Os receptores Dopamine D2 na disfunción de recompensa como adicción e comidas compulsivas en ratas obesas (2010)

Comment: Este estudo demostra que cando un animal ten acceso ilimitado, un forte reforzador natural (alimento moi estimulante) pode causar un descenso nos receptores D2. Este descenso foi observado en case todas as ratas e produciuse con bastante rapidez. Cando se eliminou a comida "moi saborosa", as ratas negáronse a comer chow normal. As ratas seguiron aburridas (cando puideron) a pesar de emparejar descargas eléctricas co consumo de alimentos "moi agradable".

• Estudo completo

Nat Neurosci. 2010 maio; 13(5): 635-641. Publicado en liña 2010 March 28. doi:  10.1038 / nn.2519

Abstracto

Descubrimos que o desenvolvemento da obesidade xuntouse coa aparición dun déficit progresivamente en respostas de recompensa neural. Os cambios similares na homeostase de recompensa inducidos pola cocaína ou a heroína considéranse cruciais para desencadear a transición do consumo de drogas casual a compulsivo. En consecuencia, detectamos un comportamento de alimentación tipo compulsivo en ratas obesas pero non delgadas, medido como un consumo agradable de alimentos resistente á interrupción dun estímulo aversivo condicionado. Os receptores D2 de dopamina estriatal (D2R) foron descartados en ratas obesas, como se informou en humanos adictos ás drogas. Ademais, a caída do D2Rs estriatal mediada por lentivirus acelerou rapidamente o desenvolvemento de déficits de recompensa similares á adicción e a aparición de alimentos compulsivos en ratas con acceso estendido a alimentos ricos en graxas. Estes datos demostran que o consumo excesivo de alimentos apetitosos provoca respostas neuroadaptativas semellantes á adicción nos circuítos de recompensa cerebral e impulsa o desenvolvemento da alimentación compulsiva. Os mecanismos hedónicos comúns poden, por tanto, subxacer a obesidade e a dependencia de drogas.

introdución

A alimentación está influenciada polo pracer e a recompensa, e obter recompensa alimentaria pode motivar poderosamente o consumo1, 2. Non obstante, os mecanismos hedónicos que contribúen á obesidade seguen mal comprendidos. En humanos hiperfágicos con deficiencia conxénita de leptina, a actividade no estriado dorsal e ventral, que son compoñentes fundamentais dos circuítos de recompensa cerebral aumenta notablemente en resposta ás imaxes de alimentos3, e a terapia de reposición da leptina atenúa a actividade estriada e o "gusto" dos alimentos3. . Isto suxire que o estriado é importante en aspectos hedónicos do comportamento alimentario. Recentemente demostrouse que a activación do estriado en resposta a alimentos moi gustosos é contundente en individuos obesos cando se compara con controis magros4. Ademais, a hipofunción do estriado dorsal e o aumento de peso a longo prazo son máis pronunciados en individuos co alelo TaqIA do locus xene DRD2 – ANKK1, o que resulta nunha diminución da expresión do D2R estriado e demostrou predispor aos individuos a trastornos por dependencia de substancias4, 5 Estas e outras observacións similares levaron á proposta de que os déficits no procesamento da recompensa poden ser un factor de risco importante para o desenvolvemento da obesidade e que os individuos obesos poden consumir compulsivamente alimentos apetecibles para compensar a hiposensibilidade á recompensa6. En particular, non está claro se os déficits no procesamento da recompensa son constitutivos e preceden á obesidade ou se o consumo excesivo de alimentos apetecibles pode provocar a disfunción da recompensa e contribuír así á obesidade inducida pola dieta.

Unha característica que define aos individuos con sobrepeso e obesidade é que seguen en exceso a pesar das consecuencias sociais e sociais negativas. De feito, moitos individuos con exceso de peso expresan o desexo de limitar o seu consumo de alimentos, aínda que loitan por controlar a súa inxestión e consumir varias veces máis aló das súas necesidades enerxéticas7, 8. O desenvolvemento do comportamento de alimentación que non é sensible ao resultado negativo é análogo ao comportamento compulsivo de toma de drogas visto en toxicodependentes humanos, que é igual de impermeable ás consecuencias negativas9. Aquí investigamos os efectos do acceso estendido a unha dieta sabrosa e rica en graxas sobre a sensibilidade dos sistemas de recompensa do cerebro en ratas. Tamén analizamos a relación entre a desregulación hedónica inducida pola dieta e a aparición de procuras compostas. Finalmente, investigamos o papel das D2Rs estriais nestas respostas comportamentais similares ás dependencias.

Déficit de recompensa semellante á adicción en ratas obesas

Para probar os efectos do acceso restrinxido ou estendido a unha dieta rica en graxa e apetecible, preparamos ratas machos Wistar (300-350 g) cun electrodo estimulante bipolar no hipotálamo lateral e adestrámolos durante 10-14 d nun ensaio discreto. procedemento de recompensa de estimulación cerebral de limiar actual (BSR) ata que se estableceron limiares de recompensa estables4. No procedemento BSR, as ratas responden vigor para obter unha autoestimulación eléctrica gratificante a través do electrodo de estimulación interno, coa intensidade de estimulación mínima que mantén o comportamento de autoestimulación denominado limiar de recompensa10. Debido a que os limiares de recompensa permanecen estables e inalterados durante tempos prolongados baixo condicións básicas, este procedemento proporciona unha medida sensible da capacidade de resposta dos sistemas de recompensa cerebral. Despois do establecemento de limiares BSR estables (definidos como variación <10% nos limiares en tres sesións consecutivas), asignamos ratas a tres grupos que non mostraron diferenzas nos pesos corporais medios nin nos limiares de recompensa entre grupos. Aos tres grupos déronlles acceso diferencial a unha dieta de tipo "cafetería" que consiste en alimentos gustosos e densos en enerxía dispoñibles para o consumo humano (ver Métodos en liña). As ratas tiñan 0 h (ratas só chow; n = 9), 1 h (ratas de acceso restrinxido; n = 11) ou 18-23 h (ratas de acceso extendido; n = 11) acceso á dieta por día durante 40 días consecutivos. Sábese que as dietas de cafetería provocan obesidade inducida pola dieta en ratas11. Todas as ratas tamén tiveron acceso ad libitum ao chow de laboratorio estándar, con limiares de recompensa, aumento de peso e inxestión calórica rexistrados ao longo.

O peso aumentou notablemente nas ratas con acceso estendido á dieta da cafetería en comparación cos grupos de acceso exclusivo ou con restricións (fig. 1a). O peso tamén tendía a aumentar nos ratos de acceso restrinxido en comparación con ratos só con chow, pero este efecto non alcanzou significación estatística. O desenvolvemento da obesidade en ratas de acceso prolongado estivo estreitamente asociado a un empeoramento do déficit na función de recompensa cerebral, reflectida nos límites progresivamente elevados de BSR (Fig. 1b). Porque non se observaron diferenzas nas latencias de resposta para a BSR entre os tres grupos (Fig. 1 suplementaria), o déficit no rendemento comportamental non pode dar conta desta observación. En ratos reportáronse déficits similares na función de recompensa do cerebro con acceso estendido pero non restrinxido á auto-administración de cocaína ou heroína intravenosa 12, 13, 14. Deste xeito, o acceso estendido a un alimento rico en graxas saborosas pode inducir déficits semellantes á adicción na función de recompensa cerebral, considerada unha importante fonte de motivación que pode conducir a comer de máis e contribuír ao desenvolvemento da obesidade 1, 6.

