PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
Abstract
Bíonn athruithe ar mhoirfeolaíocht néarónach agus iompraíocht a d'fhéadfadh a bheith mar bhonn le andúil chóicín mar chúis le hathruithe a spreagann cóicín i léiriú géine. D'aithníomar ról riachtanach do dhétholachtú histone 3 lysine 9 (H3K9) agus don ghéineas dimethyltransferase G9a i bplaisteacht struchtúrach agus iompraíochta a spreagann cóicín. Laghdaigh riarachán cóicín arís agus arís eile leibhéil dhomhanda de dhé-aigéad H3K9 sa núicléis accumbens. TRinneadh a laghdú i meitileacht histone a idirghabháil trí chois G9a sa réigiún inchinne seo, a bhí á rialú ag an bhfachtóir trascríobh cedFosB. Trí úsáid a bhaint as só-ghineach coinníollach agus aistriú géine víreasach-idirghabhála, fuaireamar amach gur mhéadaigh dírialú G9a plaisteachas deilgneach na núicléas de néaróin agus gur fearr an rogha atá ann do chóicín, rud a bhunaigh ról ríthábhachtach do mheitiliú histone i ngníomhartha fadtéarmacha an chóicín.
Réamhrá
Tá nochtadh leanúnach cóicín tréithrithe ag athruithe leanúnacha ar léiriú géine agus ar mhoirfeolaíocht neuronal athraithe laistigh den núicléis accumbens (NAc), príomhghné de chuaird luach saothair an inchinn (1-2). Tá athmhúnlú crómatin tábhachtach in athruithe trascríobh neamhghnácha sa réigiún inchinn seo a d'fhéadfadh a bheith mar bhonn le gnéithe de andúil cóicín (3-9). Mar thoradh ar rialachán cóicín ar struchtúr crómatin i NAc, is é an toradh a bhíonn air, i bpáirt, ná modhnuithe díreacha ar an innealra einsímeach crómatin, a dtiocfaidh athruithe ar aicéitiliú agus fosfathú an histone (4, 7-9); mar sin féin, níor imscrúdaíodh róil le haghaidh einsímí a rialaíonn meitileolaíocht.
Anailís ar thionscnóir ar fud na géanóm a d'úsáidtí ag úsáid imdhíonadh crómatin in éineacht le micrea-mhíreanna (slis-chip) a aithníodh patrúin athraitheacha de mheitileacht aithrise H3 lysine 9 (H3K9) agus 27 (H3K27) ag tionscnóirí géine sainiúla sa NAc tar éis cóireáil athuair ar chóicín (6). Dá bhrí sin, phróifílíomar go leor meitileatreferases lysine (KMTanna) agus demethylases (KDManna) ar eol go bhfuil meitiliú H3K9 nó H3K27 rialaithe orthu (Fíor 1A). Níor thaispeáin ach dhá einsím, G9a agus GLP, rialachán leanúnach trascríobh 24 tar éis riaradh cóicín a rinneadh arís agus arís eile, nuair a rinneadh an abairt den dá ghéine a rialáil go suntasach. Ós rud é go ndéanann G9a agus GLP dé-dhíleá H3K9 (H3K9me2) a chatalú go sonrach, tá a n-íoslaghdú ag cóicín comhsheasmhach le leibhéil dhomhanda laghdaithe EuxhUMXK3me9 domhanda a breathnaíodh ag an bpointe ama seo (Fíor 1B). I gcodarsnacht leis sin, d'fhan na leibhéil dhifriúla de mheitil heterochromatic H3K27 gan athrú ag nochtadh cóicín arís agus arís eile (Fíor S1 chun tacú le hábhar ar líne). Mar gheall ar a leibhéil arda gníomhaíochta catalaíche araon in vitro agus in vivo (10, rinneamar iarracht imscrúdú breise a dhéanamh ar thábhacht feidhme choisctheacht G9a tar éis nochtadh cóicín arís agus arís eile sa NAc. Laghdaíodh leibhéil G9a próitéine, cosúil le leibhéil a mRNA, go mór le huaireanta 24 tar éis arís riarachán cóicín (Fig. S2). Cé gur laghdaíodh slonn mRNA G9a ag 35% sa NAc, léirigh anailís imdhíon-cheimiceolaíoch laghdú níos ísle 15% ar leibhéil próitéine G9a, i gcomhréir leis an laghdú 21% i H3K9me2 tar éis riarachán cóicín arís agus arís eile (Fíor 1B). Laghdaíodh an abairt mRNA G9a freisin sa réigiún inchinn seo de 20% tar éis féin-riarachán cóicín arís agus arís eile (Fig. S3).
Chun a fháil amach an bhfuil athruithe ar H3K9me2 euchromatic in oiriúint d'athruithe ar fud an ghéinití sa léiriú géine sa NAc, bhí micrea-anailísí fostaithe againn chun scrúdú a dhéanamh ar phróifílí léirithe géine a d'eascair ó dhúshlán dúshlán cóicín in ainmhithe a raibh nó nach raibh nochtadh cóicín acu roimhe seo (féach forlíontach liostaí géine isteach Táblaí S1 – S3). Mhéadaigh na hainmhithe a fuair arís cóicín arís agus arís eile léiriú géine 1 uair an chloig tar éis dúshlán cóicín i gcomparáid le hainmhithe a bhfuil cóireáil ghéar orthu (Fíor 1C). Tharla an léiriú géine méadaithe seo mar fhreagra ar dhúshlán cóicín a tugadh tar éis seachtain 1 maidir le tarraingt siar ó athchúrsáil cóicín. I gcomhréir le tuarascálacha roimhe seo, thaispeáin céatadán beag de ghéinte (~ 10%) freagraí trascríofa desensitized tar éis riaradh cóicín arís agus arís eile (Fíor 1C; féach Tábla S1) (5). Chun ról dí-rialuithe G9a a fhiosrú go díreach sa léiriú géine feabhsaithe a breathnaíodh i ndiaidh cóicín athdhéanta, fuair lucha instealltaí laistigh de NAc de veicteoirí víreas Herpes simplex (HSV) a chuir GFP nó G9a in iúl agus a caitheadh le cóicín salanda nó arís agus arís eile chun a chinneadh an raibh ró-mhoilliú G9a bhí sé leordhóthanach chun cosc a chur ar an bhfeabhsú arís agus arís eile ar an léiriú géine a spreagann an cóicín. Ó shraith de ghéinte 12 a roghnaíodh go randamach a thaispeánann leibhéil mhéadaithe cainte i ndiaidh cóicín a tharla arís agus arís eile, thugamar faoi deara gur laghdaigh G9a go mór an léiriú feabhsaithe de 50% de na géinte seo (Tábla S4).
