαλύτερης έκδοσης:
Εικόνα 2.
Το ΔFosB είναι μια φωσφοπρωτεΐνη στον εγκέφαλο. A, το ΔFosB είναι φωσφορυλιωμένο στον εγκέφαλο. Το ενδογενές ΔFosB προκλήθηκε σε εγκέφαλο αρουραίου με χρόνια θεραπεία ECS όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Οι μετωπικές φλοιώδεις φέτες επισημάνθηκαν μεταβολικά με 32PH3PO4 για αρκετές ώρες. Μετά την ομογενοποίηση των φετών, το ΔFosB ανοσοκαταβυθίστηκε και φωσφορυλιώθηκε το ΔFosB (32Το P-ΔFosB) ανιχνεύθηκε με αυτοραδιογραφία (πάνω πάνελ). Το συνολικό ΔFosB σε μη ραδιενεργά ανοσοϊζήματα ανιχνεύθηκε με ανοσοστύπωση (κάτω πλαίσιο). Ως αρνητικοί μάρτυρες, παρουσιάζονται το ανοσοκαταβύθισμα ενός ζώου που υποβλήθηκε σε ψευδή αγωγή και η μη άνοση IgG. B, Υποψήφιες θέσεις φωσφορυλίωσης και κινάσες με αντίστοιχες βαθμολογίες πρόβλεψης για την αλληλουχία πρωτεΐνης ΔFosB ποντικού ελήφθησαν με βιοπληροφορική ανάλυση. Οι υποψήφιες θέσεις με τις υψηλότερες βαθμολογίες πρόβλεψης επισημαίνονται στην πρωτεϊνική αλληλουχία και παρατίθενται στον πίνακα. Η (βασική) περιοχή δέσμευσης DNA και το φερμουάρ λευκίνης είναι με έντονους χαρακτήρες στην πρωτεϊνική αλληλουχία. C, D, η φωσφορυλίωση ΔFosB αυξάνεται από τον αναστολέα φωσφατάσης Ser/Thr ΟΑ. C, 32Τα επίπεδα P-ΔFosB σε ανοσοκατακρημνίσματα από μετωπιαίους φλοιώδεις τομές που σημάνθηκαν απουσία (Ctr) ή παρουσία 100 ng/ml ΟΑ (γραφική παράσταση και άνω πίνακας) ανιχνεύθηκαν με αυτοραδιογραφία. Το κάτω πλαίσιο δείχνει το συνολικό ΔFosB που ανιχνεύτηκε σε ανοσοϊζήματα από μη επισημασμένες φέτες με ανοσοστύπωση. D, κύτταρα PC12 μολύνθηκαν με HSV-ΔFosB ή HSV-LacZ (φορέας) και σημάνθηκαν μεταβολικά με 32PH3PO4 απουσία (Ctr) ή παρουσία 100 ng/ml ΟΑ. 32Τα επίπεδα P-ΔFosB σε ανοσοϊζήματα ανιχνεύθηκαν με αυτοραδιογραφία (γραφική παράσταση, επάνω πλαίσιο). Το κάτω πλαίσιο δείχνει το συνολικό ΔFosB που ανιχνεύεται σε προϊόντα λύσης κυττάρων με ανοσοστύπωση.
Ως πρώτο βήμα για την αποσαφήνιση της κινάσης (ή των κινασών) και της θέσης (θέσεων) που εμπλέκονται στη φωσφορυλίωση της ΔFosB, υποβάλαμε την αλληλουχία αμινοξέων της σε αρκετές βιοπληροφορικές αναλύσεις. Αυτό αποκάλυψε ότι, αν και η ΔFosB δεν περιέχει υποψήφιες θέσεις φωσφορυλίωσης Tyr, περιέχει αρκετές θέσεις συναίνεσης κινάσης Ser/Thr, συμπεριλαμβανομένων τριών θέσεων CaMKII, τριών θέσεων CK2 και δύο θέσεων PKC με πολύ υψηλές βαθμολογίες πρόβλεψης φωσφορυλίωσης ( Εικ. 2 Β ). Εάν, όπως προβλέπεται μέσω της βιοπληροφορικής, η ΔFosB φωσφορυλιώνεται μόνο σε υπολείμματα Ser ή Thr, τότε η φωσφορυλίωσή της θα πρέπει να τροποποιείται σημαντικά από τη δράση των φωσφατασών Ser/Thr. Για να ελέγξουμε αυτήν την υπόθεση, επισημάναμε μετωπιαίες φλοιώδεις φλοιώδεις φλοιούς με 32P -ορθοφωσφορικό παρουσία ή απουσία OA, ενός αναστολέα πρωτεϊνικής φωσφατάσης Ser/Thr. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2 C , η οστεοαρθρίτιδα προκάλεσε μεγάλη (∼2.5 φορές) αύξηση στο 32P -ΔFosB. Προκάλεσε επίσης μια μικρή αύξηση στα συνολικά επίπεδα ΔFosB, η οποία είναι σύμφωνη με προηγούμενες αναφορές που συνδέουν τις καρκινογόνες επιδράσεις της οστεοαρθρίτιδας με την ικανότητά της να επάγει αρκετά άμεσα πρώιμα γονίδια, συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών Fos ( Miller et al., 1998 ; Choe et al., 2004 ). Το καθαρό αποτέλεσμα είναι μια σημαντική συνολική αύξηση (∼60%) στα φωσφορυλιωμένα επίπεδα ΔFosB.
Στη συνέχεια, διερευνήσαμε εάν, σε κύτταρα PC12, τα οποία είναι πιο ευαίσθητα σε πειραματικό χειρισμό, το ΔFosB εμφάνισε ένα πρότυπο φωσφορυλίωσης παρόμοιο με αυτό που παρατηρείται στον εγκέφαλο. Εκφράσαμε ΔFosB σε κύτταρα PC12 μέσω μόλυνσης με HSV-ΔFosB και επισημάναμε μεταβολικά τα κύτταρα με 32P -ορθοφωσφορικό παρουσία ή απουσία οστεοαρθρίτιδας (ΟΑ). Η επιτυχής έκφραση και ανοσοκαθίζηση της πρωτεΐνης από κύτταρα μολυσμένα με HSV-ΔFosB φαίνεται από την παρουσία τόσο στο ανοσοστύπωμα ( Εικ. 2 D , κάτω πλαίσιο) όσο και στο αυτοραδιόγραμμα (άνω πλαίσιο) μιας ζώνης ~35 kDa, που απουσιάζει από τα κύτταρα μολυσμένα με φορέα. Όπως παρατηρήθηκε στον εγκέφαλο, το ΟΑ προκάλεσε μια μικρή αύξηση στα συνολικά επίπεδα ΔFosB αλλά μια πολύ υψηλότερη (περίπου διπλάσια) αύξηση στο 32P -ΔFosB, με αποτέλεσμα μια σημαντική (~50%) καθαρή αύξηση στη φωσφορυλίωση ΔFosB. Επιπλέον, σύμφωνα με τις βιοπληροφορικές προβλέψεις, η θεραπεία των κυττάρων PC12 με αναστολέα φωσφατάσης Tyr δεν οδήγησε σε σημαντικές αλλαγές στα επίπεδα 32P -ΔFosB (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συνολικά, αυτά τα ευρήματα αποκάλυψαν ότι το ΔFosB φωσφορυλιώνεται σε υπολείμματα Ser και/ή Thr στον εγκέφαλο και στα κύτταρα PC12 και επιβεβαίωσαν ότι το τελευταίο είναι ένα καλό σύστημα κυτταροκαλλιέργειας για την περαιτέρω μελέτη των προφίλ φωσφορυλίωσης και αποικοδόμησης του ΔFosB.
Το CK2 αλλά όχι το PKC ή το CaMKII φωσφορυλιώνει το ΔFosB in vitro
Όπως περιγράφηκε παραπάνω, η ανάλυση της αλληλουχίας αμινοξέων ΔFosB αποκάλυψε υψηλές βαθμολογίες πρόβλεψης για θέσεις φωσφορυλίωσης CK2, PKC και CaMKII. Για να προσδιορίσουμε ποιες από αυτές τις κινάσες μπορεί να φωσφορυλιώσουν το ΔFosB, πραγματοποιήσαμε μια σειρά από in vitro αντιδράσεις φωσφορυλίωσης χρησιμοποιώντας καθαρισμένες κινάσες και καθαρισμένο ανασυνδυασμένο ΔFosB. Όπως φαίνεται στο Εικόνα 3A, από τις τρεις υποψήφιες κινάσες, μόνο το CK2 φωσφορυλιώθηκε το ΔFosB με σημαντικό τρόπο. Επιπλέον, δοκιμάστηκαν αρκετές άλλες κινάσες (π.χ. GSK3 και p70S6K) αλλά απέτυχαν να φωσφορυλώσουν σημαντικά το ΔFosB (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπρόσθετος χαρακτηρισμός της αντίδρασης CK2 με ανάλυση χρονικής πορείας αποκάλυψε ότι αυτή η κινάση μπορεί να καταλύσει την ενσωμάτωση περίπου 0.5 mol φωσφορικού ανά mole ΔFosB (Σύκο. 3B). Το γεγονός ότι το CK2 μπορεί να φωσφορυλιώσει το ΔFosB in vitro σε μια σημαντική στοιχειομετρία (~50%) υποδηλώνει μια φυσιολογικά σχετική αντίδραση. Στη συνέχεια μελετήσαμε την κινητική αυτής της αντίδρασης επωάζοντας το CK2 παρουσία αυξανόμενων ποσοτήτων καθαρού ΔFosB και προσδιορίσαμε ότι το CK2 φωσφορυλιώνει το ΔFosB με Vmax από 5.8 pmol · min-1 · μg-1 του ενζύμου, α KM 18.4 μm και α kπως 0.2/s (Σύκο. 3C). Οι τιμές που λαμβάνονται για αυτές τις κινητικές παραμέτρους υποστηρίζουν περαιτέρω τη φυσιολογική συνάφεια αυτής της αντίδρασης. Για παράδειγμα, το KM του CK2 για το DARPP32, ένα από τα πιο γνωστά υποστρώματά του, είναι 3.4 μm και το kπως είναι ~0.3/s (Girault et al., 1989) · ο KM για το ATP κυμαίνεται από ~10–40 μm (Cochet et al., 1983; Silva-Neto et al., 2002), και ότι για την καζεΐνη κυμαίνεται από ~10–50 μm (Meggio et al., 1977; Pyerin et al., 1987). Μαζί, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι το ΔFosB είναι ένα καλόπιστο υπόστρωμα για το CK2 in vitro.
Προβολή μεγαλύτερης έκδοσης:
Εικόνα 3.
Η CK2 αλλά όχι η PKC ή η CaMKII φωσφορυλιώνει το ΔFosB in vitro . Το αυτοραδιόγραμμα (πάνω πλαίσιο) δείχνει το φωσφορυλιωμένο προϊόν και το πήκτωμα που έχει χρωματιστεί με Coomassie (κάτω πλαίσιο) δείχνει το συνολικό ΔFosB που υπάρχει στην αντίδραση. A , Καθαρισμένο ανασυνδυασμένο ΔFosB υποβλήθηκε σε φωσφορυλίωση in vitro από διάφορες υποψήφιες κινάσες (τρεις από τις οποίες φαίνονται). B , Η χρονική πορεία και οι στοιχειομετρικές αναλύσεις δείχνουν ότι η CK2 μπορεί να φωσφορυλιώσει το ΔFosB in vitro με στοιχειομετρία ~50%. C , Η κινητική ανάλυση της αντίδρασης CK2 αποκάλυψε ότι το ΔFosB είναι ένα καλό υπόστρωμα in vitro . Η γραμμικοποίηση της αντίδρασης φαίνεται σε ένα διπλά αμοιβαίο διάγραμμα (κάτω), αλλά οι κινητικές παράμετροι προέκυψαν από την καμπύλη Michaelis-Menten (πάνω).
