A dieta moderada de graxa elevada aumenta a autoanálise de sacarosa en mozos ratos (2013)

Dianne P. Figlewicz,^1,2 Jennifer L. Jay,² Molly A. Acheson, Irwin J. Magrisso,⁴ Constance H. West,¹ Aryana Zavosh,² Stephen C. Benoit,³ Jon F. Davis³

Xa informamos anteriormente de que unha dieta moderadamente alta en graxas aumenta a motivación da sacarosa nas ratas adultas. Neste estudo, comprobamos os efectos motivacionais, neurocúmicos e metabólicos da dieta rica en graxas en ratas masculinas que transicionan pola puberdade durante 5-8 semanas de idade. Observamos que a dieta rica en graxa aumentou motivada a responder a sacarosa, o que era independente de cambios metabólicos ou cambios nos metabolitos de neurotransmisores de catecolamina no núcleo accumbens. Non obstante, os niveis de ARNm de AGRP no hipotálamo foron significativamente elevados. Demostramos que o aumento da activación das neuronas AGRP está asociado a un comportamento motivado e que a administración AGRP exóxena (terceira cerebroventricular) deu lugar a unha motivación significativa da sacarosa. Estas observacións suxiren que un aumento da expresión e da actividade de AGRP no hipotálamo medial pode subxace a maior resposta por sacarosa causada pola intervención na dieta rica en graxas. Finalmente, comparamos a motivación para sacarosa en ratas pubertales fronte a adultos e observamos unha maior motivación para sacarosa nas ratas pubertais, o que é consistente en informes anteriores de que os animais e os humanos novos teñen unha maior preferencia polo sabor doce, en comparación cos adultos. Xuntos, os nosos estudos suxiren que a dieta de fondo desempeña un forte papel modulador na motivación do sabor doce en animais adolescentes.

Temas

Os suxeitos eran ratas masculinas Albino de Simonsen (Gilroy, CA). Os ratos mantivéronse con chow (Laboratorio de roedores 5001, LabDiet) ou dieta moderada e alta en graxas (31.8%; Research Diets Inc) ad libitum. As dietas concordan co contido en hidratos de carbono (58% kcal vs. 51% kcal para baixo contido de graxa e graxa, respectivamente). O chow baixo en graxa ten 6.23 gm% de azucres libres e a dieta rica en graxa ten 29 gm% sacarosa. Mantéñense nun ciclo 12: 12 h claro-escuro con luces acendidas en 6 AM. A non ser que se indique o contrario, as ratas foron traídas ás 3 semanas de idade, inmediatamente despois do destete, e aloxáronse para aclimatación ata as 5 semanas de idade. A esta idade comezaron os adestramentos e / ou a proba de adestramento e comportamento. Os protocolos específicos descríbense en detalle a continuación e resúmense en Táboa 1. Porque as ratas machos pasan pola puberdade na 6^th-7^th semana de idade, o momento dos estudos foi deseñado para estudar ratas xa que atravesan esta etapa de desenvolvemento. Todos os procedementos realizados nas ratas seguiron as directrices de NIH para o coidado dos animais e foron aprobados polo Subcomité de coidados e uso de animais do Comité de Investigación e Desenvolvemento do Sistema de Saúde Sonora de Pug Pug.

  

Táboa 1

Protocolos experimentais

Autoadministración de sacarosa

Protocolo xeral. Os procedementos baseáronse na nosa metodoloxía publicada (Figlewicz et al., 2008; Figlewicz et al., 2006). Todos os procedementos de adestramento e probas realizáronse entre 0700 e 1200 hr. O experimento incluíu fases 2-3: autoshaping e adestramento de relación fixa (FR); cirurxía e recuperación en cohortes especificadas (ver Táboa 1); e adestramento de relacións progresivas (PR) utilizando os algoritmos de PR de Richardson e Roberts (Richardson e Roberts, 1996). O algoritmo de PR require 1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 28, 36, 48, 63, 83, 110, 145, 191, 251, 331, 437, 575, 759, 999 etc) a palanca presiona para ter éxito as entregas de recompensas dentro dunha sesión e é unha proba rigorosa de motivación e recompensa (999). Adestráronse as ratas para que auto-administrase 27% sacarosa (recompensa de 5 ml) entregada nun receptáculo de gota de líquido. As caixas operantes controladas por un sistema Med Associates (Xeorxia, VT) tiñan dúas palancas, pero só unha palanca (unha palanca activa e retráctil) activou a bomba de infusión. Tamén se rexistraron prensas na outra palanca (unha panca inactiva e estacionaria). A solución de sacarosa foi entregada nun recipiente de gota de líquido para consumo oral (Med Associates). O adestramento inicial realizouse durante sesións de unha hora durante días 0.5 baixo un programa de reforzo continuo (FR10: reforzouse cada prensa de palanca), co máximo posible de recompensas de sacarosa 1 entregadas por sesión. Cada sesión comezou coa inserción da panca activa e a iluminación dunha luz branca que quedou encendida durante toda a sesión. Un ton 50-s (5 Hz, 2900 dB por riba do fondo) + luz (luz branca 20 W por riba da panca activa), un compost discreto que acompañou cada entrega de recompensa, seguido dun tempo de espera 7.5-seg despois de cada entrega de sacarosa. O adestramento en PR realizouse durante un máximo de 20 h / día posible durante dez días. As sesións diarias remataron despois de que 3 min de ningunha resposta de palanca activa respondese, momento no que se apagou a luz da casa e a palanca activa retirouse.

Efecto da AGRP na autoadministración de sacarosa

Como os nosos resultados mostraron un aumento da expresión ARNm de AGRP en ratas pubertales alimentadas na dieta rica en graxa, queriamos confirmar que a AGRP podería aumentar a autoadministración de sacarosa. As ratas alimentadas por chow con idade vella de 5-wk foron tomadas a través do adestramento FR e logo recibiron cánulas no terceiro ventrículo cerebral (ICV). Despois dunha semana de recuperación, confirmación da colocación cun test de resposta á bebida á angiotensina II (ver Figlewicz et al., [2006]) e nunha sesión de re-adestramento de FR, comezaron as ratas no paradigma de autoadministración de PR. Despois do día PR 1, as ratas foron asignadas a un de dous grupos, o que significa que o rendemento PR Day 1 non difería entre os dous grupos (vehículo CSF ​​artificial, aCSF; ou AGRP, 2 μl de 0.01 nmol). Recibiron inxeccións de aCSF (n = 8) ou AGRP (n = 7) os días PR 2, 5 e 8. A inxestión total diaria de alimentos cuantificouse durante o tempo de formación en PR.

