Psiquiatría dianteira. 2018; 9: 81.
Publicado en liña 2018 Mar 12. doi: 10.3389 / fpsyt.2018.00081
PMCID: PMC5858605
PMID: 29593587
Minho Lee,1,† Hyeyoung Cho,2,3,† Seung Hyun Jung,2,4 Seon-Hee Yim,2 Cho Cho Min,2,3 Ji-Won Chun,5 Soo-Hyun Paik,5 Yae Eun Park,6,7 Dong Huey Cheon,7,8 Ji Eun Lee,7 Jung-Seok Choi,9 Dai-Jin Kim,5,* Yeun-Jun Chung1,2,3,*
Abstracto
Fondo
O uso adictivo de Internet e dos xogos en liña é un posible trastorno psiquiátrico denominado trastorno de xogo en Internet (IGD). Os perfís de expresión alterados de microARN (miRNA) foron reportados en sangue e tecidos cerebrais de pacientes con certos trastornos psiquiátricos e suxeridos como biomarcadores. Non obstante, non houbo informes sobre perfís de miRNA no sangue no IGD.
Methods
Para descubrir os miRNA asociados ao IGD, analizamos os perfís de expresión de miRNA das mostras de 51 (controis 25 IGD e 26) usando a matriz miRNA de baixa densidade TaqMan. Para a validación, realizamos PCR de transcrición inversa cuantitativa con mostras independentes de 36 (controis 20 IGD e 16).
Resultados
A través do descubrimento e validación independente, identificamos tres miRNAs (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-652-3p) que foron significativamente regulados no grupo IGD. Os individuos con todas as tres alteracións do miRNA tiñan un risco moito maior de IGD que aqueles sen alteración [odds ratio (OR) 22, 95% CI 2.29-211.11], e as OR aumentaron dependendo do número de miRNA alterados. Os xenes obxectivo previstos dos tres miRNAs asociáronse con vías neuronais. Exploramos a expresión da proteína dos tres xenes obxectivo de baixa por western blot e confirmamos que a expresión de GABRB2 e DPYSL2 foi significativamente maior no grupo IGD.
Conclusión
Observamos que as expresións de hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p e hsa-miR-652-3p foron descartadas nos pacientes IGD. Os nosos resultados serán útiles para comprender a fisiopatoloxía da IGD.
introdución
O uso adictivo de Internet e os xogos baseados en Internet non é só un fenómeno social en países con ampla infraestrutura de acceso a Internet, senón un potencial trastorno psiquiátrico denominado trastorno de xogo en Internet (IGD) (IGD)1-3). Segundo informes epidemiolóxicos, as taxas de prevalencia de IGD en adolescentes varían de un país a outro, dende 0.8 a 26.7% (4). En particular, os estudos mostran taxas de prevalencia superiores a 10% en adolescentes en moitos países asiáticos como Corea do Sur, China, Taiwán, Hong Kong e Singapur (4). A IGD está asociada a un deterioro na cognición, nas relacións psicosociais e na vida diaria; por exemplo, o descenso do rendemento académico ou profesional4-7). O IGD está agora incluído na Sección III (Condicións para o Estudo adicional) da quinta revisión do Manual de diagnóstico e estatística de trastornos mentais (DSM-V) (8). Non obstante, a pesar da súa importancia clínico-social, sábese pouco sobre o mecanismo xenético molecular detrás da IGD.
Os estudos xerais a gran escala recentes suxeriron un fondo xenético para o IGD.9, 10). Vink et al. investigou as diferenzas individuais no uso compulsivo da Internet con xemelgos monocigóticos e dizygóticos 5,247 no rexistro gemelo dos Países Baixos e informou de que 48% das diferenzas explicáronse por factores xenéticos (9). Li et al. observou pares 825 de xemelgos adolescentes chineses e informou de que os factores xenéticos explicaron 58-66% das diferenzas (10). En consecuencia, os polimorfismos dos xenes implicados na neurotransmisión, cognición e atención como o xene D2 do receptor de dopamina (DRD2), xene de catecolamina-O-metiltransferase (COMT), xene transportador de serotonina5HTTLPR), e xin alfa 4 do receptor colinérxicoCHRNA4) asociáronse significativamente coa adicción a Internet ()11-13). Recentemente, Kim et al. analizaron variantes de xenes candidatos máis que 100 relacionados coa produción, acción e metabolismo dos neurotransmisores pola análise de secuenciación de próxima xeración e informou de que rs2229910 de NTRK3 o xene está asociado co IGD14).
