J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.
Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ.
fonte
Departamento de Psiquiatría, Centro de Neurociencia Básica, Centro Médico Suroeste da Universidade de Texas, Dallas, Texas 75390-9070, EUA.
Abstracto
O factor de transcrición DeltaFosB (tamén coñecido como FosB2 ou FosB [forma curta]) é un importante mediador da plasticidade a longo prazo inducida no cerebro por exposición crónica a varios tipos de estímulos psicoativos, incluíndo drogas de abuso, estrés e convulsións electroconvulsivas. . Unha característica distinta de DeltaFosB é que, unha vez inducida, persiste no cerebro por períodos de tempo relativamente longos en ausencia de máis estimulación. Non obstante, os mecanismos subxacentes a esta aparente estabilidade permaneceron descoñecidos. Aquí demostramos que DeltaFosB é un factor de transcrición relativamente estable, cunha vida media de aproximadamente 10 h no cultivo celular. Ademais, mostramos que DeltaFosB é unha fosfoproteína no cerebro e que a fosforilación dun residuo de serina altamente conservada (Ser27) en DeltaFosB protéxea da degradación do proteasomal. Proporcionamos varias liñas de evidencia que suxiren que esta fosforilación está mediada pola caseína quinasa 2. Estes descubrimentos constitúen a primeira evidencia de que DeltaFosB está fosforilado e demostra que a fosforilación contribúe á súa estabilidade, que é o núcleo da súa capacidade de mediar adaptacións duradeiras no cerebro.
introdución
O factor de transcrición BFosB, tamén denominado FosB2 ou FosB [forma curta], é unha variante de empalme truncada ao término C do xene precoz inmediato fosb (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu e Nathans, 1991; Yen et al., 1991). Do mesmo xeito que o FosB de longa duración, ΔFosB ten un dominio básico de unión a ADN e unha cremalleira de leucina a través da cal se dimeriza coas proteínas de xuño para formar complexos de factores de transcrición de proteínas activadoras 1 (AP-1), que regulan a expresión de moitos xenes (Morgan e Curran, 1995; Rylski e Kaczmarek, 2004). A pesar de carecer de parte do dominio de transactivación atopado no extremo C do FosB, ΔFosB funciona como un potente activador transcripcional e represor en células cultivadas e no cerebro (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu e Nathans, 1991; Chen et al., 1997; McClung e Nestler, 2003; Kumar et al., 2005).
ΔO FosB é inducido a niveis elevados de xeito específico na rexión no cerebro despois da exposición crónica, pero non aguda, a unha variedade de estímulos psicoactivos, incluíndo o estrés, certas lesións, medicamentos antipsicóticos e antidepresivos, drogas e recompensas naturais. (Hope et al., 1994b; Hiroi e Graybiel, 1996; Moratalla et al., 1996; Bing et al., 1997; Mandelzys et al., 1997; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Andersson et al., 2003; Colby et al., 2003; Peakman et al., 2003; Perrotti e col., 2004; Zachariou et al., 2006). A inducción de FosB relacionouse directamente cos efectos funcionais de varios destes estímulos no cerebro. A persistencia de ΔFosB incluso en ausencia de estimulación adicional distínguea de todos os demais factores de transcrición da familia Fos, que son inducidos rapidamente en resposta a estímulos agudos, decaen cara aos niveis basais nunhas poucas horas e xeralmente mostran desensibilización despois da estimulación crónicaHope et al., 1992; Daunais et al., 1993; Persico et al., 1993; Hiroi e Graybiel, 1996; Perrotti e col., 2004). Isto fai que BFosB sexa un candidato atractivo para mediar algúns dos cambios duradeiros na expresión xénica que subxacen nas adaptacións neuronais estables causadas por certos estímulos crónicos.
Porque a presenza prolongada de FosB ocorre en ausencia de máis inducción do seu ARNm (Chen et al., 1995), especulamos que, a diferenza do FosB de longa duración e de todas as outras proteínas da familia Fos, que son intrínsecamente inestables, ΔFosB pode ser un factor de transcrición inusualmente estable (Hope et al., 1994b; Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001; McClung et al., 2004). Ademais, a análise da inmunotransferencia do tecido cerebral agudo contra estimulación crónica suxeriu que ΔFosB aparece Mr (masa molecular) de ∼33 kDa en estado agudo a ∼35 – 37 kDa durante o tratamento crónico (Hope et al., 1994a; Chen et al., 1995). Debido a que non hai evidencia da existencia de mRNA adicionais que puidesen codificar estas varias isoformas, especulamos ademais que osFosB é modificado posttranslación e que talvez contribúe á súa inusual estabilidade. Ata a data, con todo, non se informou de análises bioquímicos do volume de negocio ou das modificacións postraduccionais de BFosB. O obxectivo do presente estudo foi determinar se ΔFosB é unha fosfoproteína e se a fosforilación ten un papel na súa estabilidade.
Sección anteriorA seguinte sección
Materiais e Métodos
Liñas celulares de mamíferos e construcións de ADN.
As células PC12 (Clontech, Mountainview, CA) cultiváronse en DMEM de alta glicosa que contiña l-glutamina (L-Gln) e complementáronse con 5% soro bovino fetal (FBS), 10% soro de cabalo (ambos de Invitrogen, Carlsbad, CA) , 100 U / ml penicilina e 100 μg / ml estreptomicina (ambas de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). As células HeLa (American Type Culture Collection, Manassas, VA) cultiváronse en DMEM de alta glicosa que contiña L-Gln e complementáronse con 10% FBS, penicilina e estreptomicina. Ambas liñas celulares mantivéronse a 37 ° C nun 5% CO húmido2 atmosfera.
Para as transfeccións transitorias con ADN, as células PC12 ou HeLa foron sementadas en placas de seis pozos (revestidas con coláxeno I para células PC12) para alcanzar a confluencia 90-100% ao día seguinte e despois transfectáronse usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen). Nalgúns experimentos (ver Figs. 1⇓⇓⇓⇓⇓-7), ΔFosB foi expresado transitoriamente en células PC12 por infección por virus recombinante do herpes simple (VHS).
Os ADNc ΔFosB e FosB obtivéronse das nosas propias construcións pTetop (Chen et al., 1997), e subclonado nun vector pcDNA3.1 (Invitrogen). Estas construcións pcDNA3.1-ΔFosB / FosB foron utilizadas para a expresión en células de mamíferos e como modelo para a mutagênese dirixida ao sitio. O HSV-ΔFosB recombinante preparouse como se describiu anteriormente (Neve et al., 1997), ea preparación tiña un título de ∼1 × 108 pfu / ml.
Experimentos de persecución de pulsos.
Aproximadamente 24 h despois da infección / transfección, as células (PC12 ou HeLa) en placas de seis pozos foron lavadas dúas a tres veces con 2 ml de PBS e incubadas a 37 ° C para ∼1 h en ml 2 de DMEM Cys / Met-free (Invitrogen) complementado con FBS dializado por 5% (Hyclone, Logan, UT) para esgotar os pozos intracelulares de Met e Cys. Ao final deste período de "inanición", engadíronse drogas (se se trataban as células) e as células etiquetáronse (pulso) con 12 – 25 μCi de 35Mezcla de etiquetaxe de proteínas S (PerkinElmer, Wellesley, MA) para ∼1 h en 37 ° C para etiquetar todas as proteínas recén sintetizadas. O radiomarcador eliminouse despois lavando as células dúas a tres veces con 2 ml de PBS e 35Seguíronse as proteínas marcadas con S (persecución) substituíndo o medio por medio "frío" (non radioactivo) suplementado con 5% FBS e collendo as células en diferentes momentos. Os tratamentos celulares mantivéronse ao longo da persecución. Todas as figuras destes experimentos mostran cantidades iniciais similares das distintas proteínas para optimizar as comparacións das súas taxas de rotación.
Animais e tratamento crónico electroconvulsivo.
As ratas macho Sprague Dawley adultas (200-300 g; Charles River Laboratories, Kingston, RI) foron tratadas unha vez ao día con convulsións electroconvulsivas (ECS) para 7 – 9 d. O ECS foi realizado como se describiu anteriormente (Hope et al., 1994a) usando un Ugo Basile (Comerio VA, Italia) Unidade ECS cos seguintes axustes: frecuencia, pulsos / s 100; pulso con 0.5 ms; duración do choque, 1.0 s; e actual, 75 mA. Os animais de control simulado foron tratados en paralelo mediante a aplicación de electrodos de agulla sen ningunha corrente eléctrica.
32 P etiquetado metabólico.
Para a etiquetaxe das franxas cerebrais, as ratas foron decapitadas, os cerebros se diseccionaron rapidamente, e 300 μm cortes corticales frontales preparáronse cun microscopio DSK (Ted Pella, Redding, CA). As rebanadas foron incubadas dentro de tubos plásticos en 2 ml de CSF artificial con deficiencia de fosfato (ACSF) e mantense a 30 ° C baixo unha constante burbullas suaves cun O2/ CO2 mestura (Hemmings et al., 1989). As franxas (dúas franxas por tubo) foron etiquetadas con 1.3 mCi para 8-10 h en presenza ou ausencia de ácido okadaico (100 ng / ml). Ao final desta incubación, as rebanadas foron enjuagadas polo menos tres veces con ACSF frío e logo homoxeneizadas por sonicación en tampón 250 μl de ensaio de radioimmunoprecipitación en frío (RIPA) [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (v / v) ) Desoxicolato de sodio, 0.5% (p / v), XSNX% (p / v) SDS, 0.1 mm EDTA] suplementado antes do seu uso con cocktail de inhibidores de proteasa ata 1% para células de mamíferos (usado en 0.6 μl / ml; Sigma-Aldrich), cócteles de inhibidores de fosfatase I e II (utilizados en 5: 1; Sigma-Aldrich), 100 mm PMSF e 1% glicerol. Os homoxenatos foron fervidos para 2 min e limpados por centrifugación en 15 × g para 15 min. A concentración de proteínas nos sobrenadantes resultantes foi avaliada utilizando o ensaio de proteínas BCA (Pierce, Holmdel, NJ).
Para o 32P etiquetado de células cultivadas, ∼24 h despois da infección / transfección, as células foron lavadas dúas a tres veces con medio libre de fosfato e incubadas neste medio para ∼1 h. Despois deste período de fame, 0.2 – 0.3 mCi de 32PH3PO4 (PerkinElmer) engadíronse a cada pozo e as células etiquetáronse para 4 – 12 h dependendo do tipo de experimento (ver figs. 1 – 7 para as especificacións). As células foron lavadas tres veces con PBS e lisadas en xeo para 15 min con 50 μl de tampón RIPA complementado. Recolléronse lisados raspándose e pasáronse 10 veces a través dunha agulla 25 ga para cortar ADN, fervida por 10 min, e centrifugada en 15,000 rpm para 15 – 30 min a 4 ° C. Os lisados (sobrenadantes) limpos foron transferidos a un novo tubo e realizouse un ensaio de proteína BCA (Pierce). Todas as figuras destes experimentos mostran cantidades similares de proteínas de tipo salvaxe total (WT) e S27A ΔFosB para optimizar as comparacións dos seus niveis de fosforilación relativa.
Tratamentos químicos e de cultivo celular.
