Is éard atá i gceist le gníomhaíocht mhéadaithe de kinase-spleách kinase 5 luasú comharthaíochta dopamine idirbheartaithe cóicín (2005)

Abstract

Méadaíonn cóicín leibhéil dopamine synaptic sa striatum agus athraíonn sé léiriú géine sna néaróin dopaminoceptive trí chosáin intracellular a ghníomhaíonn an comhartha tosaigh ón ngabhdóir dopamine D1 chuig an núicléas a ghníomhachtú1). Déanann neamhchosaint ainsealach ar chóicín rialáil ar roinnt fachtóirí trascríobh, agus mar thoradh air seo tá na hathruithe fadtréimhseacha ar léiriú géine a mheastar a bheith mar bhonn le hoiriúnuithe néaróin in andúil cóicín (2). BFosB, a aithnítear mar fhachtóir trascríobh (3), léiríodh go bhfeabhsaíonn sé freagrúlacht iompraíochta ainmhithe go cóicín (4, 5). Dá bhrí sin, táthar ag súil go gcuirfidh sainaithint na ngéinte sprice a rialaítear le hionduchtú BFosB le tuiscint níos fearr ar an meicníocht mhóilíneach is bun le andúil cóicín. Le déanaí, tá sé léirithe go bhfuil cóireáil ainsealach ar ainmhithe le cóicín léirithe ag léiriú an kinase atá ag brath ar chiclin-5 (Cdk5) agus a ghníomhaire p35 sa striatum trí ionduchtú ΔFosB (6, 7).

Tá Cdk5 ina bhall den teaghlach Cdk de kinases serine / threonine. Murab ionann agus Cdks eile atá ina mór-rialtóirí ar dhul chun cinn timthrialla cille, tá Cdk5 i gceist go príomha le fosfáitiú foshraitheanna i néaróin iarbhreiteacha. (8). Baintear sainiúlacht neuronal ghníomhaíocht Cdk5 amach trí chomhcheangal lena ghníomhaithe, p35 nó p39, a chuirtear in iúl go príomha i néaróin iarbhreiteacha (8). Chomh maith le ról riachtanach Cdk5 i bhforbairt inchinne (9, 10), iBhí baint ag t freisin le tarchur dopaminergic in inchinn iarbhreithe (11, 12). Is é an toradh a bhíonn ar chosc ar ghníomhaíocht Cdk5 go scaoiltear dopamine níos mó sa striatum, rud a thaispeánann feidhm réamhghabhálach de Cdk5 mar rialtóir diúltach ar scaoileadh dopamine (11). Ina theannta sin, déanann Cdk5 modhnú ar éifeachtúlacht chomharthaíocht dopamine postsynaptic trí phosphoryro fosphoprotein dopamine-agus cAMP-rialaithe, mais mhóilíneach 32 kDa (DARPP-32) ag Thr-75, a athraíonn DARPP-32 isteach i gcosc ar kinase spleách-cAMP (PKA) (12).

Tugann na barúlacha seo le tuiscint gur rialtóirí iartheachtacha iad Cdk5 agus p35 maidir le gníomhachtú fada a dhéanamh ar chomharthaíocht dopamine tar éis nochtadh ainsealach do chóicín agus mar sin i andúil cóicín. Chun aghaidh a thabhairt tuilleadh ar ról Cdk5 maidir le comharthaíocht dopamine striatal, ghin muid dhá líne luiche trasghineacha inar cuireadh Cdk5 nó p35 róshaothraithe go sonrach i néaróin faoi rialú an tionscnóra p35. Thug ár dtorthaí le fios go raibh gníomhaíocht Cdk5 rialaithe suas le leibhéil mhéadaithe próitéine p35 ach ní Cdk5 próitéin, rud a thugann le tuiscint go bhfuil an leibhéal próitéine p35 ag teorannú ráta do ghníomhaíocht Cdk5. Soláthraímid anseo in vivo De thoradh na fianaise gur tháinig méadú ar ghníomhaíocht Cdk5, mar thoradh ar ró-ísliú p35, go laghdaítear dopamine idirghabhála cóicín a thugann comhartha don núicléas trí bhíthin toirmeasc ar eascraíonn an kinase PKA agus kinase comhartha-asceallach (ERK).