Ademais dos factores xenéticos, tamén é ben sabido que os fenotipos neurocomportamentais son controlados epigenéticamente por ARNs non codificantes, incluíndo microRNAs (miRNAs)15, 16). Os miRNA son pequenas moléculas de ARN monocatenarias non codificantes (aproximadamente nucleótidos 20-23 en lonxitude), que regulan negativamente a expresión dos xenes que codifican proteínas degradando os ARNm e desempeñan un papel crítico no proceso fisiopatolóxico de diversas enfermidades (17). As liñas de evidencia demostraron que os miRNA son abundantes no sistema nervioso central humano (SNC) e actúan para axustar os niveis de expresión dos seus xenes obxectivo, que están implicados no desenvolvemento e maduración do sistema SNC.15). En realidade, estudos recentes revelaron que os perfís de expresión de miRNA son alterados no tecido cerebral de pacientes con trastornos psiquiátricos, o que suxire que os seus perfís de expresión poden ser biomarcadores de trastornos psiquiátricos (15, 16, 18). Por exemplo, a través da análise postmortem, López et al. informou de que a expresión de miR-1202, que regula a expresión do xene metabotrópico do receptor glutamato-4 e predice a resposta ao antidepresivo, foi descartada nos tecidos da cortiza prefrontal de pacientes con trastorno de depresión maior (19). En canto ao cribado de biomarcadores, este enfoque ten unha clara limitación porque a realización dunha biopsia do tecido do SNC para o cribado é imposible. Dado que os miRNA poden detectarse no sangue (plasma ou soro), os miRNA circulantes teñen unha vantaxe definitiva como biomarcadores non invasivos en trastornos neuropsiquiátricos. Non obstante, ata a data, non houbo estudos sobre circulación de perfís de miRNA na IGD. Unha mellor comprensión dos perfís de expresión miRNA circulante podería axudar a aclarar o mecanismo do desenvolvemento do IGD e facilitar a tradución clínica.
Neste estudo, buscamos identificar os marcadores de miRNA asociados ao IGD observando miRNAs plasmáticos expresados de xeito diferente entre os grupos IGD e control e explorando as súas implicacións biolóxicas.
Materiais e Métodos
Temas de estudo
Investigamos aos adolescentes de 3,166 (anos de idade 12-18) usando puntuación DSM-V IGD. Entre eles, 251 (machos 168 e femias 83) foron diagnosticados como IGD segundo os criterios DSM-V (8). Un total de individuos 91 (controis 49 IGD e 42) proporcionaron o consentimento informado para este estudo. Entre eles, catro persoas foron excluídas segundo os criterios de exclusión. Finalmente, foron inscritos para este estudo os individuos 87 (individuos 45 IGD e individuos control 42 sans). Entre eles, os participantes de 51 (pacientes 25 IGD e controis 26) foron recrutados como o conxunto de descubrimentos de 2014 a 2016. Os outros participantes de 36 (pacientes 20 IGD e controis 16) foron recrutados como o conxunto de validación independente de 2016. Todos os participantes eran individuos coreanos, matriculados no Hospital de Santa María de Seúl (Seúl, Corea do Sur) e na Universidade Nacional de Seúl, Hospital Boramae (Seúl, Corea do Sur). Todos os participantes foron sometidos a unha entrevista estruturada por un psiquiatra baseada no calendario coreano de trastornos afectivos e esquizofrenia (K-SADS-PL).20). Todos os participantes completaron os subtestes de Deseño de bloques e vocabulario da escala de intelixencia de Wechsler para nenos, edición 4th (K-WISC-IV) (21). A impulsividade foi avaliada pola Escala de Impulsividade de Barratt (BIS).22). As escalas do sistema de inhibición do comportamento (BInS) e do sistema de activación comportamental (BAS) foron medidos para avaliar a dimensión da personalidade (23). Os criterios de exclusión incluíron trastornos médicos principais pasados ou actuais (por exemplo, diabetes mellitus), trastornos neurolóxicos (por exemplo, trastornos de convulsións, lesións na cabeza), trastornos psiquiátricos (por exemplo, trastorno depresivo maior, trastornos de ansiedade), atraso mental ou calquera abuso de substancias (por exemplo, , tabaco, cannabis, alcohol). As características xerais dos suxeitos do estudo resúmense na táboa Táboa1.1. Este estudo foi aprobado polo Institutional Review Board do Catholic University Medical College of Korea (MC16SISI0120). Todos os participantes e os seus pais deron consentimento informado por escrito.