O ácido okadaico (OA; Sigma-Aldrich) disolveuse en etanol e utilizouse nunha concentración final de 100 ng / ml. 5,6-Dicloro-1-β-d-ribofuranosil-benzimidazol (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) disolveuse en dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma-Aldrich) e utilizouse no cultivo celular nunha concentración final de 50 μm. A esperma (Sigma-Aldrich) disolveuse en auga e usouse nunha concentración final de 200 μm. O calfostina-C (Biomol) disolveuse en DMSO e utilizábase en 0.2 μm, mentres que o forbol 12-miristato 13-acetato (PMA; Promega, Madison, WI) foi disolto en DMSO e usado en 0.1 μm. O péptido inhibitorio relacionado con miristoilado-autocamtida-2 (m-AIP; Biomol) disolveuse en auga e utilizouse nunha concentración final de 1 e 10 μm. Os inhibidores da proteína quinase de amplo espectro H-7 e H-8 (Biomol) foron disoltos en auga e utilizáronse nunha concentración final de 150 e 200 μm, respectivamente. MG132 (Calbiochem, San Diego, California) e epoxomicina (Peptides International, Louisville, KY) foron disoltos en DMSO e usados nunha concentración final de 12.5 e 7.5 μm, respectivamente. En todos os experimentos, DMSO (vehículo) foi engadido ás células segundo o necesario para manter unha cantidade constante de DMSO en tratamentos. Pois 32Experimentos de etiquetaxe P, os medicamentos foron engadidos inmediatamente antes da etiqueta e mantidos para o resto do período de etiquetaxe. Para experimentos de persecución de pulsos, engadíronse fármacos no momento de "inanición" de Cys / Met, mantidos ao longo do período de etiquetaxe, e despois agregados de novo ao medio de persecución. Os inhibidores do proteasoma foron espallados por cada 3-4 h ao longo da persecución para compensar a rápida rotación destes péptidos.
Op Inmunoprecipitación, inmunotransferencia e autoradiografía de FosB.
Para os inmunoprecipitacións, os lisados diluíronse 1: 5 con RIPA simple para reducir a concentración de SDS a 0.1% antes de proceder coa inmunoprecipitación (IP). Para limitar a unión inespecífica, os lisados foron limpados por primeira vez por inmunoprecipitación con IgG e proteína G-Sepharose (Sigma-Aldrich) non inmunes durante polo menos 4 h. O wasFosB foi entón inmunoprecipitado dos lisados limpos usando un anticorpo policlonal de cabra que recoñece un epítopo interno presente en FosB e ΔFosB (SC-48G; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) en 0.5-1 μg IgG por 10 μg de proteína de lisado (50 – 300 μg da proteína total) nun volume total de 0.5 ml. As IPs mesturáronse suavemente a 4 ° C nun rotor durante polo menos 8 h e logo engadíronse 15 μl de proteína G-Sepharose e mesturáronse IPs polo menos noutro 4 h. As IP foron xirando por 3000 × g para 3 – 5 min a 4 ° C, lavado tres veces con 0.5 ml de RIPA liso frío e dúas veces con PBS frío que contén 0.1% Tween 20. As IP foron resuspendidas en 0.5 ml de PBS frío, transferidas, sedimentadas nun novo tubo, e as proteínas inmunoprecipitadas foron eluídas mediante a adición de 15-25 μl de 2 × buffer de mostra de proteína Laemmli reducindo. Este protocolo IP resultou na precipitación específica e efectiva de case todos os ΔFosB no lisado. As proteínas inmunoprecipitadas foron sometidas a SDS-PAGE cargando toda a IP nun xel de criterio 12.5% Tris-HCl (Bio-Rad, Hercules, CA) e despois transferidas a PVDF ou nitrocelulosa. Despois da transferencia, a membrana foi secada ao aire e 32P- e 35As bandas de proteínas radiomarcadas por S foron observadas por autorradiografía mediante película autoradiográfica Kodak (Rochester, NY), así como por fosforimetración usando un PhosphorImager Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Detectouse a total (fosforylada e fosforilada) BFosB nos lisados celulares ou homoxeneizados cerebrais mediante a inmunotransferencia de calquera proteína inmunoprecipitada (usando a mesma membrana usada para detectar 32Proteína marcada con P), ou de cantidades iguais de proteína lisado / homoxene sometidas a SDS-PAGE e transferidas a PVDF ou nitrocelulosa. A membrana primeiro foi bloqueada incubándoa con leite seco 1% (p / v) sen grasa (Bio-Rad) en PBS complementado con XPNX% (v / v) Tween 0.1 (Sigma) para 20 h a 1 ° C. A membrana foi entón inmobilizada durante a noite en 25 ° C co noso propio anticorpo policlonal anti-FosB de coello xerado contra aminoácidos 4-1 de FosB / ΔFosB (usado en 16: 1). Despois da incubación primaria, as membranas foron lavadas catro veces para 10,000 min con buffer de bloqueo, e logo incubadas en 5 ° C para ∼25 h cun IgG de cabra anti-coello conxugado con peroxidasa de rabaño (usado en 1: 1 en bloqueo de bloqueo, de vector Laboratorios, Burlingame, CA). As membranas laváronse tres veces para 5000 min con buffer de bloqueo e unha vez para 10 min con PBS. As bandas de proteínas ΔFosB totais visualizáronse na película MR Kodak mediante a quimioluminiscencia mellorada (Pierce) e / ou pola detección de fluorescencia usando os reactivos ECL-Plus (Amersham Biosciences) e Storm PhosphorImager.
Sobreexpresión e purificación de ΔFosB recombinante a partir de células de insectos.
O BFosB foi sobreexpresado nas células de insectos Sf9 como unha proteína marcada con hexa-His N terminais (N-His (6) osFosB) usando o sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac (Invitrogen) e seguindo as instrucións do fabricante. Resumidamente, o ADNc de BFosB (residuos 2-237) precedido da etiqueta de afinidade N-terminal MGHHHHHHAG foi subclonado no vector pFASTBacTM1, que se usou para xerar baculovirus recombinante. As células Sf9 infectáronse con virus recombinantes, e N-His (6) ΔFosB foi purificado a partir de lisados celulares por varios pasos cromatográficos, incluíndo a cromatografía de afinidade usando unha columna de níquel (Qiagen, Valencia, CA), intercambio aniónico usando unha columna mono-Q (Amersham Biosciencias) e exclusión de tamaño usando unha columna de filtración de xel (Amersham Biosciences).
In vitro estudos de fosforilación.
In vitro As reaccións de fosforilación para o análise de tempo e estequiometría realizáronse nun volume de 30 μl con substrato 10 μm (N-His (6) ΔFosB ou substrato de control positivo), 250 μm ATP e 1 μCi / μl [γ-32P] ATP, o buffer subministrado polo fabricante de quinase, e unha das seguintes quinases: CK2 (20 ng / μl; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / μl; Upstate), PKC (1.6 ng / μl; Calbiochem) ou p70S6K (2.5 mU / μl; Upstate). As reaccións de tempo realizáronse eliminando alícuotas 5 μl da solución de reacción nos puntos horarios designados e engadindo un volume igual de 4 × reducindo o tampón de mostra de proteína Laemmli. Os parámetros cinéticos Michaelis-Menten para a reacción de CK2 determináronse baixo condicións de estado estacionario lineal definidas empíricamente. Estas reaccións realizáronse para 15 min nun volume de 10 μl que contiña encima 2 ng / μl, 250 μm ATP, 1 μCi / μl [γ-32P] ATP e N-His (6) ΔFosB concentracións que varían de 2.5 – 30 μm. Todas as reaccións realizáronse a 30 ° C nun baño de auga. Despois de SDS-PAGE e tinción do xel con Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad), o xel secouse e 32A incorporación de fosfato P foi avaliada por análise de fosforimetración (véxase máis adiante, Cuantificación de datos, cálculos e estatísticas).
Mapa de fosfopéptido bidimensional e análise de fosfaminoacidos.
Ambas análises realizáronse como se describe na Ploegh e Dunn (2000). Resumindo, fragmentos de xel secos que conteñen 32ΔFosB con etiqueta P (desde in vitro reaccións ou de inmunoprecipitadas de células marcadas metabólicamente), foron eliminadas, rehidratadas, lavadas e sometidas a dixestión tríptica. Liofilizouse o sobrenadante que contiña os produtos de dixestión tríptica e o liofilado lavouse varias veces e resuspendido en 10 μl de tampón de electroforese, pH 1.9. A mostra (3 μl) foi vista nunha placa de cromatografía de capa fina de celulosa (TLC) (Analtech, Newark, DE) e separada nunha dimensión por electroforese ea outra dimensión mediante TLC ascendente. Os mapas fosfopéptidos resultantes visualizáronse mediante autoradiografía e fosforimetración. Para a análise de fosfaminoacido, 2 μl dos resumos trípticos resuspendidos no tampón de electroforese foron clivados por hidrólise de HCl a 105 ° C para 25 min en 3 m HCl baixo un N2 atmosfera. A reacción foi detida por seis dilucións na auga, e a mestura foi liofilizada. O liofilato resuspendeuse en 5 μl de tampón de electroforese, pH 1.9, e apareceu nunha placa de TLC de celulosa xunto cos estándares de fosforo-Ser, -Tr e -Tyr. A electroforese realizouse durante a metade da lonxitude da placa de TLC usando un tampón de electroforese, pH 1.9, e despois a placa foi transferida ao tampón de pH 3.5, e realizouse a electroforese ata a conclusión. Os estándares de ácido fosfamamino visualizáronse pulverizando a placa de TLC cunha solución de ninhidrina 1% (v / v) en acetona, e 32As mostras de aminoácidos marcadas con P foron visualizadas tanto por autoradiografía como por fosforimetración.
CK2α inducido por siRNA.
Usamos un método de interferencia de ARN para eliminar de xeito selectivo os niveis de CK2 (Di Maira et al., 2005). As células PC12 foron sementadas en placas de seis pozos recubertas de coláxeno I para alcanzar a confluencia ∼70-80% ao día seguinte, cando foron transfectadas transitoriamente con 20 nm (concentración final) de siRNA ou siRNA non dirixido cara ao ARNm do catalizador. Subunidade α da rata CK2, usando 5 μl do axente de transfección SilentFectin (Bio-Rad) e seguindo as instrucións do fabricante. Aproximadamente 24 h máis tarde, as células transfectáronse transitoriamente co plásmido mFosB, como se indicou anteriormente. Aproximadamente 24 h máis tarde (∼48 h despois da transfección de siRNA), as células foron sometidas a calquera 32P etiquetado metabólico ou análise de pulso-persecución como se describiu anteriormente Usáronse os seguintes siRNA de CK2α con resultados similares: 5′P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 ′, 5′P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3 ′, 5′P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUU3 ′, 5′P-AAAUCCCUG ACAUCAUAUUUU3 ′ (Dharmacon, Lafayette, CO). Como control negativo usamos Silenciador control negativo #3 siRNA de Ambion (Austin, TX). A extensión de knock-down de CK2 foi monitorizada por inmunotransferencia usando un anticorpo policlonal anti-CK2 (catálogo # 06-873 de Upstate) durante a noite nunha dilución 1: 1000. Utilizouse β-tubulina como control de carga e detectouse cun anticorpo monoclonal (catálogo # 05-661 de Upstate) durante a noite nunha dilución 1: 20,000.
Mutagénese dirixida ao sitio.
A mutación de Ser27 a Ala ou a Asp foi realizada empregando un kit de mutagênese dirixido ao cambio rápido do sitio (Stratagene, La Jolla, CA) e seguindo as instrucións do fabricante. Para introducir as mutacións Ser27 na proteína ΔFosB do rato, utilizáronse os seguintes cebadores de mutagênese. Ser27 a Ala: (cebador inverso) 5′GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 ′. Ser27 a Asp (imprimación directa) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 ′. As bases mutadas están en negra e o codón Ser27 está en cursiva.
Bioinformática.
Procuráronse os potenciais sitios de fosforilación e quinasas para ΔFosB mediante a presentación da secuencia de proteínas do rato en bases de datos especializadas incluíndo ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProteinRost et al., 2004), e NetPhosK (Blom et al., 2004).
Cuantificación de datos, cálculos e estatísticas.
