A contratación do sistema CRF media o lado escuro da alimentación compulsiva (2009)

. 2009 Nov 24; 106 (47): 20016 – 20020.

Publicado en liña 2009 Nov 9. doi:  10.1073 / pnas.0908789106

PMCID: PMC2785284

Abstracto

A dieta para controlar o peso corporal implica ciclos de privación de alimentos apetecibles que poden favorecer a alimentación compulsiva. O presente estudo mostra que as ratas retiradas do acceso intermitente a un alimento apetecível mostran un exceso de alimento saboroso tras un acceso renovado e un estado de retiro afectivo caracterizado por factor liberador de corticotropina-1 (CRF).1) comportamentos reversibles antagonistas, incluíndo hipofagias, déficits motivacionais para obter alimentos menos palatábeis e comportamentos de tipo anxiogênico. A retirada foi acompañada dunha maior expresión de CRF e CRF1 Resposta electrofisiolóxica no núcleo central da amígdala. Propoñemos que o recrutamento de CRF-CRF extrahitotalámico anti-recompensa1 os sistemas durante a retirada dos alimentos apetitosos, análogos á abstinencia de drogas abusadas, poden promover unha selección compulsiva de alimentos apetecibles, que sofren alternativas máis saudables, e prevén un estado emocional negativo cando se inxiren alimentos apetecibles.

Palabras clave: trastornos da alimentación, obesidade, palatabilidad, dependencia alimentaria agradable, retirada

As formas de obesidade e trastornos da alimentación, similares á adicción ás drogas, pódense conceptualizar como condicións crónicas de recaídas con períodos alternativos de abstinencia (é dicir, dieta para evitar alimentos prohibidos) e recaídas (é dicir, compulsiva, moitas veces incontrolable, comendo de alta alimentos apetitosos) que seguen a pesar das consecuencias negativas (). Aínda que son ben coñecidas as propiedades de reforzo positivas dos alimentos apetitosos, ), prestouse menos atención ás súas propiedades de reforzo negativas (-), é dicir, o aumento da probabilidade dunha resposta comportamental producida pola eliminación dun estímulo aversivo (por exemplo, a inxestión de alimentos apetecibles para aliviar os estados emocionais negativos). Os ciclos intermitentes de uso estendido de drogas de abuso poden levar progresivamente a "dependencia afectiva", observada como unha necesidade de cantidades máis altas e / ou máis regulares do fármaco para manter un determinado punto de axuste emocional e un estado emocional negativo ao cesar inxestión de drogas (, ). Tal retirada afectiva pode manter o uso e motivar a recaída mediante as propiedades de reforzo negativas de continuar e retomar o uso de drogas, respectivamente (, ).

Os sistemas de tensión cerebral do factor de liberación de corticotropina extrahypotalamica (CRF) están implicados na transición do uso de drogas á dependencia, durante o cal o consumo de drogas abusadas vólvese cada vez máis motivado por estes mecanismos de reforzo negativos que positivos. A CRF ten un papel relevante nas síndromes de abstinencia por todas as principais drogas de abuso, incluíndo alcohol, nicotina, cocaína, opiáceos, anfetaminas e tetrahidrocannabinol (, ). Por analogía, hipótese a repetición de ciclos de acceso estendido intermitente a alimentos altamente palatábeis para inducir as neuroadaptacións do sistema de CRF semellantes ás dos modelos de dependencia de drogas (, , ).

Resultados

O acceso estendido e intermitente a un alimento apetecível leva progresivamente a sofre de dietas menos preferidas cando non se dispón de alimentos apetecibles e de comer de bo gusto despois de ter acceso renovado (-). Para probar a hipótese de CRF1 sistemas median estas adaptacións de alimentación, ratas Wistar masculinas (n = 20) proporcionáronse unha dieta chow ad libitum (Chow / Chow) a diario cada semana ou se lles proporcionou un chow ad libitum para os días 5 (fase C) seguido dunha dieta azucarada altamente agradable para os días 2 (fase P) (Chow / Palatable) ) (Ver Fig. S1 para o calendario da dieta e Fig. S2 para os efectos da dieta sobre a inxestión de alimentos e o peso corporal). Despois das semanas 7 de ciclismo dietético, as ratas recibiron o CRF non peptídico1 antagonista do receptor R121919 (0, 5, 10 e 20 mg / kg, sc) nun deseño cadrado latino (). Os tratamentos recibiron 1 h antes de cambiar de dieta palatável a chow ou de chow a dieta agradable. R121919 diminuíu dependendo da inxestión de dieta do paladar e aumentou a inxestión de alimentos en chow en ratas Chow / palatábeis (fase de dieta × horario de dieta × dose farmacéutica: F3,54 = 7.25, P <0.001), sen alterar a inxestión de controis de chow. R121919 diminuíu a inxestión da dieta altamente apetecible ao renovar o acceso aos alimentos apetecibles (fase P) (Fig 1A). En probas independentes, o CRF1 antagonista do receptor aumentou a inxestión do chow menos palatável en ratas Chow / palatáveis ​​retiradas da dieta agradable (fase C) (Fig 1B). Deste xeito, atenuando a hipofagia do chow e o exceso de alimentos apetecibles, R121919 atenuou a amplitude do ciclo de inxestión (a diferenza entre a inxestión durante a primeira fase P agradable e a primeira retirada para a fase C de Chow: Horario de dieta × Dose da droga: F3,54 = 7.25, P <0.001) (Fig 1C). Apoiar un recrutamento progresivo de CRF-CRF1 Os sistemas segundo o historial de dieta, en lugar de por un efecto de dieta aguda, R121919 non reduciu a inxestión de alimentos apetecibles despois dunha soa exposición á dieta ou aumentou a inxestión de chow durante unha primeira retirada de alimentos apetecibles.Fig. S3).