Táboa 1
Características xerais das materias do estudo.
| Descubrimento | validación | Combinado | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Control | IGD | P-valor | Control | IGD | P-valor | Control | IGD | P-valor | |
| N | 26 | 25 | 16 | 20 | 42 | 45 | |||
| Idade (anos) | |||||||||
| Mediana (min – max) | 13 (12 - 17) | 13 (12 - 15) | 0.759 | 15 (13 - 18) | 14.5 (12 - 18) | 0.628 | 14 (12 - 18) | 14 (12 - 18) | 0.509 |
| Horas de xogo semanal en Internet (h) | |||||||||
| Mediana (min – max) | 5.25 (2 - 17) | 18 (6 - 46) | 1.27E − 6a | 5.5 (2 - 23) | 8 (1 - 112) | 0.374 | 5.5 (2 - 23) | 14 (1 - 112) | 1.63E − 5a |
| Renda mensual do fogar (millóns de KRW) | |||||||||
| Mediana (min – max) | 5 (1 - 9) | 3 (1 - 9) | 0.588 | 4 (4 - 4) | 2 (2 - 2) | 1.000 | 5 (1 - 9) | 3 (1 - 9) | 0.460 |
| Educación (anos) | |||||||||
| Mediana (min – max) | 8 (7 - 9) | 8 (7 - 9) | 0.584 | 12 (12 - 12) | 6 (6 - 13) | 0.305 | 8 (7 - 12) | 8 (6 - 13) | 0.269 |
| K-WISC: deseño de bloques | |||||||||
| Mediana (min – max) | 10.5 (4 - 17) | 10 (4 - 16) | 0.544 | 10 (3 - 16) | 12.5 (4 - 15) | 0.125 | 10 (3 - 17) | 11 (4 - 16) | 0.598 |
| K-WISC: vocabulario | |||||||||
| Mediana (min – max) | 9 (5 - 17) | 7 (5 - 13) | 0.174 | 9.5 (8 - 15) | 11.5 (5 - 15) | 0.595 | 9 (5 - 17) | 9 (5 - 15) | 0.527 |
| KS | |||||||||
| Mediana (min – max) | 24 (17 - 36) | 37 (22 - 51) | 3.81E − 6a | 29 (17 - 34) | 59 (22 - 108) | 1.2E − 5a | 25 (17 - 36) | 40 (22 - 108) | 2.05E − 10a |
| BIS | |||||||||
| Mediana (min – max) | 63 (35 - 75) | 67.5 (45 - 81) | 0.080 | 61 (45 - 79) | 63 (32 - 82) | 0.835 | 62 (35 - 79) | 65 (32 - 82) | 0.240 |
| BAS | |||||||||
| Mediana (min – max) | 31 (15 - 40) | 31 (13 - 51) | 0.558 | 36.5 (22 - 48) | 34 (27 - 52) | 1.000 | 32 (15 - 48) | 34 (13 - 52) | 0.637 |
| BInS | |||||||||
| Mediana (min – max) | 18 (10 - 26) | 17.5 (13 - 27) | 0.642 | 18.5 (12 - 25) | 20 (13 - 21) | 0.138 | 18 (10 - 26) | 19 (13 - 27) | 0.302 |
IGD, pacientes con trastorno de xogo en Internet; KS, Escala coreana de pronomeza da adicción á Internet; BIS, Escala de impulsividade de Barratt; BAS, sistema de activación comportamental; BInS, Sistema de inhibición do comportamento; KRW, Korean Won.
aP <0.05 (proba de Mann – Whitney – Wilcoxon).
