Cdk5 Phosphorylates Dopamine D2 receptor e Attenuates Downstream Signaling (2013)

Cita: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) Cdk5 Fosforila o receptor da dopamina D2 e atenúa a sinalización en sentido descendente. PLoS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Editor: James Porter, Universidade de Dakota do Norte, Estados Unidos de América

Recibido: 20, 2013; Aceptada: Novembro 14, 2013; Publicado en: Decembro 31, 2013

Copyright: © 2013 Jeong et al. Este é un artigo de acceso aberto distribuído baixo os termos da Licenza de recoñecemento de Creative Commons, que permite o uso, distribución e reprodución sen restricións en calquera medio, sempre que o autor e a orixe orixinais se acrediten.

Financiamento: Este traballo contou coa axuda das axudas (NRF-2012R1A2A2A01012923 e NRF-2012R1A4A1028200) do goberno coreano (MSIP) e tamén apoiadas no marco do programa de cooperación internacional xestionado por NRF de Corea (2012K2A1A2033117) e polo Korea Brain Research Institute (KBRI) Programa básico de investigación do MSIP (2031-415). SKP foi destinatario da 2004 e 2006 National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (NARSAD) Awards Investigator Awards. Os financiadores non tiñan ningún papel no deseño do estudo, na recollida e análise de datos, na decisión de publicar ou na preparación do manuscrito.

Intereses competidores: Os autores declararon que non existen intereses en competencia.

introdución

A sinalización de dopamina está implicada en varias funcións cerebrais, incluíndo a coordinación motora, control de humor e mecanismos de recompensa [1]. Un compoñente importante da sinalización de dopamina nos vertebrados é exercido por neuronas espiáis medias espiáis (MSNs) que expresan selectivamente un subconxunto de receptores de dopamina e reciben entrada dopaminérxica principalmente da área tegmental ventral (VTA) e substantia nigra (SN)) [2]. Os receptores de dopamina son receptores acoplados á proteína G (GPCR) con sete dominios transmembrana e consisten en dous subtipos, Receptores similares a D1 e D2, que median as accións recíprocas na sinalización de dopamina [1]. Por exemplo, os receptores de dopamina D1 (D1, D5) activan a adenilil ciclase a través de G_αs e aumenta o nivel intracelular de AMPc, pero os receptores D2 de dopamina (D2, D3, D4) inhiben a adenilil ciclase a través de G_αi e diminúe o nivel intracelular do AMPc [1], [3].

Entre os receptores de dopamina, o receptor D2 (DRD2) está implicado na fisiopatoloxía de múltiples trastornos psiquiátricos importantes incluíndo a esquizofrenia e a adicción ás drogas [4], de tal xeito que moitos medicamentos antipsicóticos apuntan polo menos parcialmente a DRD2. Tamén se sabe que a actividade de DRD2 se correlaciona ben coas consecuencias comportamentais das drogas de abuso nos modelos animais [5]. Os antidepresivos e a eficacia do estabilizador do humor tamén foron ligados a alteracións na expresión da superficie celular de DRD2 ou de sinalización intracelular por mediación de PKA, ERK e GSK3. [1], [4], [6]. A pesar destas funcións críticas para DRD2 no cerebro, os mecanismos reguladores detallados que confiren heterogeneidade e complexidade ás propiedades de DRD2 non se comprenden completamente.

As liñas de evidencia converxentes indican que varias modificacións postraduccionais están implicadas no axuste da actividade DRD2. A glicosilación extensiva de DRD2 revelouse nos primeiros estudos de etiquetado de afinidade fotográfica [7]e a formación de enlaces disulfuro dentro de DRD2 tamén se identificou como unha modificación importante para a unión ao ligando [8]. Ademais, os sitios de fosforilación de DRD2 foron inicialmente identificados por in vitro ensaio con radioisótopos, proporcionando rutas para varias vías reguladoras mediadas por varias quinases [9]. De feito, a proteína quinasa C (PKC) regula a mobilización mediada por DRD2 do calcio intracelular e modula a interacción de DRD2 con proteínas do citoesqueleto. [10]. A fosforilación por quinasa GPCR 2 (GRK2) regula os patróns de resensibilización inducidos polos agonistas de DRD2 [11].