Το CK2 ρυθμίζει τη φωσφορυλίωση και τη σταθερότητα του ΔFosB σε άθικτα κύτταρα
Για να αξιολογήσουμε τη φυσιολογική σημασία της φωσφορυλίωσης του ΔFosB που προκαλείται από CK2, πραγματοποιήσαμε συγκριτική χαρτογράφηση φωσφοπεπτιδίων χρησιμοποιώντας in vitro φωσφορυλιωμένο ΔFosB και φωσφορυλιωμένο από PC12 κύτταρα. Μετά από SDS-PAGE και έκλουση σε πήκτωμα του 32P -ΔFosB (από τις in vitro αντιδράσεις ή από το ανοσοίζημα των 32P -σημασμένων κυττάρων), η πρωτεΐνη υποβλήθηκε σε πέψη με θρυψίνη και τα προκύπτοντα φωσφοπεπτίδια υποβλήθηκαν σε δισδιάστατο διαχωρισμό. Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε ότι το κύριο φωσφοπεπτίδιο από την αντίδραση CK2 συν-μετανάστευσε με ένα από τα δύο κύρια φωσφοπεπτίδια από ΔFosB που φωσφορυλιώθηκε σε κύτταρα PC12 ( Εικ. 4 Α ), ενώ τα φωσφοπεπτίδια που προέκυψαν από την αντίδραση PKC ή CaMKII (δεδομένα δεν παρουσιάζονται) δεν το έκαναν. Υπήρχε ένα δεύτερο φωσφοπεπτίδιο ΔFosB στον χάρτη από τα κύτταρα PC12, αλλά λόγω της αδυναμίας οποιασδήποτε από τις κινάσες που έχουμε δοκιμάσει να δημιουργήσουν ένα παρόμοιο φωσφοπεπτίδιο in vitro , δεν γνωρίζουμε προς το παρόν εάν αυτό το δεύτερο φωσφοπεπτίδιο περιέχει μια θέση φωσφορυλίωσης διαφορετική από το άλλο φωσφοπεπτίδιο ή εάν αντιπροσωπεύει ένα ξεχωριστό τρυπτικό πεπτίδιο που περιέχει την ίδια θέση φωσφορυλίωσης.
Προβολή μεγαλύτερης έκδοσης:
Εικόνα 4.
Η CK2 ρυθμίζει τη φωσφορυλίωση και τη σταθερότητα της ΔFosB σε άθικτα κύτταρα. Α , η CK2 αλλά όχι η PKC φαίνεται να φωσφορυλιώνει τη ΔFosB στα κύτταρα. Δισδιάστατοι χάρτες φωσφοπεπτιδίων της ΔFosB φωσφορυλιωμένης από CK2 ή PKC in vitro ή από άθικτα κύτταρα PC12. Τα βέλη δείχνουν τη συμμετανάστευση του CK2-φωσφορυλιωμένου πεπτιδίου αλλά όχι του PKC-φωσφορυλιωμένου με ένα από τα ΔFosB φωσφοπεπτίδια που λαμβάνονται από κύτταρα PC12. Β , η φωσφορυλίωση ΔFosB σε κύτταρα PC12 αυξάνεται με την επεξεργασία των κυττάρων με τον ισχυρό ενεργοποιητή CK2 σπερμίνη (SP) και μειώνεται με την επεξεργασία με τον αναστολέα CK2 DRB. Αντίθετα, η φωσφορυλίωση ΔFosB σε κύτταρα PC12 δεν επηρεάστηκε από την επεξεργασία ούτε με ενεργοποιητή PKC (PMA) ούτε με τον ειδικό για την PKC αναστολέα καλφωστίνη-C (Calph). Παρουσιάζεται ένα αντιπροσωπευτικό αυτοραδιογράφημα (άνω πλαίσιο) και ένα ανοσοστύπωμα (κάτω πλαίσιο). C–F , Επίδραση της δραστικότητας CK2 στη σταθερότητα του ΔFosB. Τα σχήματα δείχνουν την χρονική πορεία (και το αντιπροσωπευτικό αυτοραδιογράφημα) της αποικοδόμησης του ΔFosB. Τα κύτταρα PC12 που εκφράζουν παροδικά ΔFosB υποβλήθηκαν σε πειράματα παλμικής εκδίωξης που διεξήχθησαν απουσία ή παρουσία του αναστολέα CK2 DRB ( C ), του ενεργοποιητή CK2 σπερμίνη ( D ) ή του αναστολέα κινάσης ευρέος φάσματος H-8 ( E ), ο οποίος χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο των μη ειδικών επιδράσεων του DRB. F , Επίδραση της καταστολής της καταλυτικής υπομονάδας του CK2 στη σταθερότητα του ΔFosB. Τα κύτταρα PC12 μεταμοσχεύθηκαν είτε με ένα μη στοχευμένο siRNA (Ctr) είτε με siRNA που στοχεύει την CK2α αρουραίου και 24 ώρες αργότερα μεταμοσχεύθηκαν με ένα πλασμίδιο ΔFosB. Το επάνω πλαίσιο απεικονίζει ανοσοστυπώματα λυμάτων ολόκληρων κυττάρων που δείχνουν την επίδραση του siRNA CK2 στα επίπεδα πρωτεϊνών CK2 και ΔFosB. Το αντίστοιχο ανοσοστύπωμα για τη β-τουμπουλίνη εμφανίζεται ως έλεγχος φόρτωσης.
Για περαιτέρω αντιμετώπιση της φυσιολογικής σημασίας του CK2 ως κινάσης ΔFosB, αντιμετωπίσαμε τα κύτταρα PC12 που εκφράζουν ΔFosB με δύο φάρμακα που ρυθμίζουν τη δραστηριότητα του CK2. Όπως φαίνεται στο Εικόνα 4B, η φωσφορυλίωση του ΔFosB μειώθηκε με επεξεργασία των κυττάρων PC12 με τον διαπερατό από κύτταρα αναστολέα CK2 DRB (Meggio et al., 1990; Szyszka et al., 1995), και αυξήθηκε με θεραπεία με τη σπερμίνη πολυαμίνης, που είναι γνωστό ότι είναι ένας ισχυρός ενεργοποιητής CK2 (Cochet και Chambaz, 1983; Meggio et al., 1983). Αντίθετα, η θεραπεία των κυττάρων PC12 με τον αναστολέα PKC calphostin-C (Kobayashi κ.ά., 1989; Tamaoki et al., 1990) ή τον ενεργοποιητή PKC PMA (Schmidt και Hecker, 1975; Beh et al., 1989) δεν οδήγησε σε σημαντικές αλλαγές στη φωσφορυλίωση του ΔFosB. Στην περίπτωση του PMA, η ελαφρά (και όχι σημαντική) αύξηση του 32Το P-ΔFosB θα μπορούσε να οφείλεται σε αύξηση των συνολικών επιπέδων ΔFosB που προκαλείται από αυτό το φάρμακο. Στην πραγματικότητα, έχει αναφερθεί ότι οι εστέρες φορβόλης προκαλούν έκφραση πολλών πρωτεϊνών της οικογένειας Fos, συμπεριλαμβανομένου του FosB (Yoza et al., 1992; Suh et al., 2004). Επιπλέον, η θεραπεία των κυττάρων με τον ειδικό διαπερατό από κύτταρα CaMKII αναστολέα m-AIP (Ishida και Fujisawa, 1995; Stevens et αϊ., 1999) επίσης δεν οδήγησε σε μειωμένη φωσφορυλίωση ΔFosB (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα είναι συνεπή με το δικό μας in vitro ευρήματα και υποδεικνύουν ότι σε άθικτα κύτταρα το ΔFosB είναι πιθανόν φωσφορυλιωμένο από CK2 αλλά όχι από PKC ή CaMKII. Το γεγονός ότι η αναστολή της CK2 δεν αποτρέπει πλήρως τη φωσφορυλίωση του ΔFosB υποδεικνύει την ύπαρξη πρόσθετων θέσεων φωσφορυλίωσης στην πρωτεΐνη.
Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν η CK2 παίζει ρόλο στην ανακύκλωση της ΔFosB και, ως εκ τούτου, στη σταθερότητά της. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήσαμε πειράματα παλμικής εκδίωξης χρησιμοποιώντας κύτταρα PC12 που εκφράζουν ΔFosB και υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με τον αναστολέα CK2 είτε με τον ενεργοποιητή CK2 που χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη φωσφορυλίωσης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4 C , η αγωγή των κυττάρων με τον αναστολέα CK2 DRB είχε σημαντική επίδραση στον ρυθμό ανακύκλωσης της ΔFosB, όπως αποδεικνύεται από την αλλαγή στο σχήμα της καμπύλης αποικοδόμησης, από διφασική σε μια καμπύλη που είναι πιο κοντά σε αυτή της εκθετικής αποσύνθεσης. Αντίθετα, η παρουσία του ενεργοποιητή CK2, σπερμίνης, προκάλεσε σημαντική μείωση στον ρυθμό αποικοδόμησης της ΔFosB, η οποία οδήγησε στη συσσώρευση της πρωτεΐνης κατά τις πρώτες ώρες της εκδίωξης ( Εικ. 4 D ).
Όπως συμβαίνει με πολλούς ενεργοποιητές και αναστολείς κινάσης, η σπερμίνη και η DRB μπορούν να έχουν μεταβολικές επιδράσεις εκτός της ρύθμισης της δραστικότητας της CK2. Στην πραγματικότητα, έχει αποδειχθεί ότι η DRB αναστέλλει την κινάση που σχετίζεται με τον παράγοντα μεταγραφής IIH (TFIIH) ( Yankulov et al., 1995 ), η οποία οδηγεί σε αναστολή της μεταγραφής που προκαλείται από την RNA πολυμεράση II. Επειδή αυτή η επίδραση θα μπορούσε ενδεχομένως να επηρεάσει τη σταθερότητα της ΔFosB, αναλύσαμε την επίδραση του αναστολέα κινάσης ευρέος φάσματος H-8 ( Hidaka and Kobayashi, 1992 ) στην ανακύκλωση της ΔFosB σε συγκέντρωση (200 μm) που είναι γνωστό ότι αναστέλλει την κινάση που σχετίζεται με την TFIIH αλλά όχι την CK2 ( Yankulov et al., 1995 ). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4 Ε , η θεραπεία με H-8 δεν επηρέασε τον ρυθμό ανακύκλωσης της ΔFosB. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με την H-7, έναν άλλο αναστολέα κινάσης ευρέος φάσματος, που χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση που αναστέλλει την κινάση που σχετίζεται με την TFIIH αλλά όχι την CK2 (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν περαιτέρω την ερμηνεία ότι η μείωση της σταθερότητας του ΔFosB που προκαλείται από το DRB πιθανότατα αποδίδεται στην αναστολή της CK2.