FIG. 1. 

Efectos do CRF1 antagonista do receptor R121919 (−1 h pretratamento, 0, 5, 10 e 20 mg / kg, sc) na inxestión de alimentos acumulada 3-h en (A) Fase P (con acceso renovado á comida apetecible), (B) Fase C (cando as ratas foron retiradas do palatável) ...

A retirada dun acceso estendido e intermitente a un alimento agradable tamén pode aumentar o comportamento de ansiedade.). Para probar a hipótese de CRF1 Os receptores están implicados nos sinais de comportamento emocional negativo que seguen a retirada de alimentos apetecibles; administráronse ratas R121919 (0, 20 mg / kg, sc, 1-h pretratamento) e probado nun deseño entre os suxeitos no plus-labirinto elevado (), 5 – 9 h despois de cambiar de dieta palatábel a chow. Os ratos Chow / Palatable tratados con vehículos mostraron menos tempo de brazo aberto que os controis alimentados por chow, o que reflicte un efecto semellante ao ansioxénico, durante a retirada das semanas 7 de ciclismo de dieta (Fig 2A), un efecto aínda non visto despois de só dous ciclos de retirada.Fig. S4). O pre-tratamento con R121919 (20 mg / kg, a dose que modulou tanto o exceso de alimentos apetecibles como o subterráneo de chow) bloquearon a diminución da exploración do brazo aberto por ratos Chow / Palatable nunha dose que non alterou o comportamento máis labirinto nos controis chow ( Horario de dieta × Dose: F1,43 = 7.25, P <0.02; Fig 2Unha esquerda). A administración de R121919 non cambiou a actividade xeral medida como entradas de brazo pechado. Polo tanto, R121919 bloqueou o aumento do comportamento de ansiedade asociado á retirada do acceso intermitente e estendido a alimentos apetecibles, sen alterar o comportamento dos controis, o que suxire o recrutamento de CRF.1 sistemas.

FIG. 2. 

Efectos do CRF1 antagonista do receptor R121919 (pretratamento −1 h, 0, 20 mg / kg, sc) no comportamento elevado do labirinto elevado (n = 47) e proporción progresiva que responde polo alimento menos saboroso (n = 17) en ratas Wistar masculinas retiradas de alimentos apetecibles ...

A retirada dun acceso estendido e intermitente a alimentos apetecibles pode levar a déficits de motivación para obter dietas menos preferidas, un índice potencial de comportamento hipoedónico (). De xeito análogo, a resposta a reforzos gustativos menos preferidos baixo os programas de reforzo de proporción progresiva empregouse anteriormente para indexar os déficits motivacionais observados durante a retirada de drogas (). Para determinar a implicación de CRF1 Os receptores probaron os efectos de R121919 sobre o rendemento de ratos ciclados por dieta para obter o seu chow menos preferido baixo un programa de relación progresiva. Confirmando os resultados anteriores), os ratos Chow / Palatable tratados con vehículos mostraron unha motivación reducida para traballar para obter o chow menos palatável, reflectido por un punto de ruptura diminuído e as respostas totais diminuídas emitidas en comparación con ratas de Chow / Chow () (Fig. S5). O pretratamento de R121919 (20 mg / kg, a dose eficaz para aumentar a hipofagia de chow, reducir a hiperfagia alimentaria agradable e reducir o comportamento de tipo anxiogênico) reduciu selectivamente o déficit en rendemento de relación progresiva en ratos ciclados por dieta nunha dose ineficaz nos controis de chow. (punto de interrupción: Dieta Horario × Droga: F1,15 = 8.17, P <0.02; respostas totais: Programa de dieta × Medicamento: F1,15 = 9.14, P <0.01; Fig 2B, á esquerda). Fronte á interpretación alternativa de que R121919 facilitou o rendemento nas ratas Chow / Palatable por diminución da saciedadeestestiva, R121919 bloqueou os déficits ao responder tan pronto como 5 min na sesión (Diet Schedule × Drug: F1,15 = 2.55, P <0.05) (Fig 2B dereita). Polo tanto, o CRF1 O antagonista do receptor acentuou os déficits de motivación en proporción progresiva que respondían a reforzos gustativos menos preferidos que se observan nos animais retirados do acceso intermitente e estendido a alimentos altamente apetecibles.

