Cdk5 Phosphorylates Dopamine D2 Receiver agus Attenuates Downstream Comharthaíochta (2013)

Lua: Jeong J, Yu Y Park, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) Cdk5 Phosphorylates Dopamine D2 Glacadóir agus Attenuates Downsam Signaling. PLÓS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Eagarthóir: James Porter, Ollscoil Dakota Thuaidh, Stáit Aontaithe Mheiriceá

faighte: Bealtaine 20, 2013; Glactar leis: Samhain 14, 2013; Foilsithe: Nollaig 31, 2013

Cóipcheart: © 2013 Jeong et al. Is alt rochtana oscailte é seo a dháileadh faoi théarmaí an Ceadúnas Attribution Creative Commons, a cheadaíonn úsáid neamhshrianta, dáileadh, agus atáirgeadh in aon mheán, ar choinníoll go bhfuil an t-údar bunaidh agus an fhoinse creidiúnaithe.

Maoiniú: Thacaigh rialtas na Cóiré (MSIP) leis an obair seo ó dheontais (NRF-2012R1A2A2A01012923A2012A1R4A1028200A2012) agus tugadh tacaíocht dó freisin faoi chreat an chláir chomhair idirnáisiúnta arna bhainistiú ag NRF na Cóiré (2K1A2033117A2031) agus an Institiúid Taighde Brain Chóiré (KBRI) Clár Taighde Bunúsach MSIP (415-2004). Fuair ​​SKP Comhaontas Imscrúdaitheora Óga 2006 agus XNUMX um Thaighde ar Scitsifréine agus Storm (NARSAD). Ní raibh aon ról ag na maoinitheoirí i ndearadh staidéir, i mbailiú agus in anailísiú sonraí, i gcinneadh an lámhscríbhinn a fhoilsiú nó a ullmhú.

Leasanna iomaíochta: Dearbhaigh na húdair nach bhfuil aon leas iomaíochta ann.

Réamhrá

Tá comharthaí dopamine bainteach le feidhmeanna inchinn éagsúla lena n-áirítear comhordú mótair, rialú giúmar agus meicníochtaí luaíochta [1]. Is mórchuid de chomharthaí dopamine i veirteabraigh iad néaróin spíonacha mheánmhéide (MSNanna) a chuireann fo-thacar de ghabhdóirí dopamine in iúl go roghnach agus a fhaigheann ionchur dopaminergic den chuid is mó ón limistéar cothromaíochta ventral (VTA) agus ó subsia nigra (SN) [2]. Is iad gabhdóirí dopamine gabhdáin G-chúpláilte próitéine (GPCR) le seacht bhfearann ​​tras-chraicinn agus tá dhá fhochineál iontu, Gabhdóirí cosúil le D1 agus D2, a dhéanann idirghabháil ar ghníomhartha cómhalartacha i gcomharthaíocht dopamine [1]. Mar shampla, gníomhaíonn gabhdóirí dopamine D1-mhaith (D1, D5) adenylyl cyclase trí G_αs agus méadú a dhéanamh ar leibhéal intracellular cAMP, ach cuireann gabhdóirí dopamine D2-mhaith (D2, D3, D4) bac ar cháisc adenylyl trí G_αi agus laghdú a dhéanamh ar an leibhéal intracellular de CAMP [1], [3].

I measc gabhdóirí dopamine, tá gabhdóir D2 (DRD2) gafa le pataifiseolaíocht iolrach neamhoird shíciatracha mhóra lena n-áirítear scitsifréine agus andúil drugaí [4], mar sin go ndíríonn go leor drugaí frith-shíciatracha go páirteach ar DRD2 ar a laghad. Tá sé ar eolas freisin go bhfuil gníomhaíocht DRD2 comhoiriúnach go maith le hiarmhairtí iompraíochta drugaí mí-úsáide i samhlacha ainmhithe [5]. Tá éifeachtúlacht frithdhúlagráin agus éifeachtúlacht coimeádaithe giúmar nasctha freisin le hathruithe ar léiriú dhromchla cille DRD2 nó idirghabháil comharthaíochta intracellular le sruth ag PKA, ERK agus GSK3 [1], [4], [6]. In ainneoin na róil chriticiúla seo do DRD2 san inchinn, ní thuigtear go hiomlán na meicníochtaí rialála mionsonraithe a thugann ilchineálacht agus castacht do mhaoine DRD2.

Léirítear sna línte fianaise atá ag teacht le chéile go bhfuil baint ag ilmhodhnuithe post-aistrithe le mionchoigeartú ghníomhaíocht DRD2. Léiríodh glycosylation fairsing de DRD2 i staidéir lipéadaithe luathghrianghrafachta [7], agus aithníodh foirmiú na mbannaí díomá laistigh de DRD2 freisin mar mhodhnú tábhachtach do cheangal ceangailteach [8]. Ina theannta sin, aithníodh láithreáin phosphorylation DRD2 ar dtús in vitro measúnacht le rada-iseatóipí, ag soláthar bealaí do bhealaí rialála éagsúla arna idirghabháil ag cánainn éagsúla [9]. Go deimhin, rialaíonn kinase próitéine C (PKC) slógadh de chailciam intracellular in-idirghabhálach DRD2 agus modhnaíonn sé an idirghníomhaíocht idir DRD2 agus próitéiní cícocsaídeacha. [10]. Rialaíonn an fosfóirseacht ag GPCR kinase 2 (GRK2) patrúin athainmniúcháin ionduchtaithe DRD2 [11].