Experimentos de matriz de miRNA de baixa densidade TaqMan (TLDA)
O sangue periférico foi recolectado por cada participante e trasladado ao laboratorio dentro de 4 h para minimizar a lise das células sanguíneas. O espécime foi centrifugado en 3,000 rpm para 10 min a temperatura ambiente. Entón, recolleu o sobrenadante (capa de plasma) sen contaminar as células sanguíneas. Os miRNA circulantes extraíronse usando o Kit de Purificación TaCMan miRNA ABC (Human Panel A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) segundo a instrución do fabricante. En resumo, 50 µL de mostra de plasma e 100 µL do buffer ABC foron mesturados. Despois da hibridación con perlas magnéticas anti-miARN específicas para o branco, os elite de circulación limitada foron eluídos das perlas con 100 µL de tampón de elución. Na fase de descubrimento, os miRNAs de 381 foron examinados a partir de mostras de plasma 51 (controles 25 IGDs e 26) usando o Kit de purificación ABC de TaqMan miRNA (Human Panel A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) segundo as instrucións do fabricante. Realizáronse reaccións de transcrición inversa e pre-amplificación Megaplex para aumentar a cantidade de ADNc para a análise de expresión de miARN utilizando MegaplexPreAmp Primers Human Pool A e TaqManPreAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific). O panel TLDA A v2.0 (Thermo Fisher Scientific) foi executado no sistema de PCR en tempo real de ViiA7 (Thermo Fisher Scientific) para avaliar a expresión dos miARN. Os datos en bruto procesáronse mediante o software ExpressionSuite v1.0.4 (Thermo Fisher Scientific) para determinar os valores de Ct para cada miARN.
Análise de datos para TLDA
Primeiro medimos ciclos limiares (valor Ct) de cada miARN. Os miRNA cun valor Ct> 35 consideráronse como non detectables e excluídos da análise posterior. Todos os valores de Ct normalizáronse ao valor de Ct de miR-374b (valor de ΔCt), un dos miRNA máis expresados que circulan no plasma humano (24). Calculouse unha relación de cambio de dobra log2 (ΔΔCt) de expresión usando os valores medios das mostras de control como un calibrador no paquete HTqPCR en Bioconductor (25). A cuantificación relativa (RQ) de cada destino de miRNA foi definida como 2−ΔΔCt. Para probas hipotéticas da diferenza de expresión entre dous grupos, aplicamos a análise de variable subrogada (SVA) para capturar heterogeneidades como os efectos dos lotes nos experimentos usando o sva paquete en Bioconductor (26). miRNAs cun P-valor <0.05 consideráronse significativamente diferentes entre dous grupos.
Análise de enriquecemento de xenes
Para a análise de enriquecemento de xenes, usamos ToppFun en Suite ToppGene (27) para inferir unha ontoloxía xenética (GO) enriquecida significativamente (GO) (28) termos, vías e termos da enfermidade. Como entrada para este enfoque, utilizamos 1,230 xenes previstos de destino dos miRNA candidatos. A análise de vías foi usada para atopar vías significativas dos xenes obxectivo previstos segundo as vías de KEGG, BioCarta, Reactome, GeneMAPP e MSigDBin. A importancia dos termos de enriquecemento funcional determinouse en función do axuste axustado de Bonferroni P-valor.