Efecto da idade na autoadministración de sacarosa

Comparamos o comportamento de autoadministración entre as ratas pubertes e adultos novos, o chow alimentado ou a dieta de graxas 31.8%. As ratas tiveron dúas semanas de aclimatación ao vivarium VAPSHCS (3-5wk ou 8-10 wk). Despois recibiron a dieta durante todo o período de proba / adestramento (4 sem.). Así, como no experimento inicial, estudáronse ratas pubertales a 5-8 semanas de idade. Os adultos novos estudáronse en 10-13 semana de idade.

Determinación da composición corporal

A composición do corpo foi medida mediante espectroscopia de resonancia magnética cuantitativa (QMR [Nixon et al., 2010]) determinar o contido de auga corporal de ratas individuais, a partir do cal se calcula a graxa corporal relativa. Os animais colocáronse en soportes cilíndricos sen anestesiado, e logo os titulares introdúcense na máquina QMR para unha pescuda de minutos 2, que realiza medicións por triplicado. Os datos gárdanse nun ordenador integrado (EchoMRI, Echo Medical Systems, Houston, TX) para o cálculo inmediato de auga, graxa e masa magra do corpo enteiro.

Probas por tolerancia á glucosa por vía intravenosa (IVGTT)

Os IVGTT conscientes leváronse a cabo en ratas con cánulas IV implantadas de forma crónica, que foron axexadas durante a noite antes do estudo utilizando metodoloxía baseada en Frangioudakis, Gyte, Loxham e Poucher (2008). As cánulas intravenosas bilaterais foron implantadas dúas semanas antes do estudo, segundo a nosa metodoloxía establecida (Figlewicz et al., 2009). As mostras de base foron extraídas en t-10 min (0.5 ml para a determinación de insulina e glicosa, en todos os momentos) e t0 min. As ratas recibiron unha infusión de 1 gm glucosa / 2ml / kg durante 15-20 segundos seguidas de 0.5 ml de solución salina. Tomáronse mostras de sangue en 5, 15, 30, 60, 90 e 120 min. Debido a conectar un catéter durante o procedemento (polo tanto, a incapacidade de obter mostras de sangue), os n finais dos datos básicos / datos IVGTT presentados son 7-8 para ratas alimentadas con chow e 8 para ratas alimentadas con 31.8% de graxa (Táboa 3). A insulina plasmática determinouse usando kits RIA de insulina de rata Linco (# RI-13K e SRI-13K, Linco) e a glicosa plasmática determinouse nun analizador de glucosa YSI). A área baixo a curva (AUC) para a resposta desde a liña de base calculouse en 5 min e 120 min. O índice HOMA calculouse como xaxún (glicosa [mM] × insulinm [U / L]) / 22.5 e calculouse usando mostras de xaxún terminal medidas para insulina e glicosa.

  

Táboa 3

Parámetros metabólicos¹

Parámetros metabólicos do xaxún

As ratas do Experimento 1 xalomaron durante a noite antes da eutanasia, poucos días despois da conclusión do IVGTT. As ratas foron profundamente anestesiadas por inhalación de isoflurano e exsanguinadas. Os cerebros foron eliminados e conxelados rapidamente en nitróxeno líquido para a medición de ARNm de péptido hipotálamo e catecolaminas do núcleo accumbens. Utilizáronse plasma ou soro terminal para a medición de insulina en xaxún, glicosa, leptina e triglicéridos. Para triglicéridos, utilizouse o Kit GPO Triglyceride Point # T7531-400 (Fisher # 23-666-418) e os estándares KIT # 7531-STD (Fisher # 23-666-422) e probouse 3 μl de soro. A leptina plasmática foi medida con Millipore Linco RIA Kit # RL 83K.

Métodos HPLC de catecolamina [Davis et al., 2008]

Os ratos foron eutanasiados con anestesia isoflurano, e os cerebros foron eliminados rapidamente, conxelados e almacenados a -80 ° C. Illáronse de cada animal micro-golpes bilaterais do núcleo accumbens (NAcc). Aínda que se coidou substancialmente para minimizar a contaminación por rexións cerebrais veciñas, debido á natureza e tamaño de cada micro-perforación, o noso método non nos permitiu distinguir subrexións (é dicir, o núcleo NAcc vs. o shell) dentro do NAcc. Para a análise de cromatografía líquida de alto rendemento (HPLC), engadiuse ás mostras unha solución antioxidante (perclorato 0.4 N, ácido etilenediaminetetraacético 1.343 mM (EDTA) e metabisulfito sódico 0.526 mM seguido da homoxeneización mediante un homoxeneizador de tecidos ultrasónicos (Biologics; Gainesville, VA ). Unha pequena parte do homoxeneado do tecido disolveuse en 2% sulfato de dodecil sódico (SDS) (p / v) para a determinación de proteínas (Kit de reactivos proteicos Pierce BCA; Rockford, IL). A suspensión restante foi xirada en 14,000 g para 20 min nunha centrífuga refrixerada. O sobrenadante reservouse para HPLC.