A cantidade de proteína presente na PVDF ou membrana de nitrocelulosa foi cuantificada usando un Storm PhosphorImager e o software ImageQuant que o acompaña (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics). No cultivo celular e por porción de cerebro estuda a fosforilación, os valores obtidos para a 32A proteína marcada con P foi entón dividida polos valores obtidos para o totalFosB total e expresados como razón. No in vitro estudos de fosforilación, a cantidade de 32O ΔFosB marcado con P por mole de ΔFosB (estequiometría) foi calculado como se describiu anteriormente (Sahin et al., 2004). Todas as medidas tomáronse dentro do rango de linearidade do instrumento utilizado. Os parámetros cinéticos foron calculados empregando o modelo Michaelis-Menten V = VMax[S] / ([[S]+KM) E VMax = k2[ETotal]. A vida mediat1/2) de ΔFosB e FosB estimáronse a partir das parcelas de persecución de pulso (usando a regresión non lineal que mellor se axustan aos puntos de datos) e corresponden ao momento en que a cantidade de proteína restante é 50% do orixinal. En todas as cifras, os resultados mostrados son representativos de polo menos dous a tres experimentos independentes. En todos os gráficos, os datos mostrados son medias ± SEM (3 ≤ n ≤16). A importancia estatística das diferenzas foi avaliada empregando un pareado t proba, corrixida para comparacións múltiples, e os asteriscos indican p ≤ 0.05.
Sección anteriorA seguinte sección
Resultados
ΔFosB é un factor de transcrición inusualmente estable
Aínda que especulamos anteriormente que ΔFosB é un factor de transcrición relativamente estable (Nestler et al., 2001), non se realizou unha análise directa do perfil de facturación da proteína. Para abordar esta pregunta, realizamos experimentos de persecución por pulso utilizando células PC12, que se empregaron extensivamente como liña celular tipo neurona, na que viaFosB foi expresado transitoriamente por infección cun virus de herpes simple recombinante (HSV-ΔFosB). As proteínas recentemente sintetizadas foron etiquetadas metabólicamente con 35S-Met / Cys, e o patrón de degradación de 35S-etiquetado con (FosB (35O S-ΔFosB) foi monitorizado por inmunoprecipitación dos lisados celulares obtidos en varios momentos despois da eliminación dos aminoácidos radiomarcados. A análise dos inmunoprecipitados por SDS-PAGE e autoradiografía revelou que a vida media de ΔFosB nas células PC12 é ∼10 h (Fig 1). Estes resultados mostran que a vida media de ΔFosB é maior que a maioría dos factores de transcrición inducibles (véxase a discusión), incluíndo FosB de longo completo, cuxa semivida no cultivo celular foi relatada como ∼90 min (Dobrazanski et al., 1991; Carle et al. 2004). Ademais, cabe destacar que a degradación de ΔFosB non se encaixa nunha curva de decaimento exponencial de primeiro grao, senón que é bifásica, comezando cunha taxa de degradación máis lenta. Isto suxire a existencia de máis dunha especie de osFosB e / ou máis dunha vía de degradación.
Ver a versión máis grande:
Figura 1.
ΔFosB é un factor de transcrición inusualmente estable. A semivida de ΔFosB é ∼10 h no cultivo celular. ΔFosB expresouse en células PC12 mediante unha infección por HSV-ΔFosB ou transfección transitoria con plásmido -FosB e as células foron sometidas a experimentos de persecución de pulso como se describe en Materials and Methods. Os resultados equivalentes obtivéronse independentemente do método usado para sobreexprimir FosB. A figura mostra o tempo (e o autoradiogramo representativo) da degradación de BFosB. Os datos representados son a media ± SEM de polo menos puntos de datos individuais 15 obtidos de polo menos cinco experimentos independentes. Para comparación, indícase a semivida reportada do FosB de corpo enteiro.
BFosB é unha fosfoproteína no cerebro
Cremos que a modificación postraduccional de BFosB pode contribuír á súa aparente estabilidade. Porque se demostrou que a fosforilación modula a actividade dos factores de transcrición de moitas maneiras, incluíndo a súa estabilidade (para revisión, vexa Desterro et al., 2000; Whitmarsh e Davis, 2000), investigamos se ΔFosB é unha fosfoproteína. Para iso, a expresión de FosB foi inducida no cerebro de rato usando ECS crónica, un tratamento coñecido por inducir niveis altos de ΔFosB, particularmente no córtex frontal (Hope et al., 1994a). Un día despois do último tratamento ECS, cando os niveis de FosB seguen sendo altos, preparáronse franxas corticales delgadas e etiquetadas metabólicamente con 32P-ortofosfato. Non se radiomarcou un conxunto paralelo de cortes, e estes usáronse para detectar niveis ΔFosB totais. Tras a inmunoprecipitación cun anticorpo específico anti-FosB / ΔFosB e separación das proteínas inmunoprecipitadas por SDS-PAGE, fosforilado 32O BFosB marcado con P foi detectado por autoradiografía, mentres que o ΔFosB total detectouse por inmunotransferencia. Esta análise revelou que ΔFosB está fosforilado no cerebro, como evidencia un específico 32A banda marcada con P de UM35 kDa presente nas mostras cerebrais tratadas crónicamente, pero é virtualmente indetectable nos controis tratados con simulaciónFig 2A). Isto é consistente co feito de que, en ausencia de estimulación crónica, os niveis basais de BFosB son moi baixos. A especificidade da reacción de inmunoprecipitación é ilustrada pola falta de sinal no precipitado IgG non inmune.
Ver a versión máis grande:
Figura 2.
BFosB é unha fosfoproteína no cerebro. A, ΔFosB está fosforilado no cerebro. O wasFosB endóxeno foi inducido no cerebro de ratas por tratamento crónico ECS descrito en Materiais e Métodos. As franxas corticais frontales foron etiquetadas metabólicamente con 32PH3PO4 durante varias horas. Tras a homoxeneización das franxas, ΔFosB foi inmunoprecipitado e ΔFosB fosforilado (32P-ΔFosB) detectouse mediante autoradiografía (panel superior). O ΔFosB total en inmunoprecipitados non radiactivos foi detectado por inmunotransferencia (panel inferior). Como controis negativos, móstrase o inmunoprecipitado dun animal tratado simulado e unha IgG non inmune. BOs sitios de fosforilación dos candidatos e as quinasas con correspondentes resultados de predicción para a secuencia da proteína ΔFosB do rato obtivéronse por análise bioinformático. Os sitios candidatos con puntuacións de predición máis elevadas están resaltados na secuencia de proteínas e listados na táboa. O dominio de unión ao ADN (básico) e a cremalleira de leucina están en negra na secuencia da proteína. C, D, A fosforilación de FosB increméntase co inhibidor de fosfatase Ser / Thr. C, 32Os niveis de P-ΔFosB en inmunoprecipitados de cortes corticais frontales marcados en ausencia (Ctr) ou presenza de 100 ng / ml OA (gráfico e panel superior) foron detectados por autoradiografía. O panel inferior mostra o BFosB total detectado en inmunoprecipitados a partir de franxas non marcadas por inmunotransferencia. D, As células PC12 foron infectadas con HSV-ΔFosB ou HSV-LacZ (vector) e etiquetadas metabólicamente con 32PH3PO4 en ausencia (Ctr) ou presenza de 100 ng / ml OA. 32Os niveis de P-ΔFosB en inmunoprecipitados detectáronse mediante autoradiografía (gráfico, panel superior). O panel inferior mostra o ΔFosB total detectado nos lisados celulares por inmunotransferencia.
Como primeiro paso para dilucidar cales quinasas e sitios están implicados na fosforilación de BFosB, someteu a súa secuencia de aminoácidos a varias análises bioinformáticas. Isto revelou que, aínda que BFosB non contén sitios candidatos a fosforilación de Tyr, contén varios sitios de consenso de quinasa Ser / Thr, incluíndo tres sitios CaMKII, tres sitios CK2 e dous sitios PKC con puntuacións de predicción de fosforilación moi altasFig 2B). Se, como previsto a través da bioinformática, ΔFosB só fosforilado nos residuos Ser ou Thr, entón a súa fosforilación debe ser modulada significativamente pola actividade das fosfatasas Ser / Thr. Para probar esta hipótese, etiquetamos cortes corticais frontais 32P-ortofosfato en presenza ou ausencia de OA, un inhibidor da proteína fosfatase Ser / Thr. Como se mostra en figura 2C, OA causou un gran aumento ()2.5 veces) 32P-ΔFosB. Tamén causou un pequeno aumento dos niveis de BFosB totais, o que é consistente cos informes anteriores que ligan os efectos canceríxenos da OA coa súa capacidade de inducir varios xenes tempranos inmediatos incluíndo as proteínas Fos.Miller et al., 1998; Choe et al., 2004). O resultado neto é un aumento global significativo (∼60%) en .FosB fosforilados.
Despois investigamos se, nas células PC12, que son máis susceptibles á manipulación experimental, ΔFosB mostrou un patrón de fosforilación semellante ao visto no cerebro. Expresamos ΔFosB nas células PC12 a través da infección por HSV-ΔFosB e etiquetadas metabólicamente coas células con 32P-ortofosfato en presenza ou ausencia de OA. A expresión exitosa e a inmunoprecipitación da proteína a partir de células infectadas con HSV-BFosB móstrase pola presenza tanto no inmunotransferencia (Fig 2D, panel inferior) e autoradiógrafo (panel superior) dunha banda ∼35 kDa, ausente nas células infectadas polo vector. Como se observou no cerebro, o OA causou un pequeno aumento no total dos niveis de BFosB, pero un aumento moito maior (aproximadamente dúas veces) en 32P-ΔFosB, resultando nun aumento neto significativo (∼50%) na fosforilación de FosB. Ademais, de acordo coas previsións bioinformáticas, o tratamento das células PC12 cun inhibidor da fosfatase Tyr non resultou en cambios significativos en 32Niveis de P-ΔFosB (datos non mostrados). Xuntos, estes descubrimentos revelaron que ΔFosB está fosforilado nos residuos Ser e / ou Thr no cerebro e nas células PC12 e confirmou que este último é un bo sistema de cultivo celular no que se pode estudar aínda máis os perfís de fosforilación e degradación de ΔFosB.
CK2 pero non PKC ou CaMKII fosforila o ΔFosB in vitro
Como se describiu anteriormente, a análise da secuencia de aminoácidos ΔFosB revelou altas puntuacións de predición para os sitios de fosforilación de CK2, PKC e CaMKII. Para determinar cales estas quinases poden fosforilar a BFosB, realizamos unha serie de in vitro reaccións de fosforilación usando quinasas purificadas e BFosB recombinante purificado. Como se mostra en figura 3A, dos tres candidatos quinases, só CK2 fosforilou ΔFosB de forma significativa. Ademais, probáronse varias outras quinases (por exemplo, GSK3 e p70S6K) pero non se fosforilaron significativamente BFosB (datos non mostrados). A caracterización adicional da análise de reacción CK2 por tempo revelou que esta quinasa pode catalizar a incorporación de ∼0.5 mol de fosfato por mol de ΔFosB (Fig 3B). O feito de que CK2 poida fosforilar a FosB in vitro a unha considerable estequiometría (∼50%) suxire unha reacción fisioloxicamente relevante. A continuación estudamos a cinética desta reacción incubando CK2 en presenza de cantidades crecentes de ΔFosB purificado e determinamos que CK2 fosforila ΔFosB cun Vmax de 5.8 pmol · min-1 · Μg-1 de encima, a KM de 18.4 μm e a kgato de 0.2 / s (Fig 3C). Os valores obtidos para estes parámetros cinéticos apoian aínda máis a relevancia fisiolóxica desta reacción. Por exemplo, o KM de CK2 para DARPP32, un dos seus substratos máis coñecidos, é 3.4 μm, e kgato é ∼0.3 / s (Girault et al., 1989); o KM para ATP varía de ∼10 – 40 μm (Cochet et al., 1983; Silva-Neto et al., 2002), e que para a caseína varía de ∼10 – 50 μm (Meggio et al., 1977; Pyerin et al., 1987). Xuntos, estes datos indican que ΔFosB é un substrato de boa fe para CK2 in vitro.