Validación e replicación da PCR de transcrición inversa cuantitativa (qRT-PCR)
Para validar os miRNA de 10 que se expresaron diferencialmente na fase de descubrimento, realizouse qRT-PCR usando o ensaio de MicroRNA de TaqMan (miR-15b-5p, #000390; miR-26b-5p, #000407; miR-29b-3p, # 000413; miR-125b-5p, #000449; miR-200c-3p, #002300; miR-337-5p, #002156; miR-411-5p, #001610; miR-423-5p, #002340; miR-483 -5p, #002338; e miR-652-3p, #002352) eo sistema ViiA7 (Life Technologies) segundo o protocolo do fabricante. Dez nanogramos de ARN total convertéronse en cDNA de primeira liña con iniciadores específicos de miRNA usando o Kit de transcrición inversa MicroRNA de TaqMan (#4366596, Life Technologies), seguido da PCR en tempo real con sondas TaqMan. O RQ de cada miARN definíase como 2−ΔCt, onde ΔCt é a diferenza nos ciclos dos limiares da mostra en cuestión, normalizada contra o miARN endóxeno (miR-374b-5p, #001319). Todas as reaccións de PCR leváronse a cabo por triplicado e os seus valores de Ct foron promediados. Calculamos unha relación de cambio de dobra log2 (ΔΔCt) de cada miARN do mesmo xeito que na análise baseada en matrices. Realizouse unha proba non paramétrica de Mann-Whitney-Wilcoxon para probar as diferenzas nos niveis de expresión de miRNAs en dous grupos cun limiar P-valor de 0.05.
Western Blot Analysis
Cada mostra de soro foi primeiro esgotada das proteínas 14 de alta abundancia (albumina, inmunoglobulina G, inmunoglobulina A, serotransferrina, haptoglobina, antitripsina alfa-1, fibrinóxeno, macroglobulina alfa-2, glicoproteína ácida alfa-1, inmunoglobulina M, apolipoproteína AI A apolipoproteína A-II, o complemento C3 e a transtiretina) empregando a columna MARS-14 (4.6 × 50 mm, Agilent Technology, Santa Clara, CA, EUA) antes da análise de Western blot. A fracción non ligada obtida da columna MARS-14 concentrouse usando un filtro centrífugo Amicon Ultracel-3 (corte 3 kDa) e entón a concentración da proteína determinouse usando o método do ácido bicinchonínico. As mesmas cantidades (de 10 a 30 µg) das mostras de soro de control e IGD separáronse nun xel prefabricado 4-20% Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad, CA, EUA) e transferíronse a unha membrana de difluoruro de polivinilideno. A continuación, a membrana foi bloqueada en TBS-T (190 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5 e 0.05% Tween 20) con leite seco 5% sen graxa a temperatura ambiente para 30 min. As membranas foron entón incubadas con anticorpos primarios contra DPYSL2 (1: 500, Novus Biologicals, Littleton, CO, EUA), GABRB2 (1: 1000, Abcam, Cambridge, MA, EUA) e CNR1 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology , Inc., Santa Cruz, CA, EUA), DUSP4 (1: 500, MybioSource, San Diego, CA, EUA) e PI15 (1: 500, MybioSource, San Diego, CA, EUA) en TBS-T con 5 % leite seco sen graxas a 4 ° C durante a noite e, a continuación, con anticorpos secundarios adecuados ou anti-rato bovino (1: 1,000, Santa Cruz Biotechnology) ou anti-coello de cabra (1: 1,000, Cell Signaling, Beverly, MA, EUA ) conxugado coa peroxidasa de rábano á temperatura ambiente para 1 h. A detección de sinais realizouse usando quimioluminiscencia con reactivo ECL (GE healthcare, Piscataway, NJ, EUA). Cuantificamos os resultados de Western Blot empregando o software de análise TotalLab 1D (Dinámica non lineal, Newcastle upon Tyne, Reino Unido). Entón, calculouse o valor da relación densitometría dividindo o valor densitométrico de cada mostra como se describiu noutro lugar (29). Como control para a normalización, utilizouse unha mostra de soro combinada a partir de mostras de control 46 IGD e para cada experimento. A importancia estatística determinouse usando un ensaio non paramétrico de Mann-Whitney-Wilcoxon cun limiar P-valor de 0.05.