Ábhair agus Modhanna

Antasubstaintí. Ceannaíodh antasubstaintí polyclonal go Cdk5 (C-8) agus p35 (C-19) ó Bhiteicneolaíocht Santa Cruz. Fuarthas an t-antasubstaintí fosfair-spleáchais agus neamhspleácha chun ERK kinase (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2, agus próitéin ceangailteach eilimint-fhreagra cAMP (CREB) ó Theicneolaíocht Comharthaíochta Cell (Beverly, MA). Na hantasubstaintí le fosfón-Thr-34 DARPP 32 (13,, fosfar-Thr-75 DARPP-32 (12), iomlán DARPP-32 (12), agus c-fos14) a úsáideadh mar a thuairiscítear. Ceannaíodh antasubstaint chun actin ó Sigma.

Ainmhithe Turgnamhacha. Chláraigh muid níos luaithe an géine p35 luch Cdk5r1, a ionchorpraíonn próitéin p35, agus a thréith a struchtúr géanómach (15). Chun an luch trasghiniúnach a ghiniúint le ró-róshaothrú neuronal de p35 (Tgp35), an 6-kb EcoRI-EcoRinneadh blúire RI ina bhfuil réigiún tionscnóra 1.2-kb a fholimiú i pGEM9Z (-) plasmid, agus cuireadh tag 45-bp a díorthaíodh ó SV40 isteach sa KpnSuíim síos an sruth den phola (A⁺) comhartha (Fig. 1A). Bhí a SpecialsDéanaim suíomh chun géinitíopáil a dhéanamh ar na hainmhithe. Eisíodh an blúire 6-kb ón plasmid agus íonaithe, agus ina dhiaidh sin instealladh néata ar an trasghiniúint chun na lucha transgenic a ghiniúint. Scrúdú a dhéanamh ar phróifíl cainte an transgene faoi rialú rialála thionscnóir 1.2-kb p35 in vivo, giníodh luch thrasghearrthach dúbailte (Tgp35; p35 - / -) tuilleadh trí straitéis phóraithe dhá chéim a úsáid trína ndearnadh an luch Tgp35 a athghiniúint i gcúlra p35-null endogenous. Áiríodh leis na samhlacha eile luch a úsáideadh sa staidéar seo p35 +/–, p35 - / -, Cdk5 +/–, agus luch thrasghiniúnach le ró-ró-ísliú néaróin de Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17). Socraíodh géinitíopaí de na lucha seo trí anailís blot an Deiscirt nó PCR a dhéanamh ar DNA géanómach atá scoite amach ó na bithóipí eireaball. Bhí lucha lonnaithe faoi thimthriall dorcha 12-h / 12-h dorcha. Tugadh gach cúram de réir threoirlínte na nInstitiúidí Náisiúnta Sláinte maidir le cúram agus úsáid ainmhithe saotharlainne agus turgnamhacha.

  

Fig. 1.

Giniúint luch transgenic le róshaothrú neuronal de p35 arna stiúradh ag an tionscnóir p35 (Tgp35). (A) Léirítear an tógáil transgene leis na struchtúir scéimreach de chineál fiáin agus ailléilí p35 spriocdhírithe. Léiríonn barraí dearga an tóireadóir a úsáidtear le haghaidh géinitíopála. ...

Anailís ar an gClota Theas. Rinneadh DNA géanómaíochta a baineadh as bithóipí eireaball a dhíleá leis EcoRI agus SpecialsI, leictreafóirithe ar ghlóthach agarose 0.9%, agus aistrítear isteach i scannán níolóin. Rinneadh an scannán a hibridiú le hairgead randamach ³²Probe P-lipéadaithe ag 42 ° C thar oíche. Cruthaíodh an tóireadóir 485-bp chun géinitíopáil a dhéanamh ar ph35 knockout (p35 - / -) agus Tgp35 lucha ag PCR trí na primers seo a leanas a úsáid: 5′-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 ′ agus 5′-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3 ′. Bhí nite an scannán hibridithe dhá uair i 2 × SSC / 0.1% SDS ag 42 ° C le haghaidh 10 min, agus dhá uair i 0.1 × SSC / 0.1% SDS ag 65 ° C le haghaidh 20 min, agus nochta do x-ghathaithe scannán.