Para probar a hipótese de que a retirada de alimentos apetecibles podería activar o sistema extrahitotalámico CRF relacionado co estrés, os niveis de ARNm de CRF e péptido no núcleo central da amígdala foron medidos mediante PCR e RIA en tempo real cuantitativos, respectivamente. As ratas foron cicladas de dieta para as semanas 7 ou alimentadas continuamente. Despois da anestesia e decapitación, golpes de cerebro desde o núcleo central da amígdala foron recollidos durante a retirada e despois de renovar o acceso á dieta agradable. Retirar o alimento apetecible nos ratos Chow / Palatable induciu un aumento de cinco veces na expresión de ARNm de CRF no núcleo central da amígdala en comparación cos ratos de Chow / Chow (Fig 3A). Por outra banda, o ARNm de CRF volveu a niveis semellantes ao control con acceso renovado a un alimento agradableF2,19 = 6.97, P <0.01). A expresión de ARNm de CRF no núcleo central da amígdala non cambiou cando as ratas Chow / Palatable foron cicladas só unha vez (Chow / Chow vs. Chow / Palatable: 5.5 ± 2.2 vs. 6.3 ± 1.7 ns), apoiando un recrutamento progresivo de CRF- CRF1 sistemas por historia histórica, máis que por un efecto agudo da dieta. Ademais, a expresión do ARNm de CRF non cambiou no núcleo accumbens, o córtex prefrontal ou o córtex insular, soportando a especificidade rexional dos achados (Fig. S6). Curiosamente, non se observaron cambios significativos na expresión de ARNm de CRF no núcleo paraventricular do hipotálamo ou na corticosterona circulante no mesmo momento de retirada en ratas Chow / palatáveis ​​(Figs. S6 e S7), o que suxire a hipótese de que os sistemas de estrés CRF de cambios de amygdalar, en vez de hipotalámicos, proximamente serviron as adaptacións de comportamento. Ademais, a imunorreactividade do péptido CRF no núcleo central da amígdala de animais retirados da dieta agradable era 70% máis elevada que en animais chow alimentados, pero volveu aos niveis de control alimentados por chow con acceso á dieta agradableF2,24 = 4.01, P <0.01) (Fig 3B). Así, a retirada de alimentos apetecibles activou o sistema de péptidos CRF relacionado co estrés no núcleo central da amígdala, análogo aos descubrimentos en modelos de retirada de fármacos e etanol., ). Debido a que o acceso renovado a alimentos apetecibles diminuíu a activación do sistema CRF extrahipotalámico no núcleo central da amígdala, onde a activación de CRF está ligada á ansiedade (), os resultados actuais tamén suxiren que un alimento agradable pode adquirir propiedades reforzantes negativas aliviando as consecuencias afectivas negativas da abstinencia.).

FIG. 3. 

Efectos da alternancia da dieta agradable na (A) ARNm de CRF e (B) Expresión do péptido CRF no núcleo central da amígdala. Ratos (n = 45) foron ciclos dietéticos para as semanas 7 e recolléronse o núcleo central dos golpes de amígdala. Tanto mRNA CRF como péptido ...

Para probar a hipótese de que as ratas retiradas de alimentos apetecibles poden mostrar aumento da sensibilidade á CRF1 modulación antagonista da sinalización do ácido γ-aminobutírico (GABA) no núcleo central da amígdala, que ocorre durante a retirada de etanol (), examinamos o efecto de R121919 na transmisión GABAérxica do núcleo central das neuronas da amígdala nunha preparación de porción. Ratos Wistar masculinos (n = 14) foron cicladas por dieta para semanas 7 e sacrificadas logo de ser cambiadas ao chow menos palatável. A transmisión basal de GABAérxica no núcleo central das sinapses da amígdala non difiere en relación á historia da dieta (n = Células 23) a través de todas as intensidades de estímulo utilizadas para evocar potenciais postinápticas inhibidoras de GABA (IPSP). Non obstante, a superfusión de 20 min con R121919 (1 μM) induciu unha maior redución no GABA evocadoA-IPSPs no núcleo central das neuronas de amígdala de ratas Chow / palatábeis (M ± SEM: 30 ± 6%, n = Células 9) que nas de controis alimentados por chow (M ± SEM: 12 ± 6%, P <0.05, n = Células 11) (Fig 4). Despois dun período de eliminación mínima 30, os IPSP de ambos os grupos volvían a niveis semellantes e de base. Polo tanto, é consistente coa sobreactivación da amígdala CRF-CRF1 sistema e efectos observados durante a retirada de etanol), as ratas con ciclos dietéticos mostraron un aumento da sensibilidade aos efectos inhibitores dunha CRF1 antagonista do receptor no núcleo central da transmisión amigdala GABAergic.

FIG. 4. 