As mostras foron separadas nunha columna Microsorb MV C-18 (5 Am, 4.6_250 mm, Varian; Walnut Creek, CA) e examináronse simultaneamente o ácido DA, 3,4-dihidroxifenilacético (DOPAC) e o ácido homovanílico (HVA), ambos os dous marcadores. de degradación da dopamina, 5-HT e 5-HIAA. Os compostos detectáronse mediante un detector de matrices coulométricas de canles 12 (CoulArray 5200, ESA; Chelmsford, MA) unido a un sistema de entrega de disolventes 2695 Waters (Waters; Milford, MA) nas seguintes condicións: caudal de 1 ml / min; potenciais de detección de 50, 175, 350, 400 e 525 mV, e; potencial de fregado de 650 mV. A fase móbil consistiu nunha solución 10% metanol en H destilada₂O que contén ácido cítrico 21 g / l (0.1 M), 10.65g / l (0.075 M) Na2HPO4, 176 mg / l (0.8 M) ácido heptanesulfónico e 36 mg / l (0.097 mM) EDTA a un pH de 4.1. As mostras descoñecidas cuantificáronse contra unha curva estándar de puntos 6 cun R mínimo² de 0.97. As mostras de control de calidade foron intercaladas con cada execución para garantir a calibración por HPLC.

Pptidos Orexixenicos ARNm qPCR

Medimos a expresión de péptidos hipotálamos que estimulan a alimentación e implicáronse en condutas de motivación e recompensa (Figlewicz & Sipols, 2010): neuropéptido Y (NPY [ Hahn, Breininger, Baskin e Schwartz, 1998; Jewett et al., 1995; Kelley, Nannini, Bratt e Hodge, 2001]); péptido relacionado con agouti (AGRP [Aponte, Atasoy e Sternson, 2011; Barnes, Argyropoulos e Bray, 2010; Broberger et al., 1998; Hagan et al., 2000; Hahn, Breininger, Baskin e Schwartz, 1998; Kaushik et al., 2011; Krashes et al., 2011; Rossi et al., 1998; Tracy et al., 2008]); e orexina (Cason et al., 2010; Choi, Davis, Fitzgerald e Benoit, 2010). As ratas foron eutanasiadas con anestesia con isoflurano e os cerebros elimináronse rapidamente, conxeláronse e almacenáronse a -80 ° C ata o seu procesamento. O hipotálamo medial e lateral microdiseccionáronse como un bloque usando un plano de conxelación AHP-1200CPV (Thermoelectric Cooling America, Chicago, Il) que mantivo unha temperatura constante de 12 ° C durante todo o proceso de disección. O ARN total do tecido microdiseccionado foi illado polo reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) e purificado usando o RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) segundo as instrucións do fabricante. Tratouse o ARN total para eliminar calquera posible contaminación do ADN xenómico usando DNase libre de RNase (Promega, Madison, WI) e cuantificouse mediante un espectrofotómetro NanoVue (GE Healthcare, Cambridge, Reino Unido). A calidade do ARN confirmouse mediante electroforese estándar en xel de agarosa. O ADN complementario (ADNc) retrotranscribiuse (RT) a partir de 1-2 μg de ARN total mediante unha mestura de hexámeros aleatorios e cebado de oligo DT usando o Kit de síntese de ADNc iScript (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hércules, CA). Tamén se prepararon reaccións non retrotranscritas (sen RT) de cada mostra para controlar a posible contaminación do ADN xenómico. Os controis de ADNc e sen RT diluíronse e empregáronse 5-10 ng de ADNc modelo de cada mostra para medir a expresión de ARNm de xenes seleccionados mediante PCR cuantitativa en tempo real utilizando o sistema de detección de PCR en tempo real MyIQ (Bio-Rad, Hércules Medidas por duplicado para cada mostra realizáronse en placas estándar de 96 pozos de iCycler, xunto con controis sen modelo (NTC) para detectar a contaminación cruzada potencial, en volumes de reacción de 20 μl consistentes en 10 μl 2 × iQ Sybr Green Supermix (Bio- Rad, Hércules, CA), 2 μl de 0.2-0.5 μM cada cebador, 3 μl de auga DEPC e 5 μl de molde. Todas as reaccións qPCR incluíron unha análise da curva de fusión para garantir a especificidade do sinal. A expresión relativa para cada xene de interese calculouse mediante extrapolación a unha curva estándar executada individualmente en cada placa e derivada de dilucións seriais dunha mostra agrupada de ADNc de referencia e normalizada a expresión relativa de xenes de referencia (fosfoproteína ribosómica ácida 36B4 para a expresión xénica en tecido hipotalámico e proteína ribosómica mitocondrial L32 para expresión no núcleo accumbens). As seguintes secuencias de iniciación (IDT, San Diego, CA) utilizáronse para amplificar a prepro-orexina de rata, NPY e AGRP: Prepro-orexina, adiante: 5′-TTCCTTCTACAAAGGTTCCCT-3 ′, 5′-GCAACAGTTCGTAGAGACGGCAG-3 ′; NPY: Adiante, 5- TACTCCGCTCTGCGACACTACATC-3 ′; Reverso: 5'-CACATGGAAGGGTCTTCAAGCC-3 '; AGRP, Adiante: 5'-GCAGAAGGCAGAAGCTTTGGC-3 '; Reverso: 5'-CCCAAGCAGGACTCGTGCAG-3 '.