A quinasa dependente de ciclina 5 (Cdk5) é unha serina / treonina quinasa dirixida pola prolina que ten unha actividade preferente debido á expresión específica do cerebro dos seus activadores esenciais, p35 e p39 [12]. Cdk5 está implicado en varios procesos neuronais, incluíndo a migración neuronal e a orientación axonal, e os ratos Cdk5 e p35 nulos mostran defectos na capas cortical [13]. Recentemente, demostrouse que a fosforilación de WAVE1 e da ephexina por Cdk5 regula a morfoxénese dendrítica da columna vertebral [14]. Ademais, Cdk5 tamén regula os niveis de expresión da superficie das correntes NMDA mediadas polo receptor NMDA, NR2B e NR2A. [15], [16]. Cabe destacar que varias probas suxiren unha relación íntima entre Cdk5 eo sistema de dopamina. Cdk5 fosforila a tirosina hidroxilase (TH), regulando a súa estabilidade e mantendo así a homeostase dopaminérxica [17]. Nas neuronas postsinápticas, cando o residuo T75 de dopamina e fosfoproteína-32kD regulado por AMP cíclico (DARPP-32) é fosforilado por Cdk5, pode inhibir a actividade de PKA e así antagonizar a sinalización de PKA mediada por dopamina DRD1 [18]. Curiosamente, cando a cocaína, un agonista indirecto dos receptores de dopamina, é administrada crónica en ratos, os niveis de mRNA e proteínas de Cdk5 aumentan en neuronas espiñas medianas. [19]. Colectivamente, Cdk5 parece estar implicado en adaptacións sinápticas inducidas por drogas. Neste estudo amosamos unha interacción funcional de DRD2 e Cdk5 que amplía aínda máis o papel do Cdk5 na sinalización da dopamina.

Materiais e Métodos

Anticorpos

Os soros anti-coello foron levantados contra péptidos que conteñen fosfo-serina 321 (pS321) do terceiro lazo intracelular de DRD2 (D2i3). O fosféptido, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), foi usado para facer unha columna conxugada de péptidos para a purificación de afinidade (20401, PIERCE). O anticorpo anti-pS321 foi enriquecido por un sistema de purificación de afinidade seguindo as instrucións do fabricante. O fosfo-anticorpo purificado foi almacenado en PBS con azida de sodio 0.1% e gelatina 0.1%. O anticorpo anti-Cdk5 anti-rato (sc-249) e o anticorpo anti-coello anti-p35 (sc-820) foron utilizados para a transferencia Western e a inmunocitoquímica de Cdk5 / p35. O anticorpo anti-GFP anti-rato (sc-9996) utilizouse para a inmunoprecipitación e transferencia Western de DRD2-GFP. Anticorpo anti-FLAG anti-coello (sc-807), anticorpo anti-HA anti-coello (sc-805), anticorpo anti-GST anti-rato (sc-138) e anticorpo anti-GAPDH de rato (sc- 32293) foron adquiridos en Santa Cruz Biotechnologies.

animais

O rato knockout p35 foi un agasallo do Dr. Katsuhiko Mikoshiba no RIKEN Brain Science Institute en Xapón e utilizado para a cultura primaria de neuronas. Os conxuntos de primers para xenotipado foron 5′GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5′-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC e 5′-TCCATCT GCACGAGACTAGT como se describiu anteriormente [20]. Os ratos ICR e os ratos Sprague Dawley utilizáronse para a preparación do lisado cerebral. Todos os procedementos dos animais foron aprobados polo comité institucional de coidado e uso de animais da Universidade de Pohang.

Construcións de plásmidos

Usouse a isoforma longa DRD2 humana nun vector plásmido EGFP-N1 eo terceiro lazo intracelular de DRD2 (residuos de aminoácidos 212-373 incluíndo os residuos de aminoácidos 29 adicionais exclusivos da isoforma longa DRD2) nun vector plásmido pFLAG-CMV-2. O Cdk5 humano inseríase nun vector plasmídico pCMV-HA e p35 humano inseríase nun vector do plásmido 3.1 de pcDNA. Human Cdk5 foi inserido baixo un promotor de citomegalovirus (CMV) xunto co p35 humano nun vector de pcDNA 3.1 para facer unha construción de expresión dual (Cdk5 / p35) para o ensaio de inmunocitoquímica, receptor de internalización.³⁵S] -GTP_γEnsaio de unión de S, ensaio de unión a radioligand e imunoensaio de encima cAMP.

In vitro Ensaio de quinasa

Ligado a IP in vitro O ensaio de quinasa realizouse do seguinte xeito. Un cerebro enteiro do rato foi lisado en tampón de lise de eritrocitos 3 mL (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), NaCl 250 mM, EDTA 5 mM, 0.1% NP-40) por trazos 20 dun homogeneizador de Dounce para obter lisados ​​cerebrais homoxeneizados . Os lisados ​​foron incubados en xeo para 30 min, sonicados e centrifugados en 16,000 × g para 10 min. Os sobrenadantes foron inmunoprecipitados con anticorpos anti-p35 anti-coello para obter un complexo activo de Cdk5 / p35. O complexo Cdk5 / p35 e a proteína de fusión GST purificada mesturáronse con adenosina 5′-triposfato, [γ-³²P] (NEG-502H, PerkinElmer) e incubado en tampón quinasa (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl₂, 0.2 mM DTT) para 1 h a temperatura ambiente [18], [21]. O complexo purificado Cdk5 / p25 (14 – 516, Millipore) tamén se usou para in vitro ensaio de quinase como se describiu anteriormente. O buffer de carga da mostra 2 × foi engadido á mestura de reacción e fervido a 100 ° C. As mostras foron entón sometidas a SDS-PAGE eo xel seco foi avaliado por autoradiografía.