Cóireáil Drugaí. Díscaoileadh Cocaine (Sigma) i saline steiriúil. Cuireadh ainmhithe ip-ghann le cóicín (15 mg / kg) nó le toirt chomhionann salanda ag aois 3 míonna agus maraíodh iad trí dhí-inniú ag pointí ama difriúla (15, 30, 60, agus 120 min) tar éis an insteallta. Brains a bhaint go tapa agus fuaraithe i oighear-fuar PBS. Rinneadh an striata a dháileadh amach ansin agus cuireadh faoi anailís blot Thuaisceart nó an Iarthair iad. I gcás anailís imdhíon-cheimiceimiceach, fuarthas rannóga striatal ó lucha 2 h tar éis an insteallta.

Anailís ar Bhlota an Tuaiscirt. Baineadh RNA iomlán as an striata leis an imoibrí TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) agus cuireadh faoi anailís blot an Tuaiscirt é mar a thuairiscítear (18). Chun c-fos mRNA a bhrath, baineadh úsáid as blúire 189-bp de luch c-fos cDNA mar thóireadóir mar a thuairiscítear (19). Rinneadh leibhéil c-fos mRNA a chainníochtú trí dhlús optúil an bhanda shonraigh a thomhas trí chóras anailíse íomhá a úsáid le bogearraí íomhá nih, Leagan 1.62.

Anailís ar Bhloc an Iarthair. Bhí fíocháin Striatal sonicated i SDS 1% agus bruite le haghaidh 10 min. Socraíodh an tiúchan próitéine i ngach sampla ag measúnacht próitéine BCA (Pierce). Roinneadh SDS / LEATHANACH suimeanna comhchoiteanna próitéine sular aistríodh iad go scannán nitrocellulose. Cuireadh bac ar na seicní i 1 × PBS ina raibh bainne lom 5% agus 0.05% Tween 20 agus greamaíodh iad le príomh-antasubstaintí thar oíche ag 4 ° C. Rinneadh an ghoir le frith-luch nó coinín comhchuingeach peroxidase IgG (Sigma) ag teocht an tseomra le haghaidh 60 min. Braitheadh ​​comhartha trí cheimilíneacht feabhsaithe (Pierce), agus rinneadh dlúis optúla na mbandaí a chainníochtú mar a thuairiscítear thuas.

Measúnacht Kinase Cdk5. Ullmhaíodh lysates Striatal le maolán lysis ina raibh XNMX Tris mm · HCl, pH 50 / 7.4 mM MM EDTA / 50% Triton X-5 / 1mMDTT / 100 m fluairíd feinilmethylsulfonyl / 1 /g / ml aprotinin / 1 /g / coscairí leupeptin ml / phosphatase (meascán cosantóir phosphatase I agus II, Sigma). Rinneadh na líonta a imdhíonadh le hantasubstaintí frith-Cdk1 (C-1) nó frith-p5 (C-8). Ullmhaíodh an imdhíonadh Cdk35 trí ghoir 19 μl den lysate (a fhreagraíonn do 5 de phróitéin) le antashubstaint frith-Cdk300 (300 μg) thar oíche ag 5 ° C agus ina dhiaidh sin goir le 3 μl de choirníní próitéin A-agarose % sciodair sa mhaolán lysis; Biteicneolaíocht Santa Cruz) le haghaidh 4 h ag 25 ° C. Le haghaidh imdhíonadh p50 a ullmhú, corpraíodh 3 μl den lysate (a fhreagraíonn do 4 mg próitéine) le antasubstaint frith-p35 (500 μg) mar a thuairiscítear thuas. Niteadh an imdhíon-fhrithchúpláil faoi dhó leis an maolán lysis agus dhá uair le maolán kinase arb éard a bhí ann 1 m Tris · HCl, pH 35 / 3 mM MgCl₂/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, athchóirithe i 60 μl den mhaolán kinase. Tomhaiseadh gníomhaíocht Kinase trí histone H1 a úsáid mar fhoshraith (18).