Efectos do CRF1 antagonista do receptor R121919 en GABAA-IPSPs no núcleo central da amígdala tras un historial de acceso alternativo á dieta palatável en ratas Wistar masculinas (n = 14) retirado do accesible alimento. (A) R121919 diminuíu significativamente ...

Conversa

Os resultados colectivos proporcionan evidencias funcionais de que un historial de acceso estendido e intermitente a alimentos apetecíveis leva a neuroadaptacións progresivas e relevantes na motivación do estrés CRF-CRF extrahípotal.1 sistemas. En concreto, o CRF selectivo1 o antagonista do receptor R121919 afectou de xeito diferencial e selectivo a alimentación en ratas cicladas por dieta, aumentando a inxestión regular de chow e diminuíndo a inxestión de alimentos altamente palatábeis despois do acceso renovado. O CRF1 O antagonista do receptor tamén bloqueou de xeito selectivo o maior comportamento de ansiedade e os déficits de motivación ao responder por un chow menos preferido que se observou durante a retirada da dieta agradable. A retirada do acceso á dieta palatábel aumentou a expresión do xene e peptídico CRF no núcleo central da amígdala, efectos que foron eliminados con acceso renovado. Ademais, as ratas con ciclos dietéticos mostraron un aumento da sensibilidade aos efectos inhibidores dunha CRF1 antagonista do receptor na transmisión GABAérxica no núcleo central da amígdala, o que suxire aínda máis a hiperactivación da amígdala CRF-CRF1 sistema. O exceso de alimento saboroso tras un acceso renovado pode ser resultado do aumento da activación do sistema de CRF do período de abstinencia recentemente completado, visto como aumento da expresión de CRF e sensibilidade electrofisiolóxica ao CRF1 bloqueo do receptor no núcleo central da amígdala. CRF1 O pretratamento antagonista pouco antes do acceso aos alimentos aceptables interprétase así para opoñerse ao CRF-CRF aínda presente1 sobreacción do sistema de retirada. O breve curso de tempo de comida apetecible en exceso que se observa en animais non tratados) pode reflectir o tempo en que a expresión, liberación e efectos do péptido CRF normalízanse unha vez que se recupera o acceso a un alimento agradable, como se pode ver no presente estudo. Deste xeito, as dietas que se poden comer de forma intermitente poden inducir un cambio alostático nos sistemas de recompensa do cerebro mediante o recrutamento de CRF-CRF anti-recompensa.1 sistemas no núcleo central da amígdala.

Estes resultados teñen implicacións non só para a alimentación compulsiva, senón tamén para a motivación en xeral. A repetida activación dos sistemas hedónicos provocou procesos de tipo oponente no cerebro (é dicir, o recrutamento de CRF1 circuítos) que eran distintos dunha simple perda de función nos sistemas de transmisión de recompensas. Tales neuroadaptacións entre os sistemas () tamén ocorren durante a transición á dependencia de todas as principais drogas de abuso (, ). A xeneralización dos estímulos non farmacéuticos no presente estudo suxire que os procesos motivacionais poden perturbar a individuos que experimentan contrastes repetidos na intensidade dos estímulos hedónicos ao longo do tempo (). Adaptativamente, estes procesos poden cambiar o comportamento de procura de alimentos e consumatorio cara a alimentos ricos en enerxía e ricos en enerxía, ao tempo que desvalorizan os esforzos para obter alimentos menos ricos en enerxía e con pouca recompensa (ou non alimentos), unha adaptación evolutivamente útil cando hai custos de busca de alimentos (por exemplo, exposición aos depredadores, tempo e recursos enerxéticos limitados). No entorno actual, con todo, os mesmos procesos poden impulsar a inxestión de alimentos que promoven a obesidade a costa de alternativas menos saborosas, pero quizais máis nutritivas.

Deste xeito, os cambios de tipo adicción no CRF1 os sistemas poden axudar a impulsar (i) inxestión de alimentos densos para a enerxía,ii) baixo consumo de alternativas máis saudables, e (iii) o estado emocional negativo asociado que se produce cando se evita o acceso a un alimento agradable, , -, ). Traducido á condición humana, a activación do sistema CRF pode promover comer unha recaída na obesidade e trastornos alimentarios relacionados, así como outras secuelas motivacionais negativas da abstinencia cíclica dos alimentos apetecibles.

Materiais e Métodos

Temas.

Ratos Wistar masculinos (n = 155, 180-230 g, 45 días de idade) obtivéronse a partir de Charles River e só aloxados á súa chegada en gaiolas de plástico, 19 × 10.5 × 8 nun ciclo de luz inversa 12 h: 12 h (10 : 00 h apágase), vivarium con humidade (60%) e controlado pola temperatura (22 ° C). As ratas tiveron acceso a chow de roedores con base de millo [Dieta Harlan Teklad LM-485 7012: 65% (kcal) carbohidratos, 13% de graxa, proteína 21%, enerxía metabolizable 341 cal / 100 g] e auga ad libitum para a semana 1 antes do inicio de experimentos. Procedementos experimentais cumpridos co Instituto Nacional de Saúde Guía para o coidado e uso de animais de laboratorio (NIH número de publicación 85-23, 1996 revisado) e os "Principios do coidado dos animais de laboratorio" (http://www.nap.edu/readingroom / bookslabrats) e foron aprobados polo Comité Institucional de Coidados e Uso de animais do Instituto de Investigación Scripps.