Για να προσδιορίσουμε περαιτέρω τον ρόλο της CK2 στην ανακύκλωση της ΔFosB, διερευνήσαμε τις συνέπειες της καταστολής της CK2 μέσω του siRNA. Πραγματοποιήσαμε αυτά τα πειράματα χρησιμοποιώντας κύτταρα PC12 που αρχικά μεταμοσχεύθηκαν με siRNA ελέγχου (μη στοχευόμενο) ή με ένα siRNA που στοχεύει το mRNA της καταλυτικής υπομονάδας της CK2 αρουραίου (CK2α) και 24 ώρες αργότερα μεταμοσχεύθηκαν με ΔFosB. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4 F , η μεταμόσχευση με το siRNA CK2α μείωσε αποτελεσματικά και συγκεκριμένα τα επίπεδα της πρωτεΐνης CK2α χωρίς να επηρεάσει τα επίπεδα ΔFosB (άνω πλαίσιο). Η ανάλυση παλμικής παρακολούθησης αποκάλυψε ότι η καταστολή της CK2 είχε ως αποτέλεσμα σημαντική αύξηση του ρυθμού ανακύκλωσης της ΔFosB, όπως αποδεικνύεται από την ταχύτερη αποικοδόμηση της πρωτεΐνης. Το γεγονός ότι η αναστολή της δραστικότητας της CK2 (είτε μέσω θεραπείας με DRB είτε μέσω siRNA) αυξάνει τον κύκλο ζωής του ΔFosB και έχει ως αποτέλεσμα την εξαφάνιση του συστατικού αργού ρυθμού της διφασικής καμπύλης, ενώ η ενεργοποίηση της CK2 ενισχύει την αργή φάση της καμπύλης, παρέχει ισχυρή υποστήριξη για την ιδέα ότι η CK2 παίζει ρόλο στη ρύθμιση της σταθερότητας του ΔFosB.
Το CK2 φωσφορυλιώνει το ΔFosB στο Ser27
Για να ξεκινήσουμε την αναγνώριση της/των θέσης/θέσεων στο ΔFosB που φωσφορυλιώνεται από την CK2, διεξήγαμε ανάλυση φωσφο-αμινοξέων του ανασυνδυασμένου ΔFosB που φωσφορυλιώνεται από την CK2 in vitro και του ΔFosB που φωσφορυλιώνεται σε κύτταρα PC12. Αυτά τα πειράματα αποκάλυψαν ότι, και στις δύο περιπτώσεις, το μόνο φωσφο-αμινοξύ που ανιχνεύθηκε ήταν το φωσφο-Ser ( Εικ. 5 Α ). Αυτό το εύρημα, μαζί με τη στοιχειομετρία που ελήφθη για την αντίδραση φωσφορυλίωσης CK2 in vitro (∼50%) ( Εικ. 3 Β ) και την παρουσία μόνο μίας σημαντικής κηλίδας στον χάρτη φωσφοπεπτιδίων CK2 ( Εικ. 4 Α ), υποδηλώνει ότι η φωσφορυλίωση CK2 του ΔFosB πιθανώς περιορίζεται σε ένα μόνο υπόλειμμα σερίνης. Αυτό το συμπέρασμα είναι σύμφωνο με την ανάλυση συναινετικής θέσης φωσφορυλίωσης ( Εικ. 2 Β ), η οποία προέβλεψε μόνο μία υποψήφια σερίνη, δηλαδή, Ser27, για την CK2. Η ταξινομική ανάλυση αποκάλυψε ότι η Ser27 είναι ιδιαίτερα συντηρημένη μέσω της εξέλιξης μεταξύ των μελών της οικογένειας Fos ( Εικ. 5 Β ), υποδηλώνοντας ότι μπορεί να φέρει μια σημαντική φυσιολογική λειτουργία.
Προβολή μεγαλύτερης έκδοσης:
Εικόνα 5.
Η CK2 φωσφορυλιώνει το ΔFosB σε Ser27. A , Ανάλυση φωσφοαμινοξέων της CK2-φωσφορυλιωμένης ( in vitro ) και PC12-φωσφορυλιωμένης ΔFosB που δείχνει ότι, και στις δύο περιπτώσεις, το κύριο φωσφορυλιωμένο υπόλειμμα είναι η σερίνη. B , Διασταυρούμενη ανάλυση της αλληλουχίας αμινοξέων FosB/ΔFosB αποκάλυψε υψηλή διατήρηση της Ser27 μεταξύ των μελών της οικογένειας Fos, από τον άνθρωπο έως το ζεβρόψαρο (σκούρα επισήμανση). Ωστόσο, το όξινο υπόλειμμα στη θέση +3, το οποίο απαιτείται για τη θέση συναίνεσης CK2, δεν είναι διατηρημένο (ανοιχτή επισήμανση). C , Τα κύτταρα HeLa μεταμοσχεύθηκαν παροδικά είτε με άγριου τύπου ΔFosB ( WT) είτε με ΔFosB που περιείχε σημειακή μετάλλαξη για την αντικατάσταση της Ser27 με Ala (S27A). Τα κύτταρα επισημάνθηκαν μεταβολικά με 32P-H3PO4 και υποβλήθηκαν σε αγωγή με φορέα ή με σπερμίνη (SP) για την ενεργοποίηση της CK2. Παρουσιάζεται ένα αντιπροσωπευτικό αυτοραδιογράφημα (άνω πλαίσιο) και ένα ανοσοστύπωμα (κάτω πλαίσιο) των ληφθέντων ανοσοϊζημάτων ΔFosB. Παρουσιάζεται το ανοσοϊζημα των ψευδο-μεταμοσχευμένων κυττάρων (φορέας).
Για να προσδιορίσουμε εάν η Ser27 φωσφορυλιώνεται στο ΔFosB, μεταλλάξαμε αυτό το υπόλειμμα σε Ala και αναλύσαμε τις συνέπειες στην κατάσταση φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε κύτταρα HeLa (τα οποία μπορούν να μεταμοσχευθούν με υψηλότερη αποτελεσματικότητα) για να εκφράσουμε παροδικά είτε το μεταλλαγμένο ΔFosB WT είτε το S27A. Περίπου 24 ώρες μετά τη μεταμόσχευση, τα κύτταρα επισημάνθηκαν μεταβολικά με 32P -ορθοφωσφορικό και παρασκευάστηκαν λύματα ολόκληρων κυττάρων. Μετά την ανοσοκατακρήμνιση και την SDS-PAGE, το 32P -ΔFosB ανιχνεύθηκε με αυτοραδιογραφία και το συνολικό ΔFosB με ανοσοστύπωμα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5 C (κάτω πλαίσιο), το ΔFosB δεν ανιχνεύθηκε στα κύτταρα που μεταμοσχεύθηκαν με φορέα, ενώ τα κύτταρα που μεταμοσχεύθηκαν είτε με το μεταλλαγμένο ΔFosB WT είτε με το S27A εξέφρασαν με επιτυχία την πρωτεΐνη. Διαπιστώσαμε ότι η μετάλλαξη S27A προκάλεσε σημαντική (∼30%) μείωση στα επίπεδα 32P -ΔFosB ( Εικ. 5 C, επάνω πλαίσιο και γράφημα), υποδεικνύοντας ότι στα ζωντανά κύτταρα, το ΔFosB φωσφορυλιώνεται στο Ser27. Σε μια προσπάθεια να διαπιστώσουμε εάν στα κύτταρα το Ser27 φωσφορυλιώνεται πράγματι από την CK2, συγκρίναμε την ικανότητα της σπερμίνης, του ενεργοποιητή CK2, να ρυθμίζει τη φωσφορυλίωση της WT και της S27A ΔFosB. Όπως είχαμε παρατηρήσει προηγουμένως σε κύτταρα PC12 ( Εικ. 4 B ), η επεξεργασία των κυττάρων HeLa με σπερμίνη αύξησε σημαντικά τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης WT. Το γεγονός ότι αυτό το φαινόμενο μειώθηκε σημαντικά από τη μετάλλαξη S27A ( Εικ. 5 C ) υποστηρίζει την ερμηνεία ότι η Ser27 στο ΔFosB είναι ένα φυσιολογικό υπόστρωμα για την CK2.
Η φωσφορυλίωση του Ser27 ρυθμίζει τη σταθερότητα του ΔFosB
Έχοντας διαπιστώσει ότι η σταθερότητα του ΔFosB μειώνεται όταν η CK2 αναστέλλεται και ενισχύεται όταν η CK2 ενεργοποιείται ( Εικ. 4 ), και ότι η CK2 φωσφορυλιώνει το ΔFosB στη Ser27 ( Εικ. 5 ), προβλέψαμε ότι η πρόληψη της φωσφορυλίωσης αυτής της θέσης θα πρέπει να αποσταθεροποιεί την πρωτεΐνη. Πειράματα παλμικής εκδίωξης που διεξήχθησαν με κύτταρα HeLa που εκφράζουν παροδικά είτε το μεταλλαγμένο ΔFosB WT είτε το S27A αποκάλυψαν ότι, όπως προβλέφθηκε, η μετάλλαξη S27A είχε ως αποτέλεσμα σημαντική αύξηση του ρυθμού αποικοδόμησης του ΔFosB και ταυτόχρονη μείωση του χρόνου ημιζωής της πρωτεΐνης ( Εικ. 6 Α ). Στη συνέχεια διερευνήσαμε εάν αυτός ο ρυθμιστικός μηχανισμός εμφανίζεται και στην κυτταρική σειρά PC12 που μοιάζει περισσότερο με νευρώνες. Αυτά τα πειράματα αποκάλυψαν ότι, όπως είχαμε παρατηρήσει στα κύτταρα HeLa, η σημειακή μετάλλαξη S27A προκαλεί δραματική μείωση του χρόνου ημιζωής του ΔFosB στα κύτταρα PC12 (από ~11 έως ~4 ώρες) ( Εικ. 6 Β ). Το γεγονός ότι αυτή η αποσταθεροποίηση είναι παρόμοια με αυτή που προκαλείται από την αναστολή ή την καταστολή της CK2 ( Εικ. 4 ) παρέχει περαιτέρω υποστήριξη στην ιδέα ότι η φωσφορυλίωση της Ser27 που προκαλείται από την CK2 ρυθμίζει τη σταθερότητα της ΔFosB. Πρόσθετες ενδείξεις για τον ρυθμιστικό ρόλο της φωσφορυλίωσης της Ser27 στην ανακύκλωση της πρωτεΐνης ΔFosB ελήφθησαν χρησιμοποιώντας μια φωσφομιμητική μετάλλαξη Ser27 σε Asp (S27D). Η μετάλλαξη S27D θεωρείται φωσφομιμητική, επειδή τοποθετεί μια μεγάλη αρνητικά φορτισμένη (καρβοξυλική) ομάδα στο αμινοξύ 27 και έτσι μιμείται εν μέρει τη φωσφορυλίωση της Ser27. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6 C , η μετάλλαξη S27D προκάλεσε το αντίθετο αποτέλεσμα της μετάλλαξης S27A και είχε ως αποτέλεσμα μια πρωτεΐνη σημαντικά πιο σταθερή από την πρωτεΐνη WT. Ομοίως με το αποτέλεσμα που επιτεύχθηκε μετά την ενεργοποίηση της CK2 ( Εικ. 4 D ), η μετάλλαξη S27D είχε ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση και έτσι την αύξηση των επιπέδων ΔFosB κατά τις πρώτες ώρες της καταδίωξης.
Προβολή μεγαλύτερης έκδοσης:
Εικόνα 6.
Η φωσφορυλίωση της Ser27 ρυθμίζει τη σταθερότητα της ΔFosB. A , C , ανάλυση Pulse-chase που δείχνει την επίδραση της φωσφορυλίωσης της Ser27 στον ρυθμό ανακύκλωσης της ΔFosB. Παρουσιάζονται το προφίλ αποικοδόμησης και οι εκτιμώμενοι χρόνοι ημιζωής της άγριου τύπου ΔFosB (WT), της μεταλλαγμένης από Ser27 σε Ala (S27A) και της φωσφομιμητικής μεταλλαγμένης από Ser27 σε Asp (S27D). Τα ίδια ευρήματα ελήφθησαν σε κύτταρα HeLa ( A ) και κύτταρα PC12 ( B , C ).