Ver a versión máis grande:
Figura 3.
CK2 pero non PKC ou CaMKII fosforila o ΔFosB in vitro. O autoradiógrafo (panel superior) mostra o produto fosforilado e o xel manchado Coomassie (panel inferior) mostra BFosB total presente na reacción. AFoi sometido a ΔFosB recombinante purificado in vitro fosforilación por varias quinasas candidatas (tres delas son mostradas). B, O tempo e os análises estequiométricos indican que CK2 pode fosforilar a BFosB in vitro cunha estequiometría de ∼50%. CA análise cinético da reacción CK2 revelou que ΔFosB é unha boa fe in vitro substrato. A linearización da reacción móstrase nunha trama dobre-recíproca (inferior), pero os parámetros cinéticos derivaron da curva Michaelis-Menten (arriba).
CK2 modula a fosforilación e estabilidade de ΔFosB en células intactas
Para avaliar a relevancia fisiolóxica da fosforilación mediada por CK2 de FosB, realizamos un mapeado comparativo de fosfopéptidos usando in vitro fosforilada e NFosB fosforilada con células PC12. Despois de SDS-PAGE e gel de elución de 32P-ΔFosB (do in vitro reaccións ou do inmunoprecipitado de 32Células marcadas con P), a proteína foi digerida con tripsina e os fosfopéptidos resultantes foron sometidos a separación bidimensional. Esta análise revelou que o principal fosfopéptido da reacción de CK2 se emigró cun dos dous principais fosfopéptidos da fosforilada BFosB nas células PC12 (Fig 4A), mentres que os fosfopéptidos resultantes da reacción de PKC ou CaMKII (datos non mostrados) non o fixeron. Houbo un segundo fosfopéptido FosB no mapa a partir das células PC12, pero debido á incapacidade de calquera das quinases que probamos para xerar un fosfopéptido similar. in vitro, actualmente non sabemos se este segundo fosfopéptido contén un sitio de fosforilación diferente do outro fosfopéptido ou se representa un péptido tríptico distinto que contén o mesmo sitio de fosforilación.
Ver a versión máis grande:
Figura 4.
CK2 modula a fosforilación e estabilidade de ΔFosB en células intactas. A, CK2 pero non PKC parece fosforilar a ΔFosB nas células. Mapas de fosfopéptido bidimensional de ΔFosB fosforilados por CK2 ou PKC in vitro ou por células PC12 intactas. As frechas mostran a comigración do péptido fosforilado CK2 pero non o fosforilado con PKC con un dos fosfopéptidos BFosB obtidos a partir das células PC12. BA fosforilación de BFosB nas células PC12 aumenta tratando as células co potente espermador activador de CK2 (SP) e diminuíu polo tratamento co inhibidor de CK2 DRB. En contraste, a fosforilación de BFosB nas células de PC12 non se viu afectada polo tratamento cun activador de PKC (PMA) ou o inhibidor calfostina-C específico de PKC (Calph). Amósanse un autoradiograma representativo (panel superior) e un inmunooblot (panel inferior). C – F, Efecto da actividade CK2 sobre a estabilidade BFosB. As figuras mostran o tempo (e autoradiogramo representativo) da degradación de BFosB. As células PC12 que expresan transitoriamente ΔFosB foron sometidas a experimentos de persecución de pulsos realizados en ausencia ou presenza do inhibidor DRB de CK2 (C), o activador de CK2 espermina (D), ou o inhibidor de cinasa de amplo espectro H-8 (E), que se usou para controlar os efectos inespecíficos do DRB. F, Efecto de derrubar a subunidade catalítica de CK2 na estabilidade ΔFosB. As células PC12 transfectáronse cun siRNA (Ctr) non dirixido ou siRNA dirixido a CK2α de rata e 24 h despois transfectado cun plásmido ΔFosB. O panel superior mostra inmunotransferencias de lisados de células completas mostrando o efecto do siRNA de CK2 nos niveis de proteína CK2 e ΔFosB. O correspondente inmunoblota para a β-tubulina móstrase como control de carga.
Para abordar a relevancia fisiolóxica de CK2 como quinasa BFosB, tratamos células PC12 que expresan BFosB con dous medicamentos que modulan a actividade de CK2. Como se mostra en figura 4B, A fosforilación de FosB diminuíu polo tratamento das células PC12 co inhibidor DRB permeable á célula CK2Meggio et al., 1990; Szyszka et al., 1995), e aumentado polo tratamento coa espermina de poliamina, coñecida por ser un potente activador de CK2 (Cochet e Chambaz, 1983; Meggio et al., 1983). En contraste, o tratamento das células PC12 co inhibidor de PKC calphostin-C (Kobayashi et al., 1989; Tamaoki et al., 1990) ou o activador de PKC PMA (Schmidt e Hecker, 1975; Beh et al., 1989) non resultou en cambios significativos na fosforilación de BFosB. No caso do PMA, o aumento lixeiro (e non significativo) en 32P-ΔFosB podería contabilizarse cun aumento dos niveis ΔFosB totais causados por este medicamento; de feito, informouse de que os ésteres de forbol induce a expresión de varias proteínas da familia Fos, incluíndo o FosB (Yoza et al., 1992; Suh et al., 2004). Ademais, o tratamento das células co inhibidor de CaMKII permeable á célula m-AIP (Ishida e Fujisawa, 1995; Stevens et al., 1999) tampouco deu como resultado unha diminución da fosforilación de BFosB (datos non mostrados). Xuntos, estes resultados son consistentes cos nosos in vitro descubrimentos e indican que nas células intactas ΔFosB é probablemente fosforilada por CK2 pero non con PKC ou CaMKII. O feito de que a inhibición de CK2 non evite completamente a fosforilación de ΔFosB indica a existencia de sitios de fosforilación adicionais na proteína.
A continuación examinamos se CK2 ten un papel na facturación de ΔFosB e, polo tanto, na súa estabilidade. Para iso realizamos experimentos de persecución de pulsos utilizando células PC12 que expresan FosB tratadas co inhibidor de CK2 ou co activador de CK2 usado no estudo de fosforilación. Como se mostra en figura 4C, o tratamento das células co inhibidor de CK2 DRB tivo un efecto significativo na taxa de rotación de ΔFosB, evidenciado polo cambio de forma da súa curva de degradación, desde o bifásico a unha curva máis próxima á dunha decadencia exponencial. Por outra banda, a presenza da esperma activadora de CK2 causou unha diminución significativa da taxa de degradación de ΔFosB, que levou á acumulación da proteína durante as primeiras horas da persecución (Fig 4D).
Como ocorre con moitos activadores e inhibidores de cinasas, a esperma e DRB poden ter efectos metabólicos fóra da modulación da actividade de CK2. De feito, demostrouse que a DRB inhibe a quinasa asociada ao factor de transcrición IIH (TFIIH) (Yankulov et al., 1995), o que resulta na inhibición da transcrición mediada por ARN polimerase II. Debido a que este efecto podería afectar á estabilidade de ,FosB, analizamos o efecto do inhibidor de ampla espectro quinase H-8 (Hidaka e Kobayashi, 1992) sobre o volume de negocio de BFosB cunha concentración (200 μm) que se sabe que inhibe a quinasa asociada a TFIIH pero non a CK2 (Yankulov et al., 1995). Como se mostra en figura 4E, o tratamento con H-8 non afectou a taxa de rotación de BFosB. Resultados similares foron obtidos con H-7, outro inhibidor da cinasa de amplo espectro, usado nunha concentración que inhibe a quinasa asociada a TFIIH pero non a CK2 (datos non mostrados). Estes datos apoian aínda máis a interpretación de que a redución da estabilidade ΔFosB causada por DRB é máis probable atribuible á inhibición de CK2.
Para establecer aínda máis a función de CK2 no volume de negocio de BFosB, investigamos as consecuencias de derrubar CK2 a través de siRNA. Realizamos estes experimentos utilizando células PC12 que foron primeiro transfectadas con siRNA de control (non dirixido) ou siRNA que se dirixe ao mRNA da subunidade catalítica da rata CK2 (CK2α) e 24 h despois transfectada con ΔFosB. Como se mostra en figura 4F, a transfección co siRNA de CK2α eliminou de forma eficiente e específica os niveis de proteínas de CK2α sen afectar aos niveis de ΔFosB (panel superior). A análise de pulso-persecución revelou que derrubar CK2 resultou nun aumento significativo da taxa de rotación de BFosB como se evidencia na degradación máis rápida da proteína. O feito de que a inhibición da actividade de CK2 (sexa mediante tratamento DRB ou siRNA) aumenta o volume de negocio de ΔFosB e resulta na desaparición do compoñente de velocidade lenta da curva bifásica, mentres que a activación de CK2 aumenta a fase lenta da curva, apoia forte para a idea de que CK2 ten un papel na regulación da "estabilidade de FosB".
CK2 fosforila ΔFosB en Ser27
Para comezar a identificar o (s) sitio (s) en fosforilados por phFosB por CK2, realizamos o análise de fosfoaminoácidos do ΔFosB recombinante fosforilado por CK2 in vitro e de ΔFosB fosforilado en células PC12. Estes experimentos revelaron que, en ambos os casos, o único fosfo-aminoácido detectado era o fosfo-ser (Fig 5A). Este descubrimento, xunto coa estequiometría obtida para o CK2 in vitro reacción de fosforilación (∼50%) (Fig 3B) e a presenza de só un punto significativo no mapa de fosfopéptido CK2 (Fig 4A), suxire que a fosforilación de CK2 de ΔFosB está limitada probablemente a un único residuo de serina. Esta conclusión é consistente coa análise do sitio web de consenso de fosforilación (Fig 2B), que predijo só unha candidata serina, é dicir, Ser27, para CK2. A análise taxonómica revelou que o Ser27 está altamente conservado a través da evolución entre os membros da familia Fos (Fig 5B), o que suxire que pode ter unha importante función fisiolóxica.
Ver a versión máis grande:
Figura 5.
CK2 fosforila ΔFosB en Ser27. A, Análise de fosfaminoacido de fosforilado CK2 (in vitro) e BFosB fosforilado por células PC12 amosando que, en ambos casos, o principal residuo fosforilado é a serina. BA análise entre especies cruzadas da secuencia de aminoácidos FosB / BFosB revelou unha elevada conservación de Ser27 entre os membros da familia Fos de humano a peixe cebra (realce escuro) Non obstante, o residuo ácido na posición + 3, que é necesario para o sitio de consenso de CK2, non se conserva (luz resaltada). CAs células HeLa transfectáronse transitoriamente con ΔFosB (WT) de tipo salvaxe ou ΔFosB que contén unha mutación puntual para substituír a Ser27 por Ala (S27A). As células etiquetáronse metabólicamente con 32PH3PO4 e tratado con vehículo ou con esperma (SP) para activar CK2. Amosarase un autoradiograma representativo (panel superior) e un inmunotransferencia (panel inferior) dos inmunoprecipitados ΔFosB obtidos. Móstrase o inmunoprecipitado das células simuladas (vector).