Resultados
Características das materias do estudo
As características demográficas e clínicas dos suxeitos do estudo móstranse na táboa Táboa1.1. Cando comparamos o IGD e os grupos de control de acordo coa escala de proneness de adicción á Internet en Corea (Internet)K-Escala) como se describe noutro lugar (20, 30), o grupo IGD mostrou un valor significativamente máis elevado da escala K da mediana que o grupo control (37 vs. 24, P = 3.81 × 10-6) (Táboa (Table1) .1). O tempo semanal medio dedicado aos xogos en Internet no grupo IGD foi significativamente máis longo que o dos controis (18 vs. 5.25 h, P = 1.27 × 10-6). Considerando que non houbo diferenza significativa entre dous grupos de idade, a renda mensual da familia, a duración da educación, o deseño dos bloques e os resultados das subtestións de vocabulario dos K-WISC, BIS, BInS e BAS.
MiARN expresado diferencialmente entre o IGD e os controis
Para descubrir miRNA asociados ao IGD, adoptamos un enfoque de dous pasos (descubrimento e validación independente). O deseño do estudo e a estratexia global móstranse na figura S1 no material suplementario. Na fase de descubrimento analizamos os perfís de expresión de miARN de mostras 51 (controis 25 IGDs e 26) usando a matriz de miRNA que contén miARN de 384. Atopouse que os niveis de expresión dos miARN de 10 son significativamente diferentes entre os grupos IGD e control (Táboa (Table2) .2). Os niveis de expresión relativa destes miARN de 10 móstranse na figura Figura1.1. Entre eles, dous (hsa-miR-423-5p e hsa-miR-483-5p) foron regulados por riba e oito (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-411-5p, e hsa-miR-652-3p) foron descartados no grupo IGD.
Táboa 2
MicroRNAs expresados diferencialmente (miRNAs) e cambios de dobra.
| miRNA | Descubrimento | validación | Combinado | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| P-valor | Dobre cambio | P-valor | Dobre cambio | P-valor | Dobre cambio | |
| hsa-miR-15b-5p | 0.033 | 0.829 | 0.694 | 1.119 | 0.381 | 0.947 |
| hsa-miR-26b-5pa | 0.008 | 0.871 | 0.049 | 0.841 | 0.013 | 0.857 |
| hsa-miR-29b-3p | 0.005 | 0.400 | 0.560 | 1.187 | 0.089 | 0.647 |
| hsa-miR-125b-5p | 0.021 | 0.582 | 0.290 | 0.950 | 0.069 | 0.723 |
| hsa-miR-200c-3pa | 0.011 | 0.336 | 0.003 | 0.542 | 2.93 × 10-5 | 0.415 |
| hsa-miR-337c-5p | 0.009 | 0.385 | 0.582 | 0.872 | 0.020 | 0.553 |
| hsa-miR-411-5p | 0.004 | 0.322 | 0.336 | 1.282 | 0.158 | 0.595 |
| hsa-miR-423-5p | 0.026 | 1.387 | 0.189 | 0.955 | 0.518 | 1.175 |
| hsa-miR-483-5p | 0.018 | 1.861 | 0.765 | 1.413 | 0.211 | 1.647 |
| hsa-miR-652-3pa | 0.019 | 0.715 | 0.049 | 0.877 | 0.011 | 0.782 |
aOs miRNA alteran de forma significativa tanto os conxuntos de descubrimento como de validación de xeito consistente.
Validación qRT-PCR dos miRNA candidatos
Para validar os miRNA candidatos de 10, realizamos qRT-PCR cun conxunto de validación independente (controis 20 IGDs e 16) (Táboa S1 en material suplementario). Tres destes miRNAs (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p e hsa-miR-652-3p) foron significativamente reducidos no grupo IGD do conxunto de validación (Táboa) (Table2) .2). Outros tres miRNAs (hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-125b e hsa-miR-423-5p) tamén foron regulados no grupo IGD pero non significativamente. Os restantes catro miRNAs (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-411-5p e hsa-miR-423-5p) expresáronse de xeito oposto no conxunto de validación. Cando combinamos os conxuntos de descubrimento e validación (un total de sujetos 45 IGD e controis 42), os tres miRNA validados foron consistentes (táboa) (Table2) .2). Información detallada, localizacións cromosómicas, secuencias maduras e niveis de expresión no sistema nervioso central destes tres miARN están dispoñibles na Táboa S2 no material suplementario.
