PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
Abstracto
As alteracións inducidas pola cocaína na expresión xénica provocan cambios na morfoloxía neuronal e no comportamento que poden ser a base da adicción á cocaína. Identificamos un papel esencial para a dimetilación da histona 3 lisina 9 (H3K9) e a lisina dimetiltransferase G9a na plasticidade estrutural e comportamental inducida pola cocaína. A administración repetida de cocaína reduciu os niveis globais de dimetilación de H3K9 no núcleo accumbens. Ta súa redución na metilación de histonas foi mediada pola represión de G9a nesta rexión do cerebro, que estaba regulada polo factor de transcrición BFosB inducido pola cocaína. Empregando a mutagênese condicional ea transferencia de xenes mediada por viral, descubrimos que a desregulación de G9a aumentaba a plasticidade da columna dendrítica do núcleo e aumentaba a preferencia pola cocaína, establecendo así un papel crucial na metilación das histonas nas accións a longo prazo da cocaína.
introdución
A exposición repetida á cocaína caracterízase por cambios persistentes na expresión xénica e alteración da morfoloxía neuronal no núcleo accumbens (NAc), un compoñente clave dos circuítos de recompensa do cerebro (1-2). A remodelación da cromatina é importante nos cambios de transcrición aberentes nesta rexión do cerebro que poden estar subxacentes a aspectos da adicción á cocaína (3-9). A regulación da cocaína na estrutura da cromatina no NAc resulta, en parte, en modificacións directas inducidas por cocaína na maquinaria enzimática da cromatina, o que orixina cambios na acetilación e fosforilación de histonas (4, 7-9); non obstante, aínda non se investigou o papel dos encimas que controlan a metilación das histonas.
Unha recente análise do promotor a todo o xenoma usando inmunoprecipitación de cromatina unida a microarrays (ChIP-Chip) identificou patróns alterados de histona represiva H3 lisina 9 (H3K9) e 27 (H3K27) metilación en promotores de xenes específicos no NAc tras o tratamento repetido de cocaína6). Por iso, perfilamos numerosas lisina metiltransferases (KMTs) e demetilases (KDMs) que se sabe que controlan H3K9 ou H3K27 metilación (Fig. 1A). Só dúas encimas, G9a e GLP, mostraron unha regulación transcripcional persistente horas 24 despois da administración repetida de cocaína, cando a expresión de ambos xenes foi significativamente regulada. Debido a que G9a e GLP catalizan especificamente a dimetilación de H3K9 (H3K9me2), a súa regulación por cocaína é consistente coa diminución dos niveis globais de eucromática H3K9me2 neste momento (Fig. 1B). En contraste, os niveis globais de metilación heterocromática de H3K27 permaneceron inalterados pola exposición repetida á cocaína.Fig. S1 no soporte de material en liña). Debido aos seus altos niveis de actividade catalítica in vitro in vivo (10), estudamos a importancia funcional da represión de G9a tras a exposición repetida á cocaína no NAc. Os niveis de proteína G9a, como os niveis do seu ARNm, reducíronse significativamente as horas 24 despois da administración repetida de cocaína.Fig. S2). Aínda que a expresión do ARNm de G9a foi reducida por 35% no NAc, a análise inmunohistoquímica revelou unha redución 15% máis modesta nos niveis de proteína G9a, consistente coa diminución observada de 21% en H3K9me2 despois da administración repetida de cocaína.Fig. 1B). A expresión do ARNm de G9a tamén foi regulada por baixo desta rexión cerebral por 20% tras a autoadministración repetida de cocaínaFig. S3).
Para identificar se os cambios no eucromático H3K9me2 se correlacionan con alteracións do xenoma na expresión xénica no NAc, empregamos análises de microarrays para examinar perfís de expresión xénica inducidos por unha dose de cocaína en animais con ou sen antecedentes de exposición previa á cocaína. listas de xenes en Táboas S1 – S3). Os animais que recibiron cocaína repetida mostraron un aumento drástico da expresión xénica 1 horas despois dun desafío de cocaína en comparación con animais tratados agudamente (Fig. 1C). Este aumento da expresión xénica aínda ocorreu en resposta a un desafío de cocaína dado despois da semana 1 de retirada de cocaína repetida. De acordo cos informes anteriores, unha pequena porcentaxe de xenes (~ 10%) mostrou respostas transcricionais desensibilizadas despois da administración repetida de cocaína (Fig. 1C; Ver Táboa S1) (5). Para investigar directamente o papel da desregulación de G9a na expresión xenética mellorada observada despois de repetida cocaína, os ratos recibiron inxeccións intra-NAc de vectores de virus Herpes simplex (HSV) que expresan GFP ou G9a e foron tratados con salina ou cocaína repetida para determinar se a sobreexpresión de G9a foi suficiente para bloquear a repetida mellora inducida pola cocaína na expresión xénica. Dende un conxunto de xenes seleccionados aleatoriamente de 12 que mostran niveis de expresión elevados tras a cocaína repetida, observamos que G9a reduciu significativamente a expresión mellorada de 50% destes xenes (Táboa S4).