Η φωσφορυλίωση Ser27 σταθεροποιεί το ΔFosB αποτρέποντας την πρωτεασωμική αποικοδόμησή του
Για να ξεκινήσουμε την αποσαφήνιση του μηχανισμού με τον οποίο η φωσφορυλίωση της Ser27 σταθεροποιεί το ΔFosB, εξετάσαμε την ικανότητα των αναστολέων πρωτεασώματος MG132 ( Palombella et al., 1994 ; Tsubuki et al., 1996 ) και της εποξομυκίνης ( Hanada et al., 1992 ; Kim et al., 1999 ) να ρυθμίζουν τον ρυθμό αποικοδόμησης του μεταλλαγμένου ΔFosB WT και S27A. Διεξήχθησαν πειράματα παλμικής εκδίωξης χρησιμοποιώντας κύτταρα PC12 μολυσμένα με ανασυνδυασμένο HSV που εκφράζει είτε WT είτε S27A ΔFosB και υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με DMSO είτε με έναν από τους δύο αναστολείς πρωτεασώματος. Αυτά τα πειράματα αποκάλυψαν ότι αν και ο ρυθμός αποικοδόμησης της πρωτεΐνης WT είναι σχετικά μη ευαίσθητος στην παρουσία οποιουδήποτε από τους δύο αναστολείς πρωτεασώματος ( Εικ. 7 Α ), αυτός του μεταλλαγμένου S27A είναι ευαίσθητος σε αυτά τα φάρμακα ( Εικ. 7 Β ). Αυτό υποδεικνύει ότι, σε αντίθεση με την πρωτεΐνη WT, η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη S27A αποτελεί στόχο πρωτεασωματικής αποικοδόμησης. Πράγματι, η επεξεργασία των κυττάρων είτε με MG132 είτε με εποξομυκίνη ανέτρεψε πλήρως την επίδραση της μετάλλαξης S27A στον ρυθμό αποικοδόμησης του ΔFosB, όπως αποδεικνύεται από την αύξηση του χρόνου ημιζωής της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης S27A από ~4 σε ~9 ώρες για την MG132 και σε ~12 ώρες για την εποξομυκίνη ( Εικ. 7 Β ). Συνολικά, αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η φωσφορυλίωση της ΔFosB στην Ser27 προστατεύει την πρωτεΐνη από την πρωτεασωματική αποικοδόμηση και ως εκ τούτου είναι απαραίτητη για την ασυνήθιστη σταθερότητά της.
Προβολή μεγαλύτερης έκδοσης:
Εικόνα 7.
Η φωσφορυλίωση της Ser27 σταθεροποιεί τη ΔFosB εμποδίζοντας την πρωτεασωματική της αποικοδόμηση. A , B , Ανάλυση παλμικής παρακολούθησης με κύτταρα PC12 μολυσμένα με HSV που δείχνει το προφίλ αποικοδόμησης και τους εκτιμώμενους χρόνους ημιζωής της άγριου τύπου ΔFosB ( A ) ή της S27A ΔFosB ( B ) απουσία ή παρουσία οποιουδήποτε από τους δύο αναστολείς πρωτεασώματος [MG132 και εποξομυκίνη (Epoxo)]. Σημειώστε το γεγονός ότι κανένα φάρμακο δεν έχει σημαντική επίδραση στην ανακύκλωση της άγριου τύπου ΔFosB, ενώ η θεραπεία κυττάρων με οποιονδήποτε από τους δύο αναστολείς πρωτεασώματος είχε ως αποτέλεσμα τη σταθεροποίηση της S27A ΔFosB. C , Ένα μοντέλο για τον ρόλο της φωσφορυλίωσης Ser27 στην ικανότητα της ΔFosB να προκαλεί τη μακροπρόθεσμη πλαστικότητα του εγκεφάλου. Μόλις επαχθεί, ένα μέρος της ΔFosB σταθεροποιείται στον εγκέφαλο μέσω της φωσφορυλίωσης της S27 που προκαλείται από την CK2. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τη συσσώρευσή της, η οποία με τη σειρά της οδηγεί σε μακροχρόνιες αλλαγές στην γονιδιακή έκφραση. Αυτές οι σταθερές αλλαγές στην γονιδιακή έκφραση συμβάλλουν σε σταθερές συμπεριφορικές προσαρμογές. Αντίθετα, η αποφωσφορυλίωση του S27 από τις φωσφατάσες Ser/Thr PP1 και/ή PP2A έχει ως αποτέλεσμα την αποσταθεροποίηση της πρωτεΐνης και την επεξεργασία της από τον πρωτεασωματικό μηχανισμό.
Προηγούμενη Ενότητα Επόμενη Ενότητα
Ερωτήσεις - Συζήτηση
Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι η ΔFosB έχει χρόνο ημιζωής ~10 ώρες σε κυτταροκαλλιέργεια, γεγονός που την καθιστά σταθερή σε σύγκριση με την FosB πλήρους μήκους και τους περισσότερους άλλους επαγώγιμους παράγοντες μεταγραφής, των οποίων ο χρόνος ημιζωής σε κυτταροκαλλιέργεια μπορεί να είναι μόλις λίγα λεπτά και σπάνια να υπερβαίνει τις 3 ώρες ( Hann and Eisenman, 1984 ; Dobrazanski et al., 1991 ; Roberts and Whitelaw, 1999 ; Ferrara et al., 2003 ; Hirata et al., 2004 ). Επιπλέον, διαπιστώνουμε ότι η ΔFosB φωσφορυλιώνεται στον εγκέφαλο και ότι η φωσφορυλίωσή της είναι ευαίσθητη στον αναστολέα PP1/PP2A, οκαδαϊκό οξύ. Οι μελέτες κυτταροκαλλιέργειας μας δείχνουν ότι η σταθερότητα της ΔFosB ρυθμίζεται από την CK2, με υψηλότερη δραστικότητα CK2 να σταθεροποιεί την πρωτεΐνη. Τέλος, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η CK2 φωσφορυλιώνει το ΔFosB σε μια σερίνη στο Ν-τελικό άκρο με υψηλή συντήρησή του (S27) και καταδεικνύουν ότι η φωσφορυλίωση του S27 προστατεύει το ΔFosB από την πρωτεασωματική αποικοδόμηση. Προτείνουμε επομένως ένα μοντέλο όπου η φωσφορυλίωση του ΔFosB στο S27 από την CK2 είναι ένας κρίσιμος ρυθμιστικός μηχανισμός της ανακύκλωσης του ΔFosB ( Εικ. 7 C ). Αυτή η σταθεροποίηση του ΔFosB που προκαλείται από φωσφορυλίωση είναι λειτουργικά σημαντική, επειδή τα αυξημένα επίπεδα ΔFosB σε συγκεκριμένες περιοχές του εγκεφάλου έχουν αποδειχθεί ότι ρυθμίζουν άμεσα πολλά νευρωνικά γονίδια in vivo και ότι ασκούν ισχυρές συμπεριφορικές επιδράσεις σε ζωικά μοντέλα αρκετών νευροψυχιατρικών διαταραχών (βλ. Εισαγωγή).
Αν και η φωσφορυλίωση είναι ένας γρήγορος και αναστρέψιμος τρόπος ρύθμισης της μεταγραφικής δραστηριότητας ορισμένων παραγόντων μεταγραφής, όπως η CREB (πρωτεΐνη δέσμευσης στοιχείου απόκρισης cAMP) ( Bohmann, 1990 ), η ρύθμιση της αποικοδόμησης των παραγόντων μεταγραφής παρέχει μια ακόμη πιο ισχυρή (λιγότερο εύκολα αναστρέψιμη) μορφή ρύθμισης ( Desterro et al., 2000 ). Παράγοντες μεταγραφής των οποίων η λειτουργική δραστηριότητα ρυθμίζεται στο επίπεδο της αποικοδόμησης τους περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, τον NFκB ( Desterro et al., 2000 ), το c-Myc ( Sears et al., 1999 ) και το c-Fos ( Ferrara et al., 2003 ). Σε πολλές περιπτώσεις, η φωσφορυλίωση είναι ένας βασικός ρυθμιστής της σταθερότητας ενός μεταγραφικού παράγοντα, όπως έχει αποδειχθεί για το c-Fos ( Okazaki and Sagata, 1995 ; Tsurumi et al., 1995 ), το Fos-related antigen-1 (Fra-1) ( Vial and Marshall, 2003 ), το Fra-2 ( Manabe et al., 2001 ), το c-Jun ( Fuchs et al., 1996 ), το JunB ( Fuchs et al., 1997 ), το ATF2 ( Fuchs et al., 2000 ) και το p53 ( Buschmann et al., 2001 ). Οι μελέτες μας προσθέτουν έτσι το ΔFosB σε αυτόν τον κατάλογο μεταγραφικών παραγόντων των οποίων η λειτουργική δραστηριότητα ρυθμίζεται μέσω της φωσφορυλιωμένης-εξαρτώμενης σταθερότητάς του.
Η CK2 είναι μια πανταχού παρούσα και ιδιοσυστατικά ενεργή κινάση Ser/Thr που έχει μέχρι στιγμής αναγνωρισμένα περισσότερα από 300 υποστρώματα και εμπλέκεται σε πολλαπλές βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένου του κυτταρικού θανάτου και της επιβίωσης (Litchfield, 2003; Unger et al., 2004), κυτταρικές αποκρίσεις στρες (Yanagawa et al., 1997; Kato et al., 2003), και επιδιόρθωση DNA και αναδιαμόρφωση χρωματίνης (Barz et al., 2003; Krohn et al., 2003). Περισσότερο από το ένα τρίτο των πιθανών υποστρωμάτων του CK2 είναι πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης (Meggio και Pinna, 2003). Στην πραγματικότητα, η CK2 έχει αποδειχθεί ότι είναι μια εξέχουσα πυρηνική κινάση (Krek et al., 1992) (για κριτική, βλ Yu et αϊ., 2001) και να αλληλεπιδράσουν με τους τομείς bZIP πολλών παραγόντων μεταγραφής (Yamaguchi et al., 1998). Η φωσφορυλίωση με τη μεσολάβηση CK2 έχει επίσης αποδειχθεί ότι ρυθμίζει την αποικοδόμηση (είτε ενισχύοντας είτε μειώνοντάς την) πολλών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένης της IkB (Schwarz et al., 1996), PTEN (Torres and Pulido, 2001), σύνδεση φακού (Yin et αϊ., 2000), πρωτεΐνη HMG1 που σχετίζεται με τη χρωματίνη (Wisniewski et al., 1999), και αρκετούς μεταγραφικούς παράγοντες όπως το HMGB (Stemmer et al., 2002), Myf-5 (Winter et al., 1997), και c-Myc (Channavajhala και Seldin, 2002). Το CK2 είναι πιο άφθονο στον εγκέφαλο (Alcazar et al., 1988; Girault et al., 1990), και η δραστηριότητά του έχει εμπλακεί σε πολλές πτυχές της λειτουργίας του εγκεφάλου, συμπεριλαμβανομένης της επιβίωσης των νευρώνων (Boehning et al., 2003), ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΟΤΗΤΑ-διάκριση (Nuthall et al., 2004), λειτουργία καναλιού ιόντων (Jones and Yakel, 2003; Bildl et al., 2004), και μακροπρόθεσμη ενίσχυση και πλαστικότητα νευρώνων (Diaz-Nido et al., 1992; Lieberman και Mody, 1999; Reikhardt et al., 2003).