Is é atá i gceist le kinase atá ag brath ar chiclin 5 (Cdk5) ná serine / kinase treonine treoraithe a bhfuil gníomhaíocht fhabhrach aige mar gheall ar léiriú sonrach an inchinn ar a ghníomhaithe riachtanacha, p35 agus p39 [12]. Tá Cdk5 páirteach i bpróisis neuronal éagsúla lena n-áirítear imirce neuronal agus treoir aisne, agus taispeánann lucha Cdk5 agus p35 null lochtanna i sraitheadh ​​cortical [13]. Le déanaí, léiríodh go rialaíonn fosfathúchán WAVE1 agus ephexin le Cdk5 morphogenesis spine dendritic [14]. Ina theannta sin, rialaíonn Cdk5 leibhéil léirithe dromchla an ghabhdóra NMDA, NR2B, agus sruthanna NMDA NR2A-mediated [15], [16]. Is fiú a thabhairt faoi deara go dtugann roinnt píosaí fianaise le fios go bhfuil gaol pearsanta idir Cdk5 agus an córas dopamine. Déanann Cdk5 phosphorylates le hiodrocsalas tyrosine (TH), ag rialáil a chobhsaíochta, agus ag cothabháil homeostasis dopaminergic dá bhrí sin [17]. I néaróin postynaptic, nuair a dhéantar an phosphoprotein-75kD (DARPP-32) atá fosaithe ag T32 a phosphorylated ag Cdk5, is féidir leis bac a chur ar ghníomhaíocht PKA agus dopamine DRC1-idirghabhála PKA a chosc [18]. Is díol spéise é, nuair a dhéantar cóicín, agonist indíreach de ghabhdóirí dopamine, a riar go hainsealach i bhfrancaigh, mRNA agus leibhéil próitéine de mhéadú Cdk5 i néaróin spíonacha meánacha [19]. Dealraíonn sé go bhfuil baint ag Cdk5 le hoiriúnuithe synaptic a spreagtar drugaí. Sa staidéar seo, taispeánann muid idirghníomhaíocht feidhmeach DRD2 agus Cdk5 a leathnaíonn ról Cdk5 i gcomharthaíocht dopamine a thuilleadh.

Ábhair agus Modhanna

Antasubstaintí

Ardaíodh séirim fhrith-choinín in aghaidh peiptídí ina raibh X-ghalar fosfarach (pS321) den tríú lúb intracellular de DRD321 (D2i2). Baineadh úsáid as Phospho-peptide, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), chun colún peptide-comhchuingeach a dhéanamh le haghaidh íonú cleamhnais (3, PIERCE). Rinneadh antasubstaint frith-pS20401 a shaibhriú trí chóras íonaithe cleamhnaithe tar éis teagasc an déantóra. Stóráladh antashubstaint fosfa-íonaithe i PBS le hazón sóidiam XNUM% agus geilitín 321%. Baineadh úsáid as antasubstaint frith-Cdk0.1 frith-luiche (sc-0.1) agus antasubstaint frith-p5 frith-choinín (sc-249) le haghaidh blotáil an Iarthair agus imdhíteimiceimic Cdk35 / p820. Baineadh úsáid as antasubstaint frith-GFP frith-luiche (sc-5) le haghaidh an fholcadh imdhíonachta agus an Iarthair ag blocáil DRD35-GFP. Antashubstaint fhrith-ghréige frith-choinín (sc-9996), antashubstaint frith-HA frith-choinín (sc-2), antashubstaint frith-GST frith-luch (sc-807), agus antashubstaint frith-GAPDH frith-luch (sc- Ceannaíodh 805) ó Bhiteicneolaíochtaí Santa Cruz.

ainmhithe

Is bronntanas comhchineáil é an luch knockout p35 ón Dr. Katsuhiko Mikoshiba ag Institiúid Eolaíochta RIKEN Brain sa tSeapáin agus d'úsáid sí le haghaidh cultúr na néarón príomha. Ba iad na tacair phóstaeir le haghaidh géinitíopála ná 5′- GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5′-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC agus 5'- GCACGAGACTAGT TEAGMHÁLA mar a tuairiscíodh roimhe seo [20]. Baineadh úsáid as lucha ICR agus francaigh Sprague Dawley chun ullmhúchán a dhéanamh don inchinn. D'fhaomh an Coiste um Chúram agus Úsáid Ainmhithe Institiúideach Pohang University of Science agus Teicneolaíochta gach nós imeachta ainmhithe.

Foirgnimh Plasmid

Baineadh úsáid as an isporm DRD2 daonna fada i veicteoir plasmid EGFP-N1 agus an tríú lúb intracellular de DRD2 (iarmhair aimínaigéid aimín 212-373 lena n-áirítear iarmhair aimínaigéid aimín bhreise a bhaineann le DRD29 isoform fada) i veicteoir plasmid pFLAG-CMV-2. Cuireadh Cdk2 Daonna isteach i veicteoir plasmid pCMV-HA agus cuireadh p5 daonna isteach i veicteoir plasmid pcDNA 35. Cuireadh Cdk3.1 an Duine isteach faoi thionscnóir cytomegalovirus (CMV) mar aon le p5 daonna i veicteoir pcDNA 35 chun foirgníocht défhocail (Cdk3.1 / p5) a dhéanamh le haghaidh measúnachta imdhíonachta immunocytochemistry, [³⁵S] -GTP_γS measúnacht cheangailteach, measúnacht cheangailteach radaiteolaíoch agus imdhíonadh einsím CAMP.

I vitro Assas Kinase

IP-nasctha in vitro rinneadh measúnacht kinase mar seo a leanas. Bhí lysed amháin inchinn luch iomlán i maolán 3 m erythrocytes lysis (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) ag 20 de homogenizer Dounce chun lysates inchinn homogenized a fháil . Bhí na lysates ghoradh ar oighear le haghaidh 30 min, sonicated, agus lártheifneofar ag 16,000 × g le haghaidh 10 min. Rinneadh imdhíonadh ar na supernatants le frith-antashubstaint frith-p35 frith-choinín chun coimpléasc gníomhach Cdk5 / p35 a fháil. Cdk5 / p35 casta agus próitéin chomhleá íonaithe GST measctha le adenosine 5 '-triposphate, [γ-³²P] (NEG-502H, PerkinElmer) agus gortha i maolán kinase (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl₂, 0.2 mM DTT) le haghaidh 1 h ag teocht an tseomra [18], [21]. Baineadh úsáid as coimpléasc Cdk5 / p25 íonaithe (14-516, Millipore) freisin le haghaidh in vitro measúnacht kinase mar a thuairiscítear thuas. Cuireadh an maolán lódála samplach 2 leis an meascán imoibriúcháin agus rinneadh é a fhiuchadh ag 100 ° C. Ansin cuireadh SDS-PAGE faoi na samplaí agus rinne autoradiography an fhoirmiú triomaithe a mheas.