Chun imeachtaí trascríofa réamhtheachtacha a shainaithint a dhéanann idirghabháil arís agus arís eile ar chur i gcoinne cóicín G9a in iúl, rinneamar imscrúdú ar ról a d'fhéadfadh a bheith ag ΔFosB, táirge spice an-chobhsaí den ghéin luath luath fosB. Bailíonn BFosB sa NAc tar éis nochtadh arís agus arís eile do chóicín, áit a bhfuil sé nasctha le luach saothair méadaithe cóicín (11). Is féidir le BFosB gníomhú mar ghníomhaire trascríofa nó repressor ag brath ar an spriocghin atá i gceist (3, 5, 6, 12). Ag baint úsáide as NSE bitgengenicTTA × tetOP-ΔFosB lucha, inar féidir expressionFosB léiriú a spreagadh go roghnach i NAc agus striatum droma ainmhithe fásta (13, rinneamar scrúdú ar thionchar impactFosB léiriú ar rialachán cóicín H3K9me2 agus KMTanna sa NAc. Bhí róshaothrú ΔFosB leordhóthanach chun leibhéil an dá H3K9me2 a laghdú (Fíor 1D) agus léiriú G9a (Fíor 1E), rud a dhéanfaidh aithris ar na héifeachtaí a bhaineann le cóicín arís agus arís eile. I gcodarsnacht leis sin, níor laghdaigh BFosB an léiriú GLP sa réigiún inchinne seo, agus ní raibh aon éifeacht aige ar SUV39H1 agus EZH2, na heinsímí trimethylating príomha le haghaidh H3K9 agus H3K27, faoi seach (Fig. S4). Chun na sonraí sin a dhearbhú ag baint úsáide as córas ressionFosB róshaothraithe neamhspleách, fuair lucha fásta wildtype instealltaí déthaobhacha NAE de veicteoirí víreas a bhaineann le Adeno (AAV) ag léiriú GFP nó ΔFosB. Laghdaigh róshaothrú ΔFosB de chuid Víreas-idirghabhála de léiriú G9a sa réigiún inchinn seo (Fíor 1E).
Spreag rialachán suntasach agus sonrach den sórt sin ar G9a sinn a fhiosrú an rialaíonn athrú G9a go sonrach i néaróin NAc freagraí iompraíochta ar chóicín. Fuair lucha Wildtype instealltaí laistigh de NAc de veicteoirí HSV a chuir GFP nó G9a in iúl agus ansin rinneadh anailís orthu ag úsáid paraidím rogha tosaíochta cóicín neamhchlaonta, a sholáthraíonn tomhas indíreach ar luaíocht drugaí. Deimhníodh róshamhlú víreasach G9a i néaróin NAc tar éis tástáil iompraíochta (Fíor 2A). Laghdaigh G9a overexpression go mór an rogha a bhí ag cóicín i gcomparáid le hainmhithe a bhí ró-róshuaiteach GFP (Fíor 2B, agus méadú ar leibhéil H3K9me2 sa NAc (Fíor 2C). Ró-stró ar shóchán G9a atá marbh go catalaíoch (G9aH1093K) (14(b) nár chuir sé isteach ar rogha cóicín (Fíor 2B) agus ní raibh aon tionchar aige ar leibhéil H3K9me2 sa réigiún inchinne seo (Fíor 2C).
Chun staidéar breise a dhéanamh ar ról G9a in éifeachtaí iompraíochta cóicín, agus níos sainiúla chun aithris a dhéanamh ar an gcosúlacht arís agus arís eile ar léiriú G9a sa chicín sa NAX, G9a do dhaoine fástafl / fl lucha (14(b) a fuair instealltaí laistigh de NAc de veicteoirí AAV a chuir in iúl athmhúnlú Cre nó GFP mar rialú. Cnagadh G9a AAV-Cre sa NAc, a deimhníodh go raibh sé imdhíon-aiséiseach (Fig. S5), mhéadaigh sé go mór na héifeachtaí a bhíonn ag cóicín ar thurgnaimh riochtúcháin agus laghdaigh sé leibhéil H3K9me2 sa NAc (Fíor. 2D, E). Coisceoir cógaseolaíochta atá ar fáil go tráchtála de G9a agus GLP, BIX01294 (15-16), baineadh úsáid as chun a fháil amach an gcuireann toirmeasc einsímí isteach ar fhreagraí iompraíochta ar chóicín. Go deimhin, chuir toirmeasc cógaseolaíochta ar G9a agus GLP go mór le rogha an chóicín agus laghdaigh sé H3K9me2 sa NAc (Fíor. 2F, G).
Méadaíonn dlús a chur le cóicín arís agus arís eile dlús na dromlach dendritic ar néaróin spíonacha mheánmhéide (17), próiseas a bhaineann le hathruithe feidhmiúla ar shionapsáití glutamatergic atá eisilteach a dhéanamh ar na néaróin seo (18-19agus) freagairtí iompraíochta íograithe ar an druga (17, 20). Dá bhrí sin rinneamar hipitéisiú go bhféadfadh idirghabháil G9a gníomhaíocht sa NAc trí chóicín athdhéanta idirghabháil a dhéanamh ar chumas an chóicín dlús dromlach na néaróin a rialú. Ag baint úsáide as imdhíonadh crómatin (an chip) le antashubstaint frith-G9a, d'aithníomar roinnt spriocanna géineacha G9a sa NAc, a raibh baint ag gach ceann acu cheana féin le plaisteacht dendritic a spreagann cóicín (Fíor 3A) (20-26). Fuaireamar amach gur laghdaigh riarachán cóicín arís agus arís eile G9a ceangailteach, chomh maith le leibhéil H3K9me2, ag na tionscnóirí géin seo (Fíor 3B). I gcodarsnacht leis sin, d'earcaigh an riarachán géar-chóicín G9a go gasta i gcás cuid de na tionscnóirí géine céanna seo, ag teacht le léiriú G9a méadaithe a breathnaíodh in NAC 1 uair an chloig tar éis dáileog ghéar cóicín (Fig. S6). Cé go bhfuil G9a ina gceangal ag tionscnóirí géine sainiúla comhoiriúnach le hathruithe ar a slonn, níl sé soiléir i gcónaí an ndéantar imeachtaí den sórt sin a idirghabháil trí leibhéil dhomhanda athraithe G9a sa NAc agus / nó trí dhifríochtaí in earcaíocht G9a tar éis géarmhíochaine vs riarachán cóicín arís agus arís eile.
Bunaithe ar rialachán G9a maidir le go leor géinte a bhaineann le plaisteacht sa NAc, scrúdaíomar go díreach an raibh cothabháil léiriú G9a sa réigiún inchinn seo tar éis cóireála cóicín arís agus arís eile leordhóthanach chun foirmiú dromlaigh dendritic a spreagann cóicín a chosc. Ag baint úsáide as prótacal cóireála cóicín a léiríodh roimhe seo chun ionduchtú spine dendritic a chur chun cinn sa NAc (20), scrúdaíomar dlús an dromlaigh in ainmhithe a instealladh le HSV-GFP nó HSV-G9a. I gcomhaontú le torthaí roimhe seo, bhreathnaíomar ar mhéadú suntasach i ndlús spine dendritic sa NAc tar éis cóireála cóicín, éifeacht a cuireadh bac go hiomlán le G9a overexpression (Fíor 3C). Ní raibh róshamhlú G9a amháin go leor chun dlús spine dendritic NAc a laghdú in éagmais cóicín. Chun na sonraí seo a chomhlánú, G9afl / fl fuair na lucha instealltaí laistigh den NAC de HSV-Cre agus rinneadh dlúis spine a chainníochtú agus i gcomparáid le hainmhithe a fuair HSV-GFP in éagmais cóicín. Méadaíodh go mór dlús an dromlaigh ar an nguthán G9a ar néaróin spíonacha mheánmhéide (Fíor 3C).
Mar gheall ar an bhfianaise go ndéantar an dírialú G9a sa NAc tar éis do chóicín ΔFosB idirghabháil a dhéanamh arís agus arís eile, scrúdaíomar an bhfuil baint ag an fhachtóir trascríobh seo freisin le rialáil spíoin dendritic NAc. Cé nach raibh baint ag ΔFosB roimhe seo le plaisteacht dendritic den sórt sin, tá roinnt dá spriocanna, lena n-áirítear fochuideachtaí Cdk5 agus NFκB, chomh casta sin. (20-23), agus expressionTuairisc leanúnach ΔFosB i néaróin NAc le dlús spine méadaithe dendritic tar éis cóireála cóicín arís agus arís eile (27). Ar an gcéad dul síos, chonaiceamar go raibh ionduchtú ΔFosB i lucha giotángenacha in éagmais cóicín, a rinne an abairt G9a agus H3K9me2 a íosluchtú (Fíor. 1D, E, laghdaíodh G9a ceangailte le go leor géinte a bhaineann le plaisteacht, agus léiríodh go leor díobh sin mar spriocanna díreacha de chuid BFosB féin (Fíor 3D) (3, 6). Thaispeáin muid an chéad cheann eile gur mhéadaigh róshamhlú víreasach ΔFosB sa NAc dlús dromlach dendritic go mór faoi choinníollacha bunúsacha, cosúil leis an gceann a breathnaíodh tar éis riaradh cóicín arís agus arís eile (Fíor 3E). Os a choinne sin, chuir ró-stró i NAc de unJunD, próitéin shóchánach dhiúltach ceannasach a théann i gcion ar ghníomhaíocht ΔFosB transcriptional, bac ar chumas athuair cóicín foirmiú spine dendritic a mhéadú sa NAc (Fíor 3C).
De réir ár mbarúlacha, tesFosB a rialaíonn léiriú G9a sa NAc, agus go rialaíonn BFosB agus G9a cuid de na sprioc-ghéinte céanna, rinneamar scrúdú ar idirghníomhaíochtaí eile idir osFosB agus G9a. Tar éis cóicín géarmhíochaine, nuair a méadaíodh leibhéil G9a, ceangail G9a leis fosB Méadaíodh géin, agus tar éis cóicín arís agus arís eile, nuair a cuireadh an abairt G9a faoi chois, chuir G9a ceangal leis fosB laghdaíodh géine (Fíor 3A). Níor laghdaíodh an ceangal ceangailteach G9a sin nuair a breathnaíodh cóicín arís agus arís eile c-fos, i gcás ina méadaítear cónasc G9a le hathchúrsáil cóicínFig. S7). Tá sé seo ag teacht leis an bhfíric, murab ionann agus a mhalairt fosB, c-fos go bhfuil sé faoi chois, gan a bheith spreagtha, trí nochtadh síceasailíoch ainsealach (5). Bhí róshaothrú ΔFosB i lucha giotánacha go leor chun G9a ceangailteach a laghdú go suntasach fosb géine (Fíor 3D). Ina theannta sin, bhí róshamhlú G9a leordhóthanach chun an abairt BFosB méadaithe a laghdú tar éis riaradh cóicín arís agus arís eile (Tábla S4). Tugann na sonraí seo le fios go bhfuil lúb uathrialaitheach ina gcuireann G9a teorainn le hionduchtú ΔFosB i dtosach ag riarachán géar-chóicín. Mar sin féin, de réir mar a charnann BFosB le nochtadh drugaí arís agus arís eile, cuireann sé in aghaidh G9a agus dá bhrí sin cuireann sé a ionduchtú breise féin i bhfeidhm.
Mar fhocal scoir, léiríomar go bhfuil baint chriticiúil ag meitilí lísín histone sa NAc le léiriú géine neuronal a rialáil mar fhreagra ar chóicín. Tar éis G9a agus H3K9me2 a chur chun cinn tar éis riarachán arís agus arís eile ar an gcóicín, cuirtear rogha cóicín chun cinn, go páirteach, trí ghníomhachtú trasghearrtha de ghéinte iomadúla a bhfuil sé ar eolas acu go ndéanann siad rialáil ar fhoirmeacha neamhghnácha de plasticity dendritic. Trí thuiscint níos fearr a fháil ar na géinte atá á rialú trí mheicníochtaí den sórt sin, feabhsófar ár n-eolas ar bhonn casta bitheolaíoch andúil drugaí agus d’fhéadfadh sé cabhrú le forbairt cóireálacha níos éifeachtaí ar neamhoird andúileacha.
Ábhair agus Modhanna
Ainmhithe agus cóireálacha
Mura luaitear a mhalairt, coinníodh lucha go cúigear in aghaidh an chaighean ar lucha i gcoilíneacht le timthriall éadrom / dorcha 12 (soilse ó 7: 00 AM go 7: 00 PM) ag teocht tairiseach (23 ° C) le roghnach rochtain ar uisce agus ar bhia. D'fhaomh IACUC gach prótacal ainmhithe ag Ionad Leighis UT Southwestern agus ag Scoil Leighis Mount Sinai.
I gcás turgnaimh cóicín [immunohistochemitry, bloting an iarthair, PCR cainníochtúil (qPCR), anailís microarray agus imdhíonadh crómatin (ChIP)], úsáideadh 8-go lucha C10BL / 57J atá 6-seachtain d'aois. Fuair ainmhithe ainmhithe instealltaí laethúla de 'shalanda' (cóireálacha 7 salanda, ip), cóicín 'géarmhíochaine' (cóireáil chóireála 6 salann + cóireáil amháin 20 mg / kg cóicín-HCl, ip) nó cóicín 'arís agus arís eile' (cóireálacha 7 20 mg / kg cóicín-HCl, ip). Rinneadh lucha a íobairt ag uair 1 nó 24 tar éis na cóireála deiridh. Maidir le staidéir mhicreafaraithe, déileáladh le hainmhithe go laethúil le “salanda” (cóireálacha salann, 15 salann, ip), cóicín 'géarmhíochaine' (cóireálacha 14 salanda agus cóireáil 1 20 mg / kg cóicín-HCl, ip), cóicín 'arís agus arís eile' Cóireálacha 7 salanda + cóireálacha 8 20 mg / kg cóicín-HCl, ip) nó 'aistarraingt arís agus arís eile + géar-chóicín (cóireálacha 7 20 mg / kg cóicín-HCl + cóireálacha 7 salann + cóireáil dúshlán 1 mg / kg cóicín-HCl, ip) agus íobairt 20 uair an chloig tar éis na cóireála deiridh. I dturgnaimh iompraíochta, cuireadh máinliacht ar fáil do lucha amháin tar éis obráid agus caitheadh leo le 1 mg / kg cóc-HCl, IP mar a thuairiscítear thíos. Maidir le hanailís ar dhromlaigh dendritic agus le bailíochtú micrea-eirearaithe tar éis ionfhabhtaithe HSV-GFP agus HSV-G10a-GFP, caitheadh le lucha le 'salann' (cóireálacha 9 salanda, ip) nó “cóicín athdhéanta” (cóireálacha 5 5 mg / kg cóc-HCl, ip (b) le linn laethanta 20, mar a léiríodh roimhe seo go méadaíonn an prótacal insteallta seo dlús spine ar néaróin núicléas (NAc) néaróin laistigh de thréimhse víreas transgene víreas Herpes simplex (HSV) (Tag forlíontach S1). Rinneadh na huaireanta a úsáideadh le haghaidh anailíse dromlaigh deirmeach a íobairt ar uaireanta 4 tar éis na cóireála deiridh.
Chun scriosadh áitiúil den athscríbhinn G9a atá teoranta do néaróin NAc a spreagadh, d'úsáid muid lucha mutant homaisigeach le haghaidh ailléil G9a floxed, a ndearnadh cur síos mion orthu in áiteanna eile (S2). Táirgeann ath-chomhdhlúthú creasa a tharchuirtear exon 22 go spréach-as-fhráma lasmuigh den fhráma as a dtiocfaidh meath neamhthréimhseach den athscríbhinn mhurtaithe. D'úsáideamar lucha floxed G25a a bhí crosáilte go hiomlán go lucha C9BL / 57J. Cuireadh na lucha isteach go stéaróideach sa NAc le veicteoirí víreas a bhaineann le Adeno (AAV) (serotype 6) ag léiriú GFP nó Cre-GFP idir 2 agus seachtainí 7. Baineadh úsáid as anailís imdhíon-cheimiceimiceach chun éifeachtúlacht ath-chomhdhlúthú Cre-idirghabhála a fhíorú (féach Fíor Forlíontach Fíor S5). D'úsáideamar lá breithe ainmhithe 21 AAV tar éis obráid toisc go raibh ath-chomhshó i lucha floxed G9a cobhsaí agus uasta ag an bpointe ama seo, ag teacht le tuarascálacha foilsithe (S3-S4). Ar an gcaoi chéanna rinneadh turgnaimh G9a agus rexJJD overexpression ag úsáid veicteoirí víreas HSV ag léiriú GFP, wildtype G9a-GFP, marbh marbh go catalaíoch G9aH1093K-GFP nó unJD-GFP (féach S2 le haghaidh sonraí maidir le forbairt G9a constructs). Úsáideadh lucha róshamhlúcháin HSV lá 3 tar éis obráid ó tharla go raibh róshaothlú uasta ag an bpointe ama seo, mar a breathnaíodh trí imdhíonhaistéimeimic. Mar gheall ar nádúr neamhbhuan an léiriú HSV, agus an cineál léiriúcháin atá níos cobhsaí ó thaobh AAV de, baineadh úsáid as veicteoirí HSV i dturgnaimh a raibh sloinneadh trasghiniúna gearrthéarmach ag teastáil uathu, ach baineadh úsáid as veicteoirí AAV i dturgnaimh a raibh tréimhsí fada léirithe trasghiniúna ag teastáil uathu. Taispeántar an dá veicteoir, i réamhstaidéir fhairsinge, ach amháin maidir le comhlachtaí cille neuronal laistigh de limistéar na hinchinne ghann, gan aon ionfhabhtú de néaróin ghrámhara nó eiseacha.
Maidir le turgnaimh iompraíochta ag baint úsáide as an gcosc cógaseolaíoch G9a / GLP, BIX01294 (25 ng / μl), ionchorpraíodh lucha go stéaróideach le dhá mhion-chaidéal subaneous, mar aon le treoir cannulae déthaobhach, isteach sa NAc. Cuireadh mion-chaidéil i ngníomh 12 uair an chloig roimh bhroinn a chuir tús le seachadadh leanúnach (0.25 μ uair an chloig) d'fheithicil (5 hydroxypropyl β-cyclodextrin) nó druga ar laethanta 14, agus rinneadh meastóireachtaí iompraíochta le linn na tréimhse sin.
Do thurgnaimh ró-chomhbhrú BFosB [blotting an iarthair, qPCR, agus ChIP], NSE fireann giotánghinteach-TTA × tetOP-ΔFosB Baineadh úsáid as lucha (10 seachtain d'aois), inar éagmais an díorthach tetracycline doxycycline (seachtainí 8 as doxycycline), go dtaispeánfadh ainmhithe léiriú srianach srianach striatal de ΔFosB (S5). Deimhníodh ressionFosB overexpression sna lucha seo trí qPCR. Torthaí a dhearbhú ag úsáid NSE-TTA × tetOP-ΔFosB bhí lucha, lucha fiáin wildtype 8-seachtain d'aois / 57J-instealladh steotaxically-laistigh den NAc le veicteoirí AAV chur in iúl GFP nó osFos-GFP. Baineadh úsáid as veicteoirí AAV, sa chás seo, chun a chinntiú gur féidir expressionFosB 'a chur in iúl ag seachtainí 6 tar éis obráid, rud a cheadaíonn comparáid dhíreach idir lucha ionfhabhtaithe ralFosB ctedFosB atá ionfhabhtaithe go víreasach agus. Deimhníodh róshamhlú víreasach trí úsáid a bhaint as qPCR ag seachtainí 8 tar éis obráid (dídháileadh punches NAC 8-thomhas faoin suíomh insteallta). Rinneadh cóireáil ar lucha róshaolaithe AAV-GFP agus AAV-ΔFosB-GFP nár úsáideadh le haghaidh qPCR le salann (cóireálacha 15 salanda, ip) nó arís agus arís eile (cóireáil 14 14 mg / kg cóicín-HCl, ip) ag tosú ag 30 seachtaine tar éis máinliacht. Laethanta 6 tar éis na cóireála deiridh, socraíodh brains le paraformaldehyde 4%, roinnte ar vibratome agus úsáideadh iad le haghaidh anailíse dromlaigh dendritic.
Anailís blot an Iarthair
Tógadh puinseanna NAN 14-thomhas ó rannóga corónacha mm 1 a fuarthas ag baint úsáide as maitrís inchinne cruach dhosmálta agus bhí siad sona i maolán 1 M HEPES lysis (1% SDS) ina raibh proteas agus coscairí phosphatase. 10-Rinneadh leictreafóiriú ar shamplaí 30 proteing de phróitéin iomlán ar ghlóthacha 18 SDS. Aistríodh próitéiní chuig seicní PVDF agus rinneadh iad a ghoradh le frith-H3K9me2 (monachlólach luch, 1: 500), frith-β-tubulin (monachlólach luiche, 1: 60,000), histone frith-iomlán H3 (coinín polyclonal, 1: 5,000), frith-GFP (a úsáidtear chun fíor-léiriú víreasach a fhíorú i bhfíochán pollta) (coinín polyclonal, 1: 1000), frith-H3K27me3 (coinín polyclonal, 1: 500) nó antasubstaintí frith-achta (luch monoconal, 1: 60,000) thar oíche ag 4 ° C (cuireadh bac ar na seicní go léir i mbainne 5% nó albam albaim 5% bólachta). Rinneadh na seicní a ghoradh ansin le hantasubstaintí tánaisteacha lipéadaithe peroxidase (1: 15,000)-1: 60,000 ag brath ar an bpríomh-antasubstaint a úsáideadh) agus bhí na bandaí léirshamhlaithe ag baint úsáide as foshraith SuperSignal West Dura. Rinneadh na bandaí a chainníochtú le NIH Image J Software agus rinneadh bandaí H3K9me2 a normalú go actin nó β-tubulin agus chun H3 histeóin iomlán a rialú chun luchtú cothrom a rialú. Ní raibh aon éifeacht ag cóicín arís agus arís eile ar leibhéil na ngníomhartha (Fig. S8) nó an t-iomlán histone 3 (Fig. S1) sa NAc. Ina theannta sin, ní raibh aon éifeacht ag ionfhabhtú HSV-G9a-GFP agus HSV-G9aH1093K-GFP ar leibhéil iomlána β-tubulin sa NAc (Fig. S8).
Immunohistochemistry
Rinneadh na lucha a chlaonadh le dáileog mharfach de hydrate clóraltach agus ídéite le paraformaldehyde XNUM% sula ndearnadh anailís uirthi le imdhíonhaistéimeimic dhúbailte nó dúbailte mar a tuairiscíodh roimhe seo (S6). Go hachomair, rinneadh brains iar-shocraithe a ghoradh ag teocht an tseomra thar oíche i siúcrós 30% sular cuireadh ar leataobh iad ag 35 (m (roinntear brains a úsáideadh le haghaidh anailíse dromlaigh deilgneach ar vibratome ag ranna 100 μm in éagmais siúcróis 30%). Niteadh codanna saor-snámh NAc le 1X PBS, blocáilte (gnáth-serum asal 3, 0.1% tritonX, 1X PBS) agus ina dhiaidh sin le haghaidh frith-GFP (sicín polyclonal, 1: 8000) agus / nó frith-G9a (coinín polyclonal , 1: 500) antasubstaintí i réiteach blocáil. Gineadh na hailt a ndearnadh anailís orthu do dhromlaigh dendritic le antasubstaint frith-GFP coincréiteach polyclonal ag 1: 200. Tar éis goir thar oíche, rinneadh rannóga NAc a shruthlú amanna 3 le haghaidh 10 nóiméad le 1X PBS, agus ina dhiaidh sin goir le Cy2 agus / nó antasubstaintí tánaisteacha fluaraiseacha cúpláilte i dtuaslagán blocála 3X PBS le haghaidh uaireanta 1. Cuireadh codanna a úsáideadh le haghaidh staidéir mhoirfeolaíochta i ngnáth-antashubstaint thar oíche ag teocht an tseomra. Baineadh amach comh-smálú núicléach trí ailt a ghoradh i 2X PBS ina raibh DAPI (1: 1) le haghaidh 50,000 nóiméad. Niteadh arís eile na codanna, agus díhiodráitíodh eatánól ina dhiaidh sin agus cuireadh DPX orthu. Rinneadh íomháú ar gach rannóg ag úsáid micreascópachta confocal.
Aonrú RNA agus qPCR
Rinneadh puntaí déthaobhacha 14-thomhas NAc a homaiginiú i Trizol agus a phróiseáil de réir threoracha an mhonaróra. Íonaíodh RNA le micrea-cholúin RNAesy agus dheimhnigh speictreascópacht go raibh ciondálacha RNA 260/280 agus 260/230> 1.8. Ansin athscríobhadh RNA droim ar ais ag baint úsáide as Kit iScript Bio-Rad. Rinne qPCR cainníochtú ar cDNA ag úsáid SYBR Green. Reáchtáladh gach imoibriú i ndúblach nó i dtrí uimhir agus rinneadh anailís air de réir an mhodha ΔΔCt mar a thuairiscítear roimhe seo ag úsáid glyceraldehyde-3-fosfáit dehydrogenase (GAPDH) mar rialú normalaithe (S7). Féach Tábla forlíontach S5 le haghaidh sraitheanna primer mRNA.
Anailís ar mhicreafar DNA
Baineadh úsáid as ceithre ghrúpa (3 macasamhla bitheolaíoch neamhspleách in aghaidh an ghrúpa) le haghaidh an staidéir micrea-eirearaí, micrea-mhíreanna 12 san iomlán. 1 uair an chloig tar éis an t-instealladh cóicín deireanach, dí-éalaíodh ainmhithe go tapa agus baineadh brains amach agus cuireadh ar oighear iad. Tógadh dáiltí NAc trí shnáthaid snáthaid 15 a thomhas agus bhí siad reoite go tapa ar oighear tirim go dtí gur baineadh RNA amach. Comhthiomsaíodh punches dhéthaobhacha ó cheithre ainmhí in aghaidh na macasamhla, iomlán na lucha 12 in aghaidh an ghrúpa. Rinneadh iargúltacht RNA, próiseáil microarray, agus anailís sonraí mar a tuairiscíodh roimhe seo (S8). Go hachomair, rinneadh RNA a aonrú agus a íonú mar a thuairiscítear thuas agus seiceáladh é le haghaidh cáilíochta ag úsáid Bioanalyzer Agilent. Rinne croí micrea-arara UT Southwestern tras-athscríobh, aimpliú, lipéadú agus hibridiú chuig eagair Illumina MouseWG-6 v2.0. Rinneadh sonraí amha a dhealú agus normalaíodh an chainníocht trí úsáid a bhaint as bogearraí Beadstudio. Rinneadh anailís ar shonraí normalaithe ag baint úsáide as bogearraí GeneSpring agus gineadh genelists ag baint úsáide as critéir suntasachta de sciorradh athraithe 1.3 huaire in éineacht le gearradh neamh-déine p-luach p <0.05.
Coinnímid muinín mhór sna sonraí seo ar chúiseanna éagsúla. Ar an gcéad dul síos, láimhseáladh, caitheadh agus maraíodh gach ainmhí ag an am céanna, faoi na coinníollacha céanna. Chomh maith leis sin, rinneadh gach próiseáil RNA agus eagar ag an am céanna. Ar an dara dul síos, rinneamar eagair thrí chóip agus il-ainmhithe comhthiomsaithe in aghaidh an tsampla eagair, rud a laghdaigh difríochtaí mar gheall ar inathraitheacht an duine aonair agus ag méadú cumhachta staidrimh (S9). Ar an tríú dul síos, molann an tionscadal um Rialú Cáilíochta MicroArray na critéir anailíse sonraí a úsáideadh dár staidéar, toisc go bhfuil na critéir seo bailíochtaithe chun ard-in-atáirgtheacht idir-inoibritheachta agus in-atáirgtheacht idir-inláite agus intraplatform a sholáthar (S10-S11).
Tógáil veicteoirí víreasacha
Mar gheall ar shrianta ar mhéid na n-iontógálacha víreasacha, cuireadh seichimh chódúcháin le haghaidh fiáinéice G9a (G9a) nó marbh-chalaithe go G9a (G9aH1093K) i bhfleasc isteach sa p1005 + HSV plasmid agus GFP á chur in iúl acu faoi rialú an tionscnóra luath-chíomegalovirus (CMV). ba é méid an chur isteach ~ 9 kb, a sháraíonn an méid uasta iontógála do veicteoirí AAV-3.96). Tiomáineann an tionscnóir IE2 / 4 léiriú G5a. Folaíodh blúirí isteach sa p9 + + HSV plasmid trí ligings deireadh blunt le PmeI cóireáilte Klenow agus EcoRI digested G1005a (ó pcDNA9) agus CIP cóireáilte p3.1 + tar éis díleá EcoRI. Le haghaidh táirgeadh HSV-ΔJunD-GFP, ghin PCR seicheamh códaithe ΔJunD le gach ceann de na láithreáin srianadh EcoRI ag baint úsáide as oligonucleotides primer ina bhfuil an láithreán EcoRI. Ansin ligeadh an táirge PCR isteach i suíomh EcoRI an veicteoir p1005 +. Baineadh amach léiriú áitiúil de recombinase Cre i néaróin NAc trí sheachadadh géine víreasach-idirghabhála ag baint úsáide as veicteoir AAV mar a thuairiscítear (S12). Rinneadh GFP nó comhleá N-teirminéil de GFP go Cre a fho-chomhfhogasú i veicteoir ath-athchuingreach AAV-2 ina raibh tionscnóir CMV le seicheamh glactha deontóra spice agus comhartha polyadenylation. Deimhníodh gach leagan veicteoir le seicheamhú dideoxy. Táirgeadh veicteoirí víreasacha trí mhodh aistrithe triple, saor ó chúntóir, mar a tuairiscíodh roimhe seo (S13). Stóráladh víreas íonaithe ag −80 ° C. Rinneadh measúnú ar cháilíocht na víreas trí theideal tógálach a ndearnadh meastóireacht air i gcealla HEK293. Ullmhaíodh víris AAV-ΔFosB-GFP freisin. Do thionscnóir HSV-Cre, thiomsaigh tionscnóir IRES an léiriú Cre, seachas an tionscnóir IE4 / 5, d’fhonn léiriú Cre a íoslaghdú agus tocsaineacht néarónach a chosc (féach S14 le haghaidh tógáil víreasach). I ngach cás, bailíodh róshamhlú víreasach, araon in vitro agus in vivo, trí qPCR, agus deimhníodh go raibh víris dearbhaithe go immunohistochemically chun léiriú a bhí srianta ag NAc a thaispeáint tar éis obráid.
Máinliacht stereotaxic
Faoi ainéistéise ketamine (100 mg / kg) / xylazine (10 mg / kg), bhí lucha suite in ionstraim steiréataigh ainmhí beag, agus nochtadh dromchla an chromáin. Úsáideadh tríocha trí shnáthaid steallaire thomhsaire chun 0.5 virus de víreas a instealladh go déthaobhach isteach sa NAc ag uillinn 10 (AP + 1.6; ML + 1.5; dv - 4.4) ag ráta 0.1 μl / min. Ceadaíodh d'ainmhithe a fuair instealltaí HSV teacht ar ais ar feadh laethanta 2 tar éis obráid, agus ceadaíodh do lucha a úsáideadh chun tástáil iompraíochta a fháil ar veicteoirí AAV teacht ar ais ar feadh 20 lá sula ndearnadh iad a riochtú áit. Tá na hamanna seo ag teacht leis na tréimhsí a bhaineann le slonn trasghnéasach víreasach-idirghabhála don dá veicteoir. I gcás insiltí BIX01294, suiteáladh gach ceann de dhá mhion-chaidéal go cúng ar chúl an luch. Baineadh amach socrúcháin Cannulae trí dhá pholl cranial beag a dhruileáil os cionn na NAc, agus trí sheachadadh na cannula ó bregma (AP + 1.5; ML + 1.0; dv - 5.4). Ceadaíodh do lucha teacht ar ais ó mháinliacht ar feadh 4 go 5 lá sula dtosaíonn siad ar an nós imeachta um riochtú áit go cóicín mar a thuairiscítear thíos.
Rogha tosaíochta áit
Rinneadh an nós imeachta um riochtú áit mar a tuairiscíodh roimhe seo, leis na modhnuithe seo a leanas (\ tS7). Go hachomair, 3 lá tar éis insiltí laistigh de NAc de HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP nó HSV-GFP, cuireadh lucha isteach sna seomraí oiriúnaithe, atá comhdhéanta de thrí thimpeallacht ar leith. Rinneadh lucha a léirigh rogha shuntasach do cheachtar den dá sheomra aeroiriúnaithe a eisiamh ón staidéar (<10% de na hainmhithe go léir). Ansin cothromaíodh grúpaí oiriúnaithe chun coigeartú a dhéanamh ar aon chlaonadh seomra a d’fhéadfadh a bheith ann fós. Ar laethanta ina dhiaidh sin, instealladh ainmhithe le seile agus iad teoranta do sheomra amháin san iarnóin ar feadh 30 nóiméad agus ansin instealladh iad le cóicín (10 mg / kg, ip) agus teoranta ar feadh 30 nóiméad go dtí an seomra eile tráthnóna ar feadh 2 lá (dhá cheann) seile agus dhá phéire cóicín). Ar lá na tástála, cuireadh lucha ar ais sa ghaireas gan chóireáil ar feadh 20 nóiméad agus rinneadh tástáil orthu chun an taobh ab fhearr leo a mheas. Rinneadh freagraí locomotóra ar chóicín a mheas trí shosanna bíoma sna seomraí péireáilte cóicín chun éifeachtacht na cóireála drugaí a chinntiú. Le haghaidh turgnaimh AAV agus BIX01294 CPP, úsáideadh prótacal mionathraithe. Instealladh ainmhithe arís le seile nó cóicín (10 mg / kg, ip) agus bhí siad teoranta do sheomraí ar leith ar feadh seisiúin 30 nóiméad, ach ina ionad sin ní raibh siad oiriúnaithe ach uair amháin sa lá ar feadh 4 lá, agus ina dhiaidh sin rinneadh an tástáil ar lá 5 (bhí ainmhithe oiriúnaithe. sa tráthnóna agus malartaíodh cóireálacha aeroiriúnaithe). Maidir le gach grúpa, rinneadh locomotion bunlíne mar fhreagairt ar shalainn a mheas chun a chinntiú nach gcuirfeadh cóireáil víreasach nó inhibitor isteach ar ghluaiseacht.
Féin-riarachán cóicín infhéitheach
Fuarthas francaigh fhireanna óga Long-Evans, meá 230-250 g ag tús an turgnaimh. Bhí siad lonnaithe i dtimpeallacht a bhí faoi rialú taise agus teochta ar thimthriall éadrom / dorcha 12 a bhí droim ar ais (soilse ag 9: 00 am) le roghnach rochtain ar bhia agus ar uisce. Ceadaíodh do rataí a dtimpeallacht nua a fhabhrú agus láimhseáladh iad go laethúil le haghaidh 1 seachtaine roimh thús an turgnaimh. Rinneadh na nósanna imeachta go léir de réir Threoir an Fhorais Náisiúnta um Chúram agus Úsáid Ainmhithe Saotharlainne agus cheadaigh Coiste Cúram agus Úsáid Ainmhithe Mount Sinai iad. Bhí bíomaí infridhearg feistithe ar an trealamh féin-riaracháin chun iompar innill ghluaiste a thomhas. Rinneadh féin-riarachán mar a tuairiscíodh roimhe seo (S15-S16) le cataitéir ionchlannaithe sa fhéith jugular cheart faoi ainéistéise isoflurane (2.4-2.7%). Rinneadh caititéirí a shruthlú le 0.1 ml de thuaslagán seile ina raibh 10 U heparin agus ampicillin (50 mg / kg). Tar éis seachtain amháin tar éis téarnamh ó mháinliacht, cuireadh tús le hoiliúint féin-riaracháin le linn na céime dorcha den timthriall éadrom / dorcha. Ceadaíodh rochtain laethúil 3 uair an chloig d’ainmhithe ar chóicín (0.75 mg / kg / insileadh) faoi sceideal athneartaithe cóimheas seasta-1 (FR1), áit a raibh insileadh amháin drugaí mar thoradh ar 1 phreas luamhán gníomhach. Chobhsaigh francaigh a n-iontógáil cóicín tar éis 6 lá (<éagsúlacht 15% sa ráta freagartha thar 3 lá as a chéile, agus 75% ar a laghad ag freagairt ar an luamhán athneartaithe). 24 uair an chloig tar éis an tseisiúin dheiridh féin-riaracháin, díothaíodh francaigh go gasta, baineadh brains go tapa agus próiseáladh iad le haghaidh aonrú RNA agus qPCR.
Frith-imdhíonadh Chromatin
Rinneadh punches úra NAC a fhoirmiú le chéile agus ullmhaíodh iad le haghaidh CTA mar a tuairiscíodh roimhe seo (S17-S18) le mionathruithe. Go hachomair, 4 14-gauge Bailíodh punanna NA in aghaidh an ainmhí (5 ainmhithe a chomhthiomsaítear in aghaidh an tsampla), a nascadh le formaildéad 1% agus a múchadh le glicín 2 M sula reoitear iad ag −80 ° C. Ullmhaíodh coirníní maighnéadacha IgG trí coirníní maighnéadacha cuí a ghoradh le frith-G1a (grád sliseanna polyclonal coinín) nó frith-H9K3me9 (grád sliseanna monachlólach na luch) antasubstaintí thar oíche ag 2 ° C faoi rothlú leanúnach i mbloc-réiteach. Rinneadh sonrú fíocháin agus cneasú crómatin mar a tuairiscíodh roimhe seo (S17). Tar éis sonrú, aistríodh comhchruinnithe comhionanna crómatin go feadáin nua agus sábháladh ~ 5% de na táirgí deiridh chun feidhmiú mar rialuithe 'ionchuir'. Tar éis níochán agus fionraí críochnúil na meascán bead / antasubstainte comhchuingeach, cuireadh méideanna cothroma de mheascáin antasubstainte / bead (~ 7.5 μg antasubstaint / sampla) le gach sampla crómatin agus deineadh iad le haghaidh ~ 16 uair an chloig faoi uainíocht leanúnach ag 4 ° C. Niteadh agus aisiompaíodh samplaí a thuilleadh tras-nasctha ag 65 C thar oíche roimh íonú DNA trí threalamh íonaithe PCR a úsáid. Tar éis íonú DNA, cuireadh qPCR faoi shamplaí agus rinneadh iad a normalú go dtí a rialuithe iomchuí 'ionchuir' mar a tuairiscíodh roimhe seo (S17). Rinneadh imdhíonadh gnáth-luch IgG ag baint úsáide as antasubstaint frith-IgG polyclonal luch chun rialú a dhéanamh freisin ar shaibhriú cuí an mhéadaithe comhartha. Baineadh úsáid as phosphoribosyltransferase (APRT) adenine mar rialú diúltach ar thurgnaimh ró-chomhbhrú cóicín agus ΔFosB. Féach Tábla Forlíontach S5 le haghaidh sraitheanna primer tionscnóra.
Anailís dromlach dendritic
Chun staidéar a dhéanamh ar ról G9a maidir le moirfeolaíocht neuronal in vivo a rialáil, d'úsáideamar modhanna a ndearnadh cur síos orthu roimhe seo leis na modhnuithe seo a leanas (S1). Trí lá tar éis instealladh HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (baineadh úsáid as na víris go léir i lucha wildtype C57Bl / 6J), nó HSV-Cre-GFP (a úsáidtear i G9afl / fl lucha), nuair a bhí an nochtadh víreasach uasta, bhí lucha ar na lucha, cuireadh na brains faoi deara agus rinneadh rannóga níos déanaí orthu ag 100 μm ar vibratome. Rinneadh imdhíonadh ar na rannóga ansin ag baint úsáide as antasubstaint in aghaidh GFP mar a thuairiscítear thuas (féach Immunohistochemistry). Chun measúnú a dhéanamh ar na héifeachtaí a bhaineann le róshamhlú G9a agus le huimhriú ar uimhreacha spine, chomh maith leis an éifeacht a bhíonn ag ression ró-róshamhlú, rinneamar tomhas ar líon na dromlach ar neurites thart ar 1-2 in aghaidh na néaróin a bhí cothrom le 299 ofm ar a laghad de mheáin thánaisteacha ó mheán GFP-in iúl NAc néaróin spíonacha (MSNanna). Ós rud é go bhfuil MSNanna éagsúil ó mhoirfeolaíochtaí ó dhaonraí eile néaróin sa NAc, chomh maith le tuarascálacha roimhe seo a léiríonn go n-ionfhabhraíonn HSV go príomha DARPP-32 ag léiriú néaróin sa réigiún inchinne seo (S19), táimid muiníneach go ndearnadh MSNanna a mheasúnú go heisiach sna staidéir seo. Maidir le gach ainmhí, scrúdaíomar néaróin 6 – 8 in ainmhithe 3-4 in aghaidh an ghrúpa (grúpaí 7), agus ina dhiaidh sin fuarthas meánluach do gach ainmhí le haghaidh anailíse staitistiúla. Rinneadh turgnaimh a dearadh chun éifeachtaí rexFosB ró-chomhbhrúite ar dhlús spine NAc a iompar ar an gcuma chéanna leis an gceann thuasluaite, ach amháin gur úsáideadh veicteoirí AAV chun GFP nó BFos-GFP a chur in iúl ar feadh tréimhsí fada ama (seachtainí 8). Gabhadh gach íomhá HSV trí mhicreascóp cómhalartach a úsáid le cuspóir tumoideachais 100X (gabhadh íomhánna AAV le cuspóir tumoideachais ola 63X). Fuarthas íomhánna leis an bpoll poll ag aonad treallach 1 agus le méid an fhráma 1024 × 1024. Tomhaiseadh fad dendritic trí bhogearraí NIH Image J a úsáid, agus rinne an príomh-turgnamh uimhreacha dall a chomhaireamh dall, mar gur códaíodh sleamhnáin roimh scanadh turgnamhach. Ríomhadh an meánlíon dromlaigh in aghaidh an 10 μ dendrite.
Anailís staitistiúil
Rinneadh ANOVAanna aon-agus dhá bhealach chun an tábhacht a bhaineann le rogha áitithe agus anailís spine dendritic le níos mó ná dhá ghrúpa a chinneadh. Baineadh úsáid as tástálacha t na mac léinn chun comparáidí eile a dhéanamh lena n-áirítear qPCR, blotting an iarthair, anailís spine dendritic i gcomparáid le HSV-GFP le HSV-Cre i G9afl / fl lucha, anailísí ar mhicrarártha (féach thuas) agus turgnaimh inmunoprecipitation chromatin. Baineadh úsáid as tástálacha t mac léinn pleanáilte tar éis anailís dhá bhealach ANOVA ar dhlús spine dendritic tar éis ró-bhrúchtadh FFBB le deimhniú ar phríomhéifeachtaí suntasacha cóireála drugaí agus víris. Is ionann na luachanna uile a chuimsítear sna finscéalta figiúr agus ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Anailísí staitistiúla mionsonraithe ar Figs. 1-3 sa phríomhthéacs tugtar iad seo a leanas: Finscéalta Figiúir Mionsonraithe lena n-áirítear Staitisticí.
Nótaí nótaí
Deimhním nach bhfuil aon cheann de na hábhair a áirítear sa lámhscríbhinn i dteideal Ról Riachtanach an G9a, Meitil-an-Féasra Staire in Plaisteachacht a Fhorbair Cóicín a foilsíodh cheana nó atá á mbreithniú in áiteanna eile, lena n-áirítear ar an Idirlíon.
Rinneadh an obair go léir a bhaineann le hainmhithe a úsáid de réir threoirlínte institiúideacha agus IACUC ag Ionad Leighis Ollscoil Texas Southwestern agus Scoil Leighis Mhóta Sinai.
Tagairtí agus Nótaí
;