cFos Inmunocitoquímica (ICC) e cuantificación

A ICC de fluorescencia usouse para identificar corpos de células neuronais Fos-positivas e AGRP positivas no hipotálamo medial, segundo a nosa metodoloxía establecida (Figlewicz et al., 2011). O último día (PR día 10), as ratas colocáronse nas súas cámaras de autoadministración como de costume, durante 90 minutos. Inmediatamente despois da última sesión de 90 minutos, as ratas foron anestesiadas profundamente con inhalación de isoflurano e perfundidas con NaCl ao 0.9% seguidas cunha solución fría de paraformaldehído ao 4%. O tempo para a anestesia e a eutanasia baseouse no coñecido curso temporal de máxima expresión da proteína cFos en 90-120 minutos despois do evento. Así, a expresión de cFos reflectiría a activación do SNC ao comezo da tarefa de comportamento, en lugar de ser o resultado dos animais que experimentaron a tarefa. Os cerebros elimináronse e fixáronse posteriormente en paraformaldehído varios días, despois colocáronse nunha solución de sacarosa-PBS ao 20% e despois solución de sacarosa-PBS ao 30%. Os cerebros seccionáronse nun criostato (criostato Leica CM 3050S) para inmunohistoquímica. Usamos a nosa metodoloxía establecida para cuantificar a proteína cFos inmunorreactiva en seccións cerebrais (Figlewicz et al., 2011). As seccións coronais de todo o cerebro de 12 μm montadas en diapositivas laváronse tres veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS, OXOID, Hampshire, Inglaterra). Laváronse as seccións durante 20 min con 100% etanol / DI auga (50%, v / v) seguidas dun lavado PBS, logo bloqueáronse durante 1 hora a temperatura ambiente en PBS que conteñen 5% normal de ser de cabra ou burro. A continuación, laváronse as seccións varias veces en PBS e incubáronse durante a noite a 4 ° C en solucións de anticorpos primarias compostas en PBS. Laváronse as seccións tres veces en PBS e logo incubáronse na escuridade a temperatura ambiente en solución de anticorpos secundaria composta en PBS durante 1 hora. As seccións foron posteriormente lavadas de novo en PBS, e montáronse e colocáronse en cuberta no medio de montaxe de conxunto duro de Vectashield (Vector; Burlingame, CA). As imaxes dixitais de seccións foron adquiridas mediante un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse E-800 conectado a unha cámara de captura dixital Qimaging Retiga mediante o software NIS Elements (Nikon).

Baseándonos en estudos de PCR que demostraron un aumento dos niveis de ARNm de AGRP, centrámonos en rexións hipotalámicas medias, especialmente o núcleo ventromedial e o núcleo arcuado (ARC). As seccións de 12 μm combinadas con atlas foron evaluadas para a expresión e cuantificación de cFos en seccións e rexións combinadas, a partir do atlas de Paxinos e Watson [2005]. Para a cuantificación (con ampliación 40 ×), seleccionáronse rexións combinadas con atlas. O software NIS Elements (Nikon) utilizouse para capturar unha imaxe da área desexada. Delimitouse unha área para contar e estableceuse un limiar para contas de células positivas. A área e fondo (limiar) idénticos utilizáronse para seccións dos respectivos grupos experimentais, e o reconto do software de células positivas (cuantificación) levouse a cabo na mesma sesión para todos os grupos experimentais, para evitar cambios entre sesión entre a configuración de fondo. Para a análise estatística, a conta tomouse dunha rata individual só se se dispoñían seccións correspondentes ou completas por cada área; non se tomaron datos dunha área específica dunha rata se houbese unha representación bilateral incompleta para esa área.

Ademais da cuantificación de cFos, realizouse unha inmunohistoquímica dobre etiqueta cuantitativa para cFos e AGRP. Debido a que non desexamos perturbar o comportamento dos animais, non foron tratados previamente con colchicina para optimizar a visualización de AGRP. Polo tanto, a visualización de neuronas positivas a AGRP pode ser subestimada. O procedemento de tinción dual para AGRP foi comparable ao ensaio de inmunorreactividade por cFos por si só, excepto que as seccións foron bloqueadas durante unha hora a temperatura ambiente no soro de burro PBS-5%. Despois, utilizouse unha mestura de anticorpos primarios fos-Ab e AGRP para a incubación durante a noite a 4 ° C; igualmente ambos anticorpos secundarios estaban na mesma solución e incubáronse durante unha hora na escuridade a temperatura ambiente. Realizáronse ensaios de optimización inicial para determinar unha dilución adecuada dos anticorpos primarios. Os anticorpos principais utilizados foron anti-cFos de coello (1: 500) (sc-52) e anti-AGRP de cabra (1: 100) (18634) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Os anticorpos secundarios utilizados foron o anti-coello de burro conxugado con Cy3 (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA) e o IgG anti-cabra de burro fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, OR); todos os anticorpos secundarios diluíronse a 1: 500.

Análise estatística

Os datos do grupo preséntanse como media ± erro estándar da media (SEM) no texto, táboas e figuras. A importancia defínese como p ≤ 0.05. As comparacións estatísticas fanse entre grupos experimentais, como se presenta en "Resultados" usando a proba de estudante sen par (por exemplo, dieta, idade ou comparación de tratamento). A "normalización" dos datos defínese a medida que se usa.

Efecto da dieta moderada en alto contido de graxa na motivación peri-pubertal de sacarosa

As ratas alimentaron a dieta 31.8% de graxa durante as semanas 5-8, mentres que nas sesións de autoadministración tiveron unha motivación significativa para a sacarosa, en comparación coas ratas alimentadas con chow. Como se mostra en Imaxe 1a, non houbo diferenzas no rendemento durante o adestramento FR inicial (medias FRDays 1-10 activas de palanca, 38 ± 5 vs. 39 ± 2 para chow vs. 31.8% dieta gorda, respectivamente). Non obstante, cando as ratas cambiaron á tarefa de PR máis rigorosa, houbo un aumento significativo do número de prensas activas da palanca e do número de recompensas de sacarosa, pero non na duración total da sesión (Imaxe 1b). Non se produciu ningún efecto do tratamento da dieta crónica sobre o número de prensas de palanca inactivas. Cando as ratas foron alimentadas con dieta rica en graxa durante a semana 5-8, pero posteriormente volveron a unha dieta chow tomada a través do adestramento de FR e PR durante semanas 9-12, houbo unha tendencia pero non hai diferenzas significativas nas prensas de palanca activas. Así, parece que non existe ningún efecto sobre o comportamento dunha dieta de graxa moderadamente alta consumida durante o período de tempo peri-puberto. Os datos do parámetro PR para estas cohortes resúmense en Táboa 2. Para comezar a dilucidar un (s) mecanismo (s) contribuíndo ao aumento da motivación sacarosa inducida pola dieta, realizamos unha serie de medicións metabólicas e do SNC.

  

figura 1

A resposta motivada pola PR por recompensas de sacarosa aumenta en ratas perifubales alimentadas cunha dieta 31.8% de graxa (n = 8). 1a. Nas sesións de FR non houbo ningún efecto na dieta, pero o efecto na dieta é manifesto cando as ratas se convirten no paradigma de PR. 1b. Os datos son ...