Para determinar se Ser27 está fosforilado en ΔFosB, mutamos este residuo en Ala e analizamos as consecuencias sobre o estado de fosforilación da proteína. Para iso utilizamos células HeLa (que poden ser transfectadas con maior eficiencia) para expresar transitoriamente o mutante WT ou S27A ΔFosB. Aproximadamente 24 h despois da transfección, as células foron etiquetadas metabólicamente con 32Preparáronse ortofosfatos de P e lisados de células integrais. Tras inmunoprecipitación e SDS-PAGE, 32P-ΔFosB detectouse mediante autoradiografía e ΔFosB total por inmunotransferencia. Como se mostra en figura 5C (panel inferior), ΔFosB non se detectou nas células transfectadas por vectores, mentres que as células transfectadas con mutante WT ou S27A ΔFosB expresaron con éxito a proteína. Descubrimos que a mutación S27A causou unha redución significativa (∼30%) en 32Niveis de P-ΔFosBFig 5C, panel superior e gráfico), indicando que en células vivas, ΔFosB está fosforilado en Ser27. Nun esforzo para establecer se nas células Ser27 é realmente fosforilada por CK2, comparamos a capacidade da espermina activadora de CK2 para modular a fosforilación de WT e S27A ΔFosB. Como observamos anteriormente nas células PC12 (Fig 4B), o tratamento das células HeLa con espermina aumentou significativamente a fosforilación da proteína WT. O feito de que este efecto diminuíse significativamente pola mutación S27A (Fig 5C) soporta a interpretación de que Ser27 en ΔFosB é un substrato fisiolóxico para CK2.
A fosforilación de Ser27 regula a estabilidade de FosB
Unha vez establecido que a estabilidade de isFosB diminúe cando CK2 é inhibido e mellorado cando CK2 está activado (Fig 4), e que CK2 fosforila ΔFosB en Ser27 (Fig 5), previmos que a prevención da fosforilación deste sitio debería desestabilizar a proteína. Os experimentos de persecución de pulso realizados con células HeLa que expresan transitoriamente o mutante WT ou S27A ΔFosB revelaron que, como previsto, a mutación S27A resultou nun aumento significativo na taxa de degradación de ΔFosB e unha diminución da vida media da proteína. (Fig 6A). A continuación investigamos se este mecanismo regulador tamén ocorre na liña celular PC12 máis parecida á neurona. Estes experimentos revelaron que, como observamos nas células HeLa, a mutación punto S27A causa unha diminución drástica da vida media da ΔFosB nas células PC12 (de ∼11 a ∼4 h) (Fig 6B). O feito de que esta desestabilización sexa semellante ao causado pola inhibición de CK2 ou o descenso (Fig 4) apoia máis a idea de que a fosforilación mediada por CK2 de Ser27 regula a estabilidade de BFosB. Obtéronse evidencias adicionais do papel regulador da fosforilación de Ser27 no volume de negocio da proteína ΔFosB usando unha mutación fosfomimética Ser27 to Asp (S27D). Considérase que a mutación S27D é fosfomimética, porque coloca un grupo grande (carboxilo) cargado negativamente no aminoácido 27 e, polo tanto, imita parcialmente a fosforilación de Ser27. Como se mostra en figura 6C, a mutación S27D causou o efecto contrario da mutación S27A e resultou nunha proteína significativamente máis estable que a proteína WT. Do mesmo xeito que o efecto obtido despois da activación de CK2 (Fig 4D), a mutación S27D resultou na acumulación e aumentou así os niveis de ΔFosB nas primeiras horas de persecución.
Ver a versión máis grande:
Figura 6.
A fosforilación de Ser27 regula a estabilidade de FosB. A, C, Análise de pulso-persecución que mostra o efecto da fosforilación de Ser27 na taxa de rotación de ΔFosB. Amosáronse o perfil de degradación e as vidas medias estimadas de BFosB (WT) de tipo salvaxe, o mutante Ser27 a Ala (S27A) e o mutante fosfomimético Ser27 a Asp (S27D). Os mesmos resultados obtivéronse nas células HeLa (A) e células PC12 (B, C).
A fosforilación de Ser27 estabiliza BFosB impedindo a súa degradación de proteasomal
Para comezar a dilucidar o mecanismo polo cal a fosforilación de Ser27 estabiliza BFosB, examinamos a capacidade dos inhibidores do proteasoma MG132 (Palombella et al., 1994; Tsubuki et al., 1996) e epoxomicina (Hanada et al., 1992; Kim et al., 1999) para modular a taxa de degradación de mutante WT e S27A ΔFosB. Os experimentos de pulso-persecución realizáronse utilizando células PC12 infectadas cun VHS recombinante que expresaba WT ou S27A ΔFosB e tratábase con DMSO ou un dos dous inhibidores do proteasoma. Estes experimentos revelaron que, aínda que a taxa de degradación da proteína WT é relativamente insensible á presenza de calquera dos dous inhibidores do proteasoma (Fig 7A), o do mutante S27A é sensible a estas drogas (Fig 7B). Isto indica que, a diferenza da proteína WT, o mutante S27A é o obxectivo da degradación do proteasomal. De feito, o tratamento das células con MG132 ou epoxomicina revertiu completamente o efecto da mutación S27A na taxa de degradación de ΔFosB, evidenciado por un aumento na vida media do mutante S27A de ∼4 a UM9 h para MG132 e ∼ 12 h para a epoxomicina (Fig 7B). Xuntos, estes resultados indican que a fosforilación de FosB en Ser27 protexe a proteína da degradación do proteasomal e, polo tanto, é esencial para a súa inusual estabilidade.
Ver a versión máis grande:
Figura 7.
A fosforilación de Ser27 estabiliza ΔFosB impedindo a súa degradación proteasomal. A, B, Análise de persecución de pulso con células PC12 infectadas por HSV que mostran o perfil de degradación e vidas medias estimadas de BFosB de tipo salvaxe (A) ou S27A ΔFosB (B) en ausencia ou presenza de calquera dos dous inhibidores do proteasoma [MG132 e epoxomicina (Epoxo)]. Nótese o feito de que ningún dos fármacos ten un efecto significativo sobre o volume de negocio de BFosB de tipo salvaxe, mentres que o tratamento das células con calquera inhibidor do proteasoma resultou na estabilización de S27A ΔFosB. C, Un modelo para o papel da fosforilación de Ser27 na capacidade de ΔFosB de mediar a plasticidade cerebral a longo prazo. Unha vez inducido, unha porción de FosB está estabilizada no cerebro pola fosforilación mediada por CK2 de S27. Isto resulta na súa acumulación, que á súa vez resulta en cambios duradeiros na expresión xénica. Estes cambios estables na expresión xénica contribúen a adaptacións estables do comportamento. Por outra banda, a desfosforilación de S27 polas fosfatasas Ser / Thr PP1 e / ou PP2A resulta en desestabilización da proteína e no seu procesamento pola maquinaria proteasomal.
Sección anteriorA seguinte sección
Conversa
No presente estudo, amosamos que ΔFosB ten unha vida media de ∼10 h no cultivo celular, o que o fai estable en comparación co FosB de longa duración e coa maioría dos outros factores de transcrición inducibles, cuxas semividas no cultivo celular poden ser tan curtas en poucos minutos e raramente excede 3 h (Hann e Eisenman, 1984; Dobrazanski et al., 1991; Roberts e Whitelaw, 1999; Ferrara et al., 2003; Hirata et al., 2004). Ademais, atopamos que ΔFosB está fosforilado no cerebro e que a súa fosforilación é sensible ao ácido okadaico do inhibidor PP1 / PP2A. Os nosos estudos de cultivo celular demostran que a estabilidade de BFosB é modulada por CK2, cunha maior actividade de CK2 estabilizando a proteína. Finalmente, os nosos descubrimentos suxiren que CK2 fosforila ΔFosB nunha serina terminal N altamente conservada (S27) e demostra que a fosforilación de S27 protexe ΔFosB da degradación do proteasomal. Propoñemos, polo tanto, un modelo polo cal a fosforilación de FosB en S27 por CK2 é un mecanismo regulador crítico da facturación de ΔFosB (Fig 7C). Esta estabilización mediada por fosforilación de BFosB é funcionalmente importante, xa que se demostrou que o aumento dos niveis de haveFosB en rexións cerebrais particulares regulan numerosos xenes neuronais in vivo e exercer poderosos efectos no comportamento en modelos animais de varios trastornos neuropsiquiátricos (ver Introdución).
Aínda que a fosforilación é un xeito rápido e reversible de regular a actividade transcricional de certos factores de transcrición, como o CREB (proteína de unión ao elemento de resposta cAMP) (Bohmann, 1990), a modulación da degradación dos factores de transcrición proporciona unha forma de regulación aínda máis poderosa (menos fácilmente reversible) (Desterro et al., 2000). Os factores de transcrición cuxa actividade funcional está regulada ao nivel da súa degradación inclúen NFκB (Desterro et al., 2000), c-Myc (Sears et al., 1999), e c-Fos (Ferrara et al., 2003), entre outros. En moitos casos, a fosforilación é un regulador clave da estabilidade dun factor de transcrición, como se mostrou para c-Fos (Okazaki e Sagata, 1995; Tsurumi et al., 1995), Antígeno relacionado con Fos-1 (Fra-1) (Vial e Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe et al., 2001), c-Jun (Fuchs et al., 1996), JunB (Fuchs et al., 1997), ATF2 (Fuchs et al., 2000), e p53 (Buschmann et al., 2001). Os nosos estudos engaden así BFosB a esta lista de factores de transcrición cuxa actividade funcional está regulada a través da súa estabilidade dependente da fosforilación.
A CK2 é unha quinasa Ser / Thr omnipresente e constitutivamente activa que ten> 300 supostos substratos identificados ata o momento e está implicada en múltiples procesos biolóxicos, incluíndo a morte e supervivencia celularLitchfield, 2003; Unger et al., 2004), respostas ao estrés celular (Yanagawa et al., 1997; Kato et al., 2003), e reparación do ADN e remodelación da cromatinaBarz et al., 2003; Krohn et al., 2003). Máis dun terzo dos substratos supostos de CK2 son proteínas implicadas na regulación da expresión xénica (Meggio e Pinna, 2003). De feito, demostrouse que CK2 é unha cinasa nuclear prominente (Krek et al., 1992) (para revisión, vexa.) Yu et al., 2001) e interactuar cos dominios bZIP de varios factores de transcrición (Yamaguchi et al., 1998). Tamén se demostrou que a fosforilación mediada por CK2 modula a degradación (mellorándoa ou diminuíndo) de moitas proteínas, incluíndo IkB (Schwarz et al., 1996), PTEN (Torres e Pulido, 2001), conexina de lentes (Yin et al., 2000), proteína asociada á cromatina HMG1 (Wisniewski et al., 1999), e varios factores de transcrición como HMGB (Stemmer et al., 2002), Myf-5Winter et al., 1997), e c-Myc (Channavajhala e Seldin, 2002). CK2 é máis abundante no cerebro (Alcazar et al., 1988; Girault et al., 1990), ea súa actividade estivo implicada en moitos aspectos da función cerebral, incluída a supervivencia neuronal.Boehning et al., 2003), diferenciación (Nuthall et al., 2004), función de canles iónicos (Jones e Yakel, 2003; Bildl et al., 2004), e potenciación a longo prazo e plasticidade neuronalDiaz-Nido et al., 1992; Lieberman e Mody, 1999; Reikhardt et al., 2003).