Efecto sinérgico da alteración simultánea dos tres miARN sobre o risco IGD
Para avaliar o efecto combinado dos tres miRNAs, observamos os odds ratios (OR) dos catro subgrupos (con modificacións de miARN do 0, 1, 2 ou 3). A alteración do miRNA foi definida polo valor de RQ como se describe na sección "Materiais e Métodos. ”Debido a que os tres marcadores de miRNA foron regulados por baixo no grupo IGD, un miRNA cuxo valor de RQ estaba por debaixo deles foi desafiado como alterado. A información detallada do valor de RQ de cada suxeito do estudo para os tres miRNA está dispoñible na Táboa S3 no material suplementario. Para cada subgrupo, as probabilidades calculáronse como a proporción de número de controis coa de IGDs, entón cada OR calculábase dividindo as probabilidades de cada subgrupo por probabilidades do subgrupo sen alteracións do miARN. As persoas con tres alteracións de miRNA mostraron un risco 22 veces maior que as que non tiñan ningunha alteración de miRNA (OR 22, 95% CI 2.29-211.11). As OR mostraron unha tendencia crecente co número de miRNAs modificados de 0 a 3 (r2 = 0.996) (Figura (Figura 22).
GO e análise de rutas dos xenes dos miRNA candidatos
Para coñecer as funcións dos tres marcadores de miARN significativamente reducidos no grupo IGD, predíxense os seus xenes de destino usando a base de datos de miRWalk 2.0 (31). Un total de xenes 1,230 predicíronse de forma consistente como obxectivos en curso por catro algoritmos (miRWalk, miRanda, RNA22 e Targetscan) usando a base de datos miRWalk (32-34) (Táboa S4 no material complementario). A análise de enriquecemento de conxuntos xenéticos usando ToppFun en Suite ToppGene mostrou que os xenes obxectivo deses miRNAs foron asociados significativamente con vías de desenvolvemento neural como "Axon guidance" e GO termos como "neurogênese" (Táboa S5 no material suplementario).
Expresión dos xenes obxectivo previstos
Entre os xenes obxecto de avance dos tres miRNA, prediñáronse 140 simultaneamente para dous ou máis miRNAs (Táboa S4 no material suplementario). Para explorar se os seus niveis de expresións de proteínas dos xenes de destino inferiores son diferentes entre os grupos IGD e control, seleccionamos xenes 2 (DUSP4 PI15), que se prevén como obxectivos de toda a imaxe de todos os miRNA de 3 e xenes 3 adicionais (GABRB2, DPYSL2e CNR1) a partir dos preditos para os miRNA de 2 e realizou unha análise de transferencia de western con mostras de plasma procedentes dos controis 28 IGDs e 28 dispoñibles para o experimento. Comparamos as expresións dos cinco obxectivos entre os grupos IGD e os de control medindo a intensidade e a área da banda como se describiu noutro lugar (29). Entre eles, os niveis de expresión de DPYSL2 (controis 28 IGDs e 28, P = 0.0037) e GABBR2 (27 IGD e 28 controis, P = 0.0052) foron significativamente maiores no grupo IGD (Figura (Figure3) .3). Non obstante, non puidemos observar expresións diferenciais de CNR1 (P = 0.0853), DUSP4 (P = 0.5443) e PI15 (P = 0.6346).