Figura 1: Disfunción de ganancia de peso e recompensa en ratas con acceso estendido a unha dieta de cafetería.

(a) Aumento de peso medio (± sem) en ratas de acceso restrinxido só con chow, de acceso restrinxido e de acceso estendido (interacción de acceso × día: F39,702 = 7.9, P <0.0001; * P <0.05 en comparación co grupo de só chow, proba post hoc). (b) Cambio porcentual medio (± sem) dos limiares de recompensa base (interacción de acceso × tempo: F78,1092 = 1.7, P <0.0005; * P <0.05 en comparación co grupo só chow, proba post hoc).

Cando examinamos o comportamento de alimentación en detalle (Fig. 2), descubrimos que a inxestión calórica total diaria era semellante entre ratos de acceso só con chow e con acceso restrinxido (Fig. 2a, d). Pola contra, a inxestión calórica total en ratas con acceso estendido foi case o dobre que a das ratas de acceso restrinxido e só con chow (Fig. 2a, d). Aínda que os ratos con acceso restrinxido e só con chow mantiveron aproximadamente a mesma inxestión calórica diaria (fig. 2a, d), as ratas de acceso restrinxido só obtiveron ~ 33% das calorías diarias do chow (Fig. 2b, d), indicando que desenvolveron un comportamento de alimentación parecido ao atracón e consumían ~% do seu consumo diario de calorías durante a súa sesión de acceso 66 h á dieta da cafetería1 (Fig. 15d). As ratas de acceso estendido obtiveron só unha pequena fracción (~ 2%) do seu consumo calórico total a partir do chow (Fig. 5b); consumiron a dieta da cafetería case exclusivamente (fig. 2d). O cambio na preferencia dietética nos grupos de acceso restrinxido e de extensión tamén se reflectiu nun acentuado aumento na inxestión de graxa en comparación cos ratos só con chow (Fig. 2c e Fig. 2). De acordo cos informes anteriores2, houbo unha tendencia a diminuír o consumo da dieta da cafetería co paso do tempo nos ratos de acceso prolongado. Isto pode reflectir o desenvolvemento da tolerancia á palatabilidad dos alimentos ofrecidos como parte da dieta da cafetería ao longo do tempo. Non obstante, a preferencia pola dieta da cafetería versus o chow estándar mantívose constantemente alta nestas ratas (Fig. 16 suplementaria). Estes datos demostran que o acceso estendido pero non restrinxido a unha dieta sabrosa e rica en graxas provoca déficits de recompensa similares á adicción, excesos e perda de equilibrio enerxético homeostático. Pola contra, o acceso restrinxido a alimentos apetitosos dá lugar a patróns de consumo semellantes á compulsión, pero non interrompe o equilibrio da enerxía homeostática nin a función de recompensa do cerebro. Non obstante, é posible que o acceso restrinxido á dieta da cafetería por máis de 3 días consecutivos provocaría un aumento significativo de peso e interrupción da función de recompensa do cerebro.

Figura 2: patróns de consumo en ratas con acceso estendido a unha dieta de cafetería.

(a) A inxestión calórica media diaria (± sem) en ratas de só acceso chow, de acceso restrinxido e de acceso extendido (acceso: F1,324 = 100.6, P <0.0001; tempo: F18,324 = 7.8, P <0.0001; acceso × interacción temporal: F18,324 = 4.6, P <0.0001; * P <0.05 en comparación co grupo só chow, proba post hoc). (b) A inxestión calórica media diaria (± sem) do chow (acceso: F2,504 = 349.1, P <0.0001; tempo: F18,504 = 5.9, P <0.0001; acceso × tempo interacción: F36,504 = 3.52, P <0.0001; * P <0.05 en comparación co grupo só chow, proba post hoc). (c) A inxestión calórica media diaria (± sem) da graxa (acceso: F2,486 = 118.7, P <0.0001; tempo: F18,486 = 8.8, P <0.0001; acceso × tempo interacción: F36,486 = 6.2, P <0.0001; * P <0.05 en comparación co grupo só chow, proba post hoc). (d) Comparación da inxestión calórica media (± sem) total e das calorías consumidas exclusivamente por chow, durante todo o período de acceso de 40 días (acceso: F2,54 = 25.0, P <0.0001; fonte de calorías: F2,54 = 1235.2, P <0.0001; acceso × interacción fonte de calorías: F2,54 = 485.7, P <0.0001; *** P <0.001 en comparación coas calorías totais do grupo só chow, ### P <0.001 en comparación co total de calorías no mesmo grupo de ratas, proba post hoc).

Despois de 40 días, ás ratas xa non se lles permitía o acceso á dieta agradable pero seguían tendo acceso ad libitum ao chow de laboratorio estándar. Avaliamos os limiares de recompensa e o consumo diario durante este período forzado de "abstinencia". As elevacións dos limiares de recompensa persistiron durante polo menos 2 semanas nas ratas de acceso prolongado cando xa non tiñan acceso á dieta agradable (Fig. 3a). Isto contrasta cos déficits relativamente transitorios (~ 48 h) na función de recompensa reportados en ratas sometidas a abstinencia de cocaína autoadministrada13. Tamén houbo unha marcada diminución da inxestión calórica (Fig. 3b) e unha diminución gradual do peso corporal (Fig. 3c) en ratas de acceso prolongado e, en menor medida, en ratas de acceso restrinxido, durante este período de abstinencia, consistente con informes previos11, 15. Despois de 14 d de abstinencia, as ratas morreron e as colocacións de electrodos determináronse mediante tinguidura de violeta cresilo (Fig. 3d).

Figura 3: disfunción e hipofagia de recompensa persistente durante a abstinencia en ratas con acceso estendido a unha dieta de cafetería.

(a) Cambio porcentual medio dos limiares de recompensa basais (± sem) durante a abstinencia dunha dieta rica en graxas (acceso: F2,112 = 3.7, P <0.05; tempo: F4,112 = 2.3, P> 0.05; * P <0.05 en comparación co grupo só chow, proba post hoc). (b) A inxestión calórica media (± sem) o último día de acceso á dieta rica en graxas (base) e durante os 14 días de abstinencia cando só estaba dispoñible o chow estándar (acceso: F2,168 = 41.7, P <0.0001 ; tempo: F6,168 = 65.6, P <0.0001; acceso × tempo interacción: F12,168 = 38.3, P <0.0001; * P <0.05 en comparación co grupo só chow, proba post hoc). (c) Cambio no peso corporal medio (± sem) en comparación co peso corporal o último día de acceso á dieta rica en graxas (liña de base) e durante os 14 días de abstinencia cando só estaba dispoñible un chow estándar (acceso: F1,126 = 37.2, P <0.0001; tempo: F7,126 = 3.1, P <0.01; acceso × tempo interacción: F7,126 = 40.9, P <0.0001; * P <0.05 en comparación co grupo só chow, proba post hoc). (d) Reconstrución histolóxica da localización de electrodos estimulantes BSR no hipotálamo lateral de ratas só chow (triángulos), de acceso restrinxido (cadrados) e de acceso extendido (círculos).