Drogas.

R121919 foi sintetizado como se describe en Chen et al. (). R121919 ten unha alta afinidade (Ki = 3.5 nM) CRF selectivo1 antagonista con propiedades fisicoquímicas superiores a moitos outros CRF1 antagonistas (por exemplo, diminución de logP e logD, aumento da solubilidade na auga) (). Para probar, R121919 primeiro foi solubilizado en 1 M HCl (10% do volume final), despois diluído nun vehículo final de 20% (wt / vol) 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (Sigma-Aldrich), retratado con NaOH a pH 4.5. A solución R121919 administrouse sc (sc) nun volume de 2 mL / kg.

Ad Libitum Diet Alternation.

Despois da aclimatación, as ratas dividíronse en dous grupos correspondentes á inxestión de alimentos, ao peso corporal e á eficiencia da alimentación dos días anteriores 3 – 4. Un grupo recibiu unha dieta chow ("Chow") ad libitum 7 días por semana (Chow / Chow), e proporcionouse un segundo grupo a chow ad libitum para os días 5 cada semana seguido de 2 días de acceso ad libitum ao altamente palatável. dieta con sabor de sacarosa con chocolate ("palatable"; Chow / palatable). A dieta apetecible é unha dieta nutritiva completa, con sabor de chocolate, alta sacarosa (50% kcal), baseada en AIN-76A, que é comparable en proporcións de macronutrientes e en densidade de enerxía para a dieta chow [TestDiet; Fórmula con sabor de chocolate 5TUL: 66.8% (kcal) carbohidratos, 12.7% de graxa, proteína 20.5%, enerxía metabolizable 3.48 kcal / g; formulado como granulado de alimentos de precisión 45-mg para aumentar a súa preferencia (, )]. Para máis brevidade, a todos os experimentos fanse referencia aos primeiros días 5 (só o chow) e os últimos días 2 (chow ou palatable segundo o grupo experimental) en todas as experiencias como fases C e P. As dietas nunca estaban dispoñibles ao mesmo tempo. A dieta de Chow foi Harlan Teklad LM-485 Diet 7012 [65% (kcal) hidratos de carbono, 13% de graxa, proteína 21%, enerxía metabolizable 341 cal / 100 g] ou 5TUM dieta formulada como 4- a 5-g. % (kcal) de hidratos de carbono, 65.5% de graxa, proteína 10.4%, enerxía metabolizable 24.1 cal / 330 g; TestDiet]. Similar a estudos anteriores, Harlan Teklad LM-100 chow utilizouse nos experimentos de alimentación e labirinto elevados.), mentres que TestDiet 5TUM chow () empregouse no contido de ARNm de CRF progresivo, contido de peptídicos CRF, RIA de corticosterona e experimentos electrofisiolóxicos.

Como se publicou anteriormente (), as preferencias relativas á dieta, calculadas como a porcentaxe de ingesta diaria (kcal) da primeira dieta en relación coa segunda dieta, foron as seguintes: Dieta de chocolate 5TUL (dieta palatável azucarada) vs chow Harlan LM-485 (M ± SEM preferencia 90.7 ± 3.6%) e 5TUL Chocolate Diet (dieta azucarada saborosa) vs 5TUM chow Diet (M ± SEM preferencia 91.2 ± 3.7%).

Maze máis elevado.

A proba de labirinto máis elevado realizouse como se describe en Cottone et al. (). Os ratos Chow / Palatable foron ciclados durante polo menos unhas semanas 7 e despois foron tratados previamente con 20 mg / kg / R121919 (−1 h, sc) e probaron 5 – 9 h despois de pasar da dieta palatábel a chow (P → Fase C). As ratas de control de Chow / Chow probáronse simultáneamente nun deseño entre suxeitos (n = 47). A dieta Chow estaba dispoñible ad libitum ata o momento das probas. Para máis detalles vexa a Texto SI.

Programa de relación progresiva de reforzo de alimentos.

O programa de relación progresiva de reforzo para alimentos foi realizado como se describe en Cottone et al. (). Os animais recibiron ad libitum A / I chow (X pelletos 5 g) na súa gaiola doméstica ao longo do experimento salvo que se especifique o contrario. Os reforzadores de alimentos foron os gránulos de precisión chow 45-mg, idénticos en composición á dieta de coxinhos da casa. As sesións finalizaron cando os suxeitos non completaron unha razón para 14 min, coa última relación completada definida como o punto de quebra. Os ratas Chow / Palatable foron cicladas durante polo menos unhas semanas 7 e despois pretratadas con R121919 (−1 h, sc) no momento de cambiar de dieta palatábel a chow (fase P → C). As ratas de control de Chow / Chow probáronse simultáneamente nun deseño entre suxeitos (n = 17). As doses de R121919 (0, 20 mg / kg de peso corporal, sc) administráronse nun proxecto dentro do suxeito e contrapesado en dous ciclos de dieta. Para máis detalles vexa a Texto SI.