Cromatografía de líquidos (LC) - Análise de espectrometría de masa (MS) / MS

A proteína recombinante GST-D2i3 foi analizada por LC-MS / MS tras ligada a IP. in vitro ensaio de quinase. Realizamos a identificación de péptidos de datos LC-MS / MS usando X !! Tandem (versión Dec-01-2008). Cada ficheiro de datos RAW converteuse primeiro en mzXML usando o pipeline trans-proteómico (TPP; versión 4.3). As enquisas de MS / MS nos mzXML convertidos foron sometidas entón a busca contra a base de datos da secuencia de proteína do rato UniProt (liberar 2010_07) incluíndo a secuencia GST-D2i3 usando X !! Tandem. A tolerancia fixouse en 3 Da para os ións precursores e 2 Da para os ións fragmentos. Usouse especificidade enzimática para a tripsina. Utilizáronse opcións de modificación variable para a carbamidometilación da cisteína (57.021 Da), a oxidación da metionina (15.995 Da), a hidrólise da asparagina (0.987 Da) e a fosforilación da serina (79.966 Da).

Inmunoprecipitación

A inmunoprecipitación realizouse en lisados ​​celulares en tampón de lise ELB. O anticorpo anti-GFP foi engadido aos lisados ​​e incubado para 3 h a 4 ° C. Os inmunocomplexos foron purificados usando agarosa proteína-A. Os precipitados foron incubados con buffer de carga de mostra SDS para 30 min a 37 ° C e sometidos a SDS-PAGE e Western blot.

Ensaio de descenso GST

10 µg de GST purificado e GST – D2i3 foron incubados con lisado cerebral de rata para 1.5 h a 4 ° C. Engadíronse e incubáronse perlas 30 µL de glutationa (GSH) conxugadas con Sepharose 4B (17-0756-01, GE Healthcare) equilibradas con tampón de lise para 1 h adicional. Recolléronse perlas por centrifugación en 2,000 ×g e enjuague con buffer de lise 4 veces [22], [23]. Os precipitados foron analizados por Western blot usando anticorpos anti-Cdk5 e anti-p35.

Inmunocitoquímica

As células 293 HEK transfectadas e as neuronas estriadas cultivadas nos lamas de tapa laváronse unha vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) e fixáronse por inmersión en 4% paraformaldehido / PBS para 30 min. O anticorpo primario diluír na solución de bloqueo (2% soro de cabalo e 1% Triton X-100 en PBS). Os anticorpos anti-rato conxugados con Alexafluor-647 (A20990, Invitrogen) e anticorpos anti-coello conxugados de Alexafluor-568 (A11011, Invitrogen) foron usados ​​como anticorpos secundarios. Os Hoechst utilizáronse para a tinción do núcleo. As imaxes foron obtidas por microscopía confocal (Olympus, FluoView-1000).

Ensaios de internalización do receptor

24 h despois da transfección, as células foron tratadas con 1 µM ​​quinpirola (Q102, Sigma) para min 30 e 90 a 37 ° C. As células foron suspendidas en 2 mL de PBS frías e as alícuotas 200 µL foron utilizadas para cada reacción. Os tratamentos con medicamentos realizáronse a temperatura ambiente para 3 h nas seguintes concentracións; 3 nM [³H] -spiperona (NET-565, PerkinElmer), Sulpirida 3 µM ​​(895, TOCRIS), haloperidol 10 µM ​​(H1512, Sigma). Hidrofóbico [³A H] -spiperona foi usada para etiquetar os receptores expresados ​​totais e empregouse a sulpirida hidrófila para substituír ao receptor membranoso.³H] -spiperona sinaliza. As sinais de receptor asociadas á membrana foron calculadas subtraindo os valores do receptor intracelular dos valores dos receptores expresados. As células filtráronse nun filtro GF / B (Millipore) e lavaron veces 3 con tampón de lavado (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Os filtros secáronse e medíase a radioactividade residual mediante un contador de centrifugado líquido [24].

Preparación de membrana celular

As células confluentes nos platos de cultivo 100 mm tras a transfección foron lavadas con PBS xeado e recolectadas en buffer HME 1 mL (HEX 25 mM (pH 7.5), MgCl 2 mM₂, 1 mM EDTA). Os lisados ​​homoxeneizados foron centrifugados con 500 × g para 15 min e os sobrenadantes foron posteriormente centrifugados con 36,000 × g para 30 min. Para a realización de ensaios utilizáronse pellets re-suspendidos no buffer HME.

[³⁵S] -GTP_γS Ensaios de unión

As fraccións da membrana celular foron pre-incubadas con Xinxm µM quinpirola (Q1, Sigma) no tampón de ensaio (102 mM HEPES (pH 25), 7.5 MM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA e 0.01 mM PIB) para 10 min. [³⁵S] -GTP_γEngadiuse S (NET-030H, PerkinElmer) á concentración final de 3 nM en 30 µL e incubouse aínda máis para 90 min. 170 µL de tampón xeado (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 MM MgCl₂e engadiuse 0.1 mM GTP para deter a reacción. As membranas filtráronse nun filtro GF / B (Millipore) e laváronse 3 veces con tampón de lavado (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Os filtros secáronse e medida a radioactividade mediante o contador de centelleiras [25], [26].