A pesar desta crecente evidencia do papel de CK2 na regulación da función neuronal, pouco se sabe sobre o que controla a súa actividade. Crese que CK2 é constitutivamente activo, con regulación da súa capacidade de fosforilar substratos específicos dependendo principalmente de cambios na súa localización intracelular (por exemplo, o citosol vs núcleo) (Ahmed e Tawfic, 1994; Yu et al., 1999). Esta información fai unha pregunta importante sobre que sinais son necesarios para inducir a acumulación de BFosB no cerebro despois da estimulación crónicaFig 7C). Un requisito é a activación repetida da fosB xene e inducción do ARNm de BFosBChen et al., 1995). Os nosos datos indican que a fosforilación de CK2 de ΔFosB é fundamental para a súa estabilidade, o que suxire que pode requirirse un segundo sinal para os efectos a longo prazo de ΔFosB na expresión xénica, é dicir, un sinal que estimula a fosforilación da proteína por CK2. Isto podería implicar a activación de CK2 por algún mecanismo descoñecido ou a súa translocación cara ao núcleo. Alternativamente, a fosforilación de CK2 de ΔFosB pode ser constitutiva, de xeito que a proteína ΔFosB tradúcese en resposta a cada estímulo, unha porción del está fosforilada e estabilízase así, de xeito que, con estimulación repetida, acumúlase a niveis altos nas neuronas afectadas.
Os nosos resultados mostran que CK2 e S27 probablemente non sexan a única quinasa e sitio responsable da fosforilación de BFosB, porque nin a inhibición de CK2 nin a mutación S27A foron capaces de impedir completamente a fosforilación de BFosB. Do mesmo xeito, o feito de que a mutación S27A resulte nunha redución de 30% en fosfo-BFosB argumenta que S27 é un importante sitio de fosforilación da proteína. Non obstante, investigamos outras putinas quinases e sitios de fosforilación en ΔFosB. Finalmente, tamén será importante analizar a fosforilación de S27 e calquera outro sitio de fosforilación en ΔFosB no cerebro in vivo despois de varios tipos de estimulación crónica, por exemplo, mediante o uso de espectrometría de masas ou anticorpos fosfosfecíficos.
Como se mencionou anteriormente, o S27 en ΔFosB está altamente conservado ao longo da evolución e entre outras proteínas da familia Fos. Non obstante, o sitio de consenso para CK2 non é: como se mostra en figura 5B, só FosB / ΔFosB (eo xenólogo Zebrafish), pero non c-Fos ou Fra-2, posúen un residuo ácido en + 3, un determinante clave da fosforilación de CK2 (Marin et al., 1986; Meggio et al., 1994). Así, a falta de fosforilación de CK2 en S27 pode explicar por que outras proteínas da familia Fos non son tan estables como FosB. Non obstante, isto non explica por que FosB de corpo enteiro, que ten o mesmo sitio de consenso de CK2 como ΔFosB, non está estabilizado de forma similar. Non sabemos se o FosB de corpo enteiro está fosforilado por CK2 neste residuo conservado. Os únicos informes de FosB (Skinner et al., 1997) e c-Fos (Okazaki e Sagata, 1995; Chen et al., 1996) A fosforilación describe os sitios da rexión C-terminal destas proteínas, que está ausente en ΔFosB. A fosforilación potencial de FosB de longa duración e outras proteínas da familia Fos por CK2 require unha investigación directa. Non obstante, mesmo se fosforilaron, sábese que as outras proteínas da familia Fos conteñen motivos nos seus extremos C que se dirixen ás proteínas para unha rápida degradación (Papavassiliou et al., 1992; Jariel-Encontre et al., 1997; Acquaviva et al., 2002). Por exemplo, demostrouse que un tramo de residuos ∼21 presentes no extremo C de todas as proteínas da familia Fos, pero ausente en ΔFosB, actúa como un dominio desestabilizador para c-Fos (Acquaviva et al., 2001). Descubrimos que, aínda que esta secuencia desestabiliza de xeito similar FosBCarle et al., 2004), a ausencia deste dominio en BFosB non conta plenamente coa súa estabilización. Pola contra, a combinación da ausencia deste dominio de terminais C e da fosforilación de Ser27 parece explicar plenamente a diferenza aproximadamente de cinco veces na estabilidade entre BFosB e FosB.
Aínda que a degradación das proteínas da familia Fos é complexa e non se comprende plenamente, a degradación do proteasomal parece ser o principal camiño implicado (Salvat et al., 1999; Acquaviva et al., 2002; Ferrara et al., 2003). Os datos aquí presentados, nos que os inhibidores do proteasoma non alteran significativamente a taxa de degradación de BFosB, argumentan que, a diferenza doutras proteínas da familia Fos, ΔFosB evade o proteasoma de 26S e iso xoga un papel central na súa estabilización. Propoñemos, polo tanto, un esquema polo que a estabilidade mellorada de isFosB pode atribuírse á combinación de dous factores principais: (1) a ausencia dun dominio C-terminal desestabilizador e (2) a fosforilación de S27 por CK2.
En resumo, o presente estudo proporciona unha visión mecanística de por que BFosB, un produto do xene inmediato precoz fosB, é, a diferenza dos outros membros da familia Fos, unha proteína de longa vida. Aínda que se pensa que outras proteínas da familia Fos median un acoplamiento rápido-transitorio de estímulos-transcriciónMorgan e Curran, 1995), a estabilidade relativa de confFosB lle confire a capacidade de mediar cambios transcricionais duradeiros inducidos por estimulación crónica. Isto apoia a opinión de que ΔFosB funciona como un interruptor molecular sostido no cerebro, convertendo gradualmente as respostas agudas en adaptacións crónicas. A identificación da fosforilación de Ser27 como mecanismo central para a estabilidade de opensFosB abre novas vías para o desenvolvemento de medios para regular a función de BFosB e modular así os seus efectos a longo prazo sobre a plasticidade neural e comportamental.
Sección anteriorA seguinte sección
Notas ao pé
- Recibido o novembro de 21, 2005.
- A revisión recibiu febreiro 21, 2006.
- Aceptado en abril de 2, 2006.
- Este traballo foi apoiado por unha Alianza Nacional para a Investigación sobre Esquizofrenia e Premio Investigador Xove Premio a PGU, un Instituto Nacional de Drogas Abuso (NIDA) Premio Servizo Nacional de Investigación para PGU, e subvencións do Instituto Nacional de Saúde Mental e NIDA para EJN Nós. agradecer ao doutor James Bibb a súa axuda co in vitro Os ensaios de fosforilación, o doutor Ming-Hu Han pola súa axuda na preparación de franxas cerebrais utilizadas para a etiquetaxe metabólica, e Dr Rachael Neve pola súa axuda na embalaxe dos VHS recombinantes.
- Enderezo actual de G. Rudenko: Instituto de Ciencias da Vida e Departamento de Farmacoloxía, Universidade de Michigan, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
- A correspondencia debería dirixirse a Eric J. Nestler, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75390-9070. Correo electrónico: [protexido por correo electrónico]
References
Acquaviva C, Brockly F, Ferrara P, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) Identificación dun motivo tripeptídico C-terminal implicado no control da degradación rápida do proteasomal da proto-oncoproteína c-Fos durante a transición de fase G (0) -a-S. oncoxene 20:7563-7572.
Acquaviva C, Bossis G, Ferrara P, F Brockly, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2002) Vías de degradación múltiples para as proteínas da familia Fos. Ann NY Acad Sci 973:426-434.
Ahmed K, Tawfic S (1994) Mecanismo de regulación intracelular da proteína quinasa CK2: papel da asociación subnuclear mediada por estímulos. Cell Mol Biol Res 40:539-545.
Alcázar A, Martín E, López-Fando J, Salinas M (1988) Un procedemento de purificación mellorado e propiedades da casexinasa II a partir do cerebro. Neurochem Res 13:829-836.
Andersson M, Westin JE, Cenci MA (2003) Curso de tempo dos niveis de inmunorreactividade estratal DeltaFosB e niveis de ARNm de prodinorfina tras a interrupción do tratamento dopaminomimético crónico. Eur J Neurosci 17:661-666.
Barz T, Ackermann K, Dubois G, Eils R, Pyerin W (2003) As pantallas de expresión de todo o xenoma indican un papel global para a proteína quinasa CK2 na remodelación da cromatina. J Cell Sci 116:1563-1577.
Texto completo abstracto / LIBRE
Beh I, Schmidt R, Hecker E (1989) Dous isozimas de PKC atopadas nas células HL-60 mostran unha diferenza de activación polo éster de forbol TPA. FEBS Lett 249:264-266.
Bildl W, Strassmaier T, Thurm H, Andersen J, Eble S, Oliver D, Knipper M, Mann M, Schulte U, Adelman JP, Fakler B (2004) A quinasa de proteínas CK2 está montada con canles K + de condutancia pequena (2 +) e regula a caída da canle. Neurona 43:847-858.
Bing G, Wang W, Qi Q, Feng Z, P Hudson, Jin L, Zhang W, Bing R, Hong JS (1997) Expresión a longo prazo do antíxeno relacionado con Fos e expresión transitoria de delta FosB asociada a convulsións no hipocampo de ratos e estriado. J Neurochem 68:272-279.
Blom N, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Gammeltoft S, Brunak S (2004) Predicción de glicosilación post-translacional e fosforilación de proteínas a partir da secuencia de aminoácidos. Proteómica 4:1633-1649.
Boehning D, Moon C, Sharma S, HJ KJ, Hester LD, Ronnett GV, Shugar D, Snyder SH (2003) A neurotransmisión de monóxido de carbono activada pola fosforilación de CK2 de hemo oxigenase-2. Neurona 40:129-137.
Bohmann D (1990) Fosforilación do factor de transcrición: unha conexión entre a transdución do sinal ea regulación da expresión xénica. Células de cancro 2:337-344.
Buschmann T, Potapova O, Bar-Shira A, Ivanov VN, Fuchs SY, Henderson S, Fried VA, Minamoto T, Alarcon-Vargas D, Pincus MR, Gaarde WA, Holbrook NJ, Shiloh Y, Ronai Z (2001) A fosforilación da quinasa terminal NH2 de xuño de p53 en Thr-81 é importante para as actividades de estabilización e transcrición p53 en resposta ao estrés. Mol Cell Biol 21:2743-2754.
Texto completo abstracto / LIBRE
Carle TL, Ulery PG, Nestler EJ (2004) A ausencia dun dominio C-terminal da familia Fos conservado contribúe á estabilidade única de deltaFosB. Soc Neurosci Abstr 30: 692.2.
Channavajhala P, Seldin DC (2002) Interacción funcional da proteína quinasa CK2 e c-Myc na linfomagênese. oncoxene 21:5280-5288.
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ (1995) Regulación de proteínas tipo FosB e FosB mediante tratamentos electroconvulsivos e tratamento de cocaína. Mol Pharmacol 48:880-889.
Chen J, Kelz MB, Hope BT, Nakabeppu Y, Nestler EJ (1997) Antígenos relacionados con Fos crónicos: variantes estables de BFosB inducidas no cerebro por tratamentos crónicos. J Neurosci 17:4933-4941.
Texto completo abstracto / LIBRE
Chen RH, Juo PC, Curran T, Blenis J. (1996) A fosforilación de c-Fos no terminal C mellora a súa actividade transformadora. oncoxene 12:1493-1502.
Choe ES, Parelkar NK, Kim JY, Cho HW, Kang HS, Mao L, Wang JQ (2004) A proteína fosfatase 1 / 2A o ácido okadaico aumenta a fosforilación de CREB e Elk-1 e a expresión de c-fos no estriado de ratos in vivo. J Neurochem 89:383-390.
Cochet C, Chambaz EM (1983) Fosforilacións de proteínas mediadas por poliaminas: posible obxectivo para a acción da poliamina intracelular. Mol célula endocrinol 30:247-266.
Cochet C, Feige JJ, Chambaz EM (1983) Propiedades catalíticas e moleculares dunha caseína quinasa de tipo G altamente purificada do tecido pulmonar bovino. Biochim Biophys Acta 743:1-12.
Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) A sobreexpresión específica do tipo de célula estriatal en DeltaFosB aumenta o incentivo para a cocaína. J Neurosci 23:2488-2493.