Para identificar eventos transcricionais ascendentes que median a represión repetida da expresión de G9a inducida pola cocaína, investigamos un posible papel para ΔFosB, un produto de empalme altamente estable do xene inmediato inmediato fosB. ΔFosB acumúlase na NAc tras unha exposición repetida á cocaína, onde se relacionou cun aumento da recompensa de cocaína (11). ΔFosB pode actuar como activador ou represor transcripcional dependendo do xene diana implicado (3, 5, 6, 12). Usando NSE bitransxénicotTA × tetOP-ΔFosB ratos, onde a expresión ΔFosB pode ser inducida selectivamente no NAc e no estriado dorsal de animais adultos (13), examinamos o impacto da expresión BFosB na regulación da cocaína de H3K9me2 e KMT no NAc. A sobreexpresión de FosB foi suficiente para reducir os niveis de ambos H3K9me2 (Fig. 1D) e expresión G9a (Fig. 1E), imitando así os efectos da cocaína repetida. En contraste, ΔFosB non reduciu a expresión de GLP nesta rexión cerebral e non tivo ningún efecto sobre SUV39H1 e EZH2, os principais encimas trimetilantes para H3K9 e H3K27, respectivamente (Fig. S4). Para confirmar estes datos usando un sistema de sobreexpresión ΔFosB independente, ratos adultos de tipo salvaxe recibiron inxeccións intra-NAc bilaterales de vectores de virus asociados ao adeno (AAV) que expresan GFP ou ΔFosB. A sobreexpresión mediada por viral de ΔFosB diminuíu os niveis de expresión de G9a nesta rexión cerebral (Fig. 1E).
Esta regulación específica e pronunciada de G9a levounos a investigar se a alteración da expresión de G9a específicamente nas neuronas NAc regula as respostas do comportamento á cocaína. Os ratos de tipo salvaxe recibiron inxeccións intra-NAc de vectores HSV que expresan GFP ou G9a e entón analizáronse usando un paradigma de preferencia de lugar sen discriminación de cocaína, que proporciona unha medida indirecta da recompensa de drogas. A sobreexpresión viral de G9a nas neuronas NAc confirmouse despois de probas de comportamento (Fig. 2A). A sobreexpresión de G9a diminuíu significativamente a preferencia pola cocaína en comparación cos animais que sobreexpresan a GFP (Fig. 2B), e aumentaron os niveis de H3K9me2 no NAc (Fig. 2C). Sobreexpresión dun mutante catalíticamente morto de G9a (G9aH1093K) (14) non afectou a preferencia de cocaína (Fig. 2B) e non tivo ningún efecto sobre os niveis de H3K9me2 nesta rexión cerebral (Fig. 2C).
Para estudar máis detidamente o papel de G9a nos efectos comportamentais da cocaína, e máis específicamente imitar a repetida represión inducida pola cocaína na expresión de G9a no GNA, adulto G9afl / fl ratos (14) recibiron inxeccións intra-NAc de vectores AAV que expresan Cre recombinasa ou GFP como control. Caída de AAV-Cre de G9a no NAc, que foi confirmada inmunohistoquímicamente (Fig. S5), aumentou significativamente os efectos dos experimentos de cocaína no lugar e diminuíu os niveis de H3K9me2 no NAc (Fig. 2D, E). Un inhibidor farmacolóxico dispoñible comercialmente de G9a e GLP, BIX01294 (15-16), usouse para determinar se a inhibición enzimática afecta de xeito similar ás respostas comportamentais á cocaína. De feito, a inhibición farmacolóxica de G9a e GLP aumentou significativamente a cocaína e diminuíu H3K9me2 no NAc (Fig. 2F, G).
A repetida administración de cocaína aumenta a densidade de espiñas dendríticas nas neuronas espiñas medias de NAc17), un proceso asociado con cambios funcionais nas sinapses glutamatérxicas excitatorias sobre estas neuronas (18-19) e respostas comportamentais sensibilizadas á droga17, 20). Así pois, fixo a hipótese de que a baixa regulación da actividade de G9a no NAc por cocaína repetida podería mediar a capacidade da cocaína de regular a densidade da columna dendrítica das neuronas NAc. Empregando a inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) cun anticorpo anti-G9a, identificamos varios supostos xenes de xenes de G9a no NAc, cada un deles implicado previamente na plasticidade dendrítica inducida por cocaína.Fig. 3A) (20-26). Descubrimos que a administración repetida de cocaína diminuíu significativamente a unión de G9a, así como os niveis de H3K9me2, nestes promotores de xenes (Fig. 3B). En contraste, a administración aguda de cocaína recrutou rápidamente G9a a algúns destes mesmos promotores xenéticos, de acordo co aumento da expresión de G9a observada na NAc 1 hora despois dunha dose aguda de cocaínaFig. S6). Aínda que a unión de G9a a promotores de xenes específicos correlaciona cos cambios na súa expresión, non está claro se tales eventos están mediados por niveis globais alterados de G9a no NAc e / ou por diferenzas no recrutamento de G9a despois de agudos vs administración repetida de cocaína.
