Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2011 Abr; 300 (4): R876 – R884.
Publicado en liña 2011 Feb 9. doi: 10.1152 / ajpregu.00655.2010
PMCID: PMC3075076
1,2 Abstracto
Segundo informou anteriormente, a administración de insulina no núcleo arqueado do hipotálamo diminúe a motivación da sacarosa, avaliada mediante unha tarefa de autoadministración, nas ratas. Como o patrón de activación do sistema nervioso central (SNC) en asociación coa auto-administración de sacarosa non foi avaliado, no presente estudo medimos a expresión de c-Fos como un índice de activación neuronal. Adestramos ratas para presionar a sacarosa, segundo un calendario de relación fixa (FR) ou de relación progresiva (PR) e expresión mapeada de inmunorreactividade c-Fos no SNC, comparada coa expresión c-Fos nos controis manexados. Observamos unha expresión única de c-Fos no hipotálamo medial (o núcleo arqueado, paraventricular, retrochiasmático, dorsomedial e ventromedial) asociado co inicio do rendemento PR e expresión de c-Fos no hipotálamo lateral e no núcleo do leito de stria terminalis en asociación co inicio do rendemento de FR. A expresión de c-Fos aumentou no núcleo accumbens de ambos ratos FR e PR. O noso estudo enfatiza a importancia dos circuítos homeostásicos de enerxía hipotálamica e circuítos límbicos no desempeño dunha tarefa de recompensa de alimentos. Dado o papel do hipotálamo medial na regulación do equilibrio enerxético, o noso estudo suxire que este circuíto pode contribuír a premiar a regulación no contexto máis amplo da homeostase enerxética.
identificouse que os circuítos dopaminérgicos mesolímbicos (DA), incluíndo a área tegmental ventral (VTA) e as proxeccións para os sitios estriado e cortical, xogan un papel crítico nos aspectos motivadores ou gratificantes de numerosas clases de drogas de abuso (13, 22-24, 26, 48). Investigacións recentes do noso laboratorio e outros suxiren que este circuíto tamén xoga un papel importante nos aspectos motivadores ou gratificantes dos alimentos. A interacción funcional e anatómica co circuíto que regula a homeostase enerxética é suxerida por informes da modulación da recompensa de alimentos polo estado nutricional dos animais (10, 14, 16, 43). A modulación da recompensa, incluída a recompensa de alimentos, por estado nutricional ou metabólico, está fortemente influenciada por sinais neuronais e endocrinas, incluída a insulina (15), leptina (11, 18, 21, 30, 32), grelina (35), hormona concentradora de melanina (MCH)45), e orexin (5, 7): a presenza de receptores, a eficacia bioquímica e celular, ea eficacia in vivo ou comportamental destes sinais no sistema nervioso central (SNC) demostráronse abundantemente nos últimos anos.
Tamén se demostrou que o circuíto límbico estendido xoga un papel na alimentación e na recompensa de alimentos.2, 19, 28). Non obstante, hai outros sitios de CNS que contribúen. En particular, o hipotálamo lateral (LH) foi coñecido como un sitio que mediaba os comportamentos de alimentación e autoestimulación (4, 31). As neuronas orxinérxicas e a sinalización da leptina no LH identificáronse como importantes para a alimentación e a recompensa dos alimentos.5, 29, 30). Recentemente observamos que a insulina administrada no terceiro ventrículo cerebral ou no núcleo arqueado do hipotálamo (ARC) podería diminuír a autoadministración de sacarosa, pero a administración de insulina no VTA ou no núcleo accumbens non tivo efecto neste paradigma específico de recompensa (15). Así, parece que varios sitios hipotalámicos poden desempeñar un papel significativo na procura e adquisición motivada de alimentos, e de acordo con isto, sería hipótese que as rexións hipotalámicas son substancialmente activadas en asociación coa autoadministración dos alimentos. Para comezar a probar esta hipótese, mapamos a expresión de c-Fos no SNC de ratos formados nun paradigma de autoadministración de sacarosa, despois de adestramentos de razóns fixas (FR) ou despois de adestramentos de razón progresiva (PR), unha tarefa máis rigorosa para avaliar a motivación (20).
MATERIAIS E MÉTODOS
Temas.
Os suxeitos foron ratas albinos machos (325-425 g) de Simonsen (Gilroy, CA). As ratas mantivéronse en chow ad libitum. Mantivéronse nun ciclo de luz escuro de 12: 12 horas con luces acesas ás 6 da mañá e adestráronse e probáronse entre as 7 da mañá e o mediodía, no estado postprandial e postabsorptivo. Todos os procedementos realizados nas ratas seguiron as directrices dos Institutos Nacionais de Saúde para o coidado dos animais e foron aprobados polo Subcomité de Coidados e Uso dos Animais do Comité de Investigación e Desenvolvemento do Sistema de Coidados de Saúde VA Puget Sound.