  

Táboa 2

Efecto da dieta rica en graos periartertal no rendemento dos ritmos progresivos para a sacarosa

Efecto da dieta moderada en alto contido de graxa nos parámetros metabólicos

Inmediatamente despois da conclusión das probas de comportamento, determinouse a composición de graxa corporal en ratas que tiñan a intervención na dieta e o paradigma de comportamento durante as semanas 5-8. As ratas recibiron cánulas intravenosas crónicas para probas de tolerancia á glicosa IV (conscientes) (IVGTTs). Posteriormente, obtivéronse plasma e soro de xaxún terminal para medidas metabólicas adicionais. Como se mostra en Táboa 3Non houbo diferenzas na composición corporal, peso corporal, medidas de insulina en xexún ou glicosa, sensibilidade á insulina (cálculo de HOMA) ou respostas ao IVGTT, entre as ratas alimentadas con chow e altas graxas. As medidas de leptina e triglicéridos en xaxún terminal non difiren entre os dous grupos. Así, aínda que o tratamento dietético tivo un efecto significativo na motivación da sacarosa, reflicte unha resposta comportamental en ratas altas en graxa que están pre-obesas.

Efecto da dieta moderada en alto contido de graxa na homeostática SNC e en neuroquímica recompensa

Ademais das medicións metabólicas finais, os cerebros da cohorte que tiveron tanto intervención dietética como adestramento comportamental durante semanas 5-8 medíronse para perfís de amina de núcleo accumbens (n ​​= 4 por grupo de dieta) ou niveis de ARNm de péptidos orexixenicos hipotalámicos. Como se mostra en Táboa 4Non houbo ningún efecto significativo da dieta rica en graxas sobre metabolitos da dopamina, noradrenalina ou serotonina no núcleo accumbens, un sitio central de recompensa e actividade motivacional (Ikemoto & Panksepp, 1996; Kelley e Berridge, 2002) no que cada un destes sistemas de neurotransmisores xoga un papel regulador clave. Dentro dos extractos hipotalámicos, medíronse os niveis de ARNm dos péptidos orixenxénicos, NPY, AGRP e orexina. Nesta cohorte observouse unha tendencia forte pero non significativa para o aumento da AGRP nas ratas alimentadas con graxa (n = 8 para calquera dieta); polo tanto, repetimos o paradigma de adestramento da dieta / comportamento nunha cohorte adicional e medimos o ARNm de NPY, AGRP e orexina no hipotálamo. Nas cohortes combinadas, observamos un aumento significativo (p <0.05) no ARNm de AGRP en ratas alimentadas coa dieta rica en graxas fronte aos controis de chow (figura 2), pero ningún cambio significativo na expresión NPY ou na orexina. Para avaliar posibles conexións entre a expresión de AGRP e o comportamento de autoadministración, medimos cFos e neuronas inmunopositivas AGRP no hipotálamo mediobasal. A grupos de ratas alimentáronse a dieta chow ou 31.8% de graxa; algúns foron tomados a través do protocolo de autoadministración (semanas 5-8) e outros foron tratados como controis de conduta. Imaxe 3a mostra un exemplo de co-localización de cFos e AGRP nunha neurona de núcleo arcuado. Como se resume en Táboa 5A activación de neuronas AGRP (co-expresión de cFos-ICC e AGRP-ICC dentro das mesmas células) asociouse coa actividade de autoadministración. Isto queda demostrado en Imaxe 3b, onde o número de neuronas activadas (cFos-positivas) móstrase como o reconto de células neuronais, ou como por cento do total de neuronas positivas de AGRP: hai unha activación significativa de neuronas AGRP nas ratas que auto-administran sacarosa, vs. , nos grupos de dieta combinada. Unha comparación de tratamento dentro da dieta para o número de neuronas AGRP activadas no grupo de autoadministración fronte aos controis de manexo amosou unha tendencia que non alcanzou importancia estatística (chow, p = .078; 31.8% dieta gorda, p = .073) . É importante, non só que estes datos vinculen a activación neuronal de AGRP co comportamento de autoadministración, senón que polo tempo para a medición de cFos (90 minutos despois de que as ratas se colocasen nas súas cámaras de autoadministración), a expresión de cFos reflicte a actividade das neuronas AGRP en anticipación ou, ao principio, da actividade de autoadministración. Houbo unha tendencia non significativa para o aumento das neuronas positivas AGRP totais no grupo de autoadministración (vs. control de manexo, p = 0.16). Naqueles ratos, onde se combinou o apretón de palanca entre os grupos de dieta, tamén se igualou o número de neuronas positivas AGRP. Non houbo ningún efecto do tratamento da dieta só sobre o número de neuronas positivas con AGRP nas ratas de control conductual.

  

figura 2

Efecto da dieta do 31.8% de graxa na expresión medial do ARNm do péptido hipotalámico. Os datos normalízanse para as ratas ricas en graxa (n = 17) fronte ás dos controis chow (n = 16). O ARNm de AGRP está significativamente elevado (p <0.05).

  

figura 3

Activación de neuronas AGRP ao inicio da autoadministración de sacarosa. 3a. Co-localización de cFos e AGRP na neurona do núcleo arco, ampliación de 60x. 3b. Número de neuronas inmunopositivas AGRP (cFos-inmunopositivas) activadas no hipotálamo mediobasal ...