Ensaios de unión a radioligandos

As membranas celulares preparadas foron incubadas con 0.01 nM [³H] -spiperona (NET-565, PerkinElmer) e concentracións crecentes de quinpirole (Q102, Sigma) para 30 min no buffer de ensaio (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). As membranas filtráronse nun filtro GF / B (Millipore) e laváronse 3 veces con tampón de lavado (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). A reacción terminouse por filtración rápida a través de filtros GF / C. A radioactividade residual foi medida mediante un contador de centrifugado líquido [27]-[29].

AMAMaxo enzimático AMPc

As células 293 transfectadas HEK foron pretratadas con rolipram 10 µM ​​(R6520, Sigma) para 1 h, e logo tratadas con forskolina 0.1 µM ​​(F6886, Sigma) e con concentracións crecentes de quinpirole (Q102, Sigma) para 30 min. As neuronas estriatais de cultivo primario tratáronse con rolipram 10 µM ​​para 1 h, e logo dopamina 1 µM ​​para 1 h [22]. Os lisados ​​celulares preparáronse cos niveis de 0.1 M HCl e cAMP foron detectados polo kit de imunoensayo de encima cAMP (Sapphire Bioscience) seguindo a instrución do fabricante.

Neurona estriatal de cultivo primario

A área estriatal foi illada do cerebro embrionario do rato (E15). O tecido diseccionado disociouse en medios mínimos esenciais (MEM) (11095, Invitrogen) que conteñen tripsina 0.25% (T4549-100, Sigma) e 0.1% DNase I para 6 min a 37 ° C. As células foron suspendidas nos medios de chapeamento (MEM con 0.01 M HEPES (pH 7.4) e 10% (vol / vol) soro de cabalo (16050-122, GIBCO)). As neuronas cultiváronse para días 7 in vitro (DIV 7) en MEM con suplemento B27 (17504-044, Invitrogen) antes de ser aplicado aos inmunoensaios de encima cAMP.

Resultados

Cdk5 Fosforila Serina 321 no terceiro lazo intracelular de DRD2 in vitro

Para identificar novos substratos de Cdk5, realizamos unha busca sistemática usando (S / T) PX (K / H / R) como secuencias de consenso de recoñecemento Cdk5 [30] e identificou a DRD2 como un substrato candidato. A secuencia consenso, incluída a serina 321, está situada no terceiro lazo intracelular de DRD2 (D2i3) onde se implicaron varios mecanismos reguladores [3], [10], [11]. A secuencia é conservada evolutivamente en DRD2 nos vertebrados, o que implica unha importancia funcional do residuo (Fig. 1A).

Descarga:   

• Ppt

  Diapositiva de PowerPoint

• PNG

  agrandar imaxe (2.08MB)

• TIFF

  imaxe orixinal (4.36MB)

Figura 1. Cdk5 fosforila a serina 321 no terceiro lazo intracelular de DRD2 in vitro.

(A) Aliñamento de secuencias de aminoácidos mostrando rexións conservadas do DRD2 de varias especies (sombreadas). O sitio potencial de fosforilación de Cdk5 indícase cun asterisco. (B) ligado a IP in vitro ensaio de quinase con proteínas mutantes GST-D2i3 e GST-D2i3 recombinantes. O complexo Cdk5 / p35 enriquecido con extracto cerebral do rato pola inmunoprecipitación anti-p35 foi usado para reaccións de quinase. Unha autoradiografía de proteínas fosforiladas móstrase xunto coa tinguidura azul brillante de Coomassie do mesmo xel. A punta de frecha indica o sinal radioactivo correspondente a GST-D2i3 e a punta de frecha aberta indica sinais radioactivas de p35. (C) Espectro MS / MS do fragmento peptídico fosforilado de D2i3. Os patróns de fragmentación teórica móstranse debaixo do espectro. Entre todos os ións dos fragmentos, os iones e e b detectados denotan no espectro. O y₆ e y₇ Os ións indican fortemente a fosforilación da serina 321. (D) In vitro ensaio de quinase con complexo purificado de Cdk5 / GST-p25 usando proteínas mutantes GST-D2i3 e GST-D2i3. As proteínas fosforiladas mostráronse nunha autoradiografía, xunto coa tinguidura azul brillante de Coomassie. A punta de frecha indica o sinal radioactivo correspondente GST-D2i3 ea punta de frecha aberta indica sinais radioactivas de GST-p25.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Para avaliar a capacidade de Cdk5 para fosforilar D2i3, realizamos ligazóns IP in vitro ensaios de quinasa usando un complexo activo de Cdk5 / p35 enriquecido con lisado do cerebro do rato pola inmunoprecipitación p35 con proteínas GST-D2i3 (residuos de aminoácidos 212 – 373) recombinantes purificados como substratos. Observamos sinais de fosforilación nas proteínas purificadas GST-D2i3 e GST-D2i3 S297A, pero o sinal diminuíu significativamente usando GST-D2i3 S321A (Fig. 1B). Para verificar aínda máis a fosforilación da serina 321 no GST-D2i3, realizamos análise LC-MS / MS das mostras de ligazóns IP in vitro ensaios de quinasa usando espectrometría de masas LTQ XL. Consistentemente, recuperáronse fosfopéptidos correspondentes á masa de péptidos de fosfo-serina 321 (Fig. 1C). Considerando que a adquisición dependente dos datos durante o análise LC-MS / MS tende a detectar proteínas abundantes na mostra [31], estes datos suxiren que o residuo de serina 321 é o sitio de fosforilación dominante de Cdk5 na rexión de D2i3. Para probar a fosforilación directa da serina 321 no GST-D2i3 por Cdk5, in vitro Realizouse un ensaio de quinasa mediante o complexo purificado de Cdk5 / GST-p25 con proteínas GST-D2i3 recombinantes purificadas. Identificamos un sinal de fosforilación significativo no GST-D2i3 que estaba ausente no GST-D2i3 S321A (Fig. 1D). En conxunto, estes resultados indican que o residuo D2i3 S321 é un obxectivo preferente para a fosforilación mediada por Cdk5.