PCR cuantitativa en tempo real.

Ratos (n = 20) foron ciclo-alimentados durante 7 semanas, anestesiados e decapitados durante as dúas condicións de dieta (días 5 e 7 de cada ciclo semanal). Os cerebros elimináronse rapidamente e cortáronse en cortes coronalmente nunha matriz cerebral e recolleuse o núcleo central da amígdala, o núcleo accumbens, a cortiza insular e a cortiza prefrontal nunha etapa de xeo. O ARN total preparouse a partir de cada golpe cerebral usando un protocolo estándar para a extracción de ARN de tecidos animais. O ARN total (1 μg) transcribiuse inversamente en presenza de Oligo (dT) 20 segundo as instrucións do fabricante. As reaccións cuantitativas de RT-PCR leváronse a cabo nun volume de 20 μL usando cebadores 0.5 μM e MgCl 4 mM2. Os resultados foron analizados por métodos de segundo derivado e expresados ​​en unidades arbitrarias, normalizadas a niveis de expresión do xene de referencia, CypA. Todas as reaccións de RT-PCR para unha secuencia dada realizáronse dentro da mesma execución. Para máis detalles vexa a Texto SI.

Extracción de ácido peptídico e CRF RIA.

Ratos (n = 25) foron cicladas durante polo menos unhas semanas 7, anestesiadas e decapitadas durante as dúas condicións da dieta (días 5 e 7 de cada ciclo semanal). Os cerebros foron rapidamente eliminados e cortados coronariamente nunha matriz cerebral, e o núcleo central dos golpes de amígdala recolleu nunha etapa xeada. A extracción de ácido peptídico seguiu un procedemento xa establecido (). A inmunorreactividade de tipo CRF de tecido foi cuantificada cunha RIA en fase sólida sensible e específica adaptada de Zorrilla et al. (). Para máis detalles vexa a Texto SI.

Corticosterona RIA.

Ratos (n = 12) foron ciclo-dietéticos durante polo menos 7 semanas e tomouse mostraxe de sangue de cola durante as dúas condicións de dieta (días 5 e 7 de cada ciclo semanal). Os niveis plasmáticos de inmunorreactividade semellante á corticosterona determináronse cun kit RIA dispoñible no comercio, segundo as instrucións do fabricante (MP Biomedicals, Inc.) (). Para máis detalles vexa a Texto SI.

Estudos electrofisiolóxicos

Preparación da porción.

O núcleo central das franxas de amígdala preparouse como se describiu anteriormente (, ) de ratos (n = 7 / grupo) que fora cicloteado durante polo menos 7 semanas, anestesiado e decapitou 2 – 3 h despois de ser retirado do alimento agradable. Os cerebros foron eliminados rapidamente e colocados nun líquido cefalorraquídeo artificial xeado (aCSF) gasado con 95% O2 e 5% CO2. As franxas cortáronse, incubáronse nunha configuración de interface por aproximadamente 30 min, e estiveron completamente mergulladas e continuamente superfundadas con aCSF quente e gaseado. Engadíronse fármacos ao aCSF a partir de solucións de accións para obter concentracións coñecidas no superfusato. Nas taxas de superfusión 2 – 4 mL / min utilizadas, as concentracións de fármacos alcanzan 90% da concentración do depósito dentro de 2 min.

Electrofisioloxía.

Gravamos o núcleo central das neuronas de amígdala con micropipetas agudas usando o modo de abrazamento de corrente ou tensión discontinua. Mantivemos a maioría das neuronas preto do seu potencial de membrana en repouso. Os datos adquiríronse cun preamplificador e almacenáronse para posterior análise mediante o software pClamp. GABA farmacolóxicamente illadoA potenciais post-sinápticos inhibidores dos receptores (GABA)A-IPSPs evocáronse estimulando localmente no núcleo central da amígdala a través dun electrodo estimulante bipolar mentres superan os bloqueadores do receptor de glutamato CNQX e APV e GABAB bloqueador de receptores CGP 55845A. Para determinar os parámetros de resposta para cada cela, realizamos un protocolo de entrada e saída. Aplicouse un rango de correntes, comezando polo límite de corrente requirido para provocar un IPSP ata a tensión necesaria para obter a amplitude máxima. Normalizamos tres intensidades de estímulo de pasos iguais (limiar, semimáximo e máximo) como 1 – 3 ×. Os pasos actuais de hiperpolarización e despolarización (incrementos de 200-pA, duración de 750-ms) tamén se aplicaron para xerar curvas de tensión-corrente (VI). Cuantificamos as amplitudes de IPSP evocadas e as respostas de VI usando o software de Clampfit. Todas as medidas tomáronse antes da superfusión co CRF selectivo1 antagonista do receptor R121919 (1 μM), durante a súa superfusión (20 min) e despois do lavado (30 min). Para máis detalles vexa a Texto SI.