D2R estriatales en ratas obesas: papel nos déficits de recompensa

A continuación probamos a hipótese de que o consumo excesivo dunha dieta de cafetería apetecible podería reducir a densidade de D2R estriada, contribuíndo ao desenvolvemento dunha hiposensibilidade de recompensa similar á adicción. Permitiuse a unha nova cohorte de ratas de acceso restrinxido só con chow, de acceso restrinxido e acceso amplo á dieta da cafetería ata que houbo un aumento estatisticamente significativo do peso corporal nas ratas de acceso estendido en comparación co grupo de só chow (P <0.05 ; Fig. 4a). A expresión estriada da forma ligada á membrana do D70R, moi glicosilada (~ 2 kDa), foi menor nas ratas de acceso estendido que nas ratas de acceso restrinxido ou só con chow (Fig. 4b; ver Métodos en liña). Cando dividimos as ratas de cada grupo de acceso en dous subgrupos sobre a base dunha división mediana de pesos corporais (lixeiros ou pesados), atopamos unha clara relación inversa entre o peso corporal e a expresión do D2R estriado (Fig. 4a, c). Non detectamos diminucións estatisticamente significativas na expresión das formas inmaduras non glicosiladas (~ 39 kDa) e citoplasmáticas glicosiladas (~ 51 kDa) intermedias do D2R (Fig. 4 complementaria) 17, o que indica que a expresión do D2R estriado en ratas de acceso estendido é probablemente regulada a través de mecanismos post-transcricionais.

Figura 4: A ganancia de peso está inversamente relacionada cos niveis de estrías D2R.

(a) As ratas de só acceso Chow, de acceso restrinxido e de acceso extendido subdividíronse en dous grupos por condición de acceso en función dunha división mediana de pesos corporais: lixeiro (L) ou pesado (H). (b) Todo o complexo estriatal recolleuse de todas as ratas e os niveis de D2R en cada grupo medidos mediante Western Blot. A banda D2R asociada á membrana resolveuse a 70 kDa e o control de carga de proteínas móstrase a continuación (β-actina, 43 kDa). Os inmunoblots de lonxitude completa móstranse na figura suplementaria 12. (c) As cantidades relativas de D2R no estriado das ratas de só acceso chow, de acceso restrinxido e de acceso estendido cuantificáronse por densitometría (F2,6 = 5.2, P <0.05, principal efecto do acceso; * P <0.05 e ** P <0.01 en comparación co grupo ch-only-L).

A continuación, para probar a relevancia funcional das reducións inducidas pola dieta na función D2R estriatal para a recompensa cerebral, deseñamos e validamos un vector lentiviral para entregar un ARN interferente curto (shRNA) para derrubar D2R (Lenti-D2Rsh; Fig. 5 e complementario Fig. 5). Os limiares de recompensa comezaron a aumentar en ratas tratadas con Lenti-D2Rsh case inmediatamente ao permitirse o acceso estendido á dieta da cafetería, mentres que os limiares de recompensa permaneceron inalterados nos ratos de acceso prolongado tratados cun vector de lentivirus baleiro (Lenti-control) durante un período relativamente curto de acceso á dieta da cafetería (14 d; Fig. 6a). As latencias de resposta non foron alteradas en ambos os grupos de ratos, mostrando que este efecto non era secundario aos déficits no rendemento das tarefas (Fig. 6 suplementaria). Os limiares de recompensa tamén foron inalterados en ratas tratadas con Lenti-D2Rsh ou Lenti-control que tiñan acceso ao chow só no mesmo período (Fig. 6b).

Os limiares permaneceron persistentemente elevados durante un 15 d extra de abstinencia cando todos os ratos tiñan acceso só ao chow estándar (Fig. 7 suplementaria). O golpe de estrato D2R aumentou a vulnerabilidade á hipofunción de recompensa inducida pola dieta, pero non alterou a actividade de base dos sistemas de recompensa do cerebro.

Figura 5: Caída mediada por lentivirus da expresión estriatal D2R.

(a) Representación gráfica das áreas estriadas nas que se sobreexpresou Lenti-D2Rsh. Os círculos verdes do hemisferio estriado esquerdo representan os lugares nos que se dirixiron as infusións virais. A tinguidura verde no hemisferio estriado dereito é unha tinguidura inmunoquímica representativa para a proteína fluorescente verde (GFP) do cerebro dunha rata Lenti-D2Rsh. (b) Inmunotransferencia representativa da expresión de D2R diminuída no estriado de ratas Lenti-D2Rsh. Os inmunoblots de lonxitude completa móstranse na figura suplementaria 13. (c) Cantidades relativas de D2R no estriado de ratas Lenti-control e Lenti-D2Rsh, cuantificadas por densitometría (* P <0.05 en comparación co grupo Lenti-control, proba post hoc ). (d) Non se detectou a infección das células gliais no estriado polo vector Lenti-D2Rsh. A tinción verde é GFP do virus; o vermello é o marcador de astrocitos proteína ácida fibrilar glial (GFAP); os núcleos celulares resáltanse mediante tinguidura DAPI en azul. As frechas brancas indican unha área localizada de gliose que se atopa só no lugar da inxección de virus no estriado e non nos tecidos circundantes nos que se difundiu o virus. Incluso nesta área, ningún dos astrocitos é GFP positivo. As frechas amarelas da imaxe ampliada resaltan os astrocitos típicos negativos de GFP que se detectaron. (e) Altos niveis de infección neuronal no estriado polo vector Lenti-D2Rsh. A tinción verde é GFP do virus; o vermello é o marcador nuclear neuronal NeuN; os núcleos celulares resáltanse mediante tinguidura DAPI en azul. As frechas amarelas da imaxe ampliada resaltan as neuronas GFP-positivas e NeuN-positivas no estriado. (f) Unha imaxe de maior aumento dunha neurona infectada viralmente (GFP positiva) no estriado das ratas Lenti-D2Rsh que mostra as características morfolóxicas típicas das neuronas espiñentas medias.

Figura 6: Golpe de estratosia D2R aumenta a vulnerabilidade para premiar a disfunción en ratos con acceso estendido a unha dieta de cafetería.