Autoadministración de sacarosa.
Os procedementos baseáronse na nosa metodoloxía publicada (15) e leváronse a cabo en ratas alimentadas. O experimento incluíu tres fases: autoshaping para iniciar adestramento, adestramento FR e ratios progresivos (PR) usando o algoritmo PR de Richardson e Roberts (38). O algoritmo PR require 1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 28, 36, 48, 63, 83, 110, 145, 191, 251, 331, 437, 575, 759, 999, 999 etc) presiona a panca para ter éxito nas entregas dunha recompensa dentro dunha sesión (38). Os ratos foron adestrados para autoadministrarse a sacarosa 5% (recompensa 0.5 ml) entregada a un recipiente de caída de líquido. As caixas operantes, controladas por un sistema de Med Associates (Georgia, VT), tiñan dúas palancas, pero só unha palanca (unha panca retráctil activa) activou a bomba de infusión. Tamén se gravaron as presións sobre a outra panca (unha palanca inactiva e estacionaria). Como observamos anteriormente, o número de presións sobre a panca inactiva era moi baixo (menos que 10 presiona / sesión). A solución de sacarosa entregouse a un recipiente de caída de líquido para o consumo oral (Med Associates, St. Albans, VT). O adestramento inicial levouse a cabo durante as sesións 1-h baixo un programa de reforzo continuo (FR1: reforzouse cada prensa de palanca). Cada sesión comezou coa inserción da panca activa e a iluminación dunha luz branca que se mantivo durante toda a sesión. Un ton 5-s (2900 Hz, 20 dB por riba do fondo) e luz (luz branca 7.5 W por encima da panca activa) discreto composto cue acompañou cada entrega de recompensa, cun tempo de saída de 20 comezando coa entrega de sacarosa. Realizouse un adestramento FR para os días 10; A resposta estable lógrase ata a quinta sesión. Realizouse un adestramento de relacións públicas durante un máximo de 10 h por día para 3 días. As sesións de relacións públicas remataron despois de que 10 min de ningunha maneta de prensa activa respondese, momento no que a luz da casa apagouse automaticamente e a panca activa retirouse; as ratas foron retiradas das cámaras e volvéronse ás súas gaiolas domésticas. Denuncia o tempo de parada Táboa 2 representa a hora na que o sistema estaba desactivado; xa que logo, a última presión activa da palanca tería ocorrido 30 min antes do tempo de parada. Datos de comportamento (Táboa 2) representan as medias de sesións 6-10 para adestramento en FR e sesións 1-9 para a formación en relacións públicas. As ratas manexadas de control tomáronse da habitación da vivenda e colocáronse nunha cámara de operación limpa con luz de casa encendida para o 60 min, dentro da sala de procedemento, para simular o manexo e as experiencias habituais das ratas sacarosa autoadministración. Non se lles deu nada que comer ou beber nas caixas operantes e non tiña acceso ás palancas.
O último día, as ratas colocáronse nas cámaras segundo os días de adestramento e mantivéronse nas cámaras durante 90 minutos, despois das cales foron retiradas, para anestesia, perfusión e posterior inmunohistoquímica. As ratas de control tamén se levaron á sala de procedemento e mantivéronse nunha cámara de operadores limpa, segundo os días de adestramento, durante 90 minutos, despois do cal foron anestesiadas e perfundidas. Inmediatamente despois da última sesión de 90 minutos, as ratas foron profundamente anestesiadas con inhalación de isoflurano e perfundidas con NaCl ao 0.9% seguidas cunha solución fría de paraformaldehído ao 4%. O tempo para a anestesia e a eutanasia baseouse no tempo coñecido de pico de expresión da proteína c-Fos aos 90-120 minutos despois do evento. Así, a expresión de c-Fos reflectiría a activación do SNC ao comezo da tarefa de comportamento, en lugar de ser o resultado de que os animais experimentasen a tarefa e inxerisen sacarosa. Os cerebros elimináronse e fixáronse en paraformaldehído durante varios días; despois, colocáronse posteriormente en sacarosa-PBS ao 20%, despois colocáronse nunha solución de sacarosa-PBS ao 30%. Os cerebros seccionáronse nun criostato (criostato Leica CM 3050S) para inmunohistoquímica.
c-Fos inmunohistoquímica e cuantificación.