Baseado na regulación de numerosos xenes relacionados coa plasticidade de G9a no NAc, analizamos directamente se o mantemento da expresión de G9a nesta rexión cerebral tras o tratamento repetido de cocaína era suficiente para bloquear a formación de columna dendrítica inducida pola cocaína. Usando un protocolo de tratamento de cocaína previamente demostrado para promover a inducción da columna dendrítica no NAc20), examinamos a densidade da columna vertebral en animais inxectados con HSV-GFP ou HSV-G9a. De acordo coas conclusións anteriores, observamos un aumento significativo da densidade da columna dendrítica no NAc tras o tratamento con cocaína, un efecto que foi bloqueado completamente pola sobreexpresión de G9a (Fig. 3C). A sobreexpresión de G9a só non foi suficiente para diminuír a densidade da columna vertebral dendrítica NAc en ausencia de cocaína. Para complementar estes datos, G9afl / fl Os ratos recibiron inxeccións intra-NAc de HSV-Cre e a densidade da columna se cuantificaron e comparáronse cos animais que recibían VHS-GFP en ausencia de cocaína. A eliminación da expresión de G9a aumentou significativamente a densidade da columna vertebral nas neuronas espiñas medias de NAcFig. 3C).
Dada a evidencia de que a desregulación de G9a no NAc tras a cocaína repetida é mediada por ΔFosB, examinamos a continuación si este factor de transcrición tamén está implicado na regulación das espiñas dendríticas NAc. Aínda que ΔFosB non se relacionou previamente causalmente con esa plasticidade dendrítica, varios dos seus obxectivos, incluíndo as subunidades Cdk5 e NFκB, foron tan implicados (20-23), ea expresión persistente de'sFosB nas neuronas NAc correlaciona coa densidade dendrítica aumentada despois do tratamento repetido de cocaína (27). En primeiro lugar, descubrimos que a inducción de ΔFosB en ratos bitransxénicos en ausencia de cocaína, que regulou a expresión G9a e H3K9me2 (Fig. 1D, E), reduciu a unión de G9a a numerosos xenes relacionados coa plasticidade, moitos dos cales tamén se mostraron como obxectivos directos da propia BFosBFig. 3D) (3, 6). A continuación mostramos que a sobreexpresión viral de ΔFosB no NAc aumentou significativamente a densidade da columna vertebral dendrítica en condicións basais, semellante ao observado despois da administración repetida de cocaínaFig. 3E). Por outra banda, a sobreexpresión na NAc de ΔJunD, unha proteína mutante negativa dominante que antagoniza a actividade transcricional ΔFosB, bloqueou a capacidade de cocaína repetida para aumentar a formación de espina dendrítica no NAc (Fig. 3C).
A nosa observación de que BFosB regula a expresión de G9a no NAc, e que ΔFosB e G9a regulan algúns dos mesmos xenes obxectivos, levounos a examinar outras interaccións entre ΔFosB e G9a. Tras a cocaína aguda, cando se incrementaron os niveis de G9a, a unión de G9a á fosB o xene aumentou, mentres que despois de repetida cocaína, cando a expresión de G9a foi suprimida, a unión de G9a ao fosB diminuíu o xeneFig. 3A). Esta diminución da unión de G9a despois de que a cocaína repetida non se observase c-fos, onde a unión de G9a aumenta mediante cocaína repetida (Fig. S7). Isto é consistente co feito de que, a diferenza de fosB, c-fos está reprimido, non inducido, por exposición psicostimulante crónica (5). A sobreexpresión fosos en ratones bitransxénicos foi suficiente para diminuír significativamente a unión de G9a coa fosb xene (Fig. 3D). Ademais, a sobreexpresión de G9a foi suficiente para reducir o aumento da expresión de ΔFosB despois da administración repetida de cocaína (Táboa S4). Estes datos suxiren un bucle autoregulatorio polo que G9a limita inicialmente a indución de ΔFosB pola administración aguda de cocaína. Non obstante, a medida que ΔFosB acumúlase con exposición á droga repetida, reprime G9a e potencia así a súa propia indución.
En conclusión, demostramos que a metilación da histona lisina no NAc está implicada de xeito crítico na regulación da expresión xénica neuronal como resposta á cocaína. A represión de G9a e H3K9me2 tras a administración repetida de cocaína promove, en parte, a preferencia da cocaína, mediante a activación transcripcional de numerosos xenes coñecidos para regular as formas aberrantes de plasticidade dendrítica. Coñecer mellor os xenes regulados mediante tales mecanismos mellorará o coñecemento da complexa base biolóxica da drogodependencia e podería contribuír ao desenvolvemento de tratamentos máis eficaces de trastornos adictivos.
Materiais e Métodos
Animais e tratamentos
Salvo que se indique o contrario, os ratos aloxáronse de catro a cinco por gaiola nunha colonia cun ciclo de luz / escuro de 12 hora (luces de 7: 00 AM a 7: 00 PM) a temperatura constante (23 ° C) con ad libitum acceso á auga e aos alimentos. Todos os protocolos dos animais foron aprobados pola IACUC tanto no Centro Médico do Suroeste UT como na Escola de Medicina Mount Sinai.
Para experimentos de cocaína [inmunohistoquímica, Western Totting, PCR cuantitativa (qPCR), usáronse análises de microarray e inmunoprecipitación á cromatina (ChIP)], xNUMX-a 8-ratos macho de semana vella 10BL / 57J. Os animais recibiron inxeccións diarias de 'solución salina' (6 tratamentos salinos, ip), cocaína 'aguda' (tratamentos 7 salinos + un tratamento 6 mg / kg cocaína-HCl, ip) ou cocaína 'repetida' (tratamentos 20 7 mg / kg cocaína-HCl, ip). Os ratos sacrificáronse na hora 20 ou 1 horas despois do tratamento final. Para estudos de microarray, os animais foron tratados diariamente con "solución salina" (24 tratamentos salinos, ip), cocaína "aguda" (15 tratamentos salinos + tratamento 14 1 mg / kg cocaína-HCl, ip), cocaína "repetida + aguda" ( 20 tratamentos salinos + 7 tratamentos 8 mg / kg cocaína-HCl, ip) ou 'retirada repetida + aguda' cocaína (20 tratamentos 7 mg / kg cocaína-HCl + 20 tratamentos salinos + 7 desafío tratamento 1 mg / kg cocaína-HCl, ip) e sacrificáronse 20 hora despois do tratamento final. Nos experimentos de comportamento, os ratos aloxáronse só despois da cirurxía e tratáronse con 1 mg / kg cocaína-HCl, ip como se describe a continuación. Para a análise dendrítica de columna vertebral e a validación de microarray despois da HSV-GFP e HSV-G10a-GFP, os ratos foron tratados con "solución salina" (9 tratamentos salinos, ip) ou "cocaína repetida" (tratamentos 5 5 mg / kg cocaína-HCl, ip ) ao longo de 20 días, xa que este protocolo de inxección demostrouse previamente aumentar a densidade de columna vertebral nas neuronas de nucleus accumbens (NAc) no prazo de expresión transxénica do virus Herpes simplex (HSV) (Ref complementario S1). Os ratos utilizados para a análise dendrítica da columna vertebral sacrificáronse 4 horas despois do último tratamento.
Para inducir a eliminación local do transcrito de G9a restrinxido ás neuronas NAc, empregamos ratones mutantes homozigotos para un alelo G9a flotante, que se describiron detalladamente noutros lugares (S2). A recombinación inducida por Cre produce unha xonificación fóra do marco do exon 22 a 25, o que conduce a unha decadencia mediada por tontería da transcrición mutada. Usamos ratos floxed G9a que estaban totalmente cruzados con ratos C57BL / 6J. Os ratos foron inxectados estereotáxicamente no NAc con vectores do virus Adeno asociados (AAV) (serotipo 2) que expresaban GFP ou Cre-GFP entre a idade de 7 e 10 semanas. A análise inmunohistoquímica utilizouse para verificar a eficiencia da recombinación mediada por Cre (ver Fig. Complementario S5). Usamos animais inxectados por AAV 21 días despois da cirurxía porque a recombinación nos ratos flotados de G9a era estable e máxima neste momento, de acordo cos informes publicados (S3-S4). Os experimentos de sobreexpresión G9a e ΔJunD realizáronse de xeito similar utilizando vectores do virus HSV que expresaban GFP, tipo salvaxe G9a-GFP, G9aH1093K-GFP mortos catalíticamente ou ΔJunD-GFP (ver S2 Para máis detalles sobre o desenvolvemento de construcións G9a). Os ratos que sobreexpresaban o VHV usáronse 3 días despois da cirurxía xa que a sobreexpresión foi máxima neste momento de tempo, segundo se observou mediante inmunohistoquímica. Debido á natureza transitoria da expresión HSV e a natureza considerablemente máis estable da expresión AAV, os vectores HSV usáronse en experimentos que requirían expresión transxénea rápida e de curto prazo, mentres que os vectores AAV usáronse en experimentos que requiren períodos prolongados de expresión transxénica. Ámbolos vectores demostraron, en extensos estudos previos, que infectan só corpos de células neuronais dentro da área cerebral inxectada, sen ningunha infección de neuronas aferentes ou eferentes.
Para experimentos de comportamento que utilizan o inhibidor farmacolóxico de G9a / GLP, BIX01294 (25 ng / μl), os ratos foron implantados estereotáxicamente con dúas mini-bombas subcutáneas, así como cánulas de guía bilateral, no NAc. As mini-bombas activáronse 12 horas antes da implantación iniciando o parto continuo (0.25 µl / hora) de calquera vehículo (5 hydroxypropyl β-ciclodextrina) ou medicamento durante 14 días, durante o cal se realizaron avaliacións de comportamento.
Para experimentos de sobreexpresión con ΔFosB [western blotting, qPCR e ChIP], NSE bitransxénica masculinatTA × tetOP-ΔFosB Usáronse ratos (semana 10), polo que a falta da doxiciclina derivada da tetraciclina (8 semanas fóra da doxiciclina), os animais mostraron unha robusta expresión constitutiva restrinxida estriatal de ΔFosB (S5). O A sobreexpresión fosos nestes ratos confirmouse a través de qPCR. Para confirmar os resultados utilizando NSE-tTA × tetOP-ΔFosB Ratóns de tipo salvaxe 8-semana vella C57BL / 6J ratos foron intra-NAc inxectados estereotáxicamente con vectores AAV que expresaban GFP ou ΔFosB-GFP. Usáronse vectores AAV neste caso para asegurar a máxima expresión ΔFosB nas semanas posteriores á cirurxía 8, permitindo unha comparación directa entre os ratos que sobreexpresionan ΔFosB infectados viralmente e os bitransxénicos. A sobreexpresión viral confirmouse usando QPCR nas 8 semanas despois da cirurxía (os punches NAc do calibre 15 foron diseccionados baixo o lugar da inxección). Os ratos que sobreexpresaban AAV-GFP e AAV-ΔFosB-GFP que non se utilizaron para qPCR foron tratados con solución salina (tratamentos 14 salinos, ip) ou con cocaína repetida (tratamentos 14 30 mg / kg cocaína-HCl, ip) comezando nas 6 semanas despois- Cirurxía. 4 días despois do tratamento final, fixáronse cerebros con 4% paraformaldehído, seccionados nun vibratoma e usados para a análise dendrítica de columna vertebral.
Análise Western blot
Os golpes NAc do calibre 14 tomáronse de seccións coronais de 1 mm obtidas mediante unha matriz de cerebro do rato de aceiro inoxidable e foron sonicadas en tampón de lise 1 M HEPES (1% SDS) que conteñen inhibidores de proteasas e fosfatase. 10-Electroforescribíronse mostras de 30 μg de proteína total en xeles 18% SDS. As proteínas transferíronse ás membranas PVDF e incubáronse con anti-H3K9me2 (mouse monoclonal, 1: 500), anti-β-tubulina (mouse monoclonal, 1: 60,000), histona anti-total H3 (coello policlonal, 1): anti-GFP (usado para a verificación da expresión viral igual no tecido perforado) (coello policlonal, 5,000: 1), anti-H1000K3me27 (coello policlonal, 3: 1) ou anticorpos anti-actina (rato monoclonal, 500: 1) durante a noite 60,000 ° C (bloqueáronse todas as membranas en 4% leite ou 5% albumina sérica bovina). A continuación, as membranas foron incubadas con anticorpos secundarios marcados con peroxidasa (5: 1)-1: 60,000 dependendo do anticorpo primario usado) visualizáronse bandas usando o substrato SuperSignal West Dura. As bandas cuantificáronse co software NIH Image J e as bandas H3K9me2 normalizáronse a actina ou β-tubulina e á histona total H3 para controlar a igual carga. A cocaína repetida non tivo efecto sobre os niveis de actina (Fig. S8) ou a histona total 3 (Fig. S1) na NAc. Ademais, a infección por HSV-G9a-GFP e HSV-G9aH1093K-GFP non tivo ningún efecto sobre os niveis totais de β-tubulina no NAcFig. S8).
Inmunohistoquímica
Os ratos foron sedados cunha dose letal de hidrato cloral e perfusionados con 4% paraformaldehído antes de ser analizados por inmunohistoquímica simple ou dobre como se describiu anteriormente (S6). Brevemente, os cerebros post-fixos foron incubados a temperatura ambiente durante a noite en 30% sacarosa antes de seccionarse en 35 μm (os cerebros usados para a análise dendrítica da columna vertebral foron seccionados nun vibratoma en seccións 100 μm a falta de 30% sacarosa). As seccións de NAc flotantes libres laváronse con 1X PBS, bloqueáronse (3% soro normal de burro, 0.1% tritonX, 1X PBS) e posteriormente incubáronse con anti-GFP (polo policlonal, 1: 8000) e / ou anti-G9a (coello policlonal) , 1: 500) anticorpos en solución de bloqueo. As seccións analizadas para espiñas dendríticas incubáronse cun anticorpo anticlonal anti-GFP de coello en 1: 200. Despois da incubación durante a noite, as seccións NAc foron enxalzadas 3 veces durante 10 minutos con 1X PBS, seguida da incubación con anticorpos secundarios Cy2 e / ou Cy3 secundarios acoplados en fluorescentes en solución de bloqueo 1X PBS durante horas 2. As seccións usadas para estudos de morfoloxía incubáronse durante un día a anticorpos secundarios a temperatura ambiente. Conseguiu o coñacemento nuclear incubando seccións en 1X PBS que contiñan DAPI (1: 50,000) durante minutos 10. Laváronse as seccións de novo, seguidas da deshidratación de etanol e montáronse con DPX. Todas as seccións foron realizadas con microscopía confocal.
Illamento de ARN e qPCR
Os socos bilaterais NAc de calibre 14 homoxeneizáronse en Trizol e procesáronse segundo as instrucións do fabricante. O ARN purificouse con columnas de ARNesy Micro e a espectroscopia confirmou que as racións de ARN 260/280 e 260/230 eran> 1.8. A continuación, o ARN transcribiuse inversamente usando un kit iScript Bio-Rad. O ADNc foi cuantificado por qPCR usando SYBR Green. Cada reacción executouse por duplicado ou por triplicado e analizouse seguindo o método ΔΔCt como se describiu anteriormente usando gliceraldehído-3-fosfato deshidroxenase (GAPDH) como control de normalización (S7). Ver Táboa complementaria S5 para secuencias de cebador de ARNm.
Análise de microarrays de ADN
Catro grupos (réplicas biolóxicas independentes de 3 por grupo) foron empregados para o estudo de microarrays, en total 12 microarrays. 1 hora despois da última inxección de cocaína, os animais foron rapidamente decapitados e os cerebros foron eliminados e colocados no xeo. As diseccións de NAc tomáronse cun zócolo de agulla do calibre 15 e foron conxeladas rapidamente no xeo seco ata que se extrae o ARN. Agrupáronse golpes bilaterais a partir de catro animais por réplica, totalizando 12 ratos por grupo. O illamento de ARN, o procesamento de microarray e a análise de datos realizáronse como se describiu anteriormente (S8). En breve, o ARN illouse e purificouse como se describiu anteriormente e comprobouse a súa calidade usando o Bioanalizador de Agilent. A transcrición inversa, amplificación, etiquetaxe e hibridación a matrices Illumina MouseWG-6 v2.0 realizáronse utilizando procedementos estándar polo núcleo de microarrays de UT Southwestern. Os datos en bruto restáronse en segundo plano e normalizáronse cuantificándose mediante o software Beadstudio. Os datos normalizados analizáronse usando o software GeneSpring e as listas de xenerais xeráronse utilizando criterios de significación dun corte de cambio de 1.3 veces xunto cun corte de valor p non rigoroso de p <0.05.
Mantemos un alto grao de confianza nestes datos por varias razóns. En primeiro lugar, todos os animais foron manipulados, tratados e asasinados ao mesmo tempo, nas mesmas condicións. Ademais, todo o procesamento de ARN e matriz realizouse ao mesmo tempo. En segundo lugar, realizamos matrices triplicadas e reunimos varios animais por mostra de matriz, minimizando así as diferenzas debido á variabilidade individual e aumentando o poder estatístico (S9). En terceiro lugar, o criterio de control de calidade MicroArray recomenda os criterios de análise de datos empregados para o noso estudo, xa que estes criterios foron validados para proporcionar un alto grao de reproducibilidade intersite e reproducibilidade inter e intraplataforma (S10-S11).
Construción de vectores virais
Debido a restricións de tamaño de inserción de vectores virales, secuencias de codificación para G9a (G9a) ou G9a catalíticamente mortos (G9aH1093K) subclonáronse no plásmido bicistrónico p1005 + HSV expresando GFP inmediatamente antes de un virus CUMComegal o tamaño da inserción foi ~ 9 kb, que supera o tamaño máximo de inserción para os vectores AAV-3.96). O promotor IE2 / 4 conduce a expresión G5a. Os fragmentos foron subclonados no plásmido bicistrónico p9 + HSV mediante ligamentos finais contundentes con PmeI tratado con Klenow e G1005a dixerido con EcoRI (de pcDNA9) e tratado con CXX p3.1 + tras a dixestión EcoRI. Para a produción de HSV-ΔJDD-GFP, a secuencia de codificación de ΔJunD flanqueada por sitios de restrición EcoRI foi xerada por PCR utilizando oligonucleótidos de cebador que conteñen o sitio EcoRI. O produto PCR ligouse entón ao sitio EcoRI do vector p1005 +. A expresión local da Cre recombinase nas neuronas NAc foi obtida mediante a entrega de xen mediada por viral usando un vector AAV como se describe (S12). GFP ou unha fusión N-terminal de GFP a Cre foi subclonada nun vector AAV-2 recombinante que contiña un promotor CMV cunha secuencia de aceptor doante de empalme e un sinal de poliadenilación. Todas as insercións vectoriais foron confirmadas por secuenciación de dióxido. Os vectores virais producíronse empregando un método de tripla transfección sen axuda, como se describiu anteriormente (S13). O virus purificado almacenouse a −80 ° C. A calidade viral avaliouse mediante un título infeccioso avaliado en células HEK293. Tamén se prepararon virus AAV-ΔFosB-GFP. Para HSV-Cre, a expresión Cre foi impulsada por un promotor IRES, ao contrario do promotor IE4 / 5, co fin de minimizar a expresión de Cre e evitar a toxicidade neuronal (ver S14 para a construción viral). En todos os casos validouse a sobreexpresión viral, ambas in vitro in vivo, vía qPCR, e os virus foron inmunohistoquímicamente confirmados para mostrar a expresión restrinxida a NAc despois da cirurxía.
Cirurxía estereotóxica
Baixo a anestesia de cetamina (100 mg / kg) / xilazina (10 mg / kg), os ratos situáronse nun instrumento estereotóxico de pequenos animais e a superficie craneal foi exposta. Usáronse trinta e tres agullas de xeringa para medir bilateralmente 0.5 μl de virus no NAc nun ángulo 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) a unha velocidade de 0.1 μl / min. Os animais que recibiron inxeccións de HSV foron autorizados a recuperarse durante 2 días despois da cirurxía, mentres que os ratos utilizados para probas de comportamento que recibiron vectores AAV foron autorizados a recuperarse durante 20 días antes de ser sometidos ao acondicionamento do lugar. Estes tempos son consistentes cos períodos de expresión transxénica mediada por viral máxima para os dous vectores. Para infusións de BIX01294, cada unha das dúas mini-bombas situáronse subcutaneamente na parte traseira do rato. As colocacións das cánulas conseguíronse perforando dous pequenos orificios craniais por encima do NAc e mediante a entrega da cánula de bregma (AP + 1.5; ML + 1.0; DV-5.4). Os ratos permitíronse recuperarse da cirurxía por 4 a 5 días antes de comezar o procedemento de acondicionamento da cocaína como se describe a continuación.
Preferencia de lugar condicionado
O procedemento de acondicionamento do lugar realizouse como se describiu anteriormente, coas seguintes modificacións (S7). Resumidamente, 3 días despois das infusións intra-NAc de HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP ou HSV-GFP, os ratos colocáronse nas cámaras acondicionadoras, que constan de tres ambientes distintos. Os ratos que mostraron unha preferencia significativa por calquera das dúas cámaras acondicionadoras foron excluídos do estudo (<10% de todos os animais). Os grupos de acondicionamento equilibráronse entón para axustarse a calquera sesgo de cámara que aínda puidese existir. Os días posteriores, os animais inxectáronse solución salina e confináronse nunha cámara pola tarde durante 30 minutos e despois inxectáronse cocaína (10 mg / kg, ip) e confináronse durante 30 minutos á outra cámara á noite durante 2 días (dous solución salina e dous maridaxes de cocaína). O día da proba, os ratos foron colocados de novo no aparello sen tratamento durante 20 minutos e probados para avaliar que lado preferiron. As respostas locomotoras á cocaína foron avaliadas mediante roturas nas cámaras parellas de cocaína para garantir a eficacia do tratamento de drogas. Para experimentos de CPV AAV e BIX01294, empregouse un protocolo lixeiramente modificado. Os animais inxectáronse de novo con solución salina ou cocaína (10 mg / kg, ip) e confináronse a cámaras específicas durante sesións de 30 minutos, pero no seu lugar só se acondicionaron unha vez ao día durante 4 días, seguido da proba o día 5 (os animais foron acondicionados pola noite alternáronse tratamentos de acondicionamento). Para todos os grupos, avaliouse a locomoción basal en resposta a solución salina para garantir que a locomoción non foi afectada polo tratamento viral ou inhibidor.
Autoadministración intravenosa de cocaína
Obtivéronse ratos Long-Evans adolescentes masculinos, que pesaban 230-250 g ao comezo do experimento. Aloxáronse nun ambiente controlado pola humidade e a temperatura nun ciclo de luz / escuridade 12 invertido (luz apagada en 9: 00 am) con ad libitum acceso a alimentos e auga. Permitíuselles que as ratas aclimatáronse no seu novo ambiente e foron manexadas diariamente para a semana 1 antes do inicio do experimento. Todos os procedementos leváronse a cabo de acordo coa guía do Instituto Nacional de Saúde para o coidado e uso de animais de laboratorio e foron aprobados polo Comité de uso e coidado dos animais do Monte Sinaí. O equipo de autoadministración estaba equipado con feixes de infravermellos para medir o comportamento locomotor. A autoadministración levouse a cabo como se describiu anteriormente (S15-S16) con catéteres implantados na vea xugular dereita baixo anestesia con isoflurano (2.4-2.7%). Os catéteres foron lavados con 0.1 ml dunha solución salina que contiña 10 U de heparina e ampicilina (50 mg / kg). Despois dunha semana de recuperación da cirurxía, comezou o adestramento de autoadministración durante a fase escura do ciclo luz / escuridade. Permitíuselles aos animais o acceso diario de cocaína durante 3 horas (0.75 mg / kg / infusión) baixo un programa de reforzo de relación fixa-1 (FR1), onde unha prensa con panca activa deu como resultado unha única infusión de droga. As ratas estabilizaron a inxestión de cocaína despois de 1 días (variación <6% na taxa de resposta durante 15 días consecutivos, polo menos o 3% respondendo na panca reforzada). 75 horas despois da sesión de autoadministración final, as ratas foron decapitadas rapidamente, os cerebros elimináronse rapidamente e procesáronse para o illamento de ARN e qPCR.
Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)
Os golpes de NAc frescos foron formaldehido entrelazados e preparados para o ChIP como se describiu anteriormente (S17-S18) con pequenas modificacións. Resumindo, recolléronse punzóns NAc de calibre 4 14 por animal (animais 5 agrupados por mostra), entrelazados con formaldehido 1% e apagado con 2 M glicina antes de conxelarse a -80 ° C. 1 día antes da mostra de sonicación, ovellas anti-coello / rato (dependendo do anticorpo de precipitación) as perlas magnéticas IgG preparáronse incubando contas magnéticas apropiadas con anti-G9a (coello policlonal ChIP grao) ou anti-H3K9me2 (grao monoclonal de rato ChIP) anticorpos durante a noite en 4 ° C baixo rotación constante en solución de bloqueo. A sonicación de tecidos ea cortadura da cromatina leváronse a cabo como se describiu anteriormente (S17). Despois da sonicación, as mesmas concentracións de cromatina transferíronse a novos tubos e ~ 5% dos produtos finais gardáronse para servir como controis de "entrada". Tras un lavado completo e unha resuspensión das mesturas de anticorpos / perlas conxugados, engadíronse volumes iguais de mesturas de anticorpos / talóns (~ 7.5 μg anticorpo / mostra) a cada mostra de cromatina e incubáronse durante horas 16 baixo rotación constante a 4 ° C. As mostras foron lavadas e envorcadas posteriormente a 65 ° C durante a noite antes da purificación do ADN usando un kit de purificación por PCR. Despois da purificación do ADN, as mostras foron sometidas a qPCR e normalizáronse aos seus controis de 'entrada' adecuados como se describiu anteriormente (S17). Realizáronse tamén inmunoprecipitacións IgG de rato normais usando un anticorpo policlonal anti-IgG de rato para controlar o enriquecemento axeitado da amplificación do sinal. A adenina fosforibosiltransferase (APRT) foi usada como control negativo para experimentos de sobreexpresión de cocaína e BFosB. Ver Táboa suplementaria S5 para secuencias de cebador promotor.
Análise da columna dendrítica
Para estudar o papel de G9a na regulación da morfoloxía neuronal in vivo, usamos métodos anteriormente descritos coas seguintes modificacións (S1). Tres días despois da inyección de HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-DJunD-GFP (todos os virus empregáronse en ratos C57Bl / 6J de tipo salvaxe) ou HSV-Cre-GFP (usado en G9afl / fl ratos), cando a expresión viral era máxima, os ratos foron perfundidos, os cerebros foron crioprotegidos e posteriormente seccionados a 100 μm nun vibratome. As seccións foron inmunosuídas usando un anticorpo contra GFP como se describiu anteriormente (ver Inmunohistoquímica). Para avaliar os efectos da sobreexpresión de G9a e do nocaut no número da columna vertebral, así como o efecto da sobreexpresión de JunD, medimos o número de espiñas sobre aproximadamente neuronas 1-2 por neurona que igualan polo menos 299 μm de dendritas secundarias de medio NAc que expresa GFP neuronas espiñentas (MSNs). Dado que os MSN son morfoloxicamente distintos doutras poboacións neuronais do NAc, así como de informes anteriores que indican que o HSV infecta principalmente as neuronas que expresan DARPP-32 nesta rexión cerebral (S19), estamos seguros de que os MSN foron avaliados exclusivamente nestes estudos. Para cada animal, analizamos as neuronas 6-8 en animais 3-4 por grupo (grupos 7), despois de que se obtivo un valor medio para cada animal para a análise estatística. Os experimentos deseñados para examinar os efectos da sobreexpresión de FosB na densidade da columna da NAC foron realizados de xeito similar ao descrito anteriormente, coa excepción de que os vectores AAV foron usados para expresar GFP ou BFosB-GFP durante longos períodos de tempo (semanas 8). Todas as imaxes HSV foron capturadas usando un microscopio confocal cun obxectivo de inmersión en aceite 100X (as imaxes AAV foron capturadas cun obxectivo de inmersión en aceite 63X). As imaxes foron adquiridas co buraco fixado na unidade arbitraria 1 e un tamaño de cadro 1024 × 1024. A lonxitude dendrítica medíase usando o software NIH Image J, e os experimentadores principais contaron números cuxos espiños, xa que as diapositivas foron codificadas antes da exploración experimental. O número medio de espiñas por 10 μm de dendrita foi calculado.
Análise estatística
Realizáronse ANOVA dun e dous sentidos para determinar a importancia para a preferencia do lugar condicionado e para a análise da espina dendrítica con máis de dous grupos. As probas de t de Student foron utilizadas para outras comparacións, incluíndo qPCR, Western blot, dendrítico espiña comparando HSV-GFP a HSV-Cre en G9afl / fl ratos, análises de microarrays (ver arriba) e experimentos de inmunoprecipitación da cromatina. Empregáronse probas de estudantes planificadas tras unha análise ANOVA bidireccional da densidade da columna dendrítica despois da sobreexpresión de osFosB con confirmación dos principais efectos significativos do tratamento farmacolóxico e do virus. Todos os valores incluídos nas lendas da figura representan a media ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Análises estatísticas detalladas para Figs. 1-3 no texto principal móstranse en: Figura detallada Lendas incluíndo estatísticas.
Notas ao pé
Certifico que ningún dos materiais incluídos no manuscrito titulado Papel esencial da histona metiltransferase G9a na plasticidade inducida pola cocaína Foron publicados previamente ou están a ser considerados noutros lugares, incluídos en Internet.
Todos os traballos que inclúen o uso de animais leváronse a cabo de acordo coas directrices institucionais e da IACUC tanto no Centro Médico do sudoeste da Universidade de Texas como na Escola de Medicina Mount Sinai.
Referencias e notas
;