Estatísticas.

As comparacións de grupos empregaron a de Student t-testes (comparacións de dous grupos) ou análise de varianza (ANOVA) (polo menos tres comparacións de grupos), o último interpretado por sinxela análise de efectos principais ou comparacións de Newman-Keuls despois de efectos significativos de omnibus.P <0.05). Os datos do experimento de alimentación foron analizados por ANOVA mixtos de tres vías coa programación da dieta como factor entre os suxeitos e a fase de dose e dieta como factores dentro dos suxeitos. Os datos do experimento de máis labirinto elevado foron analizados por ANOVA de dúas vías con horario de dieta e dose como factores entre suxeitos. Para o calendario de proporción progresiva do experimento de reforzo, o punto de interrupción e as respostas totais foron analizadas por ANOVA mixtos de dobre sentido con Diet Schedule como factor entre suxeitos e Dose como factor dentro de suxeitos. O tempo transcorrido da resposta durante os primeiros 5 minutos foi analizado por ANOVA mixtos de tres vías con horario de dieta como factor entre suxeitos e Dose e tempo como factores dentro do suxeito. Os datos dos estudos electrofisiolóxicos analizáronse cun ANOVA entre suxeitos ou ANOVA dentro dos suxeitos con medidas repetidas, segundo o caso. Os datos da RIA de corticosterona foron analizados por ANOVA mesturado de dúas vías con Diet Schedule como factor entre suxeitos e Fase de dieta como factor dentro do suxeito. Os paquetes estatísticos empregados foron Instat 3.0, Prism 4.0 (GraphPad), Systat 11.0 e SPSS 11.5 (SPSS).

 

Material complementario

Información de apoio: 

Agradecementos.

Grazas a Mike Arends por asistencia editorial, Mary Gichuhi por asistencia administrativa, e Bob Lintz, Jeanette Helfers, Stephanie Dela Cruz e Molly Brennan por asistencia técnica. Este traballo contou co apoio de DK70118, DK26741 e P30DK56336 do Instituto Nacional de Diabetes e Enfermidades Digestivas e Renal. Instituto Nacional sobre Subvencións ao Abuso de Drogas DA023680; Subvencións do Instituto Nacional de Abuso de Alcohol e Alcoholismo AA016731 e AA015566; Instituto Nacional de Trastornos Neurolóxicos e Accidente cerebrovascular IT32NS061847-01A2; Instituto Nacional sobre Envellecemento Grant AG028040; Grant National Institute, Lung and Blood HL088083; a Fundación médica Ellison; e o Centro Pearson de Investigación sobre Alcoholismo e Adicción. Unha parte deste traballo foi apoiado polos programas de investigación intramuros do Instituto Nacional de Abuso de Drogas e polo Instituto Nacional de Abuso de Alcohol e Alcoholismo. Este é o número do manuscrito 19807 de The Scripps Research Institute.

Notas ao pé

 

Os autores declaran ningún conflito de interese.

 

 

Este artigo é unha presentación directa de PNAS.

 

 

Este artigo contén información de apoio en liña en www.pnas.org/cgi/content/full/0908789106/DCSupplemental.

 