Cdk5 Fosforila Serina 321 no terceiro lazo intracelular de DRD2 en células

Para identificar a fosforilación da serina 321, levantamos anticorpos específicos para a fosfo-serina 321 (pS321). Mostras do IP ligado in vitro O ensaio de quinasa foi analizado por Western blot usando anticorpo anti-pS321. Blots mostrou unha banda distinta na reacción quinasa que dependía do GST-D2i3 (Fig. 2A). Para verificar a potencial fosforilación da serina 321 en DRD2 por Cdk5 nas células, os análogos de inmunoprecipitados anti-GFP das células HEK 293 que expresan DRD2-GFP e DRD2 S321A-GFP foron analizados mediante transferencia Western usando anti-GFP e anticorpos anti-pS5. Os sinais de banda manchada característicos por anticorpos anti-GFP que se sabe que son debidos a unha glicosilación excesiva de DRD35 só se observan en presenza de DRD321-GFP e o anticorpo anti-pS2 só detectou sinais de DRD2 similares coa expresión de Cdk321 / p2.Fig. 2B) [7]. Para verificar aínda máis a fosforilación da serina 321 por Cdk5, xeráronse D2i3 (FLAG-D2i3) e a forma mutante de D2i3 (FLAG-D2i3 S321A). FLAG-D2i3 e FLAG-D2i3 S321A expresados ​​con ou sen HA-Cdk5 e p35 en células HEK 293 analizáronse mediante un ensaio de cambio de mobilidade SDS-xel. Observouse un cambio de mobilidade dependente de Cdk5 para FLAG-D2i3, pero non para FLAG-D2i3 S321A (Fig. 2C). Tamén se valorou o nivel de fosforilación de DRD2 en Ser321 tras a estimulación dos agonistas. As células 293 HEK que expresan o complexo DRD2-GFP e Cdk5 / p35 foron estimuladas por quinpirole e as inmunoprecipitadas anti-GFP dos lisados ​​celulares foron analizadas por Western blot usando anticorpos anti-GFP e anti-pS321. Descubrimos que a fosforilación mediada por Cdk5 de DRD2 en Ser321 non foi afectada pola estimulación agonista, que aparece diferente das fosforilacións mediadas por GRK e PKC (Fig. 2D) [32], [33]. Xuntos, estes resultados indican que Cdk5 pode fosforilar o residuo de serina 321 de DRD2 no ambiente celular.

Descarga:   

• Ppt

  Diapositiva de PowerPoint

• PNG

  agrandar imaxe (1.92MB)

• TIFF

  imaxe orixinal (3.5MB)

Figura 2. Cdk5 fosforila a serina 321 no terceiro lazo intracelular de DRD2 nas células.

A fosforilación mediada pola Cdk5 da serina 321 analizouse utilizando anticorpo anti-pS321. (A) Mostras de ligazóns IP in vitro O ensaio da quinasa usando proteínas GST-D2i3 foi analizado por Western blot (WB) con anticorpos indicados. As puntas de frecha indican GST-D2i3s. (B) DRD2-GFP e DRD2 S321A-GFP expresáronse con ou sen HA-Cdk5 e p35 en células HEK 293. Os inmunoprecipitados anti-GFP foron analizados mediante transferencia de Western usando anticorpos anti-GFP e anti-pS321. O soporte indica sinais DRD2 ea punta de frecha aberta indica sinais inespecíficas do inmunoprecipitado anti-GFP. '% input' é o% de volume de lisado total para unha reacción IP. As sinais débiles de Cdk5 endóxenas foron indicadas por asteriscos. (C) Ensaios de cambio de mobilidade xel. As células 293 de HEK transfectadas como se indicaron analizáronse mediante transferencia Western. (D) As células 293 HEK transfectadas foron tratadas con quinopole e os inmunoprecipitados anti-GFP foron analizados por Western blotting con anticorpos anti-GFP e anti-pS321. A punta de frecha aberta indica sinais non específicos de inmunoprecipitados anti-GFP.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Complexo Cdk5 / p35 e DRD2 son físicamente asociados