Παρά τα αυξανόμενα αυτά στοιχεία για τον ρόλο της CK2 στη ρύθμιση της νευρωνικής λειτουργίας, λίγα είναι γνωστά για το τι ελέγχει τη δραστηριότητά της. Η CK2 θεωρείται ότι είναι σταθερά ενεργή, με τη ρύθμιση της ικανότητάς της να φωσφορυλιώνει συγκεκριμένα υποστρώματα να βασίζεται κυρίως σε αλλαγές στην ενδοκυτταρική της εντόπιση (π.χ., κυτταρόπλασμα έναντι πυρήνα) ( Ahmed and Tawfic, 1994 ; Yu et al., 1999 ). Αυτές οι πληροφορίες εγείρουν ένα σημαντικό ερώτημα σχετικά με το ποια σήματα απαιτούνται για την πρόκληση συσσώρευσης ΔFosB στον εγκέφαλο μετά από χρόνια διέγερση ( Εικ. 7 C ). Μία απαίτηση είναι η επαναλαμβανόμενη ενεργοποίηση του γονιδίου fosB και η επαγωγή του mRNA ΔFosB ( Chen et al., 1995 ). Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η φωσφορυλίωση CK2 του ΔFosB είναι κρίσιμη για τη σταθερότητά του, υποδηλώνοντας ότι ένα δεύτερο σήμα μπορεί να απαιτείται για τις μακροπρόθεσμες επιδράσεις του ΔFosB στην γονιδιακή έκφραση, δηλαδή, ένα σήμα που διεγείρει τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης από την CK2. Αυτό θα μπορούσε να περιλαμβάνει την ενεργοποίηση της CK2 με κάποιον άγνωστο μηχανισμό ή τη μετατόπισή της στον πυρήνα. Εναλλακτικά, η φωσφορυλίωση CK2 του ΔFosB μπορεί να είναι συστατική, έτσι ώστε καθώς η πρωτεΐνη ΔFosB μεταφράζεται σε απόκριση σε κάθε ερέθισμα, ένα μέρος της φωσφορυλιώνεται και έτσι σταθεροποιείται, έτσι ώστε με επαναλαμβανόμενη διέγερση να συσσωρεύεται σε υψηλά επίπεδα στους προσβεβλημένους νευρώνες.
Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι οι κινάσες CK2 και S27 πιθανώς δεν είναι η μόνη κινάση και θέση που ευθύνεται για τη φωσφορυλίωση ΔFosB, επειδή ούτε η αναστολή της CK2 ούτε η μετάλλαξη S27A ήταν σε θέση να αποτρέψουν πλήρως τη φωσφορυλίωση ΔFosB. Ομοίως, το γεγονός ότι η μετάλλαξη S27A έχει ως αποτέλεσμα μείωση κατά 30% της φωσφο-ΔFosB υποδηλώνει ότι η S27 είναι μια σημαντική θέση φωσφορυλίωσης στην πρωτεΐνη. Παρ 'όλα αυτά, διερευνούμε άλλες πιθανές κινάσες και θέσεις φωσφορυλίωσης στην ΔFosB. Τελικά, θα είναι επίσης σημαντικό να αναλυθεί η φωσφορυλίωση της S27 και οποιωνδήποτε άλλων θέσεων φωσφορυλίωσης στην ΔFosB στον εγκέφαλο in vivo μετά από διάφορους τύπους χρόνιας διέγερσης, για παράδειγμα, μέσω της χρήσης φασματομετρίας μάζας ή φωσφοειδικών αντισωμάτων.
Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η πρωτεΐνη S27 στο ΔFosB είναι εξαιρετικά συντηρημένη καθ' όλη τη διάρκεια της εξέλιξης και μεταξύ άλλων πρωτεϊνών της οικογένειας Fos. Ωστόσο, η συναινετική θέση για την CK2 δεν είναι: όπως φαίνεται στο Σχήμα 5 Β , μόνο η FosB/ΔFosB (και το ξενόλογο Zebrafish), αλλά όχι η c-Fos ή η Fra-2, διαθέτουν ένα όξινο υπόλειμμα στο +3, έναν βασικό καθοριστικό παράγοντα της φωσφορυλίωσης της CK2 ( Marin et al., 1986 ; Meggio et al., 1994 ). Έτσι, η έλλειψη φωσφορυλίωσης CK2 στην S27 μπορεί να εξηγήσει γιατί άλλες πρωτεΐνες της οικογένειας Fos δεν είναι τόσο σταθερές όσο η ΔFosB. Ωστόσο, αυτό δεν εξηγεί γιατί η πρωτεΐνη FosB πλήρους μήκους, η οποία έχει την ίδια συναινετική θέση CK2 με την ΔFosB, δεν σταθεροποιείται με παρόμοιο τρόπο. Δεν γνωρίζουμε εάν η πρωτεΐνη FosB πλήρους μήκους φωσφορυλιώνεται από την CK2 σε αυτό το συντηρημένο υπόλειμμα. Οι μόνες αναφορές φωσφορυλίωσης FosB ( Skinner et al., 1997 ) και c-Fos ( Okazaki and Sagata, 1995 ; Chen et al., 1996 ) περιγράφουν θέσεις στην περιοχή C-τελικού άκρου αυτών των πρωτεϊνών, η οποία απουσιάζει από το ΔFosB. Η πιθανή φωσφορυλίωση της FosB πλήρους μήκους και άλλων πρωτεϊνών της οικογένειας Fos από την CK2 απαιτεί άμεση διερεύνηση. Ωστόσο, ακόμη και αν είναι φωσφορυλιωμένες, οι άλλες πρωτεΐνες της οικογένειας Fos είναι γνωστό ότι περιέχουν μοτίβα στα C άκρα τους που στοχεύουν τις πρωτεΐνες για ταχεία αποικοδόμηση ( Papavassiliou et al., 1992 ; Jariel-Encontre et al., 1997 ; Acquaviva et al., 2002 ). Για παράδειγμα, έχει αποδειχθεί ότι μια έκταση ~21 υπολειμμάτων που υπάρχουν στο C άκρο όλων των πρωτεϊνών της οικογένειας Fos, αλλά απουσιάζει από το ΔFosB, λειτουργεί ως αποσταθεροποιητική περιοχή για το c-Fos ( Acquaviva et al., 2001 ). Διαπιστώσαμε ότι αν και αυτή η αλληλουχία αποσταθεροποιεί ομοίως το FosB πλήρους μήκους ( Carle et al., 2004 ), η απουσία αυτού του τομέα στο ΔFosB δεν εξηγεί πλήρως τη σταθεροποίησή του. Αντίθετα, ο συνδυασμός της απουσίας αυτού του τομέα στο C άκρο και της φωσφορυλίωσης Ser27 φαίνεται να εξηγεί πλήρως την περίπου πενταπλάσια διαφορά στη σταθερότητα μεταξύ ΔFosB και FosB.
Αν και η αποικοδόμηση των πρωτεϊνών της οικογένειας Fos είναι περίπλοκη και δεν είναι πλήρως κατανοητή, η πρωτεασωματική αποικοδόμηση φαίνεται να είναι η κύρια εμπλεκόμενη οδός ( Salvat et al., 1999 ; Acquaviva et al., 2002 ; Ferrara et al., 2003 ). Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ, στα οποία οι πρωτεασωματικοί αναστολείς δεν μεταβάλλουν σημαντικά τον ρυθμό αποικοδόμησης του ΔFosB, υποστηρίζουν ότι, σε αντίθεση με άλλες πρωτεΐνες της οικογένειας Fos, το ΔFosB αποφεύγει το πρωτεάσωμα 26S, και αυτό παίζει κεντρικό ρόλο στη σταθεροποίησή του. Προτείνουμε επομένως ένα σχήμα όπου η ενισχυμένη σταθερότητα του ΔFosB αποδίδεται στον συνδυασμό δύο κύριων παραγόντων: (1) την απουσία ενός C-τελικού αποσταθεροποιητικού τομέα και (2) τη φωσφορυλίωση του S27 από την CK2.
Συνοπτικά, η παρούσα μελέτη παρέχει μηχανιστική εικόνα για το γιατί η ΔFosB, ένα προϊόν του άμεσου πρώιμου γονιδίου fosB , είναι, σε αντίθεση με όλα τα άλλα μέλη της οικογένειας Fos, μια σχετικά μακρόβια πρωτεΐνη. Αν και άλλες πρωτεΐνες της οικογένειας Fos πιστεύεται ότι μεσολαβούν σε ταχεία αλλά παροδική σύζευξη ερεθίσματος-μεταγραφής ( Morgan and Curran, 1995 ), η σχετική σταθερότητα της ΔFosB της προσδίδει την ικανότητα να μεσολαβεί σε πιο μακροχρόνιες μεταγραφικές αλλαγές που προκαλούνται από χρόνια διέγερση. Αυτό υποστηρίζει την άποψη ότι η ΔFosB λειτουργεί ως μια παρατεταμένη μοριακή αλλαγή στον εγκέφαλο, μετατρέποντας σταδιακά τις οξείες αποκρίσεις σε χρόνιες προσαρμογές. Η αναγνώριση της φωσφορυλίωσης Ser27 ως κεντρικού μηχανισμού για τη σταθερότητα της ΔFosB ανοίγει νέους δρόμους για την ανάπτυξη μέσων για τη ρύθμιση της λειτουργίας της ΔFosB και, ως εκ τούτου, τη διαμόρφωση των μακροπρόθεσμων επιδράσεών της στη νευρωνική και συμπεριφορική πλαστικότητα.
Προηγούμενη Ενότητα Επόμενη Ενότητα
Υποσημειώσεις
- Λήφθηκε τον Νοέμβριο 21, 2005.
- Η αναθεώρηση έλαβε τον Φεβρουάριο 21, 2006.
- Αποδεκτή τον Απρίλιο 2, 2006.
- Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από ένα National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression Young Investigator Award to PGU, ένα National Institute on Drug Abuse (NIDA) National Research Service Service Award to PGU, και από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ινστιτούτο Ψυχικής Υγείας και το NIDA στο EJN We ευχαριστεί τον Δρ. James Bibb για τη βοήθειά του με το in vitro δοκιμές φωσφορυλίωσης, τον Δρ. Ming-Hu Han για τη βοήθειά του με την παρασκευή τμημάτων εγκεφάλου που χρησιμοποιούνται για τη μεταβολική επισήμανση και την Dr. Rachael Neve για τη βοήθειά της στη συσκευασία των ανασυνδυασμένων HSV.
- Η παρούσα διεύθυνση του G. Rudenko: Life Sciences Institute and Department of Pharmacology, University of Michigan, 210 Washtenaw Avenue #3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
- Η αλληλογραφία πρέπει να απευθύνεται στον Eric J. Nestler, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75390-9070. ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΣΗ: [προστασία μέσω email]
Αναφορές
Acquaviva C, Brockly F, Ferrara P, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piecachzyk M (2001) Αναγνώριση ενός τριπεπτιδικού μοτίβου στο C-τελικό άκρο που εμπλέκεται στον έλεγχο της ταχείας πρωτεασωματικής αποικοδόμησης της πρωτο-ογκοπρωτεΐνης c-Fos κατά τη διάρκεια της μετάβασης φάσης G(0)-σε-S. Oncogene 20 : 7563–7572.
Acquaviva C, Bossis G, Ferrara P, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piecachzyk M (2002) Πολλαπλές οδοί αποικοδόμησης για πρωτεΐνες της οικογένειας Fos. Ann NY Acad Sci 973 : 426–434.
Ahmed K, Tawfic S (1994) Μηχανισμός ενδοκυτταρικής ρύθμισης της πρωτεϊνικής κινάσης CK2: ρόλος της υποπυρηνικής συσχέτισης που προκαλείται από ερεθίσματα. Cell Mol Biol Res 40 : 539–545.
Alcazar A, Martin E, Lopez-Fando J, Salinas M (1988) Βελτιωμένη διαδικασία καθαρισμού και ιδιότητες της κινάσης καζεΐνης II από τον εγκέφαλο. Neurochem Res 13 : 829–836.