Usamos a nosa metodoloxía establecida para cuantificar a proteína c-Fos inmunorreactiva nas seccións cerebrais (12). A pantalla cualitativa inicial de todo o cerebro foi realizada para a expresión c-Fos. As seccións coronais do cerebro integral 12-μm montadas en diapositivas foron lavadas veces 3 en PBS (Oxoid, Hampshire, Reino Unido). Bloquearon seccións para 1 h a temperatura ambiente en PBS que contiña 5% soro de cabra ou burro normal. As seccións foron lavadas varias veces en PBS e incubadas durante a noite en 4 ° C en solucións de anticorpos primarios compostas en PBS. As seccións foron lavadas tres veces en PBS e despois incubadas á escuridade a temperatura ambiente na solución de anticorpos secundarios composta en PBS para 1 h. Posteriormente, as seccións foron lavadas de novo en PBS e montáronse e cubríronse no medio de montaxe do soporte de Vectashield (vector Laboratories, Burlingame, CA). As imaxes dixitais de seccións foron adquiridas usando un microscopio de fluorescencia E-800 Eclipse Nikon conectado a unha cámara Optiphot e usando o software Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).
Posteriormente, centrouse nun número limitado de áreas que mostran unha diferenza aparente entre as condicións, a cuantificación e o fenotipado neuronal. Especificamente, centrámonos no núcleo e na cuncha do núcleo accumbens (NAc); núcleo da cama anterior e posterior (aBNST, pBNST); rexións hipotalámicas mediais [núcleo ventromedial (VMH), hipotálamo dorsomedial (DMH), núcleo paraventricular (PVN), área retrochiasmática (RCh) e ARC]; hipotálamo lateral (LH), incluíndo rexións dorsal e ventral e área perifornical (peF); VTA; tronco cerebral [olivo inferior, núcleo hipogloso (nXII) do tracto solitario, núcleo reticular lateral e núcleos de adrenalina / noradrenalina C1 / A1]. As seccións 12-μm combinadas con Atlas foron avaliadas para a expresión e cuantificación de c-Fos en seccións e rexións correspondentes, baseadas no atlas de Paxinos e Watson (34). Consulte Táboa 1 para coordenadas estereotáxicas específicas. O foco principal dos ensaios era comparar cada tarefa comportamental co seu respectivo control (PR vs. PRC; FR vs. FRC). Para optimizar as posibles diferenzas baseadas en condicións de comportamento e control, seleccionáronse os máximos artistas dos grupos PR e FR para a análise. Así, analizáronse os ratos 4 / 12 PR e 3 / 12 FR: Estas ratas tiñan un número activo de prensa de palanca (o punto final do comportamento principal) que era maior que un desvío estándar por enriba da media do seu respectivo grupo de comportamento. Tamén se analizou un subcoort de ratas control (ratas 5 PRC e 3 FRC, presentes na sala de procedemento ao mesmo tempo que as ratas FR ou PR). Un grupo adicional de tres ratas foi tomado a través do procedemento FR ("FRext") para imitar a duración engadida do procedemento PR (é dicir, para un total de 20 días, xa que as ratos PR son tomadas a través de FR e despois PR) para avaliar se as diferenzas entre FR e PR foron debido á tarefa de comportamento ou á duración do procedemento. Os cerebros de FRext non foron analizados e examinados sistemáticamente, pero as outras rexións de interese foron ensaiadas cos outros catro grupos, para permitir a cuantificación comparativa, como se indica especificamente nos resultados.
Para a cuantificación (a magnificación 40 ×), seleccionáronse as rexións correspondentes ao atlas. O software ImagePro Plus (Media Cybernetics) utilizouse para capturar unha imaxe da área desexada. Un área foi delineada para a contaxe e estableceuse un límite para as contas de células positivas. A área e fondo idénticos (limiar) utilizáronse para as seccións dos respectivos grupos experimentais, e o reconto de software de células positivas (cuantificación) levouse a cabo na mesma sesión para todos os grupos experimentais, para evitar cambios entre as sesións na configuración de fondo. Para a análise estatística, as contas tomáronse dunha rata individual só se as seccións correspondentes ou completas a través de cada área (como se define en Táboa 1) estaban dispoñibles; os datos dunha área específica non foron tomados dunha rata se hai unha representación bilateral incompleta para esa área.
Análise cualitativa de inmunofluorescencia dobre etiqueta.
As seccións cerebrais tomáronse das ratas nas que se cuantificou c-Fos, para inmunohistoquímica de dobre etiquetaxe. Debido a que non queriamos perturbar o comportamento dos animais, non foron pretratados con colchicina para optimizar a visualización dos neurotransmisores de péptidos. Polo tanto, a visualización de fenotipos neuronais activados en asociación coa tarefa de autoadministración foi limitada. Non obstante, para comezar a avaliación dos fenotipos das neuronas activadas en varias localizacións do SNC, as imaxes dixitais (adquiridas como se describe na sección anterior) tomáronse a 20 ×, 40 × ou 60 × (como se indica nas lendas da figura) . O procedemento de dobre tinguidura para glutamato descarboxilase (GAD), tirosina hidroxilase (TH), CRF, neuropéptido Y (NPY), péptido relacionado con Agouti (AgRP) e triptófano hidroxilase foi comparable ao ensaio da inmunorreactividade c-Fos. propia, agás que se utilizou unha mestura de c-Fos-Ab e un dos outros anticorpos primarios para a incubación durante a noite a 4 ° C; do mesmo xeito, ambos anticorpos secundarios estiveron na mesma solución e incubáronse durante 1 h na escuridade a temperatura ambiente. Para o ensaio de orexina utilizouse un lavado de etanol ao 20% ao 50 minutos antes do paso de bloqueo. Realizáronse ensaios de optimización inicial para determinar unha dilución adecuada dos anticorpos primarios. Os anticorpos principais utilizados foron anti-c-Fos de coello (1: 500) (sc-52) e anti-c-Fos de rato (1: 800) (ambos de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); anti-GAD de rato (1: 1,000), anti-tirosina hidroxilase de rato (1: 500) e anti-triptófano hidroxilase de ovellas (todos de Chemicon, Temecula, CA); anti-CRF de coello (1: 500) (agasallo do doutor Wylie Vale, Salk Institute, CA); anti-NPY de coello (1: 1,000), anti-AGRP de coello (1: 1,000) e anti-orexina A de cabra (1: 5,000), todos de Phoenix Pharmaceutical (St. Joseph, MO). Os anticorpos secundarios utilizados foron anti-coello ou anti-rato conxugados con Cy3 (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA), Alexa Fluor 488 anti-rato ou anti-coello ou burro IgG anti-ovella (Molecular Probes, Eugene, OR) ; todos os anticorpos secundarios diluíronse a 1: 500. A inmunotinción dual c-Fos / MCH ensaiouse en serie; primeiro, para MCH (1: 2,500 anticorpo primario, Millipore) con Alexa-488-cabra anti-coello (1: 500) anticorpo secundario. As diapositivas volvéronse bloquear cun soro de cabra normal ao 5% e tinguíronse de anti-c-Fos (1: 500) e anti-coello de cabra cy3 como anticorpo secundario. Para o ensaio MCH utilizouse un lavado de etanol ao 20% ao 50% antes do paso de bloqueo.
Análise estatística.
Os datos do grupo preséntanse como medios ± SE no texto, táboas e figuras. A importancia defínese como P ≤ 0.05. As comparacións estatísticas fanse entre grupos experimentais (FR vs. PR) ou entre grupos experimentais e controis correspondentes (PR vs. PRC; FR vs. FRC) empregando os estudantes sen par t-proba. Os coeficientes de correlación de Pearson entre as prensas de panca activa e a expresión de c-Fos en diferentes rexións cerebrais, así como a correlación da expresión de c-Fos entre varias rexións cerebrais en idénticas condicións experimentais, calculáronse utilizando o programa de análise estatístico StatPlus: mac LE para a versión de Mac OS 2009 por AnalystSoft. Probamos correlacións lineais (Pearson's R estatística) entre a expresión c-Fos en diferentes rexións do SNC. Tamén analizamos as correlacións entre a expresión c-Fos en diferentes rexións CNS activadas e o comportamento. Para estas correlacións utilizáronse datos FR e PR de ratas, para os que se realizou a cuantificación c-Fos.
RESULTADOS
Cuantificación c-Fos.
Como observamos anteriormente, o número de prensas de palancas activas foi significativamente maior para o rendemento PR fronte a FR ()Táboa 2), eo número de recompensas de sacarosa foi maior durante o rendemento de FR. A duración da sesión para as ratas de relacións públicas era de aproximadamente 90 min (tempo de parada - 30). Táboa 3 enumera a conta de células c-Fos inmunorreactivas en todas as rexións do SNC onde se realizou a cuantificación. O patrón de expresión de c-Fos para as ratas FR e PR resúmese en Fig 1. Houbo unha activación significativa do hipotálamo medial (MH)para, un composto de ARC, PVN, RCh, DMH e VMH) de ratos implicados na palanca de presión presionando para a sacarosa, pero ningunha activación global en ratas implicadas na panca FR presionando para a sacarosa, en comparación cos controis respectivos. Dentro do hipotálamo medial das ratas PR, esta activación produciuse no PVN, ARC e VMH (Fig 2). A presión de palanca FR, pero non a presión de palanca PR, asociouse cunha activación significativa dentro do LH (baseada predominantemente na activación dentro da área perifornical). Ambas as palancas activas e a expresión hipotalámica c-Fos eran comparables entre os grupos FRext e FR (MH)para, 946 ± 26 e 911 ± 118; ARC, 176 ± 18 e 186 ± 10; LHpara, 468 ± 79 e 378 ± 34; LHpeF, 200 ± 31 e 173 ± 15, respectivamente), o que suxire que a diferenza no patrón de expresión entre os grupos FR e PR non está relacionada coa duración do adestramento / experiencia, senón coa natureza da tarefa instrumental. Para o grupo FR, houbo un aumento significativo na expresión de c-Fos no BNST, observado tanto en aBNST como en pBNST. Tanto a presion da palanca FR como a PR estiveron asociadas co aumento das neuronas immunopositivas c-Fos na cuncha NAc; Os recuentos de c-Fos incrementáronse significativamente no núcleo de NAc a partir de ratos implicados na presión de panca FR, cunha tendencia non significativa cara a unha maior expresión de c-Fos en ratas que exercían presión na palanca. c-Fos non se incrementou no VTA coa tarefa de relacións públicas, aínda que se observou unha tendencia non significativa cara a un aumento coa tarefa FR. Finalmente, c-Fos aumentou significativamente no núcleo hipogloso (nervio cranio XII) no tronco cerebral de ratos adestrados para PR, pero non para FR.
A expresión de c-Fos foi observada noutras rexións do SNC, incluíndo a amígdala e o córtex cerebral (Fig 3). Non obstante, observouse a expresión tanto nas condicións de control como en asociación con tarefas PR e FR, o que suxire que os aspectos inespecíficos do procedemento (manipulación, movemento na sala de procedemento) poderían ter como resultado esta activación. A cuantificación nestas rexións non se realizou. Do mesmo xeito, observouse a activación dentro de rexións do tallo cerebral distinta da nXII, pero ocorreu en asociación con ambas as condicións relacionadas co control e tarefa, suxerindo tamén un papel na activación inesperada ou no comportamento.
Probamos as correlacións entre a expresión de c-Fos en diferentes rexións do SNC. Combinando datos de grupos de presión de panca, atopamos unha correlación negativa entre a expresión de c-Fos no LH e no VMH; así, a activación do VMH asociouse cunha diminución da activación xeral do LH (Pearson's R, −0.7986; t = −3.7534; P = 0.0056). Ademais, observamos unha correlación positiva significativa entre a expresión de c-Fos na rexión perifornical do LH e do VTA (Pearson's R, 0.7772; t = 3.493; P = 0.0082), consistente coa conectividade monosináptica coñecida entre estas dúas rexións (ver discusión en Refs. 2 13). Atopamos unha correlación negativa significativa entre a expresión de c-Fos no VTA fronte ao NAc-shell, se se probou por separado para o rendemento FR (Pearson R, −0.9262; t = −4.9125; P = 0.008) ou para o rendemento de relacións públicas (Pearson's R, −0.9897; t = −9.7624; P = 0.0103), consistente con entradas recíprocas coñecidas entre rexións estriaxias coa substancia negra e VTA (2, 13). Tamén probamos as correlacións entre a expresión de c-Fos en diferentes rexións do SNC e o comportamento. Combinando datos de grupos de presión de panca, observamos unha correlación positiva significativa entre c-Fos no ARC e prensas de panca activas (Pearson's R, 0.8208; t = 3.8017; P = 0.0067).
Identificación de neuronas activadas coa inxestión de sacarosa e motivación para a sacarosa.
No tronco cerebral, as neuronas c-Fos-positivas non mostraron imunodexinação positiva para TH, a encima que limita a taxa de epinefrina e norepinefrina (e dopamina); así, estas neuronas catecolaminérxicas non parecen ser activadas polas tarefas FR ou PR. Non obstante, algunhas neuronas c-Fos positivas mostraron inmunosução positiva para o triptófano hidroxilase, indicando que se activou unha poboación de neuronas da serotonina. Como se mostra en Fig 4, no ARC, os corpos celulares positivos para c-Fos estaban rodeados de fibras manchadas con AGRP, e observouse un patrón similar para a inmunotinción de fibras / c-Fos de NPY (non mostrado). Nas PVN, as neuronas c-Fos parecían envolver neuronas positivas en CRF, pero non se observou ningunha colocalización (datos non mostrados). Fig 5 mostra inmunotinción de orexina e MCH na LH. As neuronas de orxina atopáronse en dLH e peLH. Aínda que observamos neuronas MCH-positivas no peLH, non houbo esencialmente ningunha colocalización con c-Fos nesa rexión do LH. Non obstante, observamos a colocalización de c-Fos en neuronas positivas en orexina no interior da LIF (Fig 6, arriba), e unha colocalización c-Fos moi limitada con MCH na vLH (Fig 6, fondo). Deberíase reiterar que tanto a localización como a colocalización con c-Fos poden ser subestimadas para os neurotransmisores peptídicos como o CRH, porque as ratas non foron pretratadas con colchicina. Finalmente, dentro do núcleo accumbens core and shellFig 7), observouse c-Fos coimunostaining con GAD, a encima sintética para o neurotransmisor GABA, tanto para ratos FR como PR. Houbo unha tinción robusta para TH dentro do VTA; con todo, as neuronas c-Fos-positivas raramente foron observadas e non parecían colocalizar exclusivamente con TH.
Conversa
No estudo actual, utilizamos a expresión do xene precoz inmediato, c-Fos, para avaliar o patrón de activación aguda do SNC asociado co inicio da actividade de presión de autoadministración de sacarosa, ben como unha tarefa relativamente pouco esixente (FR) ou unha actividade tarefa cada vez máis difícil pensada para reflectir a procura motivada dunha recompensa, como a sacarosa, e para involucrar fortemente os circuítos límbicos (22, 24, 49) (PR). Os patróns de activación hipotalámicos diferían entre as dúas tarefas, predominando a activación LH / límbica na tarefa FR e a activación hipotalámica / límbica media predominando na tarefa de relacións públicas. Fig 1). Hai varias posibles razóns para isto. En primeiro lugar, estes paradigmas poderían “mapear” como experiencias cualitativamente diferentes no SNC. As ratas adestradas en performance FR estarían esperando unha actividade sinxela e de alta recompensa. A anticipación dun alimento gratificante debería influír moito no patrón c-Fos observado nos ratos FR. A aparente diferenza cualitativa no patrón de activación suxire que unha segunda posibilidade - que os animais de reloxo PR simplemente teñen máis experiencia coa tarefa - é menos probable, e isto foi apoiado pola nosa medición de c-Fos no hipotálamo de ratas que recibiron sesións 20 FR , que mostrou unha actividade similar ao grupo FR, non ao grupo PR. Estas dúas posibilidades poden probarse aumentando sistematicamente a dificultade de formación do FR e avaliando os cambios na activación do SNC, nese caso, poderíase prever un cambio cualitativo no patrón de activación. Non obstante, mentres que o número de experiencias de adestramento non explica o patrón de activación do SNC, o número medio de recompensas de sacarosa nunha sesión podería: a tarefa de relacións públicas pode simplemente ser aprendida como unha experiencia "menos gratificante" e isto podería estar vinculado funcionalmente co falta de activación de LH. Así, o patrón de activación do SNC no inicio da sesión pode reflectir un estado interoceptivo, como o paradigma do lugar condicionado: a forza de activación dentro dos circuítos límbicos está ligada á aprendizaxe e á motivación. Observamos a variabilidade da expresión c-Fos no hipotálamo medial dos animais de FRC. Particularmente dentro do PVN, esta variabilidade podería estar enmascarando a activación nos ratos FR, para o que se observou unha tendencia a aumentar as ratas c-Fos vs. FRC (Táboa 3). Non obstante, a activación hipotalámica media non difería entre os animais FR e FRC.
Debe terse en conta que, aínda que o noso obxectivo era identificar sitios do CNS que contribúen ao inicio do comportamento, a resolución temporal é algo considerada. Como se comenta a continuación, agora apréciase que os diferentes subcomponentes dos comportamentos instrumentais ou operantes están mediados pola activación de diferentes poboacións de neuronas (13, 23, 33, 49). Non podemos descartar por completo que a activación por presións ou reclamos de barras moi inmediatas puidese contribuír un pouco aos patróns de activación que observamos. Os nosos resultados proporcionan a base para unha investigación máis aprofundida dos roles de sitios CNS específicos en diferentes aspectos ou compoñentes da tarefa de autoadministración e para tales estudos, medición doutros xenes tempranos inmediatos con diferentes horarios de tempo "on" e "off"36) será moi útil.
As correlacións que atopamos na expresión de c-Fos entre diferentes rexións cerebrais soportan a conectividade funcional coñecida das rexións límbicas hipotalámicas e primarias para esta tarefa de recompensa particular, como entre a LH e a VMH, e entre a rexión perifornical do LH e do VTA (ver discusión en Refs. 2 13). Tamén analizamos as correlacións entre a expresión c-Fos en diferentes rexións activadas e o comportamento. A correlación entre c-Fos na ARC e as palancas activas encaixa co papel ben definido da actividade de ARC na inxestión de alimentos (1); coa nosa observación anterior de que a inxección de insulina especificamente na ARC diminuíu a autoadministración de sacarosa (15); con informes previos sobre o papel crítico da ARC e as súas neuronas endorfinogênicas na adquisición e no rendemento da auto-administración de cocaína40-42); e coas proxeccións identificadas do ARC ao NAc (17). Así, o ARC probablemente xoga un papel clave no comportamento motivado para buscar e obter moitos tipos de estímulos gratificantes, incluíndo, pero non limitándose a, comida. Finalmente, observamos unha activación significativa do PVN e da VMH co inicio da procura de sacarosa PR. Isto é consistente cos roles ben caracterizados destes núcleos hipotalámicos medianos na regulación da inxestión de alimentos, a conectividade sináptica directa co ARC, e identificou as conexións co circuíto límbico (1, 27, 37).
Atopamos unha correlación negativa significativa entre a expresión c-Fos no VTA versus o NAc-shell, xa sexa probado para o desempeño de FR ou PR. Era sorprendente que non se observase unha activación VTA máis forte en asociación coa auto-administración de sacarosa PR ou FR (contra os controis respectivos). Quizais este descubrimento reflicte o momento en que medimos, centrándonos nos potenciais sitios do SNC activos no inicio da tarefa, para os que estes animais estaban ben adestrados. Isto sería consistente coas observacións e teses de Schultz (44), que a activación neuronal da dopamina serve como marcador de estímulos ou recompensas inesperadas, e esta activación diminúe asociado á formación. Non obstante, demostrouse que a liberación de dopamina estriatal durante a toma de sacarosa en animais adestrados é un evento moi preciso e temporal.39). Así, é posible que as tendencias que observamos sexan fortemente significativas cun grupo de estudo máis grande (é dicir, máis potencia estatística). Observamos a activación de NAc en asociación coa aparición de sacarosa FR e PR. Tanto a activación como a inhibición das neuronas NAc foron reportadas en asociación co desempeño da recompensa instrumental, eo patrón de activación / actividade depende da formación e do ambiente e está asociado con diferentes compoñentes do comportamento (por exemplo, orientación, aproximación, inxestión) (6, 33, 50). Como se discutiu anteriormente, a medición de c-Fos non capturaría esa actividade específica. Carlezon propuxo que a "recompensa" está asociada predominantemente cunha diminución da actividade das neuronas NAc, é dicir, neuronas espiñas medias (3). Isto non é coherente coas nosas observacións: o NAc c-Fos substancialmente mellorado en comparación cos controis de manexo e as neuronas c-Fos-positivas colocalizadas con GAD, consistentes coa activación de neuronas espiñas medias (GABAergic). ". A activación e inhibición de NAc poden ocorrer durante tarefas instrumentais, con especificidade tanto anatómica como temporal. Desde a perspectiva deste estudo, pódese concluír que o NAc está implicado no inicio da toma de sacarosa instrumental, co núcleo de NAc que contribúe á activación motor e ao shell NAc contribuíndo aos aspectos motores e motivacionais da tarefa.
Tamén observamos a activación de ambas as principais rexións do BNST (anterior e posterior) nos ratos FR. O BNST é unha parte dos circuítos límbicos que modula as respostas neuroendocrinas a repetidas experiencias de estímulos (8, 9), e nun sentido máis amplo, está asociado coa aprendizaxe dos estímulos recorrentes. Aínda que o seu papel foi dilucidado máis amplamente en relación ás experiencias estressantes repetidas, o noso descubrimento suxire un papel máis amplo para o BNST: o BNST pode modular as respostas do SNC a estímulos recurrentes positivos, así como negativos ou estresantes. Como observamos esta activación no inicio do FR, pero non PR, o rendemento, o recrutamento do BNST pode estar ligado ao aumento das recompensas de sacarosa do adestramento FR. A nosa observación de ningunha activación directa de neuronas CRF suxire que a resposta instrumental para a sacarosa non é un factor de estrés importante; con todo, a expresión c-Fos noutras neuronas PVN é consistente coa modulación dos circuítos de tensión (46). De feito, Ulrich-Lai e os seus compañeiros informaron de que, usando un diferente paradigma de dieta / alimentación, a inxestión de sacarosa modula a función PVN (47). Finalmente, observamos a activación do núcleo do nervio hipogloso en asociación co rendemento PR pero non co FR. A importancia deste só pode especularse; unha posibilidade é que a relevancia do sabor da sacarosa pode ser aumentada en ratas que inxeren menos recompensas de sacarosa.
A toma de sacarosa e sacarosa debe considerarse como unha experiencia multimodalidade, dinámica no tempo, xa que a inxestión produciría sinais periféricos relacionados co contido calórico da sacarosa, así como a habituación e a aliestesia dentro da sesión (25). Aínda que a nosa investigación centrouse na influencia dos sinais endócrinos periféricos, é dicir, insulina e leptina, para modular a recompensa de alimentos, os seus efectos poden, á súa vez, ser mediados directamente por transmisores e neuropéptidos que desempeñan un papel a curto ou longo prazo alimentación ou recompensa de alimentos (ver debate en Ref. 14). O estudo actual proporciona algunha información sobre isto; observamos algunha activación de neuronas que expresan o MCH ou a orexina, dous neuropéptidos que son orexigénicos. Estas conclusións poden, de feito, subestimar o papel do MCH ou da orexina na recompensa de alimentos, xa que sen dúbida a inmunocitoquímica en ratos tratados con non colchicina limitou a visualización destes neuropéptidos. A identificación de neuronas de orexina activada no LH é consistente en xeral cos numerosos estudos que implican as neuronas de orexina na alimentación, a recompensa de alimentos e unha recompensa de estímulo máis xeneralizada (por exemplo, 5, 7, 29). Observamos a activación das neuronas de orexina de peFLH. Aston-Jones e compañeiros5) disecaron os roles de diferentes poboacións de neuronas de orexina de LH en comportamento de recompensa e teñen implicadas neuronas de pePLH orexin na excitación, a diferenza da recompensa en si. Así, o noso descubrimento suxire un papel para a orexina LH na excitación e, posiblemente, orientación cara á palanca activa ou as pistas para a toma de sacarosa.
A consideración futura é a singularidade ou a generalización da sacarosa como estímulo gratificante. Quere determinar se o patrón da activación precoz do SNC que aquí se presenta é específico para o alimento como estímulo ou se xeneraliza a outros estímulos gratificantes. Como se mencionou anteriormente, particularmente na tarefa FR, espérase que a inxestión de varias recompensas de sacarosa teña consecuencias metabólicas, coa modulación da liberación hormonal (por exemplo, colecistoquinina, grelina, insulina) e cambios na activación periférica e neuronal do SNC. Non se esperaría que estes cambios xogasen un papel directo nos primeiros patróns de activación do SNC que medimos, pero que poden desempeñar un papel na aprendizaxe da recompensa de sacarosa durante o adestramento. De novo, os neuropéptidos como a orexina poden estar implicados críticamente.
O noso estudo representa, segundo o noso coñecemento, a primeira demostración de activación de núcleos hipotalámicos mediais específicos no inicio da autoadministración de sacarosa, incluíndo tanto o PVN, implicado na homeostase e a resposta ao estrés, como o ARC, que é crítico para a homeostase enerxética. detección de nutrientes e regulación da inxestión de alimentos. É importante destacar que observamos a activación do hipotálamo medial e do NAc, en asociación coa aparición de PR, o que suxire que tanto o homeostático coma algúns sitios límbicos teñen un papel na iniciación da autoadministración de sacarosa. Os sitios de circuítos límbicos adicionais poden ser reclutados nun punto de tempo posterior na tarefa.
Perspectivas e importancia
Mentres que, históricamente, os estudos de comportamentos motivacionais e de recompensa implicarían máis fortemente os circuítos límbicos do SNC, acumuláronse unha gran cantidade de evidencias que enfatizaban a interacción funcional crítica entre os circuítos da homeostase límbica e enerxética. O estudo actual suxire agora a probable importancia de núcleos hipotalámicos mediais específicos no traballo motivado para a sacarosa. Extrapolándose deste estudo, os estudos futuros poden avaliar se o papel do hipotálamo medial é necesario e se a súa activación está implicada na procura motivada doutras recompensas, como drogas de abuso. Ademais, os resultados deste estudo proporcionan a lóxica para estudar as alteracións de comportamentos motivados en circunstancias concomitantes con fisioloxía hipotalámica medial alterada, como na obesidade.
BEQUES
Esta investigación contou co apoio de National Institutes of Health Grant DK40963. Dianne Figlewicz Lattemann é un científico de investigación Senior, Programa de investigación de laboratorio biomédico, Sistema de saúde Puget Sound do Departamento de Veteranos, Seattle, Washington. O Dr. Sipols é apoiado polo Consello Letón de Science Grant 04.1116.
AGRADECEMENTOS
Grazas aos doutores. Yavin Shaham, Stephen Benoit, Christine Turenius e JE Blevins por consello e discusións útiles.
Referencias
;