Investigamos a interacción física potencial entre o complexo Cdk5 / p35 e DRD2 porque se sabe que moitos substratos Cdk5 están fisicamente asociados co complexo Cdk5 / p35 [23], [34], [35]. En primeiro lugar, realizouse o experimento despregable GST. A proteína GST-D2i3 recombinante purificada foi incubada con lisado de cerebro de rato e os precipitados desplegables GST foron analizados para transferencia Western. Como se mostra en Fig. 3Aidentificáronse Cdk5 e p35 endóxenos nos precipitados desplegables, indicando unha interacción física entre DRD2 eo complexo Cdk5 / p35 (Fig. 3A). Ademais, detectáronse HA-Cdk5 e p35 nos inmunoprecipitados anti-GFP dos lisados ​​de células HEK 293 que expresan DRD2-GFP e Cdk5 / p35 (Fig. 3B). Ademais, realizamos análises inmunocitoquímicos e observamos que DRD2-GFP, HA-Cdk5 e p35 mostran sinais de co-localización significativos na zona membranosa das células HEK 293 (Fig. 3C, paneis superiores). Tamén investigamos a co-localización de DRD2 e Cdk5 / p35 no contexto neuronal. Consistentemente, DRD2-GFP tamén mostrou unha significativa co-localización con Cdk5 e p35 endóxeno nas neuronas estriaxonas cultivadas (DIV7), apoiando aínda máis as conexións funcionais entre DRD2 e Cdk5 / p35 (Fig. 3C, paneis inferiores). Os resultados indican que DRD2 e Cdk5 / p35 poden formar un complexo e así apoian a noción de que DRD2 é un substrato fisiolóxico de Cdk5.

Descarga:   

• Ppt

  Diapositiva de PowerPoint

• PNG

  agrandar imaxe (3.91MB)

• TIFF

  imaxe orixinal (5.35MB)

Figura 3. Cdk5 / p35 pode formar un complexo con DRD2.

(A) ensaio de despegue GST usando proteína GST-D2i3 recombinante purificada con extracto cerebral de rato. Os precipitados descendentes de GST foron sometidos a análises de transferencia Western. "Bead" indica o precipitado descendente sen proteínas GST. (B) Inmunoprecipitación do complexo DRD2 e Cdk5 / p35. O anti-GFP IP dos lisados ​​das células transfectadas foi sometido a análises de transferencia Western. O soporte indica sinais DRD2 ea punta de frecha aberta indica sinais inespecíficas do inmunoprecipitado anti-GFP. Unha mancha excesiva para entradas tamén se mostra á dereita. (C) Análise inmunocitoquímica de DRD2 e Cdk5 / p35. As células HEK 293 que expresan DRD2-GFP e Cdk5 / p35 foron tinguidas con anticorpos anti-Cdk5 e anti-p35 (paneis superiores). A DRD2-GFP expresouse só nas neuronas estriaxonas cultivadas e tinguíase con anticorpos anti-Cdk5 e anti-p35 (paneis inferiores). Os Hoechst utilizáronse para a tinción do núcleo. A barra de escala é 5 µm. Todas as imaxes obtivéronse usando microscopia confocal (Olympus, FluoView-1000).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

A fosforilación mediada por Cdk5 de DRD2 atenúa a actividade do receptor

Informouse de que a fosforilación modula as propiedades críticas dos GPCRs como o acoplamento da proteína G, a internalización do receptor, a localización intracelular e a asociación con proteínas moduladoras [9], [11], [24]. AA internalización dos receptores inducida polos gonistas é un proceso regulador crítico da transdución do sinal. Investigamos a modulación mediada por Cdk5 da internalización DRD2. As células 293 de HEK que expresan DRD2-GFP e DRD2 S321A-GFP con ou sen Cdk5 / p35 foron incubadas con quinpirola 1 µM ​​para inducir a interiorización DRD2 estimulada polo agonista (Fig. 4A). [³Os sinais de H] -spiperona de células que expresan DRD2-GFP reducíronse significativamente a 30 min quinpirola e recuperáronse a 90 min. Curiosamente, [³Os sinais de H] -spiperona de células que expresan DRD2-GFP e Cdk5 / p35 tamén se reduciron a 30 min tratamento con quinpirola pero non se recuperaron en 90 min (Fig. 4A, segunda sección). Por outra banda, [³As sinais de H] -spiperona de células que expresan DRD2 S321A-GFP reducíronse a 30 min e recuperáronse en 90 min, independentemente da coexpresión con Cdk5 / p35. Estudos anteriores demostraron que o DRD2 internalizado recicla de novo á membrana plasmática tras unha estimulación agonista prolongada [11]. TSegundo parece, a fosforilación mediada por Cdk5 de DRD2 está implicada nos procesos de resensibilización seguindo a interiorización DRD2 inducida por agonistas.