Texto completo abstracto / LIBRE
Daunais JB, Roberts DC, McGinty JF (1993) A auto-administración de cocaína aumenta a preprodnorfina, pero non o c-fos, mRNA no estriado de ratos. NeuroReport 4:543-546.
Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT (2000) Regulación dos factores de transcrición por degradación de proteínas. Cell Mol Life Sci 57:1207-1219.
Diaz-Nido J, Armas-Portela R, Avila J (1992) O incremento na actividade do tipo citoplasmático caseína quinasa II acompaña ao crecemento da neurita tras a inhibición da síntese de ADN nas células de neuroblastoma NIA-103. J Neurochem 58:1820-1828.
Di Maira G, Salvi M, Arrigoni G, Marin O, Sarno S, F Brustolon, Pinna LA, Ruzzene M (2005) A proteína quinasa CK2 fosforila e regula a Akt / PKB. Cell Death Differ 12:668-677.
Dobrazanski P, Noguchi T, Kovary K, CA Rizzo, Lazo PS, Bravo R (1991) Os dous produtos do xene fosB, FosB ea súa forma curta, FosB / SF, son activadores transcricionais nos fibroblastos. Mol Cell Biol 11:5470-5478.
Texto completo abstracto / LIBRE
Ferrara P, Andermarcher E, Bossis G, Acquaviva C, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2003) Os determinantes estruturais responsables da degradación proteasomal da proteína c-Fos varían segundo as condicións de expresión. oncoxene 22:1461-1474.
Fuchs SY, Dolan L, Davis RJ, Ronai Z (1996) Orientación dependente da fosforilación da ubiquitinación c-Jun por N-quinasa Jun. oncoxene 13:1531-1535.
Fuchs SY, Xie B, Adler V, Fried VA, Davis RJ, Ronai Z (1997) As cinasas c-Jun NH2-terminal dirixen a ubiquitinación dos seus factores de transcrición asociados. J Biol Chem 272:32163-32168.
Texto completo abstracto / LIBRE
Fuchs SY, Tappin I, Ronai Z (2000) A estabilidade do factor de transcrición ATF2 está regulada pola fosforilación e a desfosforilación. J Biol Chem 275:12560-12564.
Texto completo abstracto / LIBRE
Girault JA, Hemmings HC Jr, Williams KR, Nairn AC, Greengard P (1989) Fosforilación de DARPP-32, fosfoproteína regulada por dopamina e cAMP, por caseína quinasa II. J Biol Chem 264:21748-21759.
Texto completo abstracto / LIBRE
Girault JA, Hemmings HC Jr, Zorn SH, Gustafson EL, Greengard P (1990) Caracterización no cerebro de mamíferos dunha serina quinasa DARPP-32 idéntica á caseína quinasa II. J Neurochem 55:1772-1783.
Hanada M, K Sugawara, Kaneta K, Toda S, Nishiyama Y, Tomita K, Yamamoto H, Konishi M, Oki T (1992) Epoxomicina, un novo axente antitumoral de orixe microbiano. J Antibiot (Tokio) 45:1746-1752.
Hann SR, Eisenman RN (1984) Proteínas codificadas polo oncogeno c-myc humano: expresión diferencial en células neoplásicas. Mol Cell Biol 4:2486-2497.
Texto completo abstracto / LIBRE
Hemmings HC Jr, JA Girault, Williams KR, LoPresti MB, Greengard P (1989) ARPP-21, unha fosfoproteína regulada por AMP cíclico (Mr = 21,000) enriquecida en rexións cerebrais dopaminérxicas-inervadas. Secuencia de aminoácidos do sitio fosforilado por AMP cíclico en células intactas e estudos cinéticos da súa fosforilación in vitro. J Biol Chem 264:7726-7733.
Hidaka H, Kobayashi R (1992) Farmacoloxía dos inhibidores da proteína quinasa. Annu Rev Pharmacol Toxicol 32:377-397.
Hirata H, Bessho Y, Kokubu H, Masamizu Y, Yamada S, Lewis J, Kageyama R (2004) A inestabilidade da proteína Hes7 é crucial para o reloxo de segmentación de somita. Nat Genet 36:750-754.
Hiroi N, Graybiel AM (1996) Os tratamentos neurolépticos típicos e atípicos inducen distintos programas de expresión do factor de transcrición no estriado. J Comp Neurol 374:70-83.
Hope B, Kosofsky B, Hyman SE, Nestler EJ (1992) Regulación da expresión xenética inmediata e da unión AP-1 no núcleo da rata accumbens pola cocaína crónica. Proc Natl Acad Sci Estados Unidos 89:5764-5768.
Texto completo abstracto / LIBRE
Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ (1994a) O tratamento electroconvulsivo crónico (ECS) resulta na expresión dun complexo AP-1 de longa duración no cerebro con composición e características alteradas. J Neurosci 14:4318-4328.
Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, MJ Iadarola, Nakabeppu Y, Duman RS, EJ Nestler (1994b) Indución dun complexo AP-1 de longa duración composto de proteínas similares a Fos no cerebro por cocaína crónica e outros tratamentos crónicos. Neurona 13:1235-1244.
Ishida A, Fujisawa H (1995) Estabilización da proteína quinase II dependente da calmodulina a través do dominio autoinhibitorio. J Biol Chem 270:2163-2170.
Texto completo abstracto / LIBRE
Jariel-Encontre I, Salvat C, Steff AM, Pariat M, Acquaviva C, Furstoss O, Piechaczyk M (1997) Mecanismos complexos para a degradación de c-fos e c-jun. Mol Biol Rep 24:51-56.
Jones S, Yakel JL (2003) A caseína quinasa ii (proteína quinase ck2) regula a función da canle do receptor 5-ht (3) da serotonina nas células ng108-15. Neurociencia 119:629-634.
Kato T Jr, Delhase M, Hoffmann A, Karin M (2003) CK2 é unha cinasa IkappaB C-terminal responsable da activación de NF-kappaB durante a resposta UV. Mol Cell 12:829-839.
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, DJ Surmeier, Neve RL, Duman RS, MR Picciotto, Nestler EJ (1999) A expresión do factor de transcrición deltaFosB no cerebro controla a sensibilidade á cocaína. Natureza 401:272-276.
Kim KB, Myung J, Sin N, tripulantes CM (1999) Inhibición do proteasoma polos produtos naturais epoxomicina e dihidroeponemicina: comprensión da especificidade e da potencia. Bioorg Med Chem Lett 9:3335-3340.
Kobayashi E, Nakano H, Morimoto M, Tamaoki T (1989) Calphostin C (UCN-1028C), un novo composto microbiano, é un inhibidor moi potente e específico da proteína quinase C. Biochem Biophys Res Commun 159:548-553.
Krek W, Maridor G, Nigg EA (1992) A caseína quinasa II é un encima predominantemente nuclear. J Cell Biol 116:43-55.
Texto completo abstracto / LIBRE
Krohn NM, Stemmer C, Fojan P, Grimm R, Grasser KD (2003) A proteína quinasa CK2 fosforila a proteína de dominio do grupo de alta mobilidade SSRP1, o que induce o recoñecemento do ADN danado polos UV. J Biol Chem 278:12710-12715.
Texto completo abstracto / LIBRE
Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, Russo SJ, LaPlant Q, Whistler K, Neve RL, Self DW, Nestler EJ (2005) A remodelación da cromatina é un mecanismo fundamental na plasticidade inducida por cocaína no estriado. Neurona 48:303-314.
Lieberman DN, Mody I (1999) A caseína quinasa II regula a función da canle NMDA nas neuronas do hipocampo. Nat Neurosci 2:125-132.
Litchfield DW (2003) Proteína quinasa CK2: estrutura, regulación e papel nas decisións celulares de vida e morte. Biochem J 369:1-15.
Manabe T, Kuramoto N, Nakamichi N, Aramachi K, Baba K, Hirai T, Yoneyama M, Yoneda Y (2001) Degradación da proteína c-Fos expresada por N-metil-d-acido ácido en fraccións nucleares do hipocampo murino. Brain Res 905:34-43.
Mandelzys A, Gruda MA, Bravo R, Morgan JI (1997) Ausencia dun antígeno relacionado con fosas 37 kDa e unha actividade de unión de AD similar a AP-1 nos cerebros de ratas fosB tratadas con ácido kainico. J Neurosci 17:5407-5415.
Texto completo abstracto / LIBRE
Marin O, Meggio F, Marchiori F, Borin G, Pinna LA (1986) Especificidade do sitio da caseína quinasa-2 (TS) a partir do citosol do fígado de rata. Un estudo con substrato de péptidos modelo. Eur J Biochem 160:239-244.
McClung CA, Nestler EJ (2003) Regulación da expresión xénica e recompensa por cocaína por CREB e DeltaFosB. Nat Neurosci 6:1208-1215.
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ (2004) DeltaFosB: un interruptor molecular para adaptación a longo prazo no cerebro. Brain Res Mol Brain Res 132:146-154.
Meggio F, Pinna LA (2003) Un milleiro e un substrato da proteína quinasa CK2? FASEB J 17:349-368.
Texto completo abstracto / LIBRE
Meggio F, Donella-Deana A, Pinna LA, Moret V (1977) Fosforilación de fraccións de caseína polo "fosvitin quinasa" do fígado de rata. FEBS Lett 75:192-196.
Meggio F, Brunati AM, Pinna LA (1983) Autofosforilación do tipo X case de quinasa 2 en ambas as súas subunidades alfa e beta. Influencia de diferentes efectores. FEBS Lett 160:203-208.
Meggio F, Shugar D, Pinna LA (1990) Derivados de ribofuranosil-benzimidazol como inhibidores da caseína quinasa-2 e da caseína quinasa-1. Eur J Biochem 187:89-94.
Meggio F, Marin O, Pinna LA (1994) Especificidade do substrato da proteína quinasa CK2. Cell Mol Biol Res 40:401-409.
Miller C, Zhang M, El Y, Zhao J, JP Pelletier, J Martel-Pelletier, JA Di Battista (1998) Indución transcricional do xene ciclooxixenase-2 por inhibición do ácido okadaico da actividade fosfatase nos condrocitos humanos: co-estimulación das proteínas de unión nuclear AP-1 e CRE. J Cell Biochem 69:392-413.
Moratalla R, Elibol B, Vallejo M, Graybiel AM (1996) Cambios a nivel de rede na expresión de proteínas Fos-Jun inducibles no estriado durante o tratamento e retirada crónica de cocaína. Neurona 17:147-156.
Morgan JI, Curran T (1995) Xenes inmediatamente tempranos: dez anos despois. Tendencias Neurosci 18:66-67.
Nakabeppu Y, Nathans D (1991) Unha forma truncada natural de FosB que inhibe a actividade transcricional Fos / Jun. Célula 64:751-759.
Nestler EJ, Barrot M, Self DW (2001) Delta FosB: un interruptor molecular sostido para a dependencia. Proc Natl Acad Sci Estados Unidos 98:11042-11046.
Texto completo abstracto / LIBRE
Neve RL, Howe JR, Hong S, Kalb RG (1997) Introdución da subunidade do receptor do glutamato 1 en neuronas motoras in vitro e in vivo usando un virus recombinante do herpes simple. Neurociencia 79:435-447.
Nuthall HN, Joachim K, Stifani S (2004) A fosforilación da serina 239 de Groucho / TLE1 pola proteína quinasa CK2 é importante para a inhibición da diferenciación neuronal. Mol Cell Biol 24:8395-8407.
Texto completo abstracto / LIBRE
Okazaki K, Sagata N (1995) A ruta Mos / MAP quinasa estabiliza c-Fos por fosforilación e aumenta a súa actividade transformadora nas células NIH 3T3. EMBO J 14:5048-5059.
Palombella VJ, Rando OJ, Goldberg AL, Maniatis T (1994) A vía de ubiquitina-proteasoma é necesaria para procesar a proteína precursora NF-kappa B1 ea activación de NF-kappa B. Célula 78:773-785.
Papavassiliou AG, Treier M, Chavrier C, Bohmann D (1992) Degradación dirixida de c-Fos, pero non de v-Fos, por un sinal dependente de fosforilación en c-Jun. ciencia 258:1941-1944.
Texto completo abstracto / LIBRE
Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E (2003) A expresión específica da rexión cerebral dun mutante negativo dominante de c-Jun nos ratos transxénicos diminúe a sensibilidade á cocaína. Brain Res 970:73-86.
Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ (2004) Indución de DeltaFosB en estruturas cerebrais relacionadas coa recompensa tras o estrés crónico. J Neurosci 24:10594-10602.
Texto completo abstracto / LIBRE
Persico AM, Schindler CW, O'Hara BF, Brannock MT, Uhl GR (1993) Expresión do factor de transcrición cerebral: efectos de anfetamina aguda e crónica e tensión de inxección. Brain Res Mol Brain Res 20:91-100.
Ploegh HL, Dunn BM (2000) Modificación postraducional: fosforilación e fosfatasas. En: Protocolos actuais na ciencia das proteínas (Dunn BM, ed.) Pp. 13.01–13.02. Nova York: Wiley and Sons.
Pyerin W, Burow E, Michaely K, Kubler D, Kinzel V (1987) Propiedades catalíticas e moleculares da fosvitina / caseína quinasa de tipo II altamente purificada a partir de células epiteliais humanas en cultivo (HeLa) e relación coa ecto-proteína quinase. Biol Chem Hoppe Seyler 368:215-227.
Reikhardt BA, Kulikova OG, Borisova GY, Aleksandrova IY, Sapronov NS (2003) Estado do sistema "proteína quinasa CK2-HMG14" en amnesia relacionada coa idade en ratas. Neurosci Behav Physiol 33:799-804.
Roberts BJ, Whitelaw ML (1999) Degradación do receptor de dioxina básica de hélice-bucle-hélice / per-ARNT-Sim receptor de dioxina a través da vía de ubiquitina / proteasoma. J Biol Chem 274:36351-36356.
Texto completo abstracto / LIBRE
Rost B, Yachdav G, Liu J (2004) O servidor PredictProtein. Ácidos Nucleicos Res 32:W321–W326.
Texto completo abstracto / LIBRE
Rylski M, Kaczmarek L (2004) Ap-1 obxectivos no cerebro. Fronte Biosci 9:8-23.
Sahin B, Kansy JW, Nairn AC, J Spychala, Ealick SE, Fienberg AA, Greene RW, JA Bibb (2004) Caracterización molecular de adenosina quinasa de rato recombinante e avaliación como obxectivo da fosforilación de proteínas. Eur J Biochem 271:3547-3555.
Salvat C, Aquaviva C, Jariel-Encontre I, Ferrara P, Pariat M, Steff AM, Carillo S, Piechaczyk M (1999) ¿Hai varias vías proteolíticas que contribúen á degradación da proteína c-Fos, c-Jun e p53 in vivo? Mol Biol Rep 26:45-51.
Schmidt R, Hecker E (1975) Autoxidación de ésteres forbolos en condicións normais de almacenamento. Cancer Res 35:1375-1377.
Schwarz EM, Van Antwerp D, Verma IM (1996) A fosforilación constitutiva de IkappaBalpha por caseína quinasa II ten preferentemente serina 293: esixencia de degradación de IkappaBalpha libre. Mol Cell Biol 16:3554-3559.
Texto completo abstracto / LIBRE
Sears R, Leone G, DeGregori J, Nevins JR (1999) Ras aumenta a estabilidade da proteína Myc. Mol Cell 3:169-179.
Silva-Neto MA, Fialho E, Paes MC, Oliveira PL, Masuda H (2002) Fosforilación independente dos nucleótidos cíclicos da vitelina por caseína quinasa II purificada dos ovocitos de Rhodnius prolixus. Insectos Biochem Mol Biol 32:847-857.
Skinner M, Qu S, Moore C, Sabedoría R (1997) A activación e transformación da transcrición por proteínas FosB requiren fosforilación do dominio de activación do carboxilo-terminal. Mol Cell Biol 17:2372-2380.
Texto completo abstracto / LIBRE
Stemmer C, Schwander A, Bauw G, Fojan P, Grasser KD (2002) A proteína quinasa CK2 fosforila de xeito diferencial as proteínas do grupo B de movilidad elevada (HMGB) do cromosoma, que modulan a súa estabilidade e as súas interaccións. J Biol Chem 277:1092-1098.
Texto completo abstracto / LIBRE
Stevens I, Derua R, Rondelez E, Waelkens E, Merlevede W, Goris J (1999) Identificación de cyk, unha ciclina B2 quinase, como unha nova proteína quinasa II dependente de calcio / calmodulina e o seu papel durante a maduración de ovocitos de Xenopus laevis. Exp Cell Res 252:303-318.
Suh HW, Choi SS, Lee JK, Lee HK, Han EJ, Lee J (2004) Regulación da expresión xénica c-fos e c-jun por lipopolisacárido e citocinas en astrocitos de cultivo primarios: efecto das vías PKA e PKC. Arch Pharm Res 27:396-401.
Szyszka R, Boguszewska A, Grankowski N, Ballesta JP (1995) Fosforilación diferencial de proteínas ácidas ribosómicas a partir de células de levadura por dúas proteínas quinasas endóxenas: caseína quinasa-2 e quinasa 60S. Acta Biochim Pol 42:357-362.
Tamaoki T, Takahashi I, Kobayashi E, Nakano H, Akinaga S, Suzuki K (1990) Calphostin (UCN1028) e compostos relacionados co calphostin, unha nova clase de inhibidores específicos e potentes da proteína quinase C. Adv Segundo Mensaxeiro Phosphoprotein Res 24:497-501.
Torres J, Pulido R (2001) O supresor tumoral PTEN está fosforilado pola proteína quinasa CK2 no seu terminal C. Implicacións para a estabilidade de PTEN á degradación mediada por proteasoma. J Biol Chem 276:993-998.
Texto completo abstracto / LIBRE
Tsubuki S, Saito Y, Tomioka M, Ito H, Kawashima S (1996) Inhibición diferencial das actividades de calpaína e proteasoma por aldehidos de peptidilo de di-leucina e tri-leucina. J Biochem (Tokio) 119:572-576.
Texto completo abstracto / LIBRE
Tsurumi C, Ishida N, Tamura T, Kakizuka A, Nishida E, Okumura E, Kishimoto T, Inagaki M, K Okazaki, Sagata N (1995) A degradación de c-Fos polo proteasoma 26S é acelerada por c-Jun e múltiples proteínas quinasas. Mol Cell Biol 15:5682-5687.
Texto completo abstracto / LIBRE
Unger GM, Davis AT, Slaton JW, Ahmed K (2004) Proteína quinasa CK2 como regulador da supervivencia celular: implicacións na terapia do cancro. Obxectivos de drogas de Cancer de Curr 4:77-84.
Vial E, Marshall CJ (2003) A actividade elevada da ERC-MAP na cinasa protexe ao membro da familia FOS-1 contra a degradación do proteasomal nas células do carcinoma de colon. J Cell Sci 116:4957-4963.
Texto completo abstracto / LIBRE
Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S (2002) BFosB regula o funcionamento da roda. J Neurosci 22:8133-8138.
Texto completo abstracto / LIBRE
Whitmarsh AJ, Davis RJ (2000) Regulación da función do factor de transcrición por fosforilación. Cell Mol Life Sci 57:1172-1183.
Winter B, Kautzner I, OG Issinger, Arnold HH (1997) Para a actividade de Myf-2 son importantes os sitios de fosforilación das proteínas quinasas CK5. Biol Chem 378:1445-1456.
Wisniewski JR, Szewczuk Z, Petry I, Schwanbeck R, Renner U (1999) A fosforilación constitutiva das colas ácidas das proteínas do grupo 1 de alta mobilidade por caseína quinasa II altera a súa conformación, estabilidade e especificidade de unión ao ADN. J Biol Chem 274:20116-20122.
Texto completo abstracto / LIBRE
Yamaguchi Y, Wada T, Suzuki F, Takagi T, Hasegawa J, Handa H (1998) A casexinasa II interactúa cos dominios bZIP de varios factores de transcrición. Ácidos Nucleicos Res 26:3854-3861.
Texto completo abstracto / LIBRE
Yanagawa T, Yuki K, Yoshida H, Bannai S, Ishii T (1997) A fosforilación da proteína de tensión A170 pola actividade semellante á caseína quinasa II nos macrófagos. Biochem Biophys Res Commun 241:157-163.
Yankulov K, Yamashita K, Roy R, Egly JM, Bentley DL (1995) O inhibidor da elongación transcricional 5,6-dicloro-1-beta-d-ribofuranosilbenzimidazol inhibe a proteína quinase asociada ao factor de transcrición IIH. J Biol Chem 270:23922-23925.
Texto completo abstracto / LIBRE
Yen J, Sabedoría RM, Tratner I, Verma IM (1991) Unha forma de empalme alternativa de FosB é un regulador negativo da activación e transformación transcricional por proteínas Fos. Proc Natl Acad Sci Estados Unidos 88:5077-5081.
Texto completo abstracto / LIBRE
Yin X, Jedrzejewski PT, Jiang JX (2000) A caseína quinasa II fosforila a conexina da lente 45.6 e está implicada na súa degradación. J Biol Chem 275:6850-6856.
Texto completo abstracto / LIBRE
Yoza BK, Brooks JW, Mizel SB (1992) Indución de compoñentes do factor de transcrición AP-1 durante a activación das células T mediante interleucina 1 e esters de forbolos. Diferencia de crecemento celular 3:677-684.
Yu S, Wang H, Davis A, Ahmed K (2001) Consecuencias de CK2 para a sinalización da matriz nuclear. Mol Cell Biochem 227:67-71.
Yu S, Davis AT, Guo C, JE Verde, Ahmed K (1999) Orientación diferencial da proteína quinasa CK2 á matriz nuclear por sobreexpresión transitoria das súas subunidades. J Cell Biochem 74:127-134.
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton Ou, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ (2006) ΔFosB: un papel esencial para ΔFosB no núcleo accumbens na acción da morfina. Nat Neurosci 9:205-211.
Artigos citando este artigo
- As respostas estruturais e de comportamento á cocaína crónica requiren un loopforforward involucrando {Delta} FosB e calcio / calmodulina-dependente da proteína quinasa II na cuncha Nucleus Accumbens Journal of Neuroscience, 6 marzo 2013, 33(10):4295-4307
- A sobreexpresión estriatal de {Delta} FosB reproduce movementos involuntarios crus inducidos por levodopa Journal of Neuroscience, 26 2010, 30(21):7335-7343
- Abstracto
- Texto completo
- Texto Completo (PDF)
- Abstracto
- Texto completo
- Texto Completo (PDF)
- Abstracto
- Texto completo
- Texto Completo (PDF)
- Abstracto
- Texto completo
- Texto Completo (PDF)
- Mecanismos de transcrición da adicción: papel de {Delta} FosB Transaccións filosóficas da Royal Society B: Ciencias Biolóxicas, 12 2008 de outubro, 363(1507):3245-3255
- Vulnerabilidade perdurable ao reintegro do comportamento que busca a metanfetamina nos ratos mutantes do factor neurotrófico derivado da liña celular glial. O xornal FASEB, 1 2007 de xullo, 21(9):1994-2004
- Factor de transcrición da proteína activadora 1 na carcinoxénese respiratoria do epitelio Investigación do cancro molecular, 1 febreiro 2007, 5(2):109-120
;