Andersson M, Westin JE, Cenci MA (2003) Χρονική πορεία της ανοσοαντιδραστικότητας τύπου DeltaFosB στο ραβδωτό σώμα και των επιπέδων mRNA της προδυνορφίνης μετά τη διακοπή της χρόνιας ντοπαμινομιμητικής θεραπείας. Eur J Neurosci 17 : 661–666.
Barz T, Ackermann K, Dubois G, Eils R, Pyerin W (2003) Οι διαλογές έκφρασης σε ολόκληρο το γονιδίωμα υποδεικνύουν έναν παγκόσμιο ρόλο για την πρωτεϊνική κινάση CK2 στην αναδιαμόρφωση της χρωματίνης. J Cell Sci 116 : 1563–1577.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Beh I, Schmidt R, Hecker E (1989) Δύο ισοένζυμα της PKC που βρίσκονται σε κύτταρα HL-60 παρουσιάζουν διαφορά στην ενεργοποίηση από τον εστέρα φορβόλης TPA. FEBS Lett 249 : 264–266.
Bildl W, Strassmaier T, Thurm H, Andersen J, Eble S, Oliver D, Knipper M, Mann M, Schulte U, Adelman JP, Fakler B (2004) Η πρωτεϊνική κινάση CK2 συναρμολογείται με κανάλια Κ+ που ενεργοποιούνται από Ca(2+) μικρής αγωγιμότητας και ρυθμίζει την πύλη καναλιών. Neuron 43 : 847–858.
Bing G, Wang W, Qi Q, Feng Z, Hudson P, Jin L, Zhang W, Bing R, Hong JS (1997) Μακροχρόνια έκφραση αντιγόνου που σχετίζεται με το Fos και παροδική έκφραση του δέλτα FosB που σχετίζεται με επιληπτικές κρίσεις στον ιππόκαμπο και το ραβδωτό σώμα αρουραίου. J Neurochem 68 : 272–279.
Blom N, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Gammeltoft S, Brunak S (2004) Πρόβλεψη μετα-μεταφραστικής γλυκοζυλίωσης και φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών από την αλληλουχία αμινοξέων. Proteomics 4 : 1633–1649.
Boehning D, Moon C, Sharma S, Hurt KJ, Hester LD, Ronnett GV, Shugar D, Snyder SH (2003) Νευροδιαβίβαση μονοξειδίου του άνθρακα που ενεργοποιείται από φωσφορυλίωση CK2 της οξυγενάσης-2 της αίμης. Neuron 40 : 129–137.
Bohmann D (1990) Φωσφορυλίωση παράγοντα μεταγραφής: μια σύνδεση μεταξύ της μεταγωγής σήματος και της ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης. Cancer Cells 2 : 337–344.
Buschmann T, Potapova O, Bar-Shira A, Ivanov VN, Fuchs SY, Henderson S, Fried VA, Minamoto T, Alarcon-Vargas D, Pincus MR, Gaarde WA, Holbrook NJ, Shiloh Y, Ronai Z (2001) Η φωσφορυλίωση της p53 από την NH2-τελική κινάση στο Thr-81 είναι σημαντική για τη σταθεροποίηση της p53 και τις μεταγραφικές δραστηριότητες σε απόκριση στο στρες. Mol Cell Biol 21 : 2743–2754.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Carle TL, Ulery PG, Nestler EJ (2004) Η απουσία ενός διατηρημένου C-τελικού τομέα της οικογένειας Fos συμβάλλει στη μοναδική σταθερότητα του deltaFosB. Soc Neurosci Abstr 30 : 692.2.
Channavajhala P, Seldin DC (2002) Λειτουργική αλληλεπίδραση της πρωτεϊνικής κινάσης CK2 και του c-Myc στη λεμφωματογένεση. Oncogene 21 : 5280–5288.
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ (1995) Regulation of delta FosB and FosB-like proteins by electroconvulsive seizure and cocaine treatments. ΜοΙ Pharmacol 48 : 880-889.
Chen J, Kelz MB, Hope BT, Nakabeppu Y, Nestler EJ (1997) Chronic Fos-related antigens: σταθερές παραλλαγές του ΔFosB που προκαλούνται στον εγκέφαλο από χρόνιες θεραπείες. J Neurosci 17 : 4933-4941.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Chen RH, Juo PC, Curran T, Blenis J (1996) Η φωσφορυλίωση του c-Fos στο C-τελικό άκρο ενισχύει τη μετασχηματιστική του δράση. Oncogene 12 : 1493–1502.
Choe ES, Parelkar NK, Kim JY, Cho HW, Kang HS, Mao L, Wang JQ (2004) Ο αναστολέας πρωτεϊνικής φωσφατάσης 1/2A okadaic acid αυξάνει τη φωσφορυλίωση CREB και Elk-1 και την έκφραση c-fos στο ραβδωτό σώμα του αρουραίου in vivo. J Neurochem 89 : 383-390.
Cochet C, Chambaz EM (1983) Φωσφορυλιώσεις πρωτεϊνών που προκαλούνται από πολυαμίνη: ένας πιθανός στόχος για ενδοκυτταρική δράση πολυαμίνης. Mol Cell Endocrinol 30 : 247–266.
Cochet C, Feige JJ, Chambaz EM (1983) Καταλυτικές και μοριακές ιδιότητες μιας εξαιρετικά καθαρής κινάσης καζεΐνης τύπου G από ιστό πνεύμονα βοοειδών. Biochim Biophys Acta 743 : 1–12.
Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) Η υπερέκφραση του DeltaFosB, ειδική για τον τύπο των ραβδωτών κυττάρων, ενισχύει το κίνητρο για κοκαΐνη. J Neurosci 23 : 2488–2493.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Daunais JB, Roberts DC, McGinty JF (1993) Η αυτοχορήγηση κοκαΐνης αυξάνει το mRNA της προπροδυνορφίνης, αλλά όχι της c-fos, στο ραβδωτό σώμα αρουραίου. NeuroReport 4 : 543–546.
Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT (2000) Ρύθμιση παραγόντων μεταγραφής μέσω αποικοδόμησης πρωτεϊνών. Cell Mol Life Sci 57 : 1207–1219.
Diaz-Nido J, Armas-Portela R, Avila J (1992) Αύξηση της κυτταροπλασματικής δραστικότητας της καζεΐνης κινάσης τύπου II συνοδεύει την ανάπτυξη νευριτών μετά από αναστολή της σύνθεσης DNA σε κύτταρα νευροβλαστώματος NIA-103. J Neurochem 58 : 1820–1828.
Di Maira G, Salvi M, Arrigoni G, Marin O, Sarno S, Brustolon F, Pinna LA, Ruzzene M (2005) Η πρωτεϊνική κινάση CK2 φωσφορυλιώνει και ρυθμίζει προς τα πάνω την Akt/PKB. Cell Death Differ 12 : 668-677.
Dobrazanski P, Noguchi T, Kovary K, Rizzo CA, Lazo PS, Bravo R (1991) Και τα δύο προϊόντα του γονιδίου fosB, το FosB και η σύντομη μορφή του, FosB/SF, είναι μεταγραφικοί ενεργοποιητές σε ινοβλάστες. Mol Cell Biol 11 : 5470–5478.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Ferrara P, Andermarcher E, Bossis G, Acquaviva C, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piecachzyk M (2003) Οι δομικοί παράγοντες που ευθύνονται για την πρωτεασωματική αποικοδόμηση της πρωτεΐνης c-Fos διαφέρουν ανάλογα με τις συνθήκες έκφρασης. Oncogene 22 : 1461–1474.
Fuchs SY, Dolan L, Davis RJ, Ronai Z (1996) Στόχευση της ουβικιτινίωσης c-Jun εξαρτώμενη από τη φωσφορυλίωση από την Jun N-κινάση. Oncogene 13 : 1531–1535.
Fuchs SY, Xie B, Adler V, Fried VA, Davis RJ, Ronai Z (1997) Οι c-Jun NH2-τελικές κινάσες στοχεύουν την ουβικιτινίωση των σχετικών παραγόντων μεταγραφής. J Biol Chem 272 : 32163–32168.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Fuchs SY, Tappin I, Ronai Z (2000) Η σταθερότητα του μεταγραφικού παράγοντα ATF2 ρυθμίζεται από φωσφορυλίωση και αποφωσφορυλίωση. J Biol Chem 275 : 12560–12564.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Girault JA, Hemmings HC Jr, Williams KR, Nairn AC, Greengard P (1989) Φωσφορυλίωση της DARPP-32, μιας φωσφοπρωτεΐνης που ρυθμίζεται από ντοπαμίνη και cAMP, από την κινάση καζεΐνης II. J Biol Chem 264 : 21748–21759.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Girault JA, Hemmings HC Jr, Zorn SH, Gustafson EL, Greengard P (1990) Χαρακτηρισμός σε εγκέφαλο θηλαστικών μιας σερινικής κινάσης DARPP-32 πανομοιότυπης με την καζεΐνη κινάση II. J Neurochem 55 : 1772–1783.
Hanada M, Sugawara K, Kaneta K, Toda S, Nishiyama Y, Tomita K, Yamamoto Η, Konishi Μ, Oki Τ (1992) Epoxomicin, ένας νέος αντικαρκινικός παράγοντας μικροβιακής προέλευσης. J Antibiot (Τόκιο) 45 : 1746 –1752.
Hann SR, Eisenman RN (1984) Πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από το ανθρώπινο ογκογονίδιο c-myc: διαφορική έκφραση σε νεοπλασματικά κύτταρα. Mol Cell Biol 4 : 2486–2497.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Hemmings HC Jr, Girault JA, Williams KR, LoPresti MB, Greengard P (1989) ARPP-21, μια φωσφοπρωτεΐνη που ρυθμίζεται από κυκλικό AMP (Mr = 21,000) εμπλουτισμένη σε περιοχές του εγκεφάλου που νευρώνονται από ντοπαμίνη. Αμινοξική αλληλουχία της θέσης που φωσφορυλιώνεται από κυκλικό AMP σε άθικτα κύτταρα και κινητικές μελέτες της φωσφορυλίωσής της in vitro. J Biol Chem 264 : 7726–7733.
Hidaka H, Kobayashi R (1992) Φαρμακολογία αναστολέων πρωτεϊνικής κινάσης. Annu Rev Pharmacol Toxicol 32 : 377–397.
Hirata H, Bessho Y, Kokubu H, Masamizu Y, Yamada S, Lewis J, Kageyama R (2004) Η αστάθεια της πρωτεΐνης Hes7 είναι κρίσιμη για το ρολόι τμηματοποίησης των σωμιτών. Nat Genet 36 : 750–754.
Hiroi N, Graybiel AM (1996) Οι άτυπες και οι τυπικές νευροληπτικές θεραπείες προκαλούν διακριτά προγράμματα έκφρασης μεταγραφικών παραγόντων στο ραβδωτό σώμα. J Comp Neurol 374 : 70–83.
Hope B, Kosofsky B, Hyman SE, Nestler EJ (1992) Ρύθμιση της άμεσης πρώιμης γονιδιακής έκφρασης και της δέσμευσης AP-1 στον πυρήνα επικλινή αρουραίου από χρόνια κοκαΐνη. Proc Natl Acad Sci USA 89 : 5764–5768.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ (1994a) Η θεραπεία των χρόνιων ηλεκτροσπασμών (ECS) έχει ως αποτέλεσμα την έκφραση ενός μακροχρόνιου συμπλόκου AP-1 στον εγκέφαλο με αλλοιωμένη σύνθεση και χαρακτηριστικά. J Neurosci 14 : 4318–4328.
Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ (1994b) Επαγωγή ενός μακροχρόνιου συμπλόκου AP-1 που αποτελείται από τροποποιημένες πρωτεΐνες τύπου Fos στον εγκέφαλο από χρόνια κοκαΐνη και άλλες χρόνιες θεραπείες. Neuron 13 : 1235–1244.
Ishida A, Fujisawa H (1995) Σταθεροποίηση της καλμοδουλινικής πρωτεϊνικής κινάσης II μέσω του αυτοανασταλτικού τομέα. J Biol Chem 270 : 2163–2170.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Jariel-Encontre I, Salvat C, Steff AM, Pariat M, Acquaviva C, Furstoss O, Piecachzyk M (1997) Πολύπλοκοι μηχανισμοί για την αποικοδόμηση των c-fos και c-jun. Mol Biol Rep 24 : 51–56.
Jones S, Yakel JL (2003) Η καζεΐνη κινάση ii (πρωτεϊνική κινάση ck2) ρυθμίζει τη λειτουργία του καναλιού του υποδοχέα σεροτονίνης 5-ht(3) σε κύτταρα ng108–15. Neuroscience 119 : 629–634.
Kato T Jr, Delhase M, Hoffmann A, Karin M (2003) Η CK2 είναι μια C-τελική κινάση IkappaB υπεύθυνη για την ενεργοποίηση του NF-kappaB κατά την απόκριση στην υπεριώδη ακτινοβολία. Mol Cell 12 : 829–839.
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ (1999) Η έκφραση του παράγοντα μεταγραφής deltaFosB στον εγκέφαλο ελέγχει την ευαισθησία στην κοκαΐνη. Nature 401 : 272–276.
Kim KB, Myung J, Sin N, Crews CM (1999) Αναστολή πρωτεασώματος από τα φυσικά προϊόντα εποξομυκίνη και διυδροεπονεμυκίνη: πληροφορίες σχετικά με την εξειδίκευση και την ισχύ. Bioorg Med Chem Lett 9 : 3335–3340.
Kobayashi E, Nakano H, Morimoto M, Tamaoki T (1989) Η καλφοστίνη C (UCN-1028C), μια νέα μικροβιακή ένωση, είναι ένας εξαιρετικά ισχυρός και ειδικός αναστολέας της πρωτεϊνικής κινάσης C. Biochem Biophys Res Commun 159 : 548–553.
Krek W, Maridor G, Nigg EA (1992) Η καζεΐνη κινάση II είναι ένα κυρίως πυρηνικό ένζυμο. J Cell Biol 116 : 43–55.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Krohn NM, Stemmer C, Fojan P, Grimm R, Grasser KD (2003) Η πρωτεϊνική κινάση CK2 φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη SSRP1, που ανήκει στην ομάδα υψηλής κινητικότητας, προκαλώντας την αναγνώριση DNA που έχει υποστεί βλάβη από την υπεριώδη ακτινοβολία. J Biol Chem 278 : 12710–12715.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, Russo SJ, LaPlant Q, Whistler K, Neve RL, Self DW, Nestler EJ (2005) Η αναδιαμόρφωση της χρωματίνης είναι ένας βασικός μηχανισμός που διέπει την πλαστικότητα που προκαλείται από την κοκαΐνη στο ραβδωτό σώμα. Neuron 48 : 303–314.
Lieberman DN, Mody I (1999) Η καζεΐνη κινάση-II ρυθμίζει τη λειτουργία του καναλιού NMDA σε νευρώνες του ιππόκαμπου. Nat Neurosci 2 : 125–132.
Litchfield DW (2003) Πρωτεϊνική κινάση CK2: δομή, ρύθμιση και ρόλος στις κυτταρικές αποφάσεις ζωής και θανάτου. Biochem J 369 : 1–15.
Manabe T, Kuramoto N, Nakamichi N, Aramachi K, Baba K, Hirai T, Yoneyama M, Yoneda Y (2001) Αποικοδόμηση της πρωτεΐνης c-Fos που εκφράζεται από το N-μεθυλο- d- ασπαρτικό οξύ σε πυρηνικά κλάσματα ιππόκαμπου ποντικού. Brain Res 905 : 34–43.
Mandelzys A, Gruda MA, Bravo R, Morgan JI (1997) Απουσία ενός επίμονα αυξημένου αντιγόνου σχετιζόμενου με το fos κατά 37 kDa και δραστικότητας δέσμευσης DNA τύπου AP-1 στους εγκεφάλους ποντικών fosB null που έλαβαν καϊνικό οξύ. J Neurosci 17 : 5407–5415.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Marin O, Meggio F, Marchiori F, Borin G, Pinna LA (1986) Ειδικότητα θέσης της κινάσης καζεΐνης-2 (TS) από κυτταρόπλασμα ήπατος αρουραίου. Μια μελέτη με υποστρώματα πεπτιδίων μοντέλου. Eur J Biochem 160 : 239–244.
McClung CA, Nestler EJ (2003) Ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης και της ανταμοιβής από την κοκαΐνη από τους CREB και DeltaFosB. Nat Neurosci 6 : 1208–1215.
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ (2004) DeltaFosB: ένας μοριακός διακόπτης για μακροπρόθεσμη προσαρμογή στον εγκέφαλο. Brain Res Mol Brain Res 132 : 146–154.
Meggio F, Pinna LA (2003) Χίλια και ένα υποστρώματα της πρωτεϊνικής κινάσης CK2; FASEB J 17 : 349–368.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Meggio F, Donella-Deana Α, Pinna LA, Moret V (1977) Phosphorylation of casein fractions by rat liver 'phosvitin kinase.'. FEBS Lett 75 : 192-196.
Meggio F, Brunati AM, Pinna LA (1983) Αυτοφωσφορυλίωση της κινάσης καζεΐνης τύπου 2 TS τόσο στις άλφα όσο και στις βήτα υπομονάδες της. Επίδραση διαφορετικών τελεστών. FEBS Lett 160 : 203–208.
Meggio F, Shugar D, Pinna LA (1990) Παράγωγα ριβοφουρανοζυλ-βενζιμιδαζόλης ως αναστολείς της κινάσης καζεΐνης-2 και της κινάσης καζεΐνης-1. Eur J Biochem 187 : 89–94.
Meggio F, Marin O, Pinna LA (1994) Ειδικότητα υποστρώματος της πρωτεϊνικής κινάσης CK2. Cell Mol Biol Res 40 : 401–409.
Miller C, Zhang M, He Y, Zhao J, Pelletier JP, Martel-Pelletier J, Di Battista JA (1998) Μεταγραφική επαγωγή του γονιδίου της κυκλοοξυγενάσης-2 με αναστολή της δραστικότητας της φωσφατάσης από οκαδαϊκό οξύ σε ανθρώπινα χονδροκύτταρα: συν-διέγερση των πρωτεϊνών δέσμευσης πυρήνα AP-1 και CRE. J Cell Biochem 69 : 392–413.
Moratalla R, Elibol B, Vallejo M, Graybiel AM (1996) Αλλαγές σε επίπεδο δικτύου στην έκφραση επαγώγιμων πρωτεϊνών Fos-Jun στο ραβδωτό σώμα κατά τη διάρκεια χρόνιας θεραπείας και στέρησης κοκαΐνης. Neuron 17 : 147–156.
Morgan JI, Curran T (1995) Άμεσα-πρώιμα γονίδια: δέκα χρόνια μετά. Trends Neurosci 18 : 66–67.
Nakabeppu Y, Nathans D (1991) Μια φυσικά απαντώμενη κολοβωμένη μορφή του FosB που αναστέλλει τη μεταγραφική δραστηριότητα Fos/Jun. Cell 64 : 751–759.
Nestler EJ, Barrot M, Self DW (2001) Delta FosB: μια βιώσιμη μοριακή αλλαγή για τον εθισμό. Proc Natl Acad Sci USA 98 : 11042–11046.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Neve RL, Howe JR, Hong S, Kalb RG (1997) Εισαγωγή της υπομονάδας 1 του υποδοχέα γλουταμινικού σε κινητικούς νευρώνες in vitro και in vivo χρησιμοποιώντας έναν ανασυνδυασμένο ιό απλού έρπητα. Neuroscience 79 : 435–447.
Nuthall HN, Joachim K, Stifani S (2004) Η φωσφορυλίωση της σερίνης 239 του Groucho/TLE1 από την πρωτεϊνική κινάση CK2 είναι σημαντική για την αναστολή της νευρωνικής διαφοροποίησης. Mol Cell Biol 24 : 8395–8407.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Okazaki K, Sagata N (1995) Η οδός κινάσης Mos/MAP σταθεροποιεί την c-Fos μέσω φωσφορυλίωσης και ενισχύει τη μετασχηματιστική της δράση σε κύτταρα NIH 3T3. EMBO J 14 : 5048–5059.
Palombella VJ, Rando OJ, Goldberg AL, Maniatis T (1994) Η οδός ουβικιτίνης-πρωτεασώματος είναι απαραίτητη για την επεξεργασία της πρόδρομης πρωτεΐνης NF-κάπα Β1 και την ενεργοποίηση του NF-κάπα Β. Cell 78 : 773–785.
Παπαβασιλείου AG, Treier M, Chavrier C, Bohmann D (1992) Στοχευμένη αποικοδόμηση του c-Fos, αλλά όχι του v-Fos, μέσω σήματος που εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση στο c-Jun. Science 258 : 1941–1944.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ, Schaeffer E (2003) Η επαγώγιμη, ειδική για την περιοχή του εγκεφάλου έκφραση ενός κυρίαρχου αρνητικού μεταλλάγματος του c-Jun σε διαγονιδιακά ποντίκια μειώνει την ευαισθησία στην κοκαΐνη. Brain Res 970 : 73–86.
Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ (2004) Επαγωγή του DeltaFosB σε δομές εγκεφάλου που σχετίζονται με ανταμοιβή μετά από χρόνιο στρες. J Neurosci 24 : 10594-10602.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Persico AM, Schindler CW, O'Hara BF, Brannock MT, Uhl GR (1993) Έκφραση παράγοντα μεταγραφής εγκεφάλου: επιδράσεις της οξείας και χρόνιας αμφεταμίνης και του στρες από ενέσεις. Brain Res Mol Brain Res 20 : 91–100.
Ploegh HL, Dunn BM (2000) Μετα-μεταφραστική τροποποίηση: φωσφορυλίωση και φωσφατάσες. Στο: Current protocols in protein science (Dunn BM, επιμ.) σελ. 13.01 –13.02. Νέα Υόρκη: Wiley and Sons.
Pyerin W, Burow E, Michaely K, Kubler D, Kinzel V (1987) Καταλυτικές και μοριακές ιδιότητες υψηλής καθαρότητας φωσβιτίνης/καζεΐνης κινάσης τύπου II από ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα σε καλλιέργεια (HeLa) και σχέση με την εξωπρωτεϊνική κινάση. Biol Chem Hoppe Seyler 368 : 215–227.
Reikhardt BA, Kulikova OG, Borisova GY, Aleksandrova IY, Sapronov NS (2003) Κατάσταση του συστήματος «πρωτεϊνικής κινάσης CK2-HMG14» στην αμνησία που σχετίζεται με την ηλικία σε αρουραίους. Neurosci Behav Physiol 33 : 799–804.
Roberts BJ, Whitelaw ML (1999) Αποικοδόμηση του βασικού υποδοχέα διοξίνης τομέα ομολογίας έλικας-βρόχου-έλικας/Per-ARNT-Sim μέσω της οδού ουβικιτίνης/πρωτεασώματος. J Biol Chem 274 : 36351–36356.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Rost B, Yachdav G, Liu J (2004) Ο διακομιστής PredictProtein. Nucleic Acids Res 32 : W321 –W326.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Rylski M, Kaczmarek L (2004) Στόχοι Ap-1 στον εγκέφαλο. Front Biosci 9 : 8–23.