  

Táboa 4

Nucleus Accumbens Metabolitos de amina

  

Táboa 5

Activación de neuronas Agrp: dieta e tratamento condutual

Efecto da administración de AGRP na motivación de sacarosa

A nosa interpretación deste achado é que a expresión AGRP nas ratas pubertais é un mecanismo clave que subxace na autoadministración mejorada de sacarosa das ratas altas en graxa da dieta. Para confirmar a eficacia de AGRP para aumentar a motivación para sacarosa, administrouse AGRP a través do terceiro ventrículo a ratas peri-pubertales alimentadas por chow durante a parte PR do paradigma de comportamento. Este réxime de dose de AGRP foi sub-limiar para a estimulación da inxestión de reses durante as dúas semanas de paradigma de PR, pero deu lugar a un aumento significativo da auto-administración de sacarosa, como se mostra en figura 4. (Teña en conta que cada recompensa de sacarosa ten un contido calórico de 0.1 kcal, polo que a actividade de autoadministración de sacarosa aporta calorías insignificantes para a inxestión total diaria.) Táboa 6 mostra datos de parámetros de autoadministración no paradigma PR do día 9, con AGVP ou a ICS inxectado ICV os días 2, 5 e 8. En ratas tratadas con AGRP, o número de prensas activas de palanca incrementouse significativamente en todos os días PR PR 2-10 (p = 0.03) e en días sen inxección (p = 0.048) cunha tendencia a un aumento do (promedio) días de inxección. Ademais, o tempo de parada (que reflicte o tempo total dedicado á tarefa de autoadministración) incrementouse significativamente nos días sen inxección (p = 0.02) con tendencias cara a un aumento global e nos días de inxección. O número de recompensas de sacarosa aumentouse en xeral durante os días PR PR 2-10 (p = 0.03). Non houbo ningún efecto do tratamento con AGRP no prensado de palanca inactiva, en comparación cos controis tratados con ACSF, ou entre os días de inxección e non de inxección Os resultados admiten unha interpretación dun efecto sostido de AGRP para aumentar a autoadministración de sacarosa: as ratas presionaron máis a panca gratificante, recibiron máis recompensas de sacarosa e dedicaron máis tempo á tarefa.

  

figura 4

O terceiro AGRP ventricular (ICV) (0.01 nmol) estimula a autoadministración de sacarosa no paradigma de PR, pero non ten efecto na inxestión diaria de alimentos durante o período de estudo (PR Days 2 — 10, con inxeccións os días 2, 5 e 8) . Os datos de AGRP (n = 9) están expresados ...

  

Táboa 6

Efecto de ICV AGRP vs. aCSF sobre o rendemento dos ratios progresivos para a sacarosa

Efecto do estadio de vida na preferencia e motivación da sacarosa

No experimento final, evaluamos se a motivación para sacarosa difire entre as ratas pubertais e as adultas. Inicialmente, as ratas vellas 5 e 10-wk recibiron unha proba de preferencia de sacarosa con opcións de solucións que van desde 0 ata 20% sacarosa, antes de comezar a probar e adestrar a autoadministración. Como se mostra en Imaxe 5a, e de acordo cos descubrimentos reportados na literatura, as ratas pre-pubertas pareceron preferir unha solución máis doce que as ratas adultas novas: a maioría das ratas pre-pubertais presentaron un consumo máximo de solución de sacarosa 20%, mentres que as ratas adultas mostraron un consumo máximo. de 15% sacarosa. Posteriormente, ambos os grupos de idade dividíronse entre a dieta de rata e a dieta rica en graxa durante o adestramento e a proba de autoadministración. Houbo un pequeno pero estadísticamente significativo no número de prensas de palanca activas das ratas peri-pubertas vs. adultos (45 ± 3 vs. 37 ± 2, p = 0.05) promediadas entre as sesións de FR, sen diferenzas no número de recompensas para sacarosa ou número de prensas na panca inactiva. Como se mostra en Imaxe 5b, houbo un efecto global altamente significativo da idade, en todas as sesións de PR, cun aumento activo significativamente da palanca activa presionando para as ratas pubertais (n = 15) fronte ás ratas de adultos novos (n = 14) (ANOVA 2-way, PRDay × idade; efecto da idade, p = 0.017, ningún efecto independente do PRDay, ningunha interacción significativa). Houbo unha tendencia para un maior efecto da idade na condición de dieta alta en graxa, pero isto non acadou importancia estatística (p = .13). Táboa 7 enumera parámetros de comportamento do PR: ademais do aumento de prensas activas de palanca, as ratas peri-pubertas recibiron recompensas significativamente máis de sacarosa e mostraron unha tendencia cara ao tempo de parada máis. Adicionalmente, as ratas peri-pubertas tiveron un pequeno pero significativo aumento nas prensas sobre a palanca inactiva (é dicir, non gratificante), aínda que tanto para as ratas peri-puberta como para as adultas, o número de prensas de palanca inactivas foi aproximadamente do 10% do número. de prensas de palanca activas. Estes resultados suxiren que as ratas peri-pubertas prefiren e buscarán con máis rapidez alimentos de sabor doce e o efecto pode verse amplificado cun fondo de dieta rica en graxa.

  

figura 5

As ratas xuvenís aumentaron a motivación das recompensas para sacarosa en comparación coas ratas adultas. 5a. Probas de preferencia de sacarosa para ratas xuvenís (peri-pubertas, n = 15) e adultos novos (n = 14). As ratas tiñan 30 min para beber no rango de concentracións (0-20% sacarosa). ...

  

Táboa 7

Efecto da idade sobre o desempeño das relacións progresivas^a para a sacarosa

Esta investigación foi apoiada pola subvención NIH DK40963. Dianne Figlewicz Lattemann é un científico de carreira de investigación maior, Programa de investigación en laboratorio biomédico, Departamento de Asuntos de Veteranos Sistema de asistencia sanitaria Puget Sound, Seattle, Washington. Stephen Benoit contou co apoio de NIH DK066223 e Ethicon Endosurgery Inc. Os autores agradecen ao doutor Tami Wolden-Hanson o apoio ás medidas de composición corporal; William Banks e Lucy Dillman para apoio coas medidas de triglicéridos; e Amalie Alver, e Samantha Thomas-Nadler para asistencia aos estudos de comportamento.

• Andersen SL, Teicher MH. Estrés, períodos sensibles e sucesos de maduración na depresión adolescente. Tendencias en neurociencia. 2008; 31: 183 – 191. [PubMed]
• Aberto Y, Atasoy D, Sternson SM. As neuronas AGRP son suficientes para orquestrar o comportamento da alimentación con rapidez e sen adestramento. Neurociencia da natureza. 2011; 14: 351 – 355. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
• Barnes MJ, Argyropoulos G, Bray GA. A preferencia por unha dieta rica en graxa, pero non unha hiperfagia despois da activación dos receptores de opioides, bloquease en ratos eliminatorios de AgRP. Investigación cerebral. 2010; 1317: 100 – 107. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
• CA Bolaños, Barrot M, Berton O, Wallace-Black D, Nestler EJ. O tratamento con metilfenidato durante a pre e a periadolescencia altera as respostas condutuais aos estímulos emocionais na idade adulta. Psiquiatría Biolóxica. 2003; 54: 1317 – 1329. [PubMed]
• Bolaños CA, Glatt SJ, Jackson D. Subsensibilidade aos fármacos dopaminérxicos en ratas periadolescentes: unha análise comportamental e neuroquímica. Investigación cerebral Desenvolvemento cerebral en desenvolvemento. 1998; 111: 25 – 33. [PubMed]
• Brandon CL, Marinelli M, Baker LK, FJ Branco. Reactividade e vulnerabilidade melloradas á cocaína despois do tratamento con metilfenidato en ratas adolescentes. Neuropsicofarmacoloxía. 2001; 25: 651 – 61. [PubMed]
• Brandon CL, Marinelli M, White FJ. A exposición dos adolescentes ao metilfenidato altera a actividade das neuronas da dopamina do cerebro de rata. Psiquiatría Biolóxica. 2003; 54: 1338 – 1344. [PubMed]
• Broberger C, Johansen J, Johansson C, Schalling M, Hokfelt T. Os circuítos cerebrais relacionados coa proteína (AGRP) do neuropéptido Y / Agouti, en ratos normais, anoréxicos e con glutamato monosódico tratados con glutamato. Actas da Academia Nacional de Ciencias. 1998; 95: 15043 – 15048. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
• Cason AM, Smith RJ, Tahsili-Fahadan P, Moorman DE, Sartor GC, Aston-Jones G. Papel de orexina / hipocretina na busca de recompensas e adicción: implicacións para a obesidade. Fisioloxía e Comportamento. 2010; 100: 419-428. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
• Choi DL, Davis JF, Fitzgerald ME, Benoit SC. O papel da orexina-A na motivación dos alimentos, no comportamento de alimentación baseada en recompensas e na activación neuronal inducida por alimentos nos ratos. Neurociencia. 2010; 167: 11-20. [PubMed]
• Cizza G, Brown RJ, Rother KI. Aumento da incidencia e retos da diabetes infantil. Unha pequena crítica. Revista de Investigación Endocrinolóxica. 2012 epub 8, 2012. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
• Coldwell SE, Oswald TK, Reed DR. Un marcador de crecemento difire entre os adolescentes con preferencia de azucre alta ou baixa. Fisioloxía e Comportamento. 2009; 96: 574-580. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
• Davis JF, Choi DL, Benoit SC. Insulina, leptina e recompensa. Tendencias en Endocrinoloxía e Metabolismo. 2010; 21: 68 – 74. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
• Davis JF, Choi DL, Schurdak JD, Fitzgerald MF, Clegg DJ, Lipton JW, Figlewicz DP, Benoit SC. A leptina regula o equilibrio enerxético e a motivación mediante a acción en circuítos neuronais distintos. Psiquiatría Biolóxica. 2011a; 69: 668 – 674. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
• Davis JF, Choi DL, Schurdak JD, Krause EG, Fitzgerald MF, Lipton JW, Sakai RR, Benoit SC. As melanocortinas centrais modulan a actividade mesocorticolímbica e o comportamento de busca de alimentos na rata. Fisioloxía e Comportamento. 2011b; 102: 491-495. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
• Davis JF, Tracy AL, Schurdak JD, Tschop MH, Clegg DJ, Benoit SC, Lipton JW. A exposición a niveis elevados de graxa na dieta atenúa a recompensa psicostimulante e a rotación de dopamina mesolímbica na rata. Neurociencia condutual. 2008; 122: 1257 – 1263. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
• Desor JA, Beauchamp GK. Cambios lonxitudinais nas preferencias doces en humanos. Fisioloxía e Comportamento. 1987; 39: 639-641. [PubMed]
• Desor JA, Greene LS, Maller O. Preferencias para o doce e o salado en 9- para humanos de 15 e adultos. Ciencia. 1975; 190: 686 – 687. [PubMed]
• Drewnowski A. Densidade de enerxía, palatabilidade e saciedade: implicacións para o control de peso. Comentarios nutricionais. 1998; 56: 347 – 353. [PubMed]
• Figlewicz DP, Bennett JL, Aliakbari S, Zavosh A, Sipols AJ. A insulina actúa en distintos sitios do SNC para diminuír a alimentación aguda de sacarosa e a autoadministración de sacarosa en ratas. Revista americana de fisioloxía. 2008; 295: R388 – R394. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
• Figlewicz DP, Bennett JL, Naleid AM, Davis C, Grimm JW. A insulina intraventricular e a leptina diminúen a autoadministración de sacarosa en ratas. Fisioloxía e Comportamento. 2006; 89: 611-616. [PubMed]
• Figlewicz DP, Bennett-Jay JL, Kittleson S, Sipols AJ, Zavosh A. Autoadministración de sacarosa e activación do SNC na rata. Am J Physiol. 2011; 300: R876 – R884. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
• Figlewicz DP, Ioannou G, Bennett Jay J, Kittleson S, Savard C, Roth CL. Efecto da inxestión moderada de edulcorantes sobre a saúde metabólica na rata. Fisioloxía e Comportamento. 2009; 98: 618-624. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
• Figlewicz DP, Sipols AJ. Sinais de regulación enerxética e recompensa de alimentos. Farmacoloxía, bioquímica e comportamento. 2010; 97: 15-24. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
• Frangioudakis G, Gyte AC, Loxham SJ, Poucher SM. A proba de tolerancia á glucosa por vía intravenosa en ratas de Wistar canuladas: un método robusto para a avaliación in vivo da secreción de insulina estimulada pola glicosa. Revista de métodos farmacolóxicos e toxicolóxicos. 2008; 57: 106 – 113. [PubMed]
• Hagan MM, apresurado PA, Pritchard LM, Schwartz MW, Strack AM, Van Der Ploeg LHT, Woods SC, Seeley RJ. Os efectos orexixenicos a longo prazo do AgRP- (83-132) implican mecanismos distintos do bloqueo do receptor da melanocortina. Revista americana de fisioloxía. 2000; 279: R47 – R52. [PubMed]
• Hahn TM, Breininger JF, DG Baskin, Schwartz MW. Coexpresión de Agrp e NPY en neuronas hipotalámicas activadas en xaxún. Neurociencia da natureza. 1998; 1: 271 – 272. [PubMed]
• Relación progresiva de Hodos W. como medida da forza de recompensa. Ciencia. 1961; 134: 943-944. [PubMed]
• Ikemoto S, Panksepp J. Disociacións entre respostas apetitivas e consumosas mediante manipulacións farmacolóxicas das rexións cerebrais relevantes para recompensa. Neurociencia condutual. 1996; 110: 331 – 345. [PubMed]
• Jewett DC, Cleary J, Levine AS, Schaal DW, Thompson T. Efectos do neuropéptido Y, insulina, 2-desoxiglucosa e privación de alimentos nun comportamento motivado por alimentos. Psicofarmacoloxía. 1995; 120: 267-271. [PubMed]
• Kaushik S, Rodriguez-Navarro JA, Arias E, Kiffin R, Sahu S, Schwartz GJ, Cuervo AM, Singh R. Autofagia en neuronas AgRP hipotalámicas regula a inxestión de alimentos e o equilibrio enerxético. Metabolismo celular. 2011; 14: 173 – 183. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
• Kelley AE, Berridge KC. A neurociencia das recompensas naturais: relevancia para as drogas adictivas. Journal of Neuroscience. 2002; 22: 3306-3311. [PubMed]
• Kelley SP, Nannini MA, Bratt AM, Hodge CW. O neuropéptido-Y no núcleo paraventricular aumenta a autoadministración de etanol. Péptidos. 2001; 22: 515 – 522. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
• Kohli R, Boyd T, Lago K, Dietrich K, Nicholas L, Balistreri WF, Ebach D, Shashidkar H, Xanthakos SA. Progresión rápida da NASH na infancia. Revista de Gastroenteroloxía e Nutrición Pediátrica. 2010; 50: 453 – 456. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
• Krashes MJ, Koda S, Ye CP, Rogan SC, Adams AC, Cusher DS, Maratos-Flier E, Roth BL, Lowell BB. A rápida activación reversible das neuronas AgRP conduce ao comportamento da alimentación nos ratos. Xornal de investigación clínica. 2011; 121: 1424-1428. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
• Mennella JA, Pepino MI, Reed DR. Determinantes xenéticos e ambientais da percepción amarga e das preferencias doces. Pediatría. 2005; 115: 216 – 222. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
• Myers KP, Sclafani A. Desenvolvemento das preferencias de sabor aprendidas. Psicobioloxía do desenvolvemento. 2006; 48: 380 – 388. [PubMed]
• Programa Nacional de Investigación Aplicada do Instituto Nacional do Cancro. Fontes de calorías de azucres engadidos entre a poboación dos Estados Unidos, 2005-06. Actualizado 21 decembro 2010. [Accedeu a 21 setembro 2011]; 2010 Dispoñible en: http://riskfactor.cancer.gov/diet/foodsources/added_sugars/
• Nixon JP, Zhang M, Wang CF, Kuskowski MA, Novak CM, Levine JA, Billington CJ, Kotz CM. Avaliación dun sistema de imaxe de resonancia magnética cuantitativa para a análise da composición do corpo enteiro en roedores. Obesidade. 2010; 18: 1652 – 1659. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
• Ogden CL, Carroll MD. División de Enquisas de exame de saúde e nutrición. Prevalencia da obesidade entre nenos e adolescentes: Estados Unidos, tendencias 1963-1965 a través de 2007-2008. [Accediu ao 21 setembro 2011]; Estado de saúde. 2010 2010 Dispoñible desde: http://www.cdc.gov/nchs/fastats/overwt.htm.
• Paxinos G, Watson C. Atlas do cerebro de rata en coordenadas estereotóxicas. 5th. San Diego CA: Elsevier Academic Press; 2005
• Richardson NR, Roberts DC. Programas de proporcións progresivas en estudos de autoadministración farmacéutica en ratas: un método para avaliar a eficacia reforzada. Revista de métodos de neurociencia. 1996; 66: 1 – 11. [PubMed]
• Roitman MF, Stuber GD, Phillips PE, Wightman RM, Carelli RM. A dopamina funciona como un modulador de segundo segundo da busca de alimentos. Revista de Neurociencia. 2004; 24: 1265 – 1271. [PubMed]
• Rossi M, Kim M, Morgan D, Small C, Edwards C, Sunter D, Abusnana S, Goldstone A, Russell S, Stanley S, Smith D, Yagaloff K, Ghatei M, Bloom S. Un fragmento C-terminal de Agouti- A proteína relacionada aumenta a alimentación e antagoniza o efecto da hormona estimulante dos alfa-melanocitos in vivo. Endocrinoloxía. 1998; 139: 4428 – 4431. [PubMed]
• Stanhope KL. Papel dos azucres que conteñen fructosa nas epidemias de obesidade e síndrome metabólica. Revisións anuais de medicina. 2012; 63: 329 – 343. [PubMed]
• Sturman DA, Mandell DR, Moghaddam B. Os adolescentes presentan diferenzas de comportamento dos adultos durante a aprendizaxe e extinción insturmetnais. Neurociencia condutual. 2010; 124: 16 – 25. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
• Tracy AL, Clegg DJ, Johnson JD, Davidson TL, Woods SC. O antagonista da melanocortina AgRP (83-132) aumenta o apetito respondendo a un reforzo de graxa, pero non un carbohidrato. Farmacoloxía Bioquímica e Comportamento. 2008; 89: 263 – 271. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]
• Vartanian LR, Schwartz MB, Brownell KD. Efectos do consumo de refrescos na nutrición e na saúde: unha revisión sistemática e metaanálise. American Journal of Public Health. 2007; 97: 667 – 75. [Artigo gratuíto de PMC] [PubMed]