Conversa
Informouse de que os miRNA están implicados no desenvolvemento neuronal (35, 36), e a expresión diferencial de miRNAs cerebrais é observada en enfermidades psiquiátricas como a esquizofrenia (37). Polo tanto, é plausible que os perfís miRNA circulantes poidan ser biomarcadores útiles para o IGD. Suxeríronse miRNA circulantes como biomarcadores para diversas enfermidades neuropsiquiátricas (38-40); con todo, os mecanismos moleculares detrás do desenvolvemento de IGD aínda son bastante descoñecidos a pesar da súa importancia clínica e social. En concreto, non houbo estudos sobre miRNA asociados ao IGD. O obxectivo deste estudo era dobre. En primeiro lugar, intentamos descubrir miRNA plasmáticos asociados ao IGD. En segundo lugar, evaluamos a implicación biolóxica dos candidatos de miRNA explorando a expresión de proteínas e GO dos xenes obxectivo de abaixo. A través do exame de xenoma de perfís de expresión de miRNA e validación de augas abaixo dos candidatos, descubrimos que a expresión de tres miRNAs (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p e hsa-miR-652-3p) era significativamente menor nos pacientes con IG que nos controis. Aínda que os patróns de expresión doutros sete candidatos a miRNA non se reproduciron na validación, pode ser falso negativo debido a un pequeno tamaño de mostra neste estudo. Segundo nós, este é o primeiro informe sobre a posibilidade de que os perfís de expresión de miRNA en sangue poidan ser biomarcadores útiles para a IGD. A combinación dos tres marcadores de miRNA podería servir como unha ferramenta mínimamente invasiva para a identificación precoz de persoas en risco de IGD.
Os miRNAs identificados neste estudo están implicados en diversos trastornos neuropsiquiátricos. A expresión de hsa-miR-200c no sangue foi descrita como regula en varios trastornos psiquiátricos como a esquizofrenia (41) e episodios depresivos graves (42). O miR-200c foi máis altamente expresado en fraccións sinápticas que no cerebro total43) e tamén estar asociado coa morte das células neuronais44). Con base nestes informes anteriores, miR-200c está implicado no neurodesarrollo e pode asociarse con trastornos neuropsiquiátricos se a súa expresión está perturbada. Varios estudos suxeriron unha asociación entre miR-652 e risco de trastornos neuropsiquiátricos. Similar ao noso enfoque, para identificar biomarcadores de sangue para a esquizofrenia, Lai et al. realizou unha análise de TLDA con pacientes con esquizofrenia e controis normais e descubriu que sete miRNA incluíndo hsa-miR-652 expresáronse diferencialmente en pacientes con esquizofrenia45). No seguinte estudo, deseñaron un modelo de predicción utilizando os datos de expresión do miRNA e distinguiron con éxito a esquizofrenia do control normal (46). A expresión alterada de hsa-miR-652 tamén se observou en alcohólicos (47). Atopouse Hsa-miR-26b activado durante a diferenciación celular neuronal48). Perkins et al. informou de que o hsa-miR-26b foi descartado no córtex prefrontal dos pacientes de esquizofrenia49).
Aínda que non hai ningunha evidencia directa para apoiar a relación entre a expresión perturbada destes miARN e a fisiopatoloxía da IGD, podemos inferir que a desregulación destes miRNAs pode estar asociada coa fisiopatoloxía da IGD en base a varios informes anteriores sobre os xenes descendentes que previmos. . Algúns dos xenes descendentes dos tres miRNAs como GABRB2, CNR1, NRXN1e DPYSL2 Informouse de que están asociados con trastornos neuropsiquiátricos. O ácido gamma-aminobutírico (GABA) é un importante neurotransmisor inhibitorio no SNC. A desregulación do receptor GABA está implicada en trastornos neuropsiquiátricos, como adicción, ansiedade e depresión (50), que tamén son as principais características do IGD (8). Os polimorfismos xenéticos nos xenes dos receptores GABA están asociados ao vicio de alcohol e á esquizofrenia (51, 52). A dihidropirimidinasa 2 (DPYSL2) é un membro da familia de proteínas mediadoras de resposta ao colapsina, que ten un papel no conxunto de microtúbulos, sinalización sináptica e regulación do crecemento axonal. En consecuencia, suxeