Diabetologia. 2017; 60 (8): 1502 – 1511.
Publicado en liña 2017 Maio 20. doi: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1Abstracto
Obxectivos / hipótese
O exceso de graxas na dieta provoca obesidade en seres humanos e roedores. Estudos recentes en humanos e roedores demostraron que a adicción ás graxas comparte un mecanismo común coa adicción ao alcol, a nicotina e aos estupefacientes en canto a unha disfunción dos sistemas de recompensa cerebral. Resaltouse que unha dieta rica en graxa (HFD) atenúa o receptor da dopamina D2 (D2R) que sinaliza no estriato, un regulador pivotal do sistema de recompensa do cerebro, o que resulta en sobredominación hedonica. Anteriormente informamos de que o compoñente bioactivo específico do arroz moreno γ-orizanol atenuou a preferencia por un HFD mediante control hipotalámico. Por iso exploramos a posibilidade de que o γ-oryzanol module o funcionamento do sistema de recompensa cerebral en ratos.
Methods
Os ratos C57BL / 6J machos alimentados cun HFD foron tratados oralmente con γ-oryzanol e avaliáronse os niveis estriais de moléculas implicadas na sinalización de D2R. Examinouse o impacto do γ-oryzanol na metilación do ADN do promotor D2R e os cambios posteriores nas preferencias para a graxa dietética. Ademais, investigáronse os efectos da 5-aza-2′-desoxicitidina, un potente inhibidor das ADN metiltransferases (DNMTs), na preferencia dos alimentos, a sinalización D2R e os niveis de DNMTs no estriatum. Os efectos inhibidores do γ-oryzanol sobre a actividade dos DNMTs foron evaluados enzimaticamente in vitro.
Resultados
No estriato de ratos alimentados cun HFD, a produción de D2Rs diminuíuse mediante un aumento na metilación de ADN da rexión promotora do D2R. A administración oral de γ-oryzanol diminuíu a expresión e a actividade dos DNMT, restablecendo así o nivel de D2R no estriato. A inhibición farmacolóxica dos DNMTs por 5-aza-2′-desoxicitidina tamén mellorou a preferencia pola graxa dietética. De acordo con estes descubrimentos, os ensaios enzimáticos in vitro demostraron que γ-oryzanol inhibiu a actividade dos DNMTs.
Conclusións / interpretación
Demostramos que o γ-orianol mellora a hipermetilación de ADN inducida por HFD da rexión promotora de D2R no estriato de ratos. O noso paradigma experimental pon de relevo o γ-orizanol como unha sustancia de antiobesidade prometedora coa distinta propiedade de ser un novo modulador epigenético.
Material complementario electrónico
A versión en liña deste artigo (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) contén material complementario revisado por pares pero non modificado, que está dispoñible para usuarios autorizados.
introdución
Alimentar excesivamente en individuos obesos comparte, polo menos parcialmente, mecanismos comúns con dependencia de alcol, nicotina e estupefacientes [1]. Así como a regulación hipotalámica e hormonal do apetito, o sistema de recompensa cerebral, en particular a sinalización do receptor da dopamina, está intimamente relacionado co comportamento de alimentación adictiva ou hedonica [2]. Un estudo previo en ratas demostrou que o derrocamento do receptor estriatal da dopamina D2 (D2R) por curto de pelo corto mediado por lentivirus interferindo o ARN que induciu rápidamente déficits de recompensa como adicción e a compulsión que buscan comida3]. Debido á redución da densidade de D2R, o estriado dorsal é menos sensible á recompensa dos alimentos en comparación cos grupos de control magro en humanos obesos e roedores [3-5]. De acordo con esta noción, o TaqEu son un alelo do ANKK1 O locus xénico (que codifica DRD2 / ankyrin repetir e quinase dominio que contén 1), que diminúe a produción de D2R estriat, está asociado a un fenotipo obeso en humanos [6], mentres que os efectos da perda de peso despois da cirurxía bariátrica están asociados a unha densidade elevada de D2R estriatal [7]. Estes datos suxiren encarecidamente a importancia do D2R estriatal como un novo obxectivo terapéutico para o tratamento da obesidade. Non obstante, algúns medicamentos que se desenvolveron que actuaron sobre o sistema de recompensa cerebral causaron considerables efectos adversos, incluídos problemas psiquiátricos graves, o que provocou a súa eventual retirada das clínicas [8].