Descarga:   

• Ppt

  Diapositiva de PowerPoint

• PNG

  agrandar imaxe (387KB)

• TIFF

  imaxe orixinal (1.31MB)

Figura 4. A fosforilación mediada por Cdk5 atenúa a expresión superficial de DRD2 e a sinalización de augas abaixo.

(A) expresión da superficie DRD2 medida por [³Ensaio de unión a H] -spiperona. As células HEK293 transfectadas foron estimuladas con xinxumol 1 µM ​​para o tempo indicado e collido, seguido de 3 nM [³Tratamento con H] -spiperona durante 3 h. Mediuse a radioactividade e calculáronse os sinais superficiais. As barras de erro representan a media ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; ANOVA unidireccional con proba post hoc de Dunnett: compare todas as columnas contra a columna de control). (B) [³⁵S] -GTP_γS ensaios de unión. As membranas celulares preparáronse a partir das células transfectadas segundo o indicado. As preparacións de membrana foron incubadas con quinpirola 1 µM ​​seguido de 3 nM [³⁵S] -GTP_γS durante 90 min. As barras de erro representan a media ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; ANOVA unidireccional con proba post hoc de Bonferroni: compare todos os pares de columnas). (C) Quinpirol competidor [³Ensaio de unión a H] -spiperona. As preparacións de membrana das células transfectadas foron incubadas con 0.01 nM [³H] -spiperona e concentracións crecentes de quinpirol durante 30 min. GraphPad obtivo a regresión non lineal. As barras de erro indican media ± SE (n = 3). (D) inmunoensaios encima AMPc en células HEK 293 transfectadas. As células transfectadas foron pretratadas con rolipram de 10 µM durante 1 h e posteriormente co-tratadas con forskolina de 0.1 µM e aumentando as concentracións de quinpirol durante 30 min. GraphPad obtivo a regresión non lineal. As barras de erro representan a media ± SE (n = 4; ** p <0.01; de dúas colas t-tests). (E) As neuronas estriadas cultivadas de embrións knockout de tipo salvaxe e p35 (DIV 7) foron tratadas con rolipram 10 µM ​​para 1 h seguido de dopamina 1 µM ​​para 1 h. As barras de erro representan media ± SE (n = 4; **p<0.01; de dúas colas t-tests).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Avaliamos ademais un posible cambio de acoplamento de proteína G agonista estimulado a DRD2 asociado á fosforilación mediada por Cdk5 usando [³⁵S] -GTP_γS ensaios de unión [25], [26]. DRD2-GFP e DRD2 S321A-GFP con ou sen Cdk5 / p35 expresáronse en células HEK 293. As membranas preparáronse e estimuláronse con quinpirola 1 µM ​​e aínda se permitiron [³⁵S] -GTP_γS incorporación. A membrana celular que expresa DRD2-GFP e Cdk5 / p35 mostrouse de xeito significativo.³⁵S] -GTP_γS vinculante en comparación con todas as outras membranas celulares (Fig. 4B). Estes resultados indican que a fosforilación mediada por Cdk5 regula baixo a unión da proteína G estimulada polos agonistas en DRD2.

Ademais, a competencia de quinpirole [³Os ensaios de unión a H] -spiperona realizáronse para investigar calquera posible cambio de afinidade agonista en DRD2 por fosforilación mediada por Cdk5. Vinculación competitiva de [³Mediuse a H] -spiperona despois do tratamento de concentracións crecentes de quinpirol á preparación da membrana transfectada. Competencia da unión de quinpirola e³H] -spiperona en DRD2-GFP e DRD2 S321A-GFP fixeron logK semellante_i valores (−9.789 para DRD2-GFP; −9.691 para DRD2 S321A-GFP), indicando que a afinidade do ligando con DRD2 non está afectada significativamente pola fosforilación mediada por Cdk5 en DRD2 (Fig. 4C).

A fosforilación mediada por Cdk5 regula baixo a ruta de sinalización DRD2-AMPc

Seguidamente, investigamos se a modificación de DRD2 por Cdk5 afecta ás rutas de sinalización de augas abaixo. Monitorizamos a inhibición mediada por DRD2 da produción de cAMP estimulada por forskolin por adenilil ciclase nas células que expresan DRD2-GFP e DRD2 S321A-GFP usando o inmunoensaio do encamp. As células que expresan DRD2 mostraron niveis de AMPc reducidos en resposta ao quinpirol de forma dependente da dose. Notablemente, a co-expresión de Cdk5 / p35 reduciu significativamente a inhibición máxima da formación de cAMP (Fig. 4D, panel esquerdo). Por outra banda, nas células que expresan DRD2 S321A-GFP, as formacións AMPc foron inhibidas efectivamente en resposta ao tratamento con quinpirola, independentemente da expresión de Cdk5 / p35 (Fig. 4D, panel dereito). Estes resultados indican que a fosforilación mediada por Cdk5 de DRD2 atenúa a actividade inhibitoria de DRD2 na vía de sinalización do AMPA. Para confirmar aínda máis os fenómenos nun contexto máis fisiológicamente relevante, fixemos uso de neuronas cultivadas primarias a partir de embrións eliminatorios deficientes en p35, un activador esencial de Cdk5. As neuronas estriais de cultivo primario tratáronse con dopamina 1 µM ​​e analizáronse por inmunoensaio enzimático cAMP. As neuronas das ratas knockout p35 exhibiron niveis reducidos de cAMP en comparación coas neuronas de tipo salvaxe cando se estimularon con dopamina (Fig. 4E). Txuntos, chegamos á conclusión de que a fosforilación mediada por Cdk5 de DRD2 resulta nunha diminución do ton inhibitorio na vía de cAMP exercida por DRD2.

Conversa

Identificamos DRD2 como un novo substrato de Cdk5. A fosforilación parece regular a expresión superficial de DRD2 afectando o destino da DRD2 tras a internalización do receptor reducindo así DRD2 G_i-acoplaxe e vía de cAMP. Como o residuo de fosforilación S321 existe tanto en isoformas longas e curtas DRD2, o mecanismo proposto neste estudo pode ser un modo xeral de regulación na sinalización mediada por DRD2.

DRD2 en neuronas espiñas medias non só foi considerado como un subtipo principal de receptores de dopamina, senón que tamén foi recoñecido pola súa susceptibilidade a cambios na dispoñibilidade en resposta a estímulos ambientais. A desensibilización e resensibilización inducida por agonistas de DRD2 foron estudadas extensivamente [11], [24]. En particular, varios estudos demostraron que os efectos da exposición psicostimulante crónica, como a cocaína e a anfetamina, que elevan o nivel extracelular de dopamina na sináptica estriada, van acompañados de cambios dinámicos de DRD2 postinápticamente [36]. De feito, sábese que os usuarios crónicos de cocaína teñen niveis reducidos de DRD2 na área estriatal e a dispoñibilidade de DRD2 no núcleo accumbens (NACC) mostra unha correlación negativa cos comportamentos de busca e reforzo de drogas nos ratos e primates. [37]-[39]. Estes resultados indican que a funcionalidade de DRD2 é altamente susceptible á regulación adaptativa ou compensatoria en resposta a varios estímulos incluíndo a exposición crónica ás drogas. Os nosos resultados mostran que o residuo S321 no terceiro lazo intracelular de DRD2 pode ser fosforilado por Cdk5, o que resulta nunha diminución da influencia inhibitoria de DRD2 na vía AMPc. Esta interacción propón un novo mecanismo regulador asociado con Cdk5 en neuronas dopaminoceptivas que poden estar ligadas á natureza dinámica da dispoñibilidade de superficie DRD2.

Debe terse en conta que Cdk5 é coñecido por ser un compoñente clave na mediación de cambios adaptativos do ambiente neuronal. Por exemplo, as alteracións estruturais e funcionais das espiñas dendríticas nas neuronas do circuito límbico son unha das consecuencias da repetida exposición psicostimulante [40]. Estes cambios van acompañados de varios cambios moleculares incluíndo a inducción de proteínas de unión de elementos de resposta a cAMP (CREB) e osFosB, factores de transcrición que mostran unha duradeira regulación en resposta á administración crónica [41], [42]. É importante destacar que Cdk5 é o obxectivo de ΔFosB [19], e moitos compoñentes críticos implicados na dinámica dendrítica da columna vertebral, como PSD-95, quinasa activada por p21 (PAK), β-catenina e spinofilina, foron reportados como substratos Cdk5 [43]-[46]. Consistentemente, as manipulacións xenéticas ou farmacolóxicas da actividade de Cdk5 provocan alteracións da morfoloxía da columna dendrítica e as respostas do comportamento á cocaína, o que implica funcións críticas para Cdk5 nos cambios moleculares e morfolóxicos dos circuítos mesolímbicos de dopamina [47], [48]. Os nosos resultados que amosan que DRD2 é un novo obxectivo de Cdk5 proporciona información adicional sobre os cambios de adaptación do sistema de dopamina en resposta ás exposicións crónicas de drogas debido á posterior regulación de aumento de Cdk5 mediada por -FosB que pode inducir un aumento tónico na fosforilación de DRD2. . Ademais, sábese que DRD2 afecta a numerosos procesos celulares, incluíndo a regulación das vías cinasa AMPAM e MAP e eventos transcricionais descendentes. [42], [49]. Así, os resultados deste estudo non só representan unha regulación directa de DRD2 por Cdk5, senón que tamén proporcionan unha nova visión das respostas adaptativas do sistema de dopamina á exposición crónica ás drogas.

Contribucións do autor

Concibido e deseñado os experimentos: JJ YUP DH SKP. Realizou os experimentos: JJ YUP DKK YK. Analizou os datos: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Reactivos / materiais / ferramentas de análise contribuídos: YHS. Escribiu o artigo: JJ SKP.