Crómatagrafaíocht Leachtacha (LC) - Anailís ar Speictriméadracht (MS) / MS

Rinneadh anailís ar an bpróitéin GST-D2i3 ath-chomhcheangailte le LC-MS / MS tar éis nasc IP- in vitro measúnacht a mhaolú. Rinneamar sainaithint peptide ar shonraí LC-MS / MS ag baint úsáide as X !! Tandem (leagan Nollaig-01-2008). Rinneadh gach comhad sonraí RAW a thiontú den chéad uair go mzXML ag baint úsáide as an bpíblíne tras-phróitéamaíoch (TPP; leagan 4.3). Scanadh scans MS / MS sna mzXML athchóirithe ansin i gcoinne bhunachar sonraí seicheamh próitéine luch UniProt (scaoileadh 2010_07) lena n-áirítear seicheamh GST-D2i3 ag baint úsáide as X !! Tandem. Cuireadh an lamháltas ar 3 Da le haghaidh iain réamhtheachtacha agus 2 Da le haghaidh iain bhréige. Baineadh úsáid as sainiúlacht einsím le haghaidh trypsin. Baineadh úsáid as roghanna um mhodhnú inathraithe chun carbón a chíoradh (57.021 Da), ocsaídiú meitiainín (15.995 Da), hidrealú asparagine (0.987 Da) agus fosfathúchán na serine (79.966 Da).

Imdhíonadh

Rinneadh imdhíonadh ar chillíní i maolán lysis ELB. Cuireadh antasubstaint Frith-GFP leis na líonta agus ghoradh é le haghaidh 3 h ag 4 ° C. Rinneadh imdhíonachta a íonú ag úsáid próitéin-A agarose. Rinneadh na deascáin a ghoradh le maolán lódála samplach SDS le haghaidh 30 min ag 37 ° C, agus bhí siad faoi réir SDS-PAGE agus blots an Iarthair.

Measúnacht GST Pull-down

Goir le 10 µg de GST íonaithe agus GST-D2i3 le inchinn francach a lusate do 1.5 h ag 4 ° C. 30 µL de glutathione (GSH) - Sepharose comhdhlúite Cuireadh coirníní 4B (17-0756-01, GE Healthcare) cothromaithe le maolán lysis agus a ghoradh le haghaidh 1 h breise. Bailíodh coirníní trí lártheifneoiriú ag 2,000 ×g agus sruthlú le maolán lysis amanna 4 [22], [23]. Rinneadh anailís ar an deascán ag blocáil an Iarthair ag baint úsáide as antasubstaintí frith-Cdk5 agus frith-p35.

Immunocytochemistry

Rinneadh cealla HEK 293 a aistríodh agus néaróin striachta saothraithe ar sceallóga a níadh uair amháin le salanda maolánaithe fosfáite (PBS) agus rinneadh iad a thumadh trí thumadh i bhfearann ​​paraformaldehyde 4 / PBS le haghaidh 30 min. Rinneadh antashubstaint phríomhúil a chaolú sa tuaslagán blocáilte (serum capall 2 agus 1% Triton X-100 i PBS). Úsáideadh antasubstaint frith-luiche Alexafluor-647 (A20990, Invitrogen) agus Alexafluor-568-frith-choinín (A11011, Invitrogen) mar antasubstaintí tánaisteacha. Baineadh úsáid as feisteas le haghaidh smálú núicléas. Fuarthas íomhánna trí mhicreascópacht confocal (Olympus, FluoView-1000).

Measúnacht Inmheánach Glacadóra

24 h tar éis an aistrithe, caitheadh ​​le cealla le 1 inM quinpirole (Q102, Sigma) le haghaidh 30 min agus min 90 ag 37 ° C. Cuireadh cealla ar fionraí i fuar PBS 2 agus baineadh úsáid as líontáin 200 µL do gach imoibriú. Rinneadh cóireálacha drugaí ag teocht an tseomra do 3 h ag na comhchruinnithe seo a leanas; 3 nM [³H] -spiperone (NET-565, PerkinElmer), 3 lpM sulfiride (895, TOCRIS), 10 µM ​​haloperidol (H1512, Sigma). Hidreafóbach [³H] -piperone baineadh úsáid as chun lipéad iomlán a chur ar ghabhdóirí sainráite agus baineadh úsáid as sulfirid hidreafhilic chun ionad an ghabhdáin ghabhálaigh [³H] - comharthaí spréite. Ríomhadh comharthaí gabhdóra a bhaineann leis na scannáin trí luachanna gabhdóra intrallular a dhealú ó na luachanna iomlána glacadóra sainráite. Rinneadh cealla a scagadh ar scagaire GF / B (Millipore) agus nite uaireanta 3 le maolán níocháin (50 m Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Rinneadh na scagairí a thriomú agus tomhaiseadh radaighníomhaíocht iarmharach ag baint úsáide as cuntar líonta leachtach [24].

Ullmhúchán Scannán Cell

Rinneadh cealla comhleá i miasa cultúir 100 mm tar éis a n-aistrithe a ní le PBS oighir-fhuar agus a lománaíodh i maolán 1 mL HME (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl₂, 1 mM EDTA). Rinneadh lártheifneachtaí homogenized a lártheifneáil le 500 × g le haghaidh 15 min agus ina dhiaidh sin rinneadh lártheifneoir ar na maoir le 36,000 × g le haghaidh 30 min. Baineadh úsáid as peileanna a cuireadh ar fionraí i maolán HME le haghaidh measúnachtaí.

[³⁵S] -GTP_γS Measúnacht Ceangailteach

Rinneadh codáin de chealla membrane a ghoradh roimh ré le quinpirole 1 µM ​​(Q102, Sigma) sa mhaolán measúnachta (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA agus 0.01 mM OTI) le haghaidh 10 min. [³⁵S] -GTP_γCuireadh S (NET-030H, PerkinElmer) leis an tiúchan deiridh de 3 nM i 30 µL agus gineadh níos mó é le haghaidh 90 min. 170 of de mhaolán fuar-oighir (XNUM mM Tris-HCl (pH 10), 8.0 mM NaCl, 100 mM MgCl₂agus cuireadh 0.1 mM GTP leis chun an t-imoibriú a stopadh. Rinneadh scagadh ar na seicní ar scagaire GF / B (Millipore) agus nite amanna 3 le maolán níocháin (50 m Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Rinneadh na scagairí a thriomú agus tomhaiseadh radaighníomhaíocht ag baint úsáide as an gcuntar scililínithe [25], [26].