(a) Cambio porcentual medio (± sem) respecto dos limiares de recompensa basais en ratas Lenti-control e Lenti-D2Rsh que tiñan acceso ampliado á dieta da cafetería durante 14 días consecutivos (virus: F1,156 = 5.9, P <0.05; tempo: F13,156 = 2.2, P <0.05; interacción virus × tempo: F13,156 = 2.2, P <0.05; # P <0.05, efecto de interacción). (b) Cambio porcentual medio (± sem) desde os limiares de recompensa basais en ratas Lenti-control e Lenti-D2Rsh que tiveron acceso só para chow. (c) A inxestión calórica media (± sem) de ratas durante só 14 días de chow ou acceso prolongado (acceso: F2,28 = 135.6, *** P <0.0001). (d) Aumento de peso medio (± sem) durante 14 días de só chow ou acceso prolongado (acceso: F2,28 = 96.4, P <0.0001; *** P <0.001, principal efecto do acceso).

Descubrimos que a inxestión calórica (Fig. 6c) e a ganancia de peso (Fig. 6d) eran similares nos Lenti-D2Rsh e os correspondentes grupos de Lenti-control baixo condicións de acceso sólido ou chow (figuras complementarias 8 e 9). Deste xeito, o estorbo D2R alterou nin a preferencia pola dieta da cafetería nin a inxestión calórica total cando o alimento apetecible estaba dispoñible gratuitamente para o seu consumo.

Comer compulsivo en ratas obesas: papel para o estriatal D2R

A continuación probamos a hipótese de que unha alimentación compulsiva pode xurdir en ratas con acceso amplo á dieta da cafetería e que os déficits na sinalización estriatal D2R poden contribuír a este efecto. Permitiuse a unha nova cohorte de ratas de acceso restrinxido só con chow, acceso restrinxido e acceso prolongado á dieta da cafetería durante> 40 d ata que se produciron aumentos de peso estatisticamente significativos nas ratas estendidas (P <0.05 en comparación con ratas só chow; datos non amosado). Aos tres grupos de ratas só se lles permitiu un acceso de 30 minutos ao día á dieta da cafetería durante 5-7 días nunha cámara operante ata que se conseguiu unha inxestión estable (definida como variación <10% na inxestión diaria). A metade das ratas en cada condición de acceso foron entón expostas a un lixeiro (estímulo condicionado) emparellado coa entrega de choques nos pés (grupo castigado), mentres que os restantes ratos de cada grupo foron expostos á luz de sinalización en ausencia de choque nos pés (grupo impune) ). O día da proba, examinamos só os efectos da exposición á luz de sinal sobre o consumo de alimentos agradables (Fig. 7; ver Métodos en liña). Descubrimos que a inxestión calórica media durante as sesións de base de 30 minutos foi maior nas ratas de só acceso chow e de acceso restrinxido que nas ratas de acceso estendido (Fig. 7a, b). Isto suxire que as ratas de só acceso chow e de acceso restrinxido inclináronse sobre o alimento apetecible durante as sesións de acceso intermitentes de 30 minutos, reflectido no feito de que estas ratas consumiron ~ 40-50% da inxestión calórica diaria, normalmente ~ 100 kCal, durante estas sesións (Fig. 7a, b). Pola contra, as ratas de acceso prolongado parecen resistentes a desenvolver este comportamento alimenticio semellante ao de atracóns, quizais porque o seu historial de acceso case ilimitado aos alimentos agradables durante máis de 40 días consecutivos estableceu patróns de alimentación relativamente inflexibles para cambiar. No día da proba, non observamos efectos estatísticamente significativos da repetición de luz de cue sobre o consumo de alimentos nas ratas impunes dos grupos de só chow, de acceso restrinxido ou de acceso estendido cando se compara coa inxestión durante o período de referencia (Fig. 7a). A luz de referencia por si soa non tiña, por tanto, ningunha relevancia motivacional. Nas ratas castigadas, a luz de sinal de choque diminuíu significativamente a inxestión de comida apetecible nas ratas con acceso restrinxido só para chow. Non obstante, a luz de referencia non tivo ningún efecto sobre a inxestión de comida apetecible nas ratas de acceso extendido, mostrando que o seu consumo era insensible ás pistas ambientais aversivas que predicían adversidades. A inxestión de enerxía base nas ratas de acceso estendido foi inferior á dos outros grupos. Non obstante, debido a que a inxestión de chow durante períodos de tempo similares foi moito menor (Fig. 7d), é improbable que isto represente un "efecto chan" que confunda os nosos descubrimentos. Xuntos, os nosos datos apoian a idea de que un comportamento alimentario de tipo compulsivo pode xurdir en ratas de acceso prolongado dun xeito análogo á toma compulsiva de cocaína observada en ratas con antecedentes de acceso estendido á droga18.

Figura 7: Como resposta compulsiva para un alimento agradable.

(a) Consumo medio (± sem) de dieta apetecible en ratas impunes durante as sesións de base de 30 minutos e o día da proba cando as ratas estaban expostas a un estímulo neutro condicionado que non se emparellaba previamente con choque nocivo no pé (acceso: F2,20 = 5.2, P <0.05; # P <0.05 en comparación con ratas só chow). (b) Consumo medio (± sem) de dieta apetecible en ratas castigadas durante as sesións de base de 30 minutos e o día da proba cando as ratas estaban expostas a un estímulo condicionado que previamente se emparellaba con choque nocivo no pé (acceso: F2,21 = 3.9 , P <0.05; indicación: F1,21 = 8.6, P <0.01; acceso × interacción indicación: F2,21 = 4.7, P <0.05; * P <0.05 en comparación coa inxestión durante a sesión inicial, #P <0.05 en comparación con ratos só chow). (c) Consumo medio (± sem) de dieta apetecible durante as sesións de base de 30 minutos e o día da proba en ratas Lenti-control e Lenti-D2Rsh que antes tiñan só acceso chow ou un acceso estendido a unha dieta de cafetería (indicación: F1,26, 29.7 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <30 en comparación coa inxestión durante as sesións de base, proba post hoc). (d) Consumo medio (± sem) de chow durante as sesións de base de 2 minutos e o día da proba en ratas Lenti-control e Lenti-D1,26Rsh que anteriormente só tiñan chow ou tiñan acceso prolongado a unha dieta de cafetería (indicación: F44.9 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <XNUMX en comparación coa inxestión durante as sesións de base, proba post hoc).

Finalmente, examinamos os efectos do estímulo condicionado por castigo sobre a inxestión de alimentos nas ratas Lenti-control e Lenti-D2Rsh que antes tiveran acceso só a chow ou acceso ampliado á dieta da cafetería (ratas da Fig. 6). Descubrimos que a inxestión inicial de comida apetecible durante as sesións iniciais de 30 minutos foi igualmente alta (~ 40 kCal) nos catro grupos (Fig. 7c). Ademais, o consumo diario total de chow (na gaiola doméstica) foi similar entre os catro grupos de ratas durante as sesións de acondicionamento e o día da proba (Fig. 10 complementaria). Os 14 d de acceso previo á dieta da cafetería non foron, polo tanto, suficientes para bloquear o comportamento alimenticio semellante ao atracón dun xeito similar ao visto en ratas que tiveron> 40 d de acceso estendido á dieta da cafetería (Fig. 7a, b). O estímulo aversivo da luz interrompeu a inxestión de comida apetecible nas ratas Lenti-control e Lenti-D2Rsh que antes só tiñan acceso a chow (Fig. 7c). Do mesmo xeito, o estímulo condicionado aversivo interrompeu a inxestión de comida apetecible nas ratas control Lenti que antes tiñan 14 días de acceso prolongado á dieta da cafetería. Pola contra, o estímulo condicionado aversivo non tivo ningún impacto no consumo de comida apetecible nas ratas Lenti-D2Rsh que antes tiñan 14 días de acceso prolongado á dieta da cafetería (Fig. 7c). Os limiares BSR mantivéronse significativamente elevados nestas ratas cando se rexistraron 48 horas despois da sesión de proba, mentres que os limiares permaneceron estables e inalterados nos outros tres grupos de ratas

(Complementaria Fig. 11). Para comprobar que a resistencia á supresión inducida por estímulos condicionados da inxestión de alimentos apetecible nos ratos de acceso prolongado Lenti-D2Rsh non foi secundaria a deficiencias nos procesos de acondicionamento clásicos, probamos os efectos do estímulo aversivo condicionado no consumo de chow estándar menos sabroso en os catro grupos de ratas. En contraste co consumo de compulsión dos alimentos apetecibles, descubrimos que os catro grupos de ratos consumían pouco chow (~ 2 kCal) durante as sesións básicas de min 30 (Fig. 7d) e que o consumo de chow foi interrompido en todos os catro grupos por unha magnitude similar á exposición ao estímulo condicionado aversivo (Fig. 7d). Estes datos demostran que a caída dos D2Rs estriais acelerou notablemente a aparición de comer de forma compulsiva de alimentos apetitosos, pero só en ratas cunha historia de acceso estendido. Ademais, como a alimentación compulsiva só se detectou nos ratos Lenti-D2Rsh que tiñan límites elevados de BSR, a hipofunción de recompensa inducida pola dieta pode ser un antecedente necesario para a procura de alimentos compulsivos.

Conversa

A facilidade de acceso a alimentos ricos en graxas saborosas considérase un importante factor de risco ambiental para a obesidade19. Descubrimos que o acceso estendido a unha dieta de estilo cafetería altamente palatável resultou en excesos e aumento de peso xunto con elevar progresivamente os límites de BSR nas ratas. Este efecto sobre os limiares de BSR pode explicarse diminuíndo gradualmente a capacidade de resposta dos circuítos de recompensa cerebral, unha interpretación consistente co feito de que a restrición de alimentos e a perda de peso pode aumentar 20, mentres que a sobrealimentación aguda pode diminuír transitoriamente. Este descubrimento representa unha extensión do traballo que amosa que a sobrealimentación aguda de ratas a través dun tubo de alimentación intragástricaNNUMX, e distensión gástrica ou infusión de glucagón intravenoso que imita a saciedade postprandial. 21, 21, 22, diminúe a resposta para a recompensa do BSR hipotálamo lateral e aumenta as respostas de aversión aos estimulación23. Os traballos previos tamén demostraron que varias veces alimentan ás ratas a través de tubos intragástricos ata que o seu peso aumentou de ~ 24 g de xeito similar diminúe as taxas de resposta para o BSR, efecto que persiste ata que o peso do corpo teña normalizado. Do mesmo xeito que nestes descubrimentos en ratas, a reacción en gatos de BSR hipotálamo lateral inhibiuse por alimentación previa a satiación25, mostrando que se conservan as interaccións entre a función de recompensa cerebral e o estado metabólico e tamén se producen en humanos tamén. A facilidade de acceso e consecuente exceso de dieta nas estancias da cafetería en humanos considérase un importante factor ambiental na actual epidemia de obesidade nas sociedades occidentais. Os nosos datos mostran que a hipofunción de recompensa xorde en ratas que excesivamente volven unha dieta da cafetería apetecible semellante á que consumen os seres humanos e que este efecto empeora progresivamente ao gañar máis peso. En particular, todas as ratas con elevación do límite de recompensa ≥200% tiñan electrodos BSR situados dentro de ~ 23 μm do fornix dorsolateralmente. A sensibilidade das neuronas relacionadas coa recompensa nesta área increméntase mediante a restricción dos alimentos de xeito que é sensible á hormona leptina derivada da graxa, e esta rexión cerebral considérase un substrato importante para o alimento recompensado. Os circuítos cerebrais que regulan os hedonicos dos alimentos son, por tanto, inhibidos por sinalización de mensaxes que estiman a saciedade, consistente cos estudos recentes sobre imaxes humanas que amosan que a distención gástricaNNX e o péptido do factor posprandial derivado do intestino YY26-19 (PYY) 20 modulan a actividade das rexións do cerebro implicados no procesamento de recompensas. Ademais, os sistemas de recompensa tamén son inhibidos por un aumento excesivo de peso. Os informes recentes indican que a leptina circulante, un regulador clave do equilibrio enerxético, pode penetrar nos tecidos cerebrais e inhibir a actividade de circuítos de recompensaNumx, 500, 27, 28.

Os déficits de recompensa en ratas con sobrepeso poden reflectir diminucións contraadaptativas na sensibilidade de base dos circuítos de recompensa cerebral para opoñerse á súa sobreestimulación por alimentos apetecibles. Esta hipofunción de recompensa inducida pola dieta pode contribuír ao desenvolvemento da obesidade aumentando a motivación para consumir dietas "obesogénicas" de alta recompensa para evitar ou aliviar este estado de recompensa negativa6, 32. Isto pode explicar a hipofagia que observamos no acceso estendido. ratas e en menor grao en ratas de acceso restrinxido cando se retirou o alimento apetecible e só se dispoñía do chow menos apetecible. Este escenario tamén é consistente cos datos de estudos de imaxe cerebral humana nos que a activación contundente do estriado en resposta a alimentos moi gustosos, especialmente en individuos con polimorfismos xenéticos que se pensa que diminúen a expresión de D2R estriada, está asociada a un aumento de peso a longo prazo4. Non está claro se esa hiposensibilidade á recompensa en individuos obesos maniféstase antes do desenvolvemento da obesidade e está relacionada unicamente con factores xenéticos ("síndrome de deficiencia de recompensa") ou se o consumo excesivo pode causar trastornos no procesamento da recompensa. Os nosos datos demostran que o acceso prolongado a alimentos de alta enerxía e os consecuentes brotes de exceso de comida premian a sensibilidade e, polo tanto, poden representar un importante mecanismo hedónico que promove o desenvolvemento da obesidade. Unha disfunción de recompensa similar á que se informa aquí en ratas obesas tamén se detecta en ratas con antecedentes de acceso prolongado á autoadministración intravenosa de cocaína ou heroína, pero non en aqueles con antecedentes de acceso restrinxido12, 13, 14. Ademais, a transición de Propúxose a busca de drogas casual a compulsiva como resultado dun intento de aliviar o estado persistente de diminución da recompensa inducida por esta disfunción de recompensa inducida por drogas12, 32, 33. Así, os nosos datos indican que a obesidade e a adicción ás drogas poden compartir mecanismos hedónicos subxacentes.

A baixa regulación da expresión estriatal D2R é unha resposta neuroadaptativa notable ante o exceso de consumo de alimentos apetecibles. De feito, as reducións na densidade estriatal D2R aparecen en individuos con sobrepeso4, 34 e rodents35, 36. Por outra banda, os individuos con anorexia nerviosa elevaron a D2R37 estriatal e a perda de peso en individuos obesos tras a cirurxía bariátrica (bypass gástrico) está asociada a un estriatal elevado D2R density28. O polimorfismo xénico referido como o alelo de TaqIA A1 ten como resultado unha diminución da densidade striatal D2R e os individuos que albergan este alelo están sobre-representados nas poboacións obesas4. O alelo de TaqIA tamén aumenta a vulnerabilidade ao alcohol, á opioide e ao estimulante psicomotor. As reducións na densidade striatal D38R que se producen a través de factores xenéticos constitutivos ou como consecuencia do exceso de alimentos poden contribuír aos mecanismos neurobiolóxicos da obesidade. Descubrimos que os niveis estriais da isoforma 2 kDa D70R, que se reflicte no D2R asociado á membrana, estiveron inversamente relacionados co peso do corpo nos ratos dos grupos con acceso restrinxido e con acceso estendido (fig. 2). A derrota da expresión estriatal D4R, máis destacada no estriado dorsolateral (Fig. 2), fixo que os limiares de BSR aumentasen case inmediatamente despois da exposición á dieta da cafetería. Polo tanto, as diminucións da expresión estriatal D5R aceleraron rápidamente a aparición da hipofunción de recompensa nas ratas con acceso estendido a alimentos altamente apetecibles, un resultado consistente cos datos de imaxes do cerebro humano que indican que os déficits en densidade D2R estriada contribúen a premiar a hipofunción en individuos obesos.

Destaca tamén tres características dos ratos Lenti-D2Rsh. En primeiro lugar, aínda que a eliminación estratéxica de D2R combinada cun acceso estendido á dieta palatábel resultou en elevar os limiares de BSR, non houbo diferenzas na inxestión calórica ou aumento de peso nestes ratos en comparación coas ratas de control. Isto pode reflectir o feito de que as ratas só tiñan acceso á dieta da cafetería; Os períodos de acceso máis longos poderían ter como resultado un aumento de peso no tempo, do mesmo xeito que a maior susceptibilidade á ganancia de peso observada en humanos con déficit na sinal D14R estriatal2. Non obstante, a vantaxe de limitar o acceso á dieta da cafetería só a 4 d é que as ratas knockdown con acceso estendido foron o único grupo que mostrou límites elevados de BSR, e isto permitiu avaliar o papel potencial da hipofunción de recompensa no desenvolvemento de compulsivos comer (ver abaixo). En segundo lugar, os limiares de BSR mantivéronse estables e inalterados nas ratas knockdown que tiñan acceso só a chow. Isto indica que a redución da expresión estriatal D14R só non foi suficiente para inducir a hipersensibilidade da recompensa; en cambio, parecía interactuar con un exceso de consumo de alimentos apetitosos para acelerar a aparición deste estado de redución da sensibilidade. Outras respostas de adaptación nos circuítos de recompensa do cerebro poden provocar unha hipersensibilidade de recompensa nas ratas con acceso estendido á dieta da cafetería. Tendo isto en conta, observamos que o agonista D2R bromocriptina reduce os niveis circulantes de leptin2 e a leptina inhibe a alimentación polo menos en parte, inhibindo as rexións estriaxias que controlan as respostas hedónicas ao alimento39, 3, 30. Deste xeito, é posible que a baixa regulación do D31R estriatal en resposta ao aumento do peso corporal aumenta a sinalización da leptina e, en consecuencia, aumenta os efectos inhibidores desta adipocina nos sistemas de recompensa do cerebro. Finalmente, observamos que apuntamos aos nosos vectores de lentivirus cara ao estriado dorsolateral. Isto foi principalmente por razóns técnicas, xa que a colocación lateral das cánulas para a entrega de virus no estriado permitiu tamén acomodar o electrodo hipotálamo estimulante de permanencia para a determinación do límite de BSR. Deste xeito, é posible que o foco de D2R para a eliminación doutras áreas do estriado, especialmente as áreas dorsomedial e ventral (núcleo e núcleo accumbens), poidan ter límites de BSR elevados mesmo en ausencia da dieta agradable.

O estriado dorsolateral estivo moi implicado na aprendizaxe tipo hábito de resposta ao estímulo, como se reflicte no desenvolvemento dun comportamento consumatorio insensible á depreciación mediante a alimentación previa á saciedade ou o emparellamento con estímulos nocivos40. Ao dirixir predominantemente o estriado dorsolateral, poderiamos derrubar poboacións de D2R que regulan a vulnerabilidade da rata ao desenvolvemento dunha alimentación compulsiva. De acordo co papel dos D2Rs estriais nos comportamentos compulsivos, o alelo TaqIA do xene do xene humano DRD2 – ANKK1, que resulta nunha baixa densidade de D2R estriado5, rompe a activación do estriado en resposta a un alimento apetecible4 e eleva a vulnerabilidade á obesidade4. déficits na aprendizaxe para evitar accións con consecuencias negativas41. A perda do control inhibitorio sobre o comportamento que pode ter un resultado negativo é un trazo característico tanto da obesidade como das drogodependencias, nas que os comportamentos consumativos persisten a pesar das consecuencias sociais, sanitarias ou financeiras negativas. O comportamento tomador de cocaína en ratas con antecedentes de inxestión extensa de drogas pode volverse inflexible e resistente á interrupción por un estímulo condicionado aversivo que predice un resultado negativo (choque no pé) 18. Do mesmo xeito, os ratos que antes tiñan acceso a unha dieta rica en graxa gustábel pasarán máis tempo nun ambiente aversivo (moi iluminado) para obter o alimento apetecible que os ratos que non tiñan experiencia coa dieta42. Descubrimos que o consumo de comida agradable en ratas con acceso amplo á dieta da cafetería era igualmente insensible a un estímulo condicionado aversivo. De acordo co papel das D2Rs estriadas neste efecto, atopouse unha comida de tipo compulsivo nas ratas derrubadas D2R estriadas que antes tiñan 14 días de acceso prolongado á dieta da cafetería pero non nos grupos control. Dende a perspectiva da neurocircuítoría, o acceso amplo a alimentos apetecibles pode desencadear a plasticidade nas vías corticostriatais, volvendo así aos animais máis vulnerables ao desenvolvemento de condutas compulsivas, con déficits na sinalización D2R estriada que mellora este proceso. De feito, a densidade de D2R estriada reducida en individuos obesos está correlacionada cun metabolismo reducido en áreas corticais prefrontais e orbitofrontais43 que exercen un control inhibitorio sobre o comportamento44.

En particular, o consumo compulsivo de alimentos apetecibles foi detectado só nas ratas knockdown que previamente tiñan acceso á dieta da cafetería, non nas ratas de control que tiñan acceso ao rexistro da cafetería durante o mesmo período de tempo, nin en ratas de caída que tiñan acceso de chow-only. A principal diferenza entre as ratas knockdown con acceso previo e aos demais grupos foron os seus límites BSR persistentemente elevados. Isto pode reflectir orixes neurobiolóxicas comúns da hipofunción de recompensa e a aparición de comer de tipo compulsivo, que son temporalmente coincidentes aínda que son fenómenos independentes. Alternativamente, a hipofunción de recompensa inducida pola dieta pode servir como substrato para o reforzo negativo que facilita o desenvolvemento de comer compulsivo. 14, 32, 33. Sexan cales sexan os mecanismos subxacentes, os nosos resultados demostran que as respostas obesas poden xurdir nunha resposta compulsiva similar á adicción e indican que o déficit na sinalización D2R estriatal aumenta a vulnerabilidade ao desenvolvemento deste comportamento.

En resumo, descubrimos que o exceso de estimulación dos sistemas de recompensa do cerebro a través dun consumo excesivo de alimentos densos e apetecibles para a enerxía induce unha profunda hipersensibilidade no estado de recompensa e o desenvolvemento de comer compulsivo. Estas respostas de comportamento inadaptadas nas ratas obesas probablemente xorden de déficits inducidos por dieta na sinalización D2R estriada. O exceso de consumo de fármacos de abuso diminúe de xeito similar a densidade estratical D2R, induce un profundo estado de recompensa e provoca a aparición de comportamentos compulsivos. Polo tanto, os nosos descubrimentos soportan o traballo anterior4, 19, 42, 45, 46, 47 en indicar que a obesidade e a adicción ás drogas poden xurdir por respostas neuroadaptativas similares nos circuítos de recompensa do cerebro.

Methods

Ratas.

Os ratos Wistar masculinos que pesaban 300-350 g no inicio dos experimentos obtivéronse a partir do río Charles. Ao chegar, as ratas foron aloxadas individualmente a temperatura constante nun ciclo de luz-escuridade 12-h (acéndese en 2200 h). Permitíuselles ás ratas o acceso ad libitum ao chow e ao auga estándar do laboratorio durante a duración do experimento. Todos os procedementos foron aprobados polo Comité Institucional de Cuidado e Uso de animais de Scripps Florida e as ratas foron tratadas de acordo coas directrices establecidas polos Institutos Nacionais de Saúde sobre os principios do coidado dos animais.

Procedementos cirúrxicos.

As ratas preparadas con electrodos de estimulación BSR foron anestesiadas por inhalación de isoflurano 1-3% en osíxeno e colocadas nun marco estereotóxico (Kopf). Os electrodos BSR bipolares (11 mm de longo) foron implantados no hipotálamo lateral posterior (anteroposterior, −0.5 mm de bregma; mediolateral, ± 1.7 mm da liña media; dorsoventral, 8.3 mm da dura; a barra incisiva foi axustada a 5 mm por riba da liña interaural ) 47. As ratas que recibiron inxeccións de virus tamén se prepararon con cánulas de guía bilateral (calibre 23, 14 mm de longo) colocadas sobre o estriado (anteroposterior, 2.8 mm de bregma; mediolateral, ± 3.1 mm da liña media; dorsoventral, −2.4 mm da dura) 48 e enchido con estiletes 14-mm. Catro parafusos de acero inoxidable e acrílico dental mantiveron o electrodo e as cánulas no seu sitio. A ferida cirúrxica foi tratada con antibiótico tópico unha vez cada 12 h para 5 d despois da cirurxía. Permitíuselles á 7-10 d que se recuperasen da cirurxía e logo formáronse no procedemento de limiar BSR.

Procedemento BSR.

Os ratos foron adestrados para responder pola estimulación BSR segundo un procedemento de limiares de corrente discreta similar ao descrito noutro lugar10, 14. Resumindo, os niveis actuais de BSR foron variados en series alternativas descendentes e ascendentes en pasos 5-μA. En cada sesión de proba presentáronse catro series descendentes / ascendentes. O limiar para cada serie definíase como o punto medio entre dúas intensidades de corrente consecutivas para as que as ratas responderon en polo menos tres dos cinco ensaios e dúas intensidades actuais consecutivas nas que as ratas non responderon en tres ou máis dos cinco ensaios. O limiar global da sesión definíase como a media dos limiares das catro series individuais. Cada sesión de proba tiña unha duración de aproximadamente 10 minutos. Os limiares estables de BSR definíronse como variación ≤30% nos limiares sobre 10 días consecutivos, normalmente establecidos tras 5 – 10 d de adestramento. A latencia de resposta para cada sesión de proba definiuse como a latencia media de resposta de todos os ensaios nos que se produciu unha resposta positiva.

Envase e entrega viral.

O ARN de horquilla curto entregouse e expresouse constitutivamente usando o sistema vectorial pRNAT-U6.2 / Lenti (GenScript). As partículas virais preparáronse segundo o protocolo do fabricante. En breve, as células HEK 293FT transfectáronse cun vector que contiña o inserto de shRNA (5'-GGATCCCGCGCAGCAGTCGAGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCTCGACTGCTGCGCTTTTTTCTCACACTCGAG-3 ') ou o vector baleiro, máis ViraPower Packaging Mix (Invitrogen) durante 72 h. A continuación, o sobrenadante recolleuse e concentrouse por ultracentrifugación (24 g, rotor Beck 76,755 CI SW SW 32 TI., 90 min, 4 ° C) e o título viral determinouse mediante clasificación de células activadas por fluorescencia segundo as instrucións do fabricante. Aliquotouse o virus e almacenouse en caixas protexidas contra a luz a -80 ° C ata o seu uso.

As ratas con límites estables de BSR recibiron inxeccións virais bilaterales en tres sitios do estriado de cada hemisferio cerebral (2 μl por inxección, 1 μl min − 1, 1 min entre inxeccións, un total de seis inxeccións por rata). As ratas permitíronse polo menos 2-3 d a recuperación de inxeccións intrastriatales antes de que se continuase a avaliación do limiar BSR. A avaliación do límite diario de BSR continuou para 33 d despois de que as inxeccións de virus asegurasen a máxima caída de D2R durante o estriado antes de permitir o acceso ás ratas á dieta da cafetería. Non houbo diferenzas nos límites de BSR entre os ratos Lenti-control e Lenti-D2Rsh durante estes 33 d (datos non mostrados).

Inmunoblotting.

As ratas morreron aproximadamente 1 h despois do seu acceso regular á cafetería, e os cerebros foron eliminados rapidamente. Preparáronse seccións cerebrais de espesor de 1-2 mm usando unha matriz cerebral coronal (intervalo de porción 1-mm; Plastics One) nun bloque de xeo e tomáronse punzóns de tecido dorsal (bregma: ~ 2.2 a −0.26 mm). Recolléronse rápidamente punzóns de tecido estriatal, conxeláronse e almacenáronse a −80 ° C ata o uso. As mostras individuais foron descongeladas en xeo e as mesmas cantidades de tecido estriado reuníronse en base a unha división media dependente do peso dos grupos de acceso (ratos 7-10 por piscina). O tecido foi resuspendido en 500 μl tampón de xeo RIPA (Thermo Scientific) que contén ortovanadato de sodio, inhibidores do cóctel de fosfatase 1 e 2 (Sigma-Aldrich), leupeptina e pepstatin antes da homoxeneización. Os lisados ​​de tecidos foron fervidos para 10 min en buffer de mostra e cargados en xeles 4% –20% ou 10% Tris-glicina SDS (Invitrogen). A proteína foi transferida a membranas de nitrocelulosa, bloqueadas por 1 h en ~ 23-25 ° C (leite seco 5% sen graxas e 0.2% Tween-20 en PBS, pH 7.4) e incubadas en anticorpos primarios durante a noite a 4 ° C. Os seguintes anticorpos primarios diluíronse en solución de bloques: monoclonal de rato D2R (Santa Cruz, 1: 100) ou monoclonal de rato β-actina (Santa Cruz, 1: 200). O reactivo chemiluminescent ECL engadiuse logo da incubación con anticorpos secundarios conxugados con peroxidasa de rábano (Amersham, 1: 2,000). A forma asociada á membrana madura de D2DR (~ 70 kDa) 17, 49 foi normalizada a un control de carga de proteínas (β-actina; 43 kDa) e cuantificada por densitometría usando o software NIH Image J.

Análise inmunoquímica.

As ratas foron anestesiadas e foron perfundidas transcardialmente con paraformaldehído% 4 en PBS (pH 7.6). Elimináronse os cerebros, fixáronse durante a noite e almacenáronse en sacarosa (solución 30% en PBS, pH 7.4) durante polo menos 72 h. As seccións de tecido conxeladas (30 μm de espesor) recolléronse a partir dun microtomo e bloqueadas (3% BSA, 5% soro de cabra normal e 0.3% Triton X-100 en PBS) para 1 h a ~ 23-25 ° C. Os seguintes anticorpos primarios foron engadidos á solución de bloque e incubados durante a noite en 4 ° C: polo policlonal a GFP (Abcam, 1: 1,000); conejo monoclonal a GFAP (Millipore, 1: 1,000); rato monoclonal a NeuN (Millipore, 1: 1,000). As seccións foron incubadas con anticorpos secundarios conxugados con colorantes fluorescentes a ~ 23-25 ° C: colorante anti-polo-488-nm (Jackson ImmunoResearch, 1: 1,000), colorante anti-coello-594-nm (Invitrogen, 1: 1,000 ), e colorante anti-rato-594-nm (Invitrogen, 1: 1000). Montáronse seccións con medios de montaxe de Vectashield que conteñan DAPI (Vector Labs) e lamer cuberto. As imaxes foron tomadas utilizando un microscopio de fluorescencia Olympus BX61 (obxectivo × 2) ou un microscopio confocal Olympus (obxectivos × 10 e × 100).

Procedemento de alimentación.

As ratas foron aloxadas individualmente en camas de papel (alfombras alfa; documentos de especialidade Shepherd) para evitar que os produtos alimenticios fosen ensuciados con materiais de cama solta. A dieta da cafetería consistía en touciño, salchicha, tarta de queixo, torta de libra, xeadas e chocolate, que foron pesadas individualmente antes de estar dispoñibles para as ratas. Os produtos alimenticios da dieta da cafetería entregáronse en pequenos recipientes de metal. Ao finalizar a sesión de alimentación pesáronse de novo todos os alimentos, incluído o laboratorio estándar. A inxestión calórica dos distintos macronutrientes calculouse utilizando a información nutricional proporcionada polo fabricante.

Supresión do comportamento da alimentación inducida polo cue.

Os procedementos de alimentación tiveron lugar en cámaras operantes atenuadas polo son idénticas en dimensións ás usadas nos experimentos BSR. As ratas foron colocadas nunha cámara operante e tiveron acceso á dieta da cafetería ou chow durante 30 minutos. Os produtos alimentarios entregáronse en pequenos recipientes metálicos. Pesáronse todos os alimentos antes e despois das sesións de alimentación, que se levaron a cabo durante o período normal de alimentación das ratas. O consumo de chow avaliouse polo consumo de gránulos de chow de 45 mg idénticos en composición ao chow proporcionado nas gaiolas domésticas das ratas. Despois permitíuselle ás ratas 30 minutos de acceso diario á dieta da cafetería ata que se conseguiu unha inxestión estable (definida como variación <10% na inxestión diaria), requirindo de 5 a 7 días. Despois da estabilización da inxestión de comida apetecible durante este período de referencia, as ratas en cada condición de acceso asignáronse a dous grupos: castigados (os que reciben choque no pé) e impunes (que non reciben choque no pé). As ratas foron sometidas a catro sesións de acondicionamento en días consecutivos na mesma cámara operante na que previamente tiveran acceso á comida agradable. Durante as sesións de acondicionamento de 30 minutos activouse unha luz de sinalización (estímulo condicionado) durante 10 min, apagouse durante 10 min e volveuse a acender durante 10 min. As ratas castigadas recibiron choque no pé só durante a presentación da luz (0.5 mA durante 1.0 s; 10 estimulacións con intervalos de ~ 1 min). As ratas impunes recibiron a luz semellante do mesmo xeito, pero sen a descarga de pé. O día da proba, ao día seguinte da última sesión de acondicionamento, as ratas dos grupos castigados recibiron un choque intermitente no pé (cinco estimulacións en total) emparellado coa activación da luz táctil durante 5 minutos. As ratas impunes volveron a estar expostas á luz de sinal en ausencia de choque nos pés. Despois do período de castigo de 5 minutos, a todas as ratas se lles permitiu o acceso á comida apetecible durante unha sesión de 30 minutos co estímulo acondicionado activado de xeito intermitente (10 minutos de luz acendida, 10 minutos de luz apagada, 10 minutos de luz acendida).

Análise estatística.

Os limiares de recompensa de referencia definíronse como o valor límite medio para o 5 d antes do acceso á dieta da cafetería para cada tema. Os limiares de recompensa expresáronse como o cambio porcentual do valor límite da liña de base. Os datos sobre a porcentaxe de valores límite de recompensa de base, a ganancia de peso, o consumo de calorías e o consumo de calorías da graxa analizáronse mediante análise de varianza de medidas repetidas de dous factores, con acceso (só chow, acceso restrinxido ou acceso estendido), fonte de calorías ( dieta chow ou cafetería estándar), virus (Lenti-control ou Lenti-D2Rsh) e sinal (emparellado ou non pareado con castigos) como factores entre os suxeitos e o tempo como factor dentro dos suxeitos. Cando proceda, analizáronse os principais efectos nas análises de varianza mediante as probas post hoc de Bonferroni. Todas as análises estatísticas realizáronse usando o software GraphPad Prism.

References

References

Correspondencia a:

· Paul J Kenny ([protexido por correo electrónico])