Immunohistochemistry. Rinneadh natháin a ainéistéisiú ag instealltaí IP de avertin (250 mg / kg, Fluka) agus rinneadh maosán sosfáite sóidiam 0.1 M orthu, a pH 7.4, agus ansin Streck Tissue Fixative (Streck Laboratories, La Vista, NE), ceartúchán neamh-chrosghaolmhar. Socraíodh inchinn dhiosctha a thuilleadh sa chóiritheoir céanna thar oíche ag 37 ° C. Ansin, bhí brains leabaithe i bpaifín, gearrtha i rannóga corónacha 5-μm-tiubh agus faoi réir immunohistochemistry trí theicníc chasta avidin-biotin peroxidase (Saotharlanna Veicteoir) le diaminobenzidine mar fhoshraith. Rinneadh na hailt a ghoradh le antashubstaint pholaimídeach íonaithe i gcoinne c-fos thar oíche ag 4 ° C. Rinneadh measúnú ar an sainiúlacht staining tríd an bpríomh-antasubstaint a fhágáil ar lár.

Torthaí

Giniúint lucha transgenic le róshaothrú neuronal de p35. Is éard a bhí i gceist leis an transgene a úsáideadh chun léiriú néarónach méadaithe de p35 a bhaint amach an bláth 6-kb den ghéin chlóite p35 luch ina bhfuil an tionscnóir 1.2-kb agus an t-ord códaithe iomlán de p35 (Fig. 1 A). Socraíodh géinitíopaí lucha le hanailís blot an Deiscirt trí úsáid a bhaint as tóireadóir a dearadh chun p35 - / - agus Tgp35 lucha a idirdhealú ó lucha de chineál fiáin (Fig. 1 A agus B). Chun scrúdú a dhéanamh ar an slonn transgene faoi rialú an tionscnóra 1.2-kb p35, ghin muid lucha déghnéasacha dúbailte (Tgp35; p35 - / -) inar seoladh an abairt p35 ón transgene amháin. An slonn p35 in Tgp35; p35 - / - níor breathnaíodh lucha san inchinn amháin (Fig. 1C), i gcás go raibh an patrún léirithe spásúla cosúil le patrún na lucha fiáine (Fig. 1D). Tá sé léirithe go bhfuil struchtúr ciseal neamhghnách i gcortex cerebral agus hippocampus lucha mar thoradh ar easpa p35.10). Mar sin féin, léirigh na lucha Tgp35; p35 - / - tarrtháil iomlán den feinitíopa p35 - / - inchinn (Fig. 1E). Thug na sonraí sin le fios gur rialaigh tionscnóir 1.2-kb p35 léiriú an trasghiniúna le próifíl cainte comhchosúil le léiriú p35 ón ngéine p35 inchríochnaitheach.

Is é an Leibhéal Próitéin P35 an Ráta Teorainn le Gníomhaíocht Cdk5 a Rialáil Suas. Scrúdaíomar éifeachtaí géine-dosage na ngéinte ionchódú p35 agus Cdk5 ar léiriú próitéine i sleachta striatal ó p35 - / -, p35 +/–, cineál fiáin, Tgp35, Cdk5 +/–, agus lucha TgCdk5 ag aois 3 mhí. Bhí na leibhéil p35 agus Cdk5 próitéin comhghaolaithe go maith leis na dosages géine, faoi seach (Fig. 2 A agus B). Léirigh lucha Tgp35 méadú fold1.6-huaire i leibhéal próitéine p35 i gcomparáid le lucha de chineál fiáin, ach níor chuir leibhéil dhifriúla próitéine p5 isteach ar leibhéil próitéine Cdk35. Léirigh TgCdk5 lucha méadú fold1.9-huaire i leibhéal próitéine Cdk5 i gcomparáid le lucha de chineál fiáin, ach níor chuir leibhéil dhifriúla próitéine Cdk35 isteach ar leibhéil próitéine p5. Chun scrúdú a dhéanamh ar na héifeachtaí a bhíonn ag méideanna difriúla próitéine p35 ar ghníomhaíocht Cdk5, rinneadh Cdk5 a imdhíonadh ó shleachta striacha le gníomhaíocht frith-Cdk5 agus gníomhaíocht kinase a thomhas. Mar an gcéanna, chun scrúdú a dhéanamh ar na héifeachtaí a bhíonn ag méideanna difriúla próitéine Cdk5 ar ghníomhaíocht kinase, rinneadh p35 a imdhíonadh ó eastóscáin striapacha le antashubstaint frith-p35, agus tomhaiseadh gníomhaíocht kinase. Bhí gníomhaíocht Cdk5 comhghaolaithe go maith le leibhéal na próitéine p35 ach ní raibh an leibhéal próitéine Cdk5 annFig. 2 C agus D). Léirigh na torthaí seo gur fachtóir teorannaithe ráta do ghníomhaíocht Cdk35 é an próitéin p5. Dá bhrí sin, d'úsáideamar lucha Tgp35 chun éifeachtaí ghníomhaíocht mhéadaithe Cdk5 a imscrúdú ar chomharthaíocht dopamine striatal.