As modificacións epixenéticas son críticas non só para o desenvolvemento e a diferenciación, senón tamén porque xorden como consecuencia de cambios ambientais, incluso na dieta e no estilo de vida [9]. A metilación do ADN é un acontecemento epixenético principal para a estabilidade da expresión xénica [9]. En ratas, a exposición materna a unha dieta rica en graxas (HFD) interxeracionalmente altera a metilación do ADN dentro do sistema de recompensa central na descendencia, o que provocou un consumo excesivo de DPH por parte das crías [10]. En particular, as ADN metiltransferases (DNMTs) xogan funcións críticas na regulación tanto do comportamento como da alimentación da actividade física [10, 11], suxerindo que os DNMTs poderían ser obxectivos terapéuticos prometedores para a terapia da síndrome de obesidade-diabetes. É importante que se coñeza que algunhas substancias naturais derivadas de alimentos, incluído o ácido cafeico e a epigalocatequina, actúan como inhibidores do DNMT [12, 13].
Recentemente demostramos que o compoñente bioactivo e específico do arroz moreno γ-orizanol, unha mestura de éster do ácido ferúlico e varios fitosteroles, atenúa a preferencia pola graxa dietética mediante unha diminución do estrés do retículo endoplasmático (ER) hipotalámico [14]. En ratos e coellos, o γ-orizanol administrado por vía oral foi absorbido rapidamente do intestino e distribuído principalmente ao cerebro [15, 16]. Unindo estes descubrimentos, produtos derivados de alimentos naturais que actúan no sistema nervioso central poden ser unha alternativa para mellorar con seguridade a conduta de alimentación deteriorada na obesidade. Neste contexto, probamos a hipótese de que o γ-oryzanol alteraría o estado de metilación do ADN no sistema de recompensa cerebral, dando como resultado unha atenuación da preferencia por un HFD en ratos.
Methods
animais
Os ratos machos C57BL / 6J de sete semanas de idade obtidos de Charles River Laboratories Japan (Kanagawa, Xapón) aloxáronse (3-4 por gaiola) en condicións de patóxenos específicos a 24 ° C baixo unha luz de 12 h / 12 h / ciclo escuro. Despois dunha semana de aclimatación, os ratos de 8 semanas coincidiron co peso e dividíronse en dous ou tres grupos para someterse a cada experimento. Aos ratos permitiulles o acceso gratuíto á comida e á auga. Todos os experimentos con animais foron aprobados polo Comité de Ética do Experimento Animal da Universidade de Ryukyus (números 5352, 5718 e 5943).
Administración de γ-oryzanol e 5-aza-2′-desoxicitidina
Para avaliar a preferencia polo HFD, γ-oryzanol (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Xapón) administrouse a ratos 8 de semana xavage durante o test de elección de alimentos como se describiu anteriormente [14, 17]. Para os outros experimentos, fabricouse como gránulos un HFD (D12079B; Dietas de Investigación, New Brunswick, NJ, EUA) que contén 0.4% γ-oryzanol. Os compoñentes da dieta móstranse no material complementario electrónico (MES) 1. Despois de 12 semanas de alimentación, recolleuse tecido do estriado e do hipotálamo. A inxestión diaria de γ-orzanol, estimada a partir da inxestión media de alimentos dos ratos, foi de aproximadamente 320 μg / g de peso corporal. As doses de γ-orzanol determináronse como se describiu anteriormente [14]. A 5-aza-2'-desoxicicidina (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) inxectouse intraperitonealmente (0.25 μg / g de peso corporal) tres veces á semana durante 12 semanas [18].
Estimación da preferencia pola graxa dietética
Para avaliar as preferencias de graxa dietética, as probas alimentarias proporcionaron unha elección entre chow e HFD (D12450B e D12451; Dietas de investigación), como se describiu anteriormente [14]. Os compoñentes da dieta móstranse na táboa ESM 1. Resumidamente, aos ratos permitiulles o acceso gratuíto a Chow e HFD. As inxestións de chow e HFD medíronse semanalmente e analizáronse os cambios na preferencia pola graxa da dieta. A preferencia HFD calculouse segundo a fórmula: Preferencia HFD = [(inxestión HFD / inxestión total de alimentos) × 100].
Secuenciación de bisulfitos para metilación do ADN
O ADN purificouse usando un DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Tokio, Xapón). A solución de ADN mesturouse con NaOH de 3 mol / l recentemente preparado, incubouse a 37 ° C durante 15 min e engadiuse a 5.3 mol / l de urea, 1.7 mol / l de bisulfito de sodio e 4.9 mmol / l de hidroquinona. A solución foi sometida a 15 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 30 segundos e incubación a 50 ° C durante 15 minutos [19]. O ADN tratado con bisulfito foi purificado mediante MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) e amplificado por PCR usando un KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix PCR Kit (KAPA Biosystems, Woburn, MA, USA) e cebadores ao redor do sitio CpG da rexión promotora de D2R . As secuencias de imprimación foron as seguintes: imprimación adiante, 5′-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3 '; cebador inverso, 5′-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3 ′. A continuación engadíronse e limpáronse as secuencias do adaptador mediante Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, EUA). A continuación, agrupáronse mostras e cargáronse nun GS Junior (Roche Diagnostics, Tokio, Xapón) para a súa secuenciación segundo o protocolo do fabricante. O nivel de metilación expresouse como a porcentaxe de citosinas metiladas en todos os residuos de citosinas.
Ensaio de actividade DNMT
O ensaio de actividade enzimática DNMT foi realizado utilizando un kit de análise de actividade / inhibición EpiQuik ADN metiltransferase (Grupo Epigentek, Brooklyn, NY, EUA) e o kit de ensayo de metiltransferase EPIgeneous (Cisbio Japan, Chiba, Xapón) segundo os protocolos do fabricante.
Para avaliar a actividade inhibidora de cada composto na metilación do ADN, formouse S-adenosil-l-homocisteína (SAH) mediuse en presenza de cada composto (20 μmol / l para ensaios de selección), S-adenosil metionina (SAM; 10 μmol / l) e substrato DNMT (4 ng / μl) a 37 ° C durante 90 min. Para avaliar a cinética de Michaelis-Menten, incubouse DNMT1 (20 μmol / l) con γ-orzanol, SAM (5 μmol / l) e a concentración indicada de poli dI-dC a 37 ° C durante 90 min. DNMT3a (100 μmol / l) e DNMT3b (100 μmol / l) incubáronse con γ-orzanol, SAM (5 μmol / l) e a concentración indicada de poli dG · dC a 37 ° C durante 120 min. Os ensaios realizáronse por cuadruplicado. A proteína extraída (0.75 mg / ml) incubouse con SAM (5 μmol / l), poli dI-dC (5 μg / ml) e poli dG · dC (5 μg / ml) a 40 ° C durante 120 minutos e Mediuse a formación de SAH.
Ensaio de actividade do receptor γ relacionado con estróxenos
A actividade antagónica potencial de γ-orzanol no receptor γ-relacionado cos estróxenos (ERRγ) foi avaliada usando o sistema de ensaio Gamma Reporter-Receptor relacionado cos estróxenos humanos (INDIGO Bioscience, State College, PA, EUA) segundo o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células informadoras de mamíferos non humanos que expresan constitutivamente ERRγ activo foron expostas ás concentracións indicadas de cada composto durante 24 h por triplicado.
Western blotting
Isto foi realizado como se describiu anteriormente [20] con anticorpos contra D2R (1: 500, coello), transportador de dopamina (DAT; 1: 500, coello), tirosina hidroxilase (TH; 1: 1000, coello) (AB5084P, AB1591P e AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, EUA), transdutor de sinal e activador de transcrición 3α (STAT3α; 1: 1000, coello), DNMT1 (1: 1000, coello), DNMT3a (1: 1000, coello) (números 8768, 5032 e 3598; Tecnoloxía de sinalización celular, Tokio, Xapón), DNMT3b (1 μg / ml, coello), ERRγ (1: 1000, coello) e β-actina (1: 10,000, rato) (ab16049, ab128930 e ab6276; Abcam, Cambridge, MA, EUA).
PCR cuantitativa en tempo real
A expresión xénica examinouse como se describiu anteriormente [14]. normalizáronse os niveis de ARNm Rn18s (ARNr 18S). Os conxuntos de imprimación empregados para as análises de PCR en tempo real cuantitativos resúmense na táboa ESM 2.
Análise estatística
Os datos exprésanse como media ± SEM. Empregáronse ANOVA unidireccional e ANOVA de medidas repetidas seguidas de probas de comparación múltiple (método Bonferroni – Dunn) cando fose aplicable. Estudantil t test usouse para analizar diferenzas entre dous grupos. As diferenzas consideráronse significativas en p <0.05.
Resultados
A inhibición farmacolóxica dos DNMTs por 5-aza-dC atenuou a preferencia pola graxa dietética en ratos
Nos ratos alimentados con HFD, a metilación do ADN na rexión promotora de D2R no estriado aumentou significativamente en comparación cos ratos que alimentaron unha dieta chow (Fig. (Fig.1a) .1a). Por outra banda, a metilación de ADN hipotalámico na rexión promotora de D2R foi aparentemente maior que a no estriado baixo dieta chow (p <0.01) (Fig. (Fig.1a, 1a, f) e non foi alterada polo HFD (Fig. (Fig.1f) .1f). Nos ratos alimentados con HFD, a metilación do ADN aumentado na rexión promotora de D2R no estriado normalizouse mediante o tratamento con 5-aza-dC, un potente inhibidor do DNMT (Fig. (Fig.1a) .1a). En contraste, a metilación do ADN na rexión promotora de D2R no hipotálamo non se cambiou significativamente polo tratamento con 5-aza-dC (Fig. (Fig.1f) .1f). No estriato de ratos machos de 20 semanas de idade alimentados con HFD durante 12 semanas, os niveis de ARNm e proteínas de D2R diminuíron significativamente (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l). En contraste, os niveis de receptores D1 da dopamina (D1Rs, codificados por Drd1), que actúan de xeito oposto ás D2Rs na adenililciclase e a sinalización intracelular mediada por cAMP, non se modificaron (Fig. (Fig.1c) .1c). Ademais, non houbo ningún cambio nos niveis doutras moléculas relacionadas coa sinalización D2R, como TH e DAT a nivel de ARNm e / ou proteína (Fig. (Fig.1d, 1d, e, k, m). Doutra banda, non se observaron cambios aparentes no hipotálamo, incluído para D2R (Fig. (Fig.1g – m) .1g – m). En particular, os niveis proteicos de D2R e TH no hipotálamo foron moito inferiores aos do estriato (Fig. (Fig.1l, 1l, m), posiblemente reflicta a importancia relativa da sinalización do receptor da dopamina no sistema de recompensa cerebral en comparación co hipotálamo.
Para examinar se a metilación do ADN na rexión promotora de D2R alteraría a preferencia pola graxa na dieta, analizouse o comportamento de alimentación de ratos tratados con 5-aza-dC. Como era de esperar, 5-aza-dC aumentou significativamente os niveis de ARNm e proteínas para D2R no estriado de ratos alimentados con HFD (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l). Por outra banda, non houbo efectos sobre os niveis de Drd1, Th Slc6a3 (codificación de DAT) no estriado ou en niveis de Drd2, Drd1, Th Slc6a3 no hipotálamo (Fig. (Fig.1c – e, 1c – e, g – m). Mentres que os ratos tratados con vehículos preferían o HFD, a preferencia polos HFD reduciuse significativamente nos ratones tratados con 5-aza-dC (88% dos valores para os ratos tratados con vehículos) (Fig. (Fig.1n) .1n) Consecuentemente, o tratamento con 5-aza-dC reduciu a ganancia de peso corporal (Fig. (Fig.11o).
O γ-oryzanol diminúe os niveis de DNMT no estriado de ratos alimentados por HFD
Como informamos anteriormente [14], a administración oral de γ-oryzanol a ratos masculinos por gavage atenuou significativamente a preferencia por un HFD (93% dos valores para ratos tratados con vehículo) (Fig. (Fig.2a), 2a), obtendo unha aparente atenuación do aumento de peso corporal (Fig. (Fig.2b) .2b). Por conseguinte, exploramos o impacto potencial de γ-oryzanol na modulación epixenética de D2Rs no estriato.
Nos mamíferos, hai tres grandes DNMT: DNMT1, 3a e 3b. As funcións DNMT1 para manter a metilación do ADN, mentres que DNMT3a e 3b xogan un papel na facilitación da metilación do ADN novo [21]. Para explorar o impacto potencial do γ-oryzanol en DNMTs in vivo, evaluamos os niveis de DNMTs no cerebro de ratos alimentados por HFD. Aínda que o HFD per se non tivo ningún efecto sobre o ARNm e os niveis de proteínas de DNMTs nin no estriatum coma no hipotálamo, a suplementación con γ-oryzanol diminuíu significativamente os niveis de DNMT no estriato pero non no hipotálamo (Fig. (Fig.2c – e, 2c – e, g – i, k – n). Estes datos levan a posibilidade de que o γ-oryzanol poida regular os niveis de DNMTs dun xeito específico de estriatum. De xeito similar, 5-aza-dC diminuíu significativamente os niveis de ARNm de DNMT3a e 3b preferentemente no estriato (ESM Fig. 1anuncio).
Na base dun estudo anterior demostrando que o nivel de ARNm de DNMT1 foi regulado positivamente, polo menos parcialmente, polo receptor nuclear ERRγ [22], examinamos o efecto potencial do γ-oryzanol na actividade ERRγ. En células de mamíferos non humanos que constitúen expresamente ERRγ activo, 4-hidroxil tamoxifeno, un potente agonista inverso de ERRγ, diminuíu notablemente a actividade ERRγ. Destacar, o γ-oryzanol diminuíu parcialmente a actividade ERRγ (unha redución aproximadamente do 40% do valor innato) (Fig. (Fig.3a) .3a). É importante destacar que ERRγ foi altamente expresado no estriato pero non no hipotálamo (Fig. (Fig.3b – d) .3b – d). En contra da situación para o estriato, o γ-oryzanol aumentou significativamente os niveis proteicos de DNMT1 só no hipotálamo (Fig. (Fig.2k, 2k, l). Estes resultados poderían explicarse, polo menos parcialmente, polo descubrimento de STAT3α, un regulador positivo do nivel DNMT1 [23], expresouse abundante no hipotálamo pero non no estriato (Fig. (Fig.33e –g).
Para avaliar aínda máis o impacto do γ-oryzanol na actividade dos DNMTs in vivo, avaliouse a formación de SAH, un produto secundario da metilación do ADN e tamén un potente inhibidor dos DNMTs, en ratones tratados con γ-oryzanol alimentados con HFD. Non houbo cambios significativos na formación de SAH nin no estriato nin no hipotálamo entre os ratos alimentados por HFD e os chow-fed (Fig. (Fig.2f, 2f, j). Notablemente, o γ-oryzanol diminuíu significativamente a formación de SAH no estriato (Fig. (Fig.2f) 2f) pero non no hipotálamo (Fig. (Fig.2j), 2j), suxerindo que o γ-oryzanol pode suprimir a actividade dos DNMT de forma específica no estriato en ratones alimentados con HFD.
Análises enzimáticas sobre propiedades inhibitorias do γ-oryzanol para DNMTs in vitro
A continuación, evaluamos o impacto do γ-oryzanol na actividade dos DNMT in vitro. Valoráronse as potencias inhibidoras de γ-oryzanol, ácido ferulico, 5-aza-dC, haloperidol (un antagonista representativo de D2R), quinpirol (un agonista representativo de D2R) e SAH contra DNMTs. Como control positivo, SAH atenuou fortemente as actividades dos DNMT de forma dependente da dose (Fig. (Fig.4a – f) .4a – f). Como era de esperar, haloperidol e quinpirol non mostraron ningún efecto nas actividades dos DNMTs (ESM Fig. 2). Notablemente, γ-oryzanol inhibiu significativamente as actividades de DNMT1 (IC50 = 3.2 μmol / l), 3a (IC50 = 22.3 μmol / l) e 3b (inhibición máxima 57%) (Fig. (Fig.4d – f) .4d – f). En contraste, a actividade inhibidora do ácido ferulico, un metabolito de γ-orizanol, foi moito menor que a de γ-oryzanol (Fig. (Fig.44d – f).
Investigamos máis as propiedades inhibitorias do γ-oryzanol en DNMTs. Medíase a formación de SAH para avaliar a actividade inhibidora do γ-oryzanol en DNMTs in vitro. Os datos sobre a formación de SAH durante a metilación do ADN mediado por DNMT indican un patrón saturable da cinética de Michaelis-Menten tanto para a presenza como por ausencia de γ-oryzanol (Fig. (Fig.4g – i) .4g – i). Na metilación do ADN mediado por DNMT1, a análise de Eadie-Hofstee demostrou que o γ-oryzanol non mostrou efectos V max de formación de SAH (vehículo, 597 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 619 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 608 pmol / min), mentres que γ-oryzanol aparentemente aumentou o K m (vehículo, 0.47 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.67 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.89 μg / ml) (Fig. (Fig.4j) .4j). Estes resultados suxiren que o γ-oryzanol inhibe DNMT1 polo menos parcialmente de forma competitiva. Por outra banda, para a metilación do ADN mediada por DNMT3a e 3b, o γ-orianol diminuíu o V max de formación de SAH (DNMT3a: vehículo, 85.3 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 63.1 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 42.5 pmol / min; DNMT3b: vehículo, 42.3 pmol / min; γ -orzanol 2 μmol / l; 28.0 pmol / min, γ-oryzanol 20 μmol / l, 15.0 pmol / min) e, do mesmo xeito, o K m para esta reacción (DNMT3a: vehículo, 0.0086 μg / ml; γ-orzanol 2 μmol / l, 0.0080 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0058 μg / ml; DNMT3b: vehículo, 0.0122 μg / ml; γ- orzanol 2 μmol / l, 0.0097 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0060 μg / ml) (Fig. (Fig.4k, 4k, l). Estes resultados suxiren que o γ-orianol inhibe DNMT3a e 3b polo menos parcialmente de xeito non competitivo.
O γ-oryzanol aumenta os niveis de D2R no estriado de ratos alimentados con HFD
Seguidamente probamos a posibilidade de que γ-oryzanol aumentase o contido de D2R estriado mediante unha inhibición de DNMTs. En ratos alimentados por HFD, a administración oral de γ-orizanol diminuíu significativamente a metilación de ADN estriatal na rexión promotora dos D2Rs (Fig. (Fig.5a), 5a), mentres que non fixo isto no hipotálamo (Fig. (Fig.5f) .5f). De acordo con estes descubrimentos, os niveis de ARNm e proteínas de D2R aumentáronse recíprocamente (Fig. (Fig.5b, 5b, g, k, l). Semellante aos datos sobre tratamento con 5-aza-dC (Fig. (Fig.1), 1), non houbo efectos aparentes sobre o ARN e os niveis de proteínas Drd1, Th Slc6a3 (DAT) no estriado e non ten efectos sobre os niveis de Drd1, Th Slc6a3 no hipotálamo (Fig. (Fig.5c – e, 5c – e, h – k, m).
Estudos anteriores demostraron que os niveis de D2R e DNMT1 están regulados pola tensión e inflamación ER polo menos parcialmente por NF-κB [17, 24, 25]. Por iso examinamos os niveis de xenes relacionados coa tensión e a inflamación. Como se demostrou anteriormente [26], o HFD aumentou a expresión dos xenes que codifican TNF-α (Tnfa), proteína quimioatractante monocito-1 (MCP-1) (Ccl2), Proteína homóloga C / EBP (Cortar), DnaJ 4 localizado con ER (ERdj4) (Dnajb9) ea forma empalmada da proteína 1 de unión de caixas X (Xbp1s) no hipotálamo pero non no estriato (Fig. (Fig.6) .6). En particular, a suplementación do HFD con γ-oryzanol diminuíu significativamente a expresión aumentada de Ccl2, Cortar, Dnajb9 Xbp1s exclusivamente no hipotálamo pero non no estriato (Fig. (Fig.66).
Conversa
O principal achado no presente estudo é que γ-oryzanol actúa como un potente inhibidor da DNMT no estriato de ratos, atenuando así, polo menos parcialmente, a preferencia por un HFD a través da modulación epixenética do D2R estriatal. No estriato de ratos alimentados con HFD, os niveis de D2R diminuíron significativamente, mentres que os de D1R, TH e DAT non se cambiaron (Fig. (Fig.1b – e, 1b – e, k – m). Estes datos son coherentes coa idea de que a desregulación do D2R estriat desempeña un papel crítico na percepción da recompensa dos alimentos cando se atopa con HFD, dando lugar a un consumo excesivo de HFD en animais obesos [3]. No presente estudo, o tratamento de ratos alimentados con HFD con 5-aza-dC aumentou significativamente os niveis de D2R estriatal (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l) posiblemente mediante unha redución do nivel de metilación do ADN na rexión promotora de D2R (Fig. (Fig.1a), 1a), e consecuentemente atenuou a preferencia pola graxa dietética (Fig. (Fig.1n) .1n) Este achado tamén apoia un papel crítico dos D2R estriais na percepción da recompensa dos alimentos cando se atopan con un HFD.
O noso ensaio in vitro demostrou que a actividade inhibidora do γ-oryzanol contra DNMTs foi aparentemente máis forte que a do seu metabolito ácido ferúlico (Fig. (Fig.4d – f), 4d – f), suxerindo a importancia da estrutura completa de γ-oryzanol para a súa acción inhibidora sobre DNMTs. Nos ratos alimentados por HFD, os nosos estudos suxiren que, despois da administración oral, o γ-oryzanol chega ao cerebro como unha estrutura completa e diminúe os niveis e as actividades dos DNMT preferentemente no estriato, cunha consecuente diminución da metilación do ADN na rexión promotora de D2R no estriado. Ademais, os nosos estudos in vitro demostraron que γ-oryzanol actúa como antagonista parcial contra ERRγ, que serve principalmente como regulador positivo para a produción de DNMT1 [22], e consecuentemente diminuíu a actividade de DNMT1 (Fig. (Fig.3a) .3a). Cabe destacar que ERRγ foi altamente expresado no estriato pero non no hipotálamo en ratos (Fig. (Fig.3b) .3b). Estes datos suxiren que o γ-oryzanol ten o potencial de diminuír o nivel de ARNm de DNMT1, polo menos en parte, a través da inhibición de ERRγ. En contraste co estriato, o γ-orianol non mostrou ningún efecto sobre o nivel de D2R en hipotálamo de ratos alimentados con HFD (Fig. (Fig.5g, 5g, k, l).
Por outra banda, demostramos que o γ-orianol aumentou significativamente os niveis de DNMT1 no hipotálamo pero non no estriato (Fig. (Fig.2k, 2k, l). Demostrouse que STAT3 aumenta o contido de DNMT1 en células de linfoma T malignas [23]. En particular, demostramos anteriormente que γ-oryzanol aumentou significativamente a fosforilación STAT3 inducida por leptina en hipotálamo de ratos alimentados con HFD [14]. Tamén hai que sinalar que STAT3α expresouse substancialmente no hipotálamo pero non no estriato nos ratos (Fig. (Fig.3e – g) .3e –g). Estes datos téñennos a especular que a aparente diferenza de efecto do γ-oryzanol nos niveis de DNMT1 entre o hipotálamo e o estriato pode atribuirse, polo menos parcialmente, ao contido específico da rexión de STAT3α e ERRγ no cerebro de ratos ( Fig. (Fig.3b – g) .3b –g). Colectivamente, parece haber un patrón de expresión recíproca de ERRγ e STAT3α entre o estriato e o hipotálamo en ratos. Na base dos nosos resultados, polo tanto, é razoable especular que no estriato, onde a produción de ERRγ é abundante, o γ-oryzanol pode diminuír preferentemente o nivel de ARNm e a actividade enzimática de DNMT1 como regulador negativo de ERRγ. En contraste, no hipotálamo, onde a produción de STAT3α é dominante, γ-oryzanol pode aumentar preferentemente os niveis de DNMT1.
Un estudo recente demostrou que unha atenuación da sinalización D2R estriada inducida por un HFD desregula o comportamento da alimentación [3], suxerindo a potencial importancia da inhibición de DNMTs estriais para o tratamento da obesidade. Por outra banda, un estudo anterior demostrou a posibilidade de que o estado da metilación do ADN do xen 4 do receptor da melanocortina expresado en núcleos hipotalámicos específicos poida modular formas transxeracionais de obesidade en ratos amarelos viables agouti [27]. Aínda que outros estudos están garantidos para dilucidar os mecanismos subxacentes, estes estudos suxiren a importancia da metilación do ADN específica de tecidos, xénicos e secuencias na fisiopatoloxía da obesidade inducida por HFD.
Recentemente informamos de que o HFD aumentou o nivel de D2R nos illotes pancreáticos de ratos [17, 24]. É probable que tal aumento estea mediado, polo menos parcialmente, por estrés e inflamación ER vía NF-κB, porque hai varios elementos que responden a NF-κB na rexión promotora de D2R [17, 24]. Ademais, un estudo recente demostrou que TNF-α e IL-1β aumentan o nivel e actividade de DNMT1 no tecido adiposo de ratos alimentados con HFD [25]. É importante destacar que o presente estudo demostrou que o HFD indujo o estrés e a inflamación ER preferentemente no hipotálamo pero non no estriato (Fig. (Fig.6) .6). Mecanismos profundos de metilación e desmetilación de ADN específicos de tecidos, rexións e xacementos no noso paradigma experimental deben esperar máis investigacións.
Xunto co noso informe anterior que demostra que o γ-oryzanol atenúa a preferencia por un HFD a través da regulación hipotalámica do estrés ER nos ratos [14], γ-oryzanol tamén representa unha propiedade única de mellorar a desregulación tanto hedonica como metabólica do comportamento da alimentación. Debido a que algúns fármacos anti-antiobesidade que se desenvolveron son coñecidos como causantes de efectos adversos críticos [8], prevese un enfoque natural baseado en alimentos cara ao sistema de recompensa cerebral para tratar a síndrome da obesidade-diabetes con seguridade [16]. Neste paradigma, γ-oryzanol é un prometedor candidato a antiobesidade cunha propiedade distinta de ser un modulador epigenético.
Grazas
Agradecemos a S. Okamoto (Universidade do Ryukyus, Xapón) que revisase o manuscrito. Agradecemos a M. Hirata, H. Kaneshiro, I. Asato e C. Noguchi (Universidade do Ryukyus, Xapón) por asistencia secretaria.
Abreviaturas
| 5-aza-dC | 5-aza-2′-desoxicitidina |
| D1R | Receptor da dopamina D1 |
| D2R | Receptor da dopamina D2 |
| DAT | Transportador de dopamina |
| DNMT | ADN metiltransferase |
| ER | Retículo endoplasmático |
| ERR | Receptor relacionado con estróxenos |
| HFD | Dieta rica en graxa |
| SAH | S-Adenosil-l-homocisteína |
| SAM | S-Adenosil metionina |
| STAT3α | Transdutor do sinal e activador da transcrición 3α |
| TH | Tiroxina hidroxilase |
Notas
Dispoñibilidade de datos
As datas de datos xeradas e / ou analizadas durante o estudo actual están dispoñibles do autor correspondente sobre solicitudes razoables.
Financiamento
Este traballo foi apoiado en parte por Grants-in-Aid da Japan Society for the Promotion of Science (JSPS; KAKENHI Grant Numbers 15K19520 e 24591338), o Consello para a Ciencia, a Tecnoloxía e a Innovación (CSTI), o programa ministerial de promoción da innovación estratéxica estratéxica. (SIP) "Tecnoloxías para a creación de agricultura, silvicultura e pesca de última xeración", a Fundación Lotte, a Fundación Xapón para a Enzimoloxía Aplicada, a Organización para o Desenvolvemento de Novas Enerxías e Tecnoloxías Industriais (NEDO), o proxecto para a formación da rede de ciencias da vida (campo farmacéutico ) (Prefectura de Okinawa, Xapón) e o Proxecto de Promoción da Agrupación Médica da Prefectura de Okinawa, Xapón, xunto cunha subvención da Prefectura de Okinawa para o fomento da medicina avanzada (Prefectura de Okinawa, Xapón).
Dualidade de interese
Os autores declaran que non existe asociado a este manuscrito unha dualidade de interese.
Declaración de contribución
CK e HM deseñaron a investigación. CK e TK realizaron os experimentos e analizaron os datos. TK, CS-O, CT, MT, MM e KA contribuíron á interpretación de datos. CK e HM escribiron o manuscrito. Todos os autores contribuíron á interpretación de datos. Todos os autores uníronse para revisar o manuscrito e aprobaron a súa versión final. HM é o garante deste traballo, tivo acceso completo a todos os datos e asume a total responsabilidade da integridade dos datos e da precisión da análise de datos.
Notas ao pé
Material complementario electrónico
A versión en liña deste artigo (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) contén material complementario revisado por pares pero non modificado, que está dispoñible para usuarios autorizados.
References
;