References

1. Volkow ND, Wise RA. Como pode a drogodependencia axudarnos a entender a obesidade? Nat Neurosci. 2005; 8: 555-560. [PubMed]
2. Corwin RL. Ratos bingos: ¿un modelo de comportamento excesivo intermitente? Apetito. 2006; 46: 11-15. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
3. Boggiano MM, et al. A alta inxestión de alimentos apetecíbeis prevé a compulsión alimentaria independientemente da susceptibilidade á obesidade: un modelo animal de compulsión gorda vs obesa e obesidade con e sen comer con compulsión. Int J Obes. 2007; 31: 1357-1367. [PubMed]
4. Avena NM, Rada P, Hoebel BG. Evidencia da adicción ao azucre: efectos comportamentais e neuroquímicos da inxestión de azucre excesiva e intermitente. Neurosci Biobehav Rev. 2007; 32: 20-39. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
5 Teegarden SL, Bale TL. Os descensos na preferencia dietética producen unha maior emocionalidade e risco para a recaída dietética. Psiquiatría de Biol. 2007; 61: 1021 – 1029. [PubMed]
6. Cottone P, Sabino V, Steardo L, Zorrilla EP. O contraste negativo anticipatorio dependente dos opiáceos e o consumo de compulsión en ratas con acceso limitado a alimentos moi preferidos. Neuropsicofarmacoloxía. 2008; 33: 524-535. [PubMed]
7. Koob GF. Un papel para os sistemas de tensión cerebral en adicción. Neurona. 2008; 59: 11-34. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
8. Koob GF, Le Moal M. O abuso de drogas: a desregulación homeostática de Hedonic. Ciencia. 1997; 278: 52-58. [PubMed]
9. Ghitza UE, Grey SM, Epstein DH, Rice KC, Shaham Y. A droga anxiogénica yohimbina restitúe a procura de alimentos apetecibles nun modelo de recaída de ratos: papel dos receptores CRF1. Neuropsicofarmacoloxía. 2006; 31: 2188-2196. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
10. Cottone P, Sabino V, Steardo L, Zorrilla EP. O acceso de alimentos intermitente preferido reduce a eficacia reforzante do chow nas ratas. Am J Physiol. 2008; 295: R1066 – 1076. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
11. Cottone P, Sabino V, Steardo L, Zorrilla EP. Adaptacións metabólicas e consumadoras en ratas femininas con acceso alternativo a alimentos preferidos. Psicouroendocrinoloxía. 2008; 34: 38-49. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
12. Berner LA, Avena NM, Hoebel BG. Bingeing, auto-restricción e aumento do peso corporal en ratas Con acceso limitado a unha dieta de graxa doce. Obesidade. 2008; 16: 1998-2002. [PubMed]
13. Zorrilla EP, Koob GF. O potencial terapéutico dos antagonistas de CRF1 para a ansiedade. Experto Opin Investig Drugs. 2004; 13: 799-828. [PubMed]
14. Carobrez AP, Bertoglio LJ. Análise etolóxica e temporal do comportamento de ansiedade: o modelo de labirinto máis elevado 20 anos despois. Neurosci Biobehav Rev. 2005; 29: 1193-1205. [PubMed]
15. Markou A, et al. Modelos animais de ansia por drogas. Psicofarmacoloxía. 1993; 112: 163-182. [PubMed]
16. George O, et al. A activación do sistema CRF-CRF1 media os aumentos inducidos pola abstinencia na auto-administración da nicotina en ratas dependentes da nicotina. Proc Natl Acad Sci USA. 2007; 104: 17198-17203. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
17. Wells AS, Ler NW, Laugharne JD, Ahluwalia NS. Cambios de humor despois de cambiar a unha dieta baixa en graxas. Br J Nutr. 1998; 79: 23-30. [PubMed]
18. Cruz MT, et al. Os antagonistas dos receptores CRF1 bloquean a liberación inducida por etanol de GABA na amígdala central in vitro e in vivo. Alcohol Clin Exp Res. 2008; 32: 6s1 P27A.
19. Koob GF, Bloom FE. Mecanismos celulares e moleculares da dependencia de drogas. Ciencia. 1988; 242: 715-723. [PubMed]
20. Flaherty CF, Grigson PS. De contraste co reforzo: papel da continxencia da resposta en contraste anticipado. J Exp Psychol. 1988; 14: 165-176. [PubMed]
21. Chen C, et al. Deseño de relacións 2,5-dimetil-3- (6-dimetil-4-metilpiridina-3-il) -7-dipropilaminopirazolo [1, 5-a] pirimidina (NBI 30775 / R121919) e estrutura-actividade dunha serie de potentes e antagonistas dos receptores do factor liberador de corticotropina por vía oral. J Med Chem. 2004; 47: 4787-4798. [PubMed]
22. Cooper SJ, Francis RL. Efectos da administración aguda ou crónica de clordiazepóxido nos parámetros de alimentación utilizando dúas texturas alimentarias na rata. J Pharm Pharmacol. 1979; 31: 743-746. [PubMed]
23. Laboure H, Saux S, Nicolaidis S. Efectos do cambio de textura dos alimentos nos parámetros metabólicos: patróns de alimentación a curto e longo prazo e peso corporal. Am J Physiol. 2001; 280: R780 – R789. [PubMed]
24. Cottone P, Sabino V, Steardo L, Zorrilla EP. FG 7142 reduce específicamente o tamaño das comidas e a velocidade e regularidade da alimentación sostida en ratas femininas: evidencia de que os agonistas inversos en benzodiazepina reducen a palatabilidade dos alimentos. Neuropsicofarmacoloxía. 2007; 32: 1069-1081. [PubMed]
25. Lahmame A, Grigoriadis DE, De Souza EB, Armario A. Inmunorreactividade do factor de liberación de corticotropina cerebral e receptores en cinco cepas de ratos endémicos: relación co comportamento da natación forzada. Res. Cerebral. 1997; 750: 285-292. [PubMed]
26. Zorrilla EP, Valdez GR, Weiss F. Cambios nos niveis de inmunorreactividade rexional de tipo CRF e corticosterona plasmática durante a retirada prolongada de drogas en ratos dependentes. Psicofarmacoloxía. 2001; 158: 374-381. [PubMed]
27. Roberto M, Madamba SG, Moore SD, Tallent MK, Siggins GR. O etanol aumenta a transmisión de GABAérxicos en ambos os sitios pre e postsinápticos nas neuronas da amígdala do centro da rata. Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100: 2053-2058. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
28. Roberto M, Madamba SG, DG de Stouffer, Parsons LH, Siggins GR. Aumento da liberación de GABA na amígdala central de ratas dependentes de etanol. J Neurosci. 2004; 24: 10159-10166. [PubMed]