Measúnacht Radaiteola agus Ceangailteach

Goir le seicní cille ullmhaithe le 0.01 nM [³H] -spiperone (NET-565, PerkinElmer) agus comhchruinnithe méadaithe quinpirole (Q102, Sigma) le haghaidh 30 min sa mhaolán measúnachta (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Rinneadh scagadh ar na seicní ar scagaire GF / B (Millipore) agus nite amanna 3 le maolán níocháin (50 m Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Cuireadh deireadh leis an imoibriú trí scagachán tapa trí scagairí GF / C. Rinneadh radaighníomhaíocht iarmharach a thomhas ag úsáid cuntair scintillation leachtach [27]-[29].

CAMP Einsím Immunoassay

Rinneadh cóireáil ar réamhchealla 293 HEK a aistríodh le 10 µM ​​rolipram (R6520, Sigma) le haghaidh 1 h, agus déileáladh leo le 0.1 µM ​​forskolin (F6886, Sigma) agus tiúchan méadaithe quinpirole (Q102, Sigma) le haghaidh 30 min. Déileáladh le néaróin stríocacha saothraithe phríomhúil le 10 µM ​​rolipram le haghaidh 1 h, agus ansin dopamine 1 µM ​​le haghaidh 1 h [22]. Ullmhaíodh líonta geille le leibhéil HCN agus HCAM 0.1 M aimsíodh iad le paca imdhíon-imdhíonachta cAMP (Eolaíocht na Sapphire) tar éis treoir an déantóra.

Neuron Bunscoile saothraithe

Bhí ceantar Striatal scoite amach ón inchinn suthach luch (E15). Díthiomsaíodh fíochán dáilte i meáin íosta riachtanacha (MEM) (11095, Invitrogen) ina raibh trypsin 0.25% (T4549-100, Sigma) agus 0.1% DNí mé as 6 min ag 37 ° C. Athchromadh ar chealla sna meáin plating (ME le 0.01 M HEPES (pH 7.4) agus 10% (vol / vol) capall capall (16050-122, GIBCO))). Saothraíodh néaróin do laethanta 7 in vitro (DIV 7) i MEM le forlíonadh B27 (17504-044, Invitrogen) sula gcuirtear i bhfeidhm é ar immunoassays einsímí cAMP.

Torthaí

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 sa Tríú Lúb Intracellular de DRD2 in vitro

Chun na foshraitheanna Cdk5 úrscéal a aithint, rinneamar cuardach córasach ag úsáid (S / T) PX (K / H / R) mar shraitheanna comhdhearcaidh aitheantais Cdk5 [30] agus aithníodh DRD2 mar fhoshraith iarrthóra. Tá an t-ord comhdhearcaidh, lena n-áirítear serine 321, suite i dtrí lúb intracellular DRD2 (D2i3) áit a raibh baint ag meicníochtaí rialála éagsúla [3], [10], [11]. Déantar an seicheamh a chaomhnú go héabhlóideach in DRD2 i veirteabraigh, rud a thugann le tuiscint go bhfuil tábhacht feidhmeach leis an iarmhar (Fíor 1A).

íoslódáil:   

• PPT

  Sleamhnán PowerPoint

• PNG

  íomhá níos mó (2.08MB)

• TIFF

  íomhá bhunaidh (4.36MB)

Fíor 1. Cdk5 fosforylates serine 321 sa tríú lúb intracellular de DRD2 in vitro.

(A) Ailíniú ord aimínaigéid a thaispeánann réigiúin chaomhnaithe den DRD2 ó speicis éagsúla (scáthaithe). Léirítear an suíomh poitéinsilíochta Cdk5 ionchasach le réiltín. (B) nasctha le IP in vitro kinase a mheas le próitéiní mutant GST-D2i3 agus GST-D2i3. Baineadh úsáid as Cdk5 / p35 coimpléasc saibhrithe ó shliocht inchinn na luch trí fhrith-imdhíonadh frith-p35 chun frithghníomhartha kinase a úsáid. Taispeántar autoradiograph próitéiní phosphorylated in éineacht le staining gorm iontach iontach Coomassie den ghlóthach chéanna. Léiríonn Arrowhead comhartha radaighníomhach a fhreagraíonn do GST-D2i3s agus léiríonn ceann saighead oscailte comharthaí radaighníomhacha ó p35. (C) Speictream MS / MS den bhloc peiptíde phosphorylated de D2i3. Taispeántar na patrúin ilroinnte teoiriciúla thíos an speictream. I measc na n-iarann ​​blúire go léir, tá na y-agus b-ian braite sa speictream. An y₆ agus y₇ léiríonn na hiain go láidir go bhfuil fosfar ag baint le serine 321. (D) In vitro kinase assay le coimpléasc íonaithe Cdk5 / GST-p25 ag baint úsáide as GST-D2i3 agus próitéiní mutant GST-D2i3. Taispeánadh próitéiní fosfaireataithe i ndatrafaif, mar aon le smálú gorm iontach Coomassie. Léiríonn Arrowhead comhartha radaighníomhach a fhreagraíonn do GST-D2i3 agus léiríonn saighead oscailte comharthaí radaighníomhacha ó GST-p25.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Chun measúnú a dhéanamh ar chumas Cdk5 chun fosfailearachas D2i3 a dhéanamh, rinneamar nasc IP- in vitro ksaase measúnachtaí ag baint úsáide as coimpléasc gníomhach Cdk5 / p35 atá saibhrithe ó inchinn luch trí imdhíonadh p35 le GST-D2i3 íonaithe íon (iarmhair aimínaigéid 212 – 373) mar na foshraitheanna. Chonaiceamar comharthaí próitéine maidir le próitéiní S2A GST-D3i2 íonaithe agus GST-D3i297, ach laghdaíodh an comhartha go mór ag úsáid GST-D2i3 S321A (Fíor 1B). Le tuilleadh a fhíorú go bhfuil an serine 321 le fáil sa GST-D2i3, rinneamar anailís LC-MS / MS ar na samplaí ó nasc IP-nasctha in vitro kinase measúnachtaí ag baint úsáide as mais-speictriméadracht LTQ XL. Go comhsheasmhach, rinneadh aisghabháil ar phospho-peiptídí a fhreagraíonn don mhais peiptídí fosfair-serine (Fíor 1C). De bhrí go bhfuil claonadh ag an éadáil ag brath ar shonraí le linn anailís LC-MS / MS próitéiní flúirseach sa sampla a bhrath [31], tugann na sonraí seo le fios gurb é iarmhar serine 321 an suíomh fosfaiceála ceannasach de chuid Cdk5 sa réigiún D2i3. A chruthú go bhfuil an fhréamhshrianadh díreach ar an bhfreastalaí sa GST-D321i2 ag Cdk3, in vitro kinase assay ag baint úsáide as casta íonaithe Cdk5 / GST-p25 le próitéiní íonaithe GST-D2i3 íonaithe. D'aithníomar comhartha mór fosfaictrithe sa GST-D2i3 a bhí as láthair sa GST-D2i3 S321A (Fíor 1D). Le chéile, léiríonn na torthaí seo gur sprioc fhabhrach é iarmhar D2i3 S321 do phosphorylation idirghabhála Cdk5.

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 sa Tríú Lúb Intracellular de DRD2 i gCill

Chun fosfóiríocht serine 321 a shainaithint, bhailíomar antasubstaint ar leith le haghaidh fosfar fosfa 321 (pS321). Samplaí ón nasc IP-nasctha in vitro Rinneadh anailís ar kinase le blocáil an Iarthair ag baint úsáide as antasubstaint frith-pS321. Thaispeáin blots banda ar leith san imoibriú kinase a bhí ag brath ar GST-D2i3 (Fíor 2A). Chun a fhíorú gur féidir le Cdk321 fosfarféarú serine 2 i DRD5 a fhíorú i gcealla, déanann frith-GFP imdhíonadh ó chealla HEK 293 ag léiriú DRD2-GFP agus DRD2 S321A-GFP le nó gan HA-Cdk5 agus rinneadh anailís ar p35 le blocáil an Iarthair ag úsáid frith-GFP agus antasubstaintí frith-pS321. Ní bhreathnaítear ach ar chomharthaí bannaí smeartha tréithrithe ag antasubstaint frith-GFP atá aitheanta mar gheall ar glycosylation iomarcach DRD2 ach i láthair DRD2-GFP, agus aimsíodh frith-pS321 antasubstaintí comharthaí DRD2 den chineál céanna ach le comh-léiriú Cdk5 / p35 (Fíor 2B) [7]. Chun tuilleadh a fhíorú go ndearnadh fosfóiriú serine 321 ag Cdk5, D2i3 (FLAG-D2i3) agus foirm shóiteáin D2i3 (FLAG-D2i3 S321A) a ghiniúint. Rinneadh anailís ar FLAG-D2i3 agus FLAG-D2i3 S321A le hais nó gan HA-Cdk5 agus p35 i gcillíní 293 HEK le measúnacht aistrithe gluaiseachta SDS-fhoirmiú. Breathnaíodh aistriú soghluaisteachta suntasach Cdk5 do FLAG-D2i3, ach ní le haghaidh FLAG-D2i3 S321A (Fíor 2C). Rinneamar measúnú freisin ar an leibhéal fosfaireachais de DRD2 ag Ser321 ar spreagadh agonist. Spreagadh quinpirole le cealla HEK 293 a chuireann casta casta DRD2-GFP agus Cdk5 / p35 in iúl, agus rinneadh anailís ar an imdhíonadh frith-GFP ón gcillín cromáin ag blocáil an Iarthair ag baint úsáide as antasubstaintí frith-GFP agus frith-pS321. Fuaireamar amach nár chuir spreagadh agonist isteach ar phosphorylation de DRD5 ag Ser2, a bhfuil idirghabháil déanta air, a bhfuil an chuma air go bhfuil sé difriúil le fosfaireachais GRK-agus PKC-idirghabhála (Fíor 2D) [32], [33]. Le chéile, léiríonn na torthaí seo gur féidir le Cdk5 iarmhar serine XDUMX de DRD321 a fholú sa timpeallacht cheallach.

íoslódáil:   

• PPT

  Sleamhnán PowerPoint

• PNG

  íomhá níos mó (1.92MB)

• TIFF

  íomhá bhunaidh (3.5MB)

Fíor 2. Cdk5 fosforylates serine 321 sa tríú lúb intracellular de DRD2 i gcealla.

Rinneadh anailís ar an bhfosfoirpiú ar an bhfreastalaí Cdk5-321 ag baint úsáide as antasubstaint frith-pS321. (A) Samplaí ó nasctha IP in vitro Rinneadh anailís ar kinase ag baint úsáide as próitéiní GST-D2i3 le blocáil an Iarthair (WB) le hantasubstaintí léirithe. Léiríonn na cromchlaí GST-D2i3s. (B) Cuireadh in iúl DRD2-GFP agus DRD2 S321A-GFP le HA-Cdk5 nó gan é a chur i gcealla HEK 35. Rinneadh anailís ar fhrith-imdhíonadh frith-GFP ag blocáil an Iarthair ag baint úsáide as antasubstaintí frith-GFP agus frith-pS293. Léiríonn an lúibín comharthaí DRD321 agus léiríonn an saighead oscailte go bhfuil comharthaí nonspecific ón imdhíon-fhrith-fhrith-GFP. Is é '% ionchuir'% toirte an lysate iomláin le haghaidh imoibriú IP. Léiríodh comharthaí soiléire Cdk2 lag le réiltíní. . Rinneadh anailís ar chillíní HEK 5 a aistríodh mar a tugadh le fios ag blotáil an Iarthair. (D) Rinneadh cóireáil ar chealla 293 HEK a aistríodh le quinpirole agus rinneadh anailís ar imdhíonta frith-GFP frith-GFP ag blocáil an Iarthair le hantasubstaintí frith-GFP agus frith-pS293. Taispeánann ceann saighead oscailte go bhfuil comharthaí nonspecific ó fhrith-imdhíonadh frith-GFP.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Tá Cdk5 / p35 Coimpléasc agus DRD2 bainteach go fisiciúil

Rinneamar imscrúdú ar an idirghníomhaíocht fhisiciúil fhéideartha idir an choimpléasc Cdk5 / p35 agus DRD2 mar is eol go bhfuil baint ag go leor foshraitheanna Cdk5 le coimpléasc Cdk5 / p35 [23], [34], [35]. Ar dtús, rinneadh an turgnamh tarraingthe anuas GST. Próiseáladh próitéin athantach GST-D2i3 íonaithe le lysate inchinne francach agus rinneadh anailís ar sceití tarraingthe anuas GST le haghaidh blotáil an Iarthair. Mar a thaispeántar i Fíor 3A, aithníodh Cdk5 agus p35 endogenous sa réamhshocruithe tarraingthe anuas, ag léiriú idirghníomhaíocht fhisiciúil idir DRD2 agus an coimpléasc Cdk5 / p35 (Fíor 3A). Thairis sin, braitheadh ​​HA-Cdk5 agus p35 sna himdhíontaí frith-GFP ó líonta cille HEK 293 ag léiriú DRD2-GFP agus Cdk5 / p35 (Fíor 3B). Ina theannta sin, rinneamar anailísí imdhíontaceiticeimiceacha agus bhreathnaíomar go dtaispeánann DRD2-GFP, HA-Cdk5 agus p35 comharthaí suntasacha comhlonnaithe ag an gceantar membranous de chealla HEK 293 (Fíor 3C, painéil uachtaracha). Rinneamar imscrúdú freisin ar chomh-logánú DRD2 agus Cdk5 / p35 sa chomhthéacs neuronal. Go comhsheasmhach, léirigh DRD2-GFP comh-logánú suntasach le Cdk5 agus p35 endogenous sa néaróin staratal saothraithe (DIV7), ag tacú le naisc fheidhmiúla idir DRD2 agus Cdk5 / p35 (Fíor 3C, painéil íochtair). Léiríonn na torthaí gur féidir le DRD2 agus Cdk5 / p35 a bheith mar choimpléasc agus, dá bhrí sin, tacú leis an smaoineamh gur foshraith fiseolaíoch de Cdk2 é DRD5.

íoslódáil:   

• PPT

  Sleamhnán PowerPoint

• PNG

  íomhá níos mó (3.91MB)

• TIFF

  íomhá bhunaidh (5.35MB)

Fíor 3. Is féidir le Cdk5 / p35 coimpléasc a dhéanamh le DRD2.

(A) Measúnacht tarraingthe anuas GST ag baint úsáide as próitéin athantach GST-D2i3 íonaithe le sliocht inchinn francach. Bhí anailísí blotála an Iarthair faoi réir sceitheanna tarraingthe anuas GST. Léiríonn 'bead' an deascán tarraingthe anuas gan próitéiní GST. (B) Imdhíonadh DRD2 agus coimpléasc Cdk5 / p35. Rinneadh anailís blotála an Iarthair ar IP Frith-GFP ó lísí ó chealla a aistríodh. Léiríonn an lúibín comharthaí DRD2 agus léiríonn an saighead oscailte go bhfuil comharthaí nonspecific ón imdhíon-fhrith-fhrith-GFP. Taispeántar blot ró-dhaite le haghaidh ionchur ar dheis freisin. (C) Anailísí imdhíceimiceimiceacha ar DRD2 agus Cdk5 / p35. Daingníodh cealla frith-Cdk293 agus frith-p2 (painéil uachtaracha) le cealla HEK 5 a chuir DRD35-GFP agus Cdk5 / p35 in iúl. Cuireadh DRD2-GFP in iúl ina aonar sna néaróin striactacha saothraithe agus cuireadh antasubstaintí frith-Cdk5 agus frith-p35 daite orthu (painéil íochtaracha). Baineadh úsáid as feisteas le haghaidh smálú núicléas. Is é an barra scála 5 µm. Fuarthas gach íomhá ag úsáid micreascópachta confocal (Olympus, FluoView-1000).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Fosfathúchán Cdk5-idirghabhála de Ghníomhaíocht Gabhdóra Leanúnach DRD2

Tuairiscíodh go modhnaíonn phosphorylation airíonna criticiúla GPCRs amhail cúpláil próitéine G, inmheánú gabhdóra, logánú intracellular, agus comhcheangal le próitéiní modhnaithe [9], [11], [24]. AIs próiseas rialaitheach criticiúil é an t-ionchódú gabhdóra gonist-ionduchtaithe maidir le haistriú comhartha. Scrúdaíomar modhnú inmheánachú DRD5 ar Cdk2. Cuireadh cillíní 293 HEK a chuir DRD2-GFP agus DRD2 S321A-GFP in iúl le Cdk5 / p35 le nó gan Cdk1 / p2 le hinmheánú DRDXNUMX a spreag an t-agonóir (Fíor 4A). [³H] - laghdaíodh comharthaí spraeóin de chealla DRD2-GFP a bhí á gcur in iúl go suntasach ag cóireáil quinpirole 30 min agus aisghafa iad ag 90 min. Suimiúil, [³H] - laghdaíodh comharthaí spraeóin de DRD2-GFP agus Cdk5 / p35 cealla a chur in iúl freisin ag cóireáil quinpirole min 30 ach níor aisghabhadh iad ag 90 min (Fíor 4A, an dara cuid). Ar an lámh eile, [³H] - laghdaíodh comharthaí-spiperone de DRD2 S321A-GFP cealla ag 30 min agus aisghabhadh iad ag 90 min, beag beann ar an gcomhléiriú le Cdk5 / p35. Léirigh staidéir roimhe seo go ndéanann an DRD2 inmheánaithe athchúrsáil ar ais go dtí an scannán plasma nuair a spreagtar agonist fada é. [11]. Tis dealraitheach go bhfuil baint ag phosphorylation CDk5-idirghabhála DRD2 leis na próisis ath-íograithe tar éis inmheánaithe DRD2 a spreagann agonist.

íoslódáil:   

• PPT

  Sleamhnán PowerPoint

• PNG

  íomhá níos mó (387KB)

• TIFF

  íomhá bhunaidh (1.31MB)

Fíor 4. Cdk5 phosphorylation attenuates léiriú dromchla DRD2 agus comharthaíocht le sruth.

(A) slonn dromchla DRD2 á thomhas ag [³H] measúnacht cheangailteach -spiperone. Spreagadh cealla HEK293 a aistríodh le quinpirole 1 µM ​​don am sonraithe agus lománaíodh iad, agus 3 nM ina dhiaidh sin [³H] -chóireáil spiperoneone ar feadh 3 h. Tomhaiseadh radaighníomhaíocht agus ríomhadh comharthaí dromchla. Is ionann barraí earráide agus meán ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; ANOVA aon-bhealach le tástáil post hoc Dunnett: déan comparáid idir na colúin uile vs an colún rialaithe). (B) [³⁵S] -GTP_γS measúnú ceangailteach. Ullmhaíodh seicní cealla ó na cealla a aistríodh mar a léiríodh. Rinneadh ullmhóidí scannán a ghoradh le quinpirole 1 M agus 3 nM ina dhiaidh sin [³⁵S] -GTP_γS ar feadh 90 nóiméad. Is ionann barraí earráide agus meán ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; ANOVA aon-bhealach le tástáil post hoc Bonferroni: déan comparáid idir gach péire colún). (C) Quinpirole-iomaíoch [³H] measúnacht cheangailteach -spiperone. Rinneadh ullmhóidí scannán ó chealla a aistríodh a ghoradh le 0.01 nM [³H] -spiperone agus tiúchan méadaithe quinpirole ar feadh 30 nóiméad. Fuair ​​GraphPad aischéimniú neamhlíneach. Léiríonn barraí earráide meán ± SE (n = 3). (D) immunoassays einsím cAMP i gcealla HEK 293 a aistríodh. Bhí cealla aistrithe réamhtheáite le rolipram 10 µM ar feadh 1 h, agus rinneadh comhchóireáil orthu ina dhiaidh sin le forskolin 0.1 µM agus tiúchan méadaithe quinpirole ar feadh 30 nóiméad. Fuair ​​GraphPad aischéimniú neamhlíneach. Is ionann barraí earráide agus meán ± SE (n = 4; ** p <0.01; dhá earball t-tests). (E) Déileáladh le néaróin staratal saothraithe ó chineálacha fiáine agus suthanna p35 (DIV 7) le 10 µM ​​rolipram le haghaidh 1 h agus ina dhiaidh sin dopamine 1 µM ​​do 1 h. Is ionann barraí earráide agus meán ± SE (n = 4; **p<0.01; dhá earball t-tests).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Rinneamar meastóireacht bhreise ar athrú féideartha cúplála próitéine G agonist-spreagtha go DRD2 a bhaineann le fosfaireachas Cdk5-idirghabhála ag baint úsáide as [³⁵S] -GTP_γS measúnú ceangailteach [25], [26]. Cuireadh DRD2-GFP agus DRD2 S321A-GFP le nó gan Cdk5 / p35 in iúl i gcealla HEK 293. Ullmhaíodh agus spreag na seicní le cuispirole 1 µM ​​agus ceadaíodh iad [³⁵S] -GTP_γIonchorprú. Léirigh DRD2-GFP agus Cdk5 / p35 cilleamhar in iúl go raibh lagú suntasach air [³⁵S] -GTP_γS ceangailteach i gcomparáid leis na seicní cealla eile go léir (Fíor 4B). Tugann na torthaí seo le fios go rialaíonn an phosphorylation Cdk5-idirghabhála síos próitéin g próitéin-spreagtha ag ag DRD2.

Ina theannta sin, iompaíonn cuispirole [³Rinneadh measúnachtaí ceangailteacha H] -spiperone chun imscrúdú a dhéanamh ar aon athrú féideartha ar ghaolmhaireacht ag DRD2 ag phosphorylation idirghabhála Cdk5. Iomaíoch ceangailteach de [³Tomhaiseadh H]-spréach nuair a caitheadh ​​le comhchruinnithe méadaithe cuppóil sa ullmhúchán membrane ó aistríodh é. Iomaíoch ceangailteach de quinpirole agus [³H] -spiperone a rinneadh logáil den chineál céanna ag DRD2-GFP agus DRD2 S321A-GFP_i luachanna (−9.789 le haghaidh DRD2-GFP; −9.691 le haghaidh DRD2 S321A-GFP), ag tabhairt le fios nach bhfuil tionchar mór ag fosfaireachas Cdk2 ag DRD5 ar ghaol ligand le DRD2Fíor 4C).

Rialaíonn an Phosphorylation Down Down-Cdk5 an Bealach Comharthaíochta DRD2

Ina dhiaidh sin, rinneamar imscrúdú ar an tionchar a bhíonn ag modhnú DRD2 ag Cdk5 ar chonairí comharthaíochta le sruth. Rinne muid monatóireacht ar chosc DRD2 ar tháirgeadh cAMP forskolin-spreagtha ag adenylyl cyclase sna cealla a chuir DRD2-GFP agus DRD2 S321A-GFP in iúl ag baint úsáide as imdhíonadh einsímí cAMP. Léirigh cealla a chuir an DRD2 in iúl gur laghdaíodh leibhéil CAMP mar fhreagra ar quinpirole ar bhealach a bhí ag brath ar dháileog. Thar cuimse, laghdaigh comhléiriú Cdk5 / p35 an toirmeasc uasta ar fhoirmiú cAMP (Fíor. 4D, an painéal ar chlé). Ar an taobh eile, sa chealla DRD2 S321A-GFP a chuireann in iúl, cuireadh bac go héifeachtach ar na foirmíochtaí cAMP mar gheall ar chóireáil quinpirole beag beann ar an abairt Cdk5 / p35 (Fíor. 4D, painéal ceart). Tugann na torthaí seo le fios go maolaíonn fosfathúchán de chuid DRC5 Cdk2 gníomhaíocht coisctheach DRD2 ar an gcosán comharthaíochta CFP iartheachtach. Chun na feiniméin a dhaingniú tuilleadh i suíomh atá níos ábhartha ó thaobh fiseolaíocha de, rinneamar úsáid as néaróin saothraithe phríomhúil ó suthanna a cuireadh as a chéile a bhí easnamhach i p35, gníomhaire riachtanach Cdk5. Déileáladh le néaróin stiatal saothraithe phríomhúil le dopamine 1 µM ​​agus rinneadh anailís orthu trí imdhíonadh einsímí cAMP. Thaispeáin néaróin ó lucha cnagála p35 leibhéil laghdaithe CAMP i gcomparáid le néaróin de chineál fiáin nuair a spreagtar iad le dopamine (Fíor 4E). Tle chéile, tháinig muid ar an gconclúid go bhfuil laghdú ar an ton coisctheach ar an gcosán cAMP a fheidhmíonn DRD5 mar thoradh ar phosphorylation DRD2 Cdk2.

Plé

D'aithníomar DRD2 mar fhoshraith nua de Cdk5. Is cosúil go laghdaíonn an fosfathú an léiriú dromchla DRD2 trí dhul i bhfeidhm ar an gcinniúint atá ag DRD2 tar éis an inmheánaitheora gabhdóra, rud a laghdaíonn DRD2 G_i-comhréiteach agus cosán cAMP iartheachtach. Ós rud é go bhfuil an t-iarmhar fosfarach S321 ann i DRD2 iseafraí fada agus gearra, d'fhéadfadh an mheicníocht atá molta sa staidéar seo a bheith ina mhodh rialála ginearálta i gcomharthaíocht DRD2-idirghabhála.

Ní hamháin gur measadh go raibh DRD2 i néaróin spíonacha mheánmhéide mar fhochineál gabhdóra dopamine mór ach aithníodh é freisin mar gheall ar a bheith so-ghabhálach maidir le hathruithe in infhaighteacht mar fhreagairt ar spreagthaí comhshaoil. Rinneadh staidéar fairsing ar dhí-íogrú agus ar athshamhlú agonist de DRD2 [11], [24]. Go háirithe, tá sé léirithe ag roinnt staidéar go bhfuil athruithe dinimiciúla de DRD2 ag gabháil le héifeachtaí na risíochta síceasaíontóra ainsealaí, amhail cóicín agus amfataimín, a ardaíonn leibhéal ellólach dopamine sa sionapse striatal [36]. Go deimhin, is eol go bhfuil leibhéil DRD2 laghdaithe ag úsáideoirí ainsealacha an chóicín sa limistéar striatal, agus taispeánann infhaighteacht DRD2 comhghaol diúltach leis na hiompraíochtaí a lorgaíonn drugaí agus a threisítear i lucha agus príomhaigh [37]-[39]. Léiríonn na torthaí seo go bhfuil feidhmiúlacht DRD2 an-so-ghabhálach do rialachán oiriúnaitheach nó cúiteach mar fhreagra ar spreagthaí éagsúla lena n-áirítear nochtadh drugaí ainsealach. Taispeánann ár dtorthaí gur féidir le Cdk321 an t-iarmhar S2 sa tríú lúb intracellular de DRD5 a phosphorylated, rud as a dtagann laghdú ar thionchar coisctheach DRD2 ar chonair an CAMP. Molann an idirghníomhaíocht seo meicníocht rialála nua a bhaineann le Cdk5 i néaróin dopaminoceptive a d'fhéadfadh a bheith nasctha le nádúr dinimiciúil infhaighteacht dhromchla DRD2.

Ba chóir a thabhairt faoi deara go bhfuil sé ar eolas go bhfuil Cdk5 mar phríomhghné chun athruithe oiriúnaitheacha ar an timpeallacht neuronal a idirghabháil. Mar shampla, tá athruithe struchtúracha agus feidhmiúla ar spíonta díbhríochacha i néaróin an chiorcaid limbic ar cheann de na hiarmhairtí a bhaineann le nochtadh síceaspaitheach arís agus arís eile [40]. In éineacht leis na hathruithe seo tá athruithe móilíneacha éagsúla, lena n-áirítear próitéin ceangailteach eilimint freagartha CAMP (CREB) agus ΔFosB, tosca trascríobh a thaispeánann uas-rialachán seasmhach mar fhreagra ar riarachán ainsealach cóicín [41], [42]. Rud tábhachtach, is sprioc de ,FosB é Cdk5 [19], agus tuairiscíodh go raibh go leor comhpháirteanna criticiúla a bhfuil baint acu le dinimic spine dendritic, ar nós PSD-95, kinase pxNUMX-gníomhachtaithe (PAK), β-catenin, agus spinophilin, mar fhoshraitheanna Cdk21 [43]-[46]. Faightear athruithe ar mhoirfeolaíocht spine dendritic agus ar fhreagairtí iompraíochta ar chóicín trí ionramhálacha comhsheasmhacha, géiniteacha nó cógaseolaíocha ar ghníomhaíocht Cdk5, rud a thugann le tuiscint róil chriticiúla do Cdk5 sna hathruithe móilíneacha agus moirfeolaíocha ar chiorcaid dopamine mesolimbic [47], [48]. Soláthraíonn ár dtorthaí a léiríonn go bhfuil DRD2 ina sprioc núíosach de Cdk5 léargas breise ar na hathruithe oiriúnaitheacha ar an gcóras dopamine mar fhreagra ar neamhchosaintí ainsealacha drugaí mar gheall ar an uasrialú tedFosB-idirghabháil Cdk5 ina dhiaidh sin d'fhéadfadh méadú tonach a bheith i fosfathú DRD2 . Thairis sin, is eol go n-imríonn DRD2 isteach ar phróisis cheallacha iomadúla, lena n-áirítear conairí cAMP agus MAP a rialáil agus imeachtaí trascríobh foghabhálacha [42], [49]. Dá bhrí sin, ní amháin go léireodh na torthaí sa staidéar seo rialachán díreach DRD2 le Cdk5 ach go gcuirfidís léargas nua ar fáil maidir le freagairtí oiriúnaitheacha an chórais dopamine go nochtadh ainsealach drugaí.

Ranníocaí Údar

Ceapadh agus ceapadh na turgnaimh: JJ YUP DH SKP. Léirigh na turgnaimh: JJ YUP DKK YK. Anailís déanta ar na sonraí: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Imoibrithe / ábhair / uirlisí anailíse curtha le chéile: YHS. Scríobh an páipéar: JJ SKP.