Sahin B, Kansy JW, Nairn AC, Spychala J, Ealick SE, Fienberg AA, Greene RW, Bibb JA (2004) Μοριακός χαρακτηρισμός ανασυνδυασμένης κινάσης αδενοσίνης ποντικού και αξιολόγηση ως στόχος για φωσφορυλίωση πρωτεϊνών. Eur J Biochem 271 : 3547–3555.
Salvat C, Aquaviva C, Jariel-Encontre I, Ferrara P, Pariat M, Steff AM, Carillo S, Piecachzyk M (1999) Υπάρχουν πολλαπλές πρωτεολυτικές οδοί που συμβάλλουν στην αποικοδόμηση των πρωτεϊνών c-Fos, c-Jun και p53 in vivo; Mol Biol Rep 26 : 45–51.
Schmidt R, Hecker E (1975) Αυτοοξείδωση φορβολεστέρων υπό κανονικές συνθήκες αποθήκευσης. Cancer Res 35 : 1375–1377.
Schwarz EM, Van Antwerp D, Verma IM (1996) Η συστατική φωσφορυλίωση του IkappaBalpha από την κινάση καζεΐνης II συμβαίνει κατά προτίμηση στη σερίνη 293: απαίτηση για την αποικοδόμηση του ελεύθερου IkappaBalpha. Mol Cell Biol 16 : 3554–3559.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Sears R, Leone G, DeGregori J, Nevins JR (1999) Το Ras ενισχύει τη σταθερότητα της πρωτεΐνης Myc. Mol Cell 3 : 169–179.
Silva-Neto MA, Fialho E, Paes MC, Oliveira PL, Masuda H (2002) Κυκλική φωσφορυλίωση βιτελίνης ανεξάρτητη από νουκλεοτίδια από κινάση καζεΐνης II καθαρισμένη από ωοκύτταρα Rhodnius prolixus. Insect Biochem Mol Biol 32 : 847–857.
Skinner M, Qu S, Moore C, Wisdom R (1997) Η μεταγραφική ενεργοποίηση και ο μετασχηματισμός από την πρωτεΐνη FosB απαιτούν φωσφορυλίωση του τομέα ενεργοποίησης του καρβοξυλικού άκρου. Mol Cell Biol 17 : 2372–2380.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Stemmer C, Schwander A, Bauw G, Fojan P, Grasser KD (2002) Η πρωτεϊνική κινάση CK2 φωσφορυλιώνει διαφορικά τις χρωμοσωμικές πρωτεΐνες υψηλής κινητικότητας ομάδας Β (HMGB) του καλαμποκιού, τροποποιώντας τη σταθερότητά τους και τις αλληλεπιδράσεις τους με το DNA. J Biol Chem 277 : 1092–1098.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Stevens I, Derua R, Rondelez E, Waelkens E, Merlevede W, Goris J (1999) Αναγνώριση της cyk, μιας κινάσης κυκλίνης Β2, ως νέας πρωτεϊνικής κινάσης II που εξαρτάται από το ασβέστιο/καλμοδουλίνη και ο ρόλος της κατά την ωρίμανση των ωαρίων του Xenopus laevis. Exp Cell Res 252 : 303–318.
Suh HW, Choi SS, Lee JK, Lee HK, Han EJ, Lee J (2004) Ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων c-fos και c-jun από λιποπολυσακχαρίτη και κυτοκίνες σε πρωτογενώς καλλιεργημένα αστροκύτταρα: επίδραση των οδών PKA και PKC. Arch Pharm Res 27 : 396–401.
Szyszka R, Boguszewska A, Grankowski N, Ballesta JP (1995) Διαφορική φωσφορυλίωση ριβοσωμικών όξινων πρωτεϊνών από κύτταρο ζύμης από δύο ενδογενείς πρωτεϊνικές κινάσες: κινάση καζεΐνης-2 και κινάση 60S. Acta Biochim Pol 42 : 357–362.
Tamaoki T, Takahashi I, Kobayashi E, Nakano H, Akinaga S, Suzuki K (1990) Καλφωστίνη (UCN1028) και ενώσεις που σχετίζονται με την καλφωστίνη, μια νέα κατηγορία ειδικών και ισχυρών αναστολέων της πρωτεϊνικής κινάσης C. Adv Second Messenger Phosphoprotein Res 24 : 497–501.
Torres J, Pulido R (2001) Ο καταστολέας όγκων PTEN φωσφορυλιώνεται από την πρωτεϊνική κινάση CK2 στο C άκρο της. Επιπτώσεις για τη σταθερότητα του PTEN στην αποικοδόμηση που προκαλείται από πρωτεάσωμα. J Biol Chem 276 : 993–998.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Tsubuki S, Saito Y, Tomioka M, Ito H, Kawashima S (1996) Διαφορική αναστολή των δραστηριοτήτων καλπαΐνης και πρωτεασώματος από πεπτιδυλαλδεΰδες δι-λευκίνης και τρι-λευκίνης. J Biochem (Τόκιο) 119 : 572–576.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Tsurumi C, Ishida N, Tamura T, Kakizuka A, Nishida E, Okumura E, Kishimoto T, Inagaki Μ, Okazaki K, Sagata N (1995) Η αποικοδόμηση του c-Fos από το πρωτεάσωμα 26S επιταχύνεται από τις κινάσες c-Jun και πολλαπλές πρωτεϊνικές κινάσες. ΜοΙ Cell Biol 15 : 5682-5687.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Unger GM, Davis AT, Slaton JW, Ahmed K (2004) Πρωτεϊνική κινάση CK2 ως ρυθμιστής της κυτταρικής επιβίωσης: επιπτώσεις στη θεραπεία του καρκίνου. Curr Cancer Drug Targets 4 : 77–84.
Vial E, Marshall CJ (2003) Η αυξημένη δραστικότητα κινάσης ERK-MAP προστατεύει το μέλος της οικογένειας FOS, FRA-1, από την πρωτεασωματική αποικοδόμηση σε κύτταρα καρκινώματος του παχέος εντέρου. J Cell Sci 116 : 4957–4963.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S (2002) Το ΔFosB ρυθμίζει τη λειτουργία του τροχού. J Neurosci 22 : 8133-8138.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Whitmarsh AJ, Davis RJ (2000) Ρύθμιση της λειτουργίας του μεταγραφικού παράγοντα μέσω φωσφορυλίωσης. Cell Mol Life Sci 57 : 1172–1183.
Winter B, Kautzner I, Issinger OG, Arnold HH (1997) Δύο πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης της πρωτεϊνικής κινάσης CK2 είναι σημαντικές για τη δραστικότητα της Myf-5. Biol Chem 378 : 1445–1456.
Wisniewski JR, Szewczuk Z, Petry I, Schwanbeck R, Renner U (1999) Η συστατική φωσφορυλίωση των όξινων ουρών των πρωτεϊνών υψηλής κινητικότητας ομάδας 1 από την κινάση καζεΐνης II μεταβάλλει τη διαμόρφωση, τη σταθερότητα και την εξειδίκευση σύνδεσης DNA. J Biol Chem 274 : 20116–20122.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Yamaguchi Y, Wada T, Suzuki F, Takagi T, Hasegawa J, Handa H (1998) Η κινάση καζεΐνης II αλληλεπιδρά με τις περιοχές bZIP αρκετών παραγόντων μεταγραφής. Nucleic Acids Res 26 : 3854–3861.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Yanagawa T, Yuki K, Yoshida H, Bannai S, Ishii T (1997) Φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης στρες A170 μέσω δραστικότητας τύπου κινάσης καζεΐνης II σε μακροφάγα. Biochem Biophys Res Commun 241 : 157–163.
Yankulov K, Yamashita K, Roy R, Egly JM, Bentley DL (1995) Ο αναστολέας επιμήκυνσης της μεταγραφής 5,6-διχλωρο-1-β- d- ριβοφουρανοζυλβενζιμιδαζόλη αναστέλλει την πρωτεϊνική κινάση που σχετίζεται με τον παράγοντα μεταγραφής IIH. J Biol Chem 270 : 23922–23925.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Yen J, Wisdom RM, Tratner I, Verma IM (1991) Μια εναλλακτική μορφή συρραφής του FosB είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής της μεταγραφικής ενεργοποίησης και μετασχηματισμού από πρωτεΐνες Fos. Proc Natl Acad Sci USA 88 : 5077–5081.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Yin X, Jedrzejewski PT, Jiang JX (2000) Η καζεΐνη κινάση II φωσφορυλιώνει την κοννεξίνη φακού 45.6 και εμπλέκεται στην αποδόμησή της. J Biol Chem 275 : 6850–6856.
Περίληψη / ΔΩΡΕΑΝ πλήρες κείμενο
Yoza BK, Brooks JW, Mizel SB (1992) Επαγωγή συστατικών του μεταγραφικού παράγοντα AP-1 κατά την ενεργοποίηση των Τ-κυττάρων από ιντερλευκίνη 1 και εστέρες φορβόλης. Cell Growth Differ 3 : 677–684.
Yu S, Wang H, Davis A, Ahmed K (2001) Συνέπειες της σηματοδότησης CK2 στον πυρηνικό πυρήνα. Mol Cell Biochem 227 : 67–71.
Yu S, Davis AT, Guo C, Green JE, Ahmed K (1999) Διαφορική στόχευση της πρωτεϊνικής κινάσης CK2 στον πυρηνικό πυρήνα κατά την παροδική υπερέκφραση των υπομονάδων της. J Cell Biochem 74 : 127–134.
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ (2006) ΔFosB: ένας ουσιαστικός ρόλος για το ΔFosB στην δράση του ακμής του μορφώματος. Nat Neurosci 9 : 205-211.
Άρθρα που παραθέτουν αυτό το άρθρο
- Συμπεριφορικές και διαρθρωτικές αποκρίσεις στην χρόνια κοκαΐνη απαιτούν έναν βρόχο τροφοδοσίας που εμπλέκει την {Delta} FosB και την πρωτεΐνη κινάση II που εξαρτάται από ασβέστιο / καλμοδουλίνη στην Shell Accumbens Nucleus Journal of Neuroscience, 6 Μαρτίου 2013, 33(10):4295-4307
- Striatal υπερέκφραση του {Delta} FosB αναπαράγει Χρόνια Λεβοντόπα-προκληθείσες άτακτες κινήσεις Journal of Neuroscience, 26 Μάιος 2010, 30(21):7335-7343
- Περίληψη
- Πλήρες κείμενο
- Πλήρες κείμενο (PDF)
- Περίληψη
- Πλήρες κείμενο
- Πλήρες κείμενο (PDF)
- Περίληψη
- Πλήρες κείμενο
- Πλήρες κείμενο (PDF)
- Περίληψη
- Πλήρες κείμενο
- Πλήρες κείμενο (PDF)
- Μεταγραφικοί μηχανισμοί εθισμού: ο ρόλος του {Delta} FosB Φιλοσοφικές Συναλλαγές της Βασιλικής Εταιρείας Β: Βιολογικές Επιστήμες, 12 Οκτώβριος 2008, 363(1507):3245-3255
- Διαρκής ευπάθεια στην αποκατάσταση της συμπεριφοράς που αναζητά μεθαμφεταμίνη σε μεταλλαγμένους ποντικούς νευροτροφικού παράγοντα που προέρχονται από γλοιακές κυτταρικές σειρές Το περιοδικό FASEB, 1 Ιούλιος 2007, 21(9):1994-2004
- Ο μεταγραφικός παράγοντας ενεργοποιητής πρωτεΐνης-1 στην καρκινογένεση του αναπνευστικού επιθηλίου Μοριακή Έρευνα Καρκίνου, 1 Φεβρουάριος 2007, 5(2):109-120