  

Fig. 2.

Tá uas-rialáil ar ghníomhaíocht Cdk5 ráta-teoranta ag an leibhéal próitéine p35. (A(B) blots an Iarthair a thaispeánann go bhfuil na leibhéil próitéine de p35 agus Cdk5 comhghaoil ​​le dáileoga géine na ngéinte p35 agus Cdk5, faoi seach. (B(D) Leibhéil choibhneasta próitéine p35 nó Cdk5 ...

Fosphorylation Cocaine-spreagtha de DARPP-32 ag Thr-34 An bhfuil mhaolú i Tgp35 lucha. Braitheann feidhm DARPP-32 ar a staid fosfathúcháin ag suíomhanna éagsúla (20). Phosphorylates PKA DARPP-32 ag Thr-34, ach phosdorylates Cdk5 DARPP-32 ag Thr-75. Dá bhrí sin, scrúdaíomar staid fosfaictrithe DARPP-32 i sleachta striatal ó na cineálacha fiáine agus de lucha Tgp35. Bhí an leibhéal fosfa-Thr-75 DARPP-32 níos airde i lucha Tgp35 (Fig. 3A; 1.6 ± 0.2-huaire os cionn luach lucha de chineál fiáin). Rinneamar measúnú eile ar na héifeachtaí a bhain le gníomhaíocht mhéadaithe Cdk5 ar chomharthaíocht dopamine striatal. Scrúdaíomar gníomhachtú PKA atá spreagtha ag an gcóicín i lucha Tgp35 trí anailís a dhéanamh ar staid phosphorylation DARPP-32 ag Thr-34. Méadaíodh an leibhéal fosfa-Thr-34 DARPP-32 i lucha cineál fiáine 15 min tar éis an insteallta cóicín (Fig. 3B; 1.8 ± 0.2-huaire os cionn leibhéal na basal). Mar sin féin, laghdaíodh an éifeacht a bhí ag cóicín ar fosforylation Thr-34 de DARPP-32 i lucha Tgp35 (1.2 fold 0.3-huaire os cionn leibhéal na basal). Thug na torthaí seo le fios gur mhaolaigh méadú ar ghníomhaíocht Cdk5 an gníomhachtú PKA a spreagann an cóicín, is dócha tríd an bhfosfathúchán DARPP-32 ag Thr-75 (6, 12). Is féidir freisin go mbeidh scaoileadh dopamine laghdaithe mar thoradh ar mhéadú ar ghníomhaíocht Cdk5 réamhghabhálach, agus go gcuireann sé seo le héifeacht laghdaithe an chóicín. Go háirithe, ní raibh aon tionchar ag instealladh aonair cóicín ar na leibhéil próitéine p35 agus Cdk5 chomh maith leis an ngníomhaíocht kinase (Fig. 3 C agus D). Tá sé seo i gcodarsnacht le staidéar roimhe seo inar taispeánadh go bhfuil nochtadh ainsealach ar chóicín in ann léiriú p35 agus Cdk5 a uas-rialáil (6).

  

Fig. 3.

Méadaíonn uas-rialáil gníomhaíochta Cdk5 an leibhéal fosfa-Thr-75 DARPP-32 agus méadaítear gníomhachtú PKA a spreagann cóicín. (A) Immunoblot a thaispeánann méadú ar an bhfosfathú de DARPP-32 ag Thr-75 (P-D32 Thr-75) i sleachta striatal ó lucha Tgp35. I ...

Uasghrádaítear Gníomhaíocht Cdk5 ag Gníomhachtú ERK1 / 2 a Chothaítear ar Chócaoin. Léiríonn fianaise le déanaí go ngníomhaíonn gníomhachtú dopamine sa striatum freisin easghluaiseachtaí comharthaíochta eile, lena n-áirítear conair ERK (21, 22), a bhfuil ról tábhachtach aige i bhfreagairt iompraíochta ar chóicín (23). Mar sin scrúdaíomar an bhféadfadh gníomhaíocht Cdk5 dul i bhfeidhm ar ghníomhachtú an chonair ERK a spreagann cóicín. Breathnaíodh gníomhachtú an chosáin ERK i ndiaidh insteallta cóicín i sleachta striatal ó lucha de chineál fiáin, mar a léiríodh trí mhéadú fosfairithe MEK1 / 2 ag Ser-217 agus Ser-221 (1.5-huaire 0.2 os cionn leibhéal na basal) agus ERK1 / 2 ag Thr-202 agus Tír Eoghain-204 (phosphorylation ERK2: 1.5 fold 0.2-huaire os cionn an leibhéal basal) (Fig. 4 A agus B). Mar sin féin, laghdaíodh an gníomhachtú cóicín a spreagann MEK1 / 2 (1.2 fold 0.2-huaire os cionn leibhéal na basal) agus ERK1 / 2 (phosphorylation ERK2: 1.2 fold 0.2-huaire os cionn leibhéal na basal) i lucha Tgp35 (Fig. 4 A agus B). Thairis sin, bhí na leibhéil bhunúsacha fosfa-ERK1 / 2 níos ísle i lucha Tgp35 (0.8 ± 0.2-huaire faoi luach lucha de chineál fiáin), ach ní raibh an treocht seo suntasach go staitistiúil. D’fhéadfaí an toradh deiridh seo a chur i leith fosfarfholcadh MEK5 atá ag brath ar Cdk1 ag Thr-286, agus mar thoradh air seo laghdaítear an ghníomhaíocht chatalaíoch (24). Chun an fhéidearthacht seo a mheas, scrúdaíomar staid fosfaictrithe MEK1 ag Thr-286 agus fuair muid amach go raibh leibhéil níos airde fosfa-Thr-286 MEK1 i láthair i sleachta striatal ó lucha Tgp35 (Fig. 4C; 1.3 ± 0.1-huaire os cionn luach lucha de chineál fiáin). Ina theannta sin, níor athraíodh instealladh singil cóicín i riocht fosfaireachais MEK1 ag Thr-286, ag teacht leis an gcinneadh nach raibh tionchar ag an gcóireáil ar ghníomhaíocht Cdk5 (Fig. 3D).

  

Fig. 4.

Cdk5-toirmeasc ar chosc ar MEK1 / 2 mar thoradh ar laghdú ar gníomhachtaithe cóicín-spreagtha ERK1 / 2. Ullmhaíodh sleachta striatal ó lucha fiáin (WT) agus ó lucha Tgp35 15 min tar éis insteallta ceachtar cóicín nó salanda agus faoi réir imdhíonachta ...

Iomadú na nDopamine Tá Gníomhaíocht mhéadaithe Cdk5 mar chomhartha don Núicléas. Is é an toradh a bhíonn ar ghníomhachtú cócáid ​​chomharthaíochta il-chomharthaíochta a bhaineann le PKA agus ERK ná gníomhaireacht trascríobh CREB ina dhiaidh sin sa núicléas trína phosphorylation ag Ser-133 (22, 25). Le himscrúdú a dhéanamh ar cé acu an féidir le héifeachtaí coisctheacha Cdk5-idirghabhála ar chascáidí gníomhachtaithe PKA agus ERK teacht ar phosphorylation CREB sa núicléas, scrúdaíomar staid fosfaireachais CREB ag Ser-133 i sleachta striatal ó chineál fiáin agus lucha Tgp35. Bhí leibhéal basal fosfa-CREB níos ísle i lucha Tgp35 (0.7 fold huaire XNÍ de luach lucha de chineál fiáin) (Fig. 5). Mar fhreagra ar instealladh cóicín, méadaíodh an leibhéal fosfa-CREB i striatum lucha de chineál fiáin (1.5 fold 0.1-huaire os cionn leibhéal na basal), ach laghdaíodh an freagra seo ar chóicín i lucha Tgp35 (1.2 ± 0.1- huaire os cionn leibhéal na basal) (Fig. 5).

  

Fig. 5.

Mar thoradh ar uas-rialáil ghníomhaíocht Cdk5, laghdaítear fosfóireáil CREB ag Ser-133 i lucha le hinstealladh salanda nó cóicín. Ullmhaíodh sleachta striatal ó lucha fiáin (WT) agus ó lucha Tgp35 30 min tar éis an insteallta agus bhí siad faoi réir imdhíonachta ...

Cuireann fosfáitiú CREB ag Ser-133 lena ghníomhaíocht trascríofa trí eilimint freagartha CAMP i réigiún an tionscnóra géinte áirithe, lena n-áirítear an ghéin c-fos26). Mar sin scrúdaíomar ionduchtú c-fos i striatum an chineáil fhiáin agus i lucha Tgp35 tar éis instealladh cóicín. I lucha de chineál fiáin, mhéadaigh leibhéal c-fos mRNA go buaic-luach (1.8 fold 0.2-huaire os cionn leibhéal na basal) 30 min tar éis instealladh cóicín, agus ina dhiaidh sin tugtar ar ais é go dtí an leibhéal basal faoi 120 min tar éis an insteallta (Fig. 6 A agus B). Mar sin féin, bhí leibhéil c-fos mRNA ≈30% níos ísle i lucha Tgp35 ná i lucha de chineál fiáin go dtí an nóiméad 30 tar éis an insteallta (Fig. 6 A agus B). Comhthacaíodh a thuilleadh an t-ionduchtú níos lú ar c-fos i lucha Tgp35 le himdhíon-choinsicimic (Fig. 6 C-F). Mhéadaigh riarachán cóicín imdhíontachtúlacht c-fos, go mór i gcodanna droma-droma neamhghnácha an striatum agus go lag sna codanna cliathánacha, i lucha fiáin agus i lucha Tgp35. Mar sin féin, laghdaíodh go háirithe an méadú ar líon na gceall c-fos-imdhíon-imdhíonach sa stróimiam de lucha Tgp35 (Fig. 6G). Le chéile, léirigh na torthaí seo go raibh bac ar fheabhsúchán idirghabhála cóicín dopamine striatal a léiríonn an núicléas i lucha Tgp35, toradh dóchúil ar ghníomhaíocht mhéadaithe Cdk5.

  

Fig. 6.

Is é an toradh a bhíonn ar ghníomhaíocht Cdk5 a uas-rialáil ná léiriú cainteach a laghdú agus a ionduchtú níos lú i ndiaidh riarachán an chóicín. (A(B) Blot thuaidh a thaispeánann an cúrsa ama a bhaineann le hionduchtú c-fos i lucha de chineál fiáin (WT) agus Tgp35 (Tg) tar éis instealladh cóicín. ...

Plé

Aithníodh Cdk5 agus a ghníomhaire p35 mar sprioc-ghéinte a dhéantar a rialáil trí nochtadh ainsealach do chóicín (6). Tugaimid tuairisc anseo ar fhianaise gur tháinig laghdú ar chomharthaíocht dopamine cóicín-idirghabhála i néaróin striatal mar thoradh ar uas-rialáil Cdk5, mar thoradh ar uas-rialáil pxNUMX seachas C-Ctk35. Chun scrúdú a dhéanamh ar na hiarmhairtí a bhaineann leis an slonn-rialáilte de Cdk5 nó p35 ar chomharthaíocht dopamine striatal, rinneadh anailís ar dhá líne luiche trasghineacha, TgCdk5 agus lucha Tgp35. Fuaireamar amach go ndearnadh Cdk5 a uas-rialáil i gcomhréir le leibhéal méadaithe próitéine p35 ach nach raibh tionchar ag leibhéal méadaithe próitéine Cdk5 air. Léirigh ár dtuarascáil roimhe seo freisin go raibh gníomhaíocht Cdk5 in inchinn luch TgCdk5 níos ísle ná mar a bhí in inchinn luchóg de chineál fiáin nuair a rinneadh an ghníomhaíocht a thomhas trí úsáid a bhaint as Cdk5 immunoprecipitates (17), ag tabhairt le tuiscint go mbíonn leibhéal méadaithe de Cdk5 monaiméaróideach mar thoradh ar róshamhlú Cdk5 mura méadaítear leibhéal p35. Léirigh na torthaí seo gur fachtóir teorannaithe ráta do ghníomhaíocht Cdk35 é an leibhéal próitéine p5.

Thaispeáin lucha Tgp35 ionduchtú níos lú ar an bhfosfathúchán CREB agus c-fos sa striatum i ndiaidh instealladh géar cóicín, ag tabhairt le tuiscint gur chuir gníomhaíocht Cdk5 níos mó bac ar an bhfreagra strócach ar chóicín. Is dócha gur baineadh an tanúchán ar chomharthaíocht dopamine cóicín-idirghabhála i lucha Tgp35 trí chosc Cdk5 ar easghluaiseachtaí ilchomharthaíochta lena mbaineann DARPP-32, PKA, agus ERK. Mhéadaigh riarachán Cóicín phosphorylation PKA DARPP-32 ag Thr-34 i lucha de chineál fiáin, ach laghdaíodh an fhreagairt seo i lucha Tgp35. Tá sé léirithe go gcuireann fosphorylation PKA de DARPP-32 ag Thr-34 bac ar ghníomhaíocht 1 phosphatase próitéine (PP1), ar an einsím atá freagrach as dí-mhoirfealú Ser-133 de CREB (27). Dá bhrí sin, ní dhéanfar gníomhaíocht PP1 a ghéarú tríd an mbealach DARPP-32 / PP1 i lucha Tgp35.

Bhí gníomhachtú ERK1 / 2 a spreagann cóicín laghdaithe freisin i lucha Tgp35. Tá roinnt meicníochtaí ar leith ann trína bhféadfadh Cdk5 bac a chur ar ghníomhachtú ERK1 / 2 a spreagann cóicín. Ar an gcéad dul síos, d’fhéadfadh go mbeadh cosc ​​ar PKA i phosphorylation de DARPP-5 a bhfuil spleáchas aige ar Cdk32 ag Thr-75, rud a chuirfeadh cosc ​​ar ghníomhachtú MEK1 / 2 PKA-idirghabhála a theastaíonn le gníomhachtú ERK1 / 2. Tá staidéar le déanaí le fáil freisin go bhfuil gá le fosfathúchán DARPP-32 ag Thr-34 chun ERK1 / 2 a ghníomhachtú le cóicín trí ilchonairí lena mbaineann rialáil indíreach gníomhachtaithe MEK chomh maith le rialáil phosphatase saibhrithe striatal, tyrosine phosphatase a ghníomhaíonn go díreach ar ERK1 / 2 (28). Tá tacaíocht don fhéidearthacht seo molta ag an gcinneadh gur cuireadh deireadh le fosforylation MEK1 / 2 a spreagann cóicín ag Ser-217 agus Ser-221 i lucha Tgp35. Is cosán dóchúil eile é trí phosphorylation atá ag brath ar Cdk5 de MEK1 ag Thr-286, a mbeadh laghdú ar a ghníomhaíocht catalaíoch mar thoradh air agus a chuirfeadh cosc ​​ar ghníomhaíocht ERK1 / 2 (24).

Taispeánadh go gcuireann toirmeasc ar ghníomhaíocht Cdk5 san striatum éifeachtaí iompraíochta cóireáil ainsealach cóicín in ainmhithe i bhfeidhm (6). Ag teacht leis an hipitéis gur féidir le huasrialú ghníomhaíocht Cdk5 cur le hoiriúnú neuronal chun dul i ngleic le héifeachtaí riaracháin arís agus arís eile ar an gcóicín (6), chonaiceamar gur chuidigh fosforylation DARPP-5 agus MEK32 Cdk1 le maolú ERK1 / 2 ar ghníomhachtú a spreagann cóicín, rud a chiallaigh go raibh ionduchtú níos lú ar fhosfaicealú CREB agus c-fos sa striatum. Tacaíonn ár dtorthaí leis an smaoineamh go bhféadfadh athrú ar ghníomhaíocht Cdk5, mar thoradh ar uas-rialáil p35, léiriú géine a athrú sa striatum tar éis nochtadh ainsealach do chóicín. D'fhéadfadh sé seo tarlú trí athruithe i ngníomhaíochtaí na dtosca trascríobh amhail CREB agus c-fos. Dá bhrí sin, féadfaidh an p5 gníomhaire Cdk35, de bharr a éifeachtaí teorannaithe ráta ar ghníomhaíocht Cdk5, cur le hathruithe fadtréimhseacha i bhfeidhm néaróin atá mar bhunús ag andúil cóicín.

Admhálacha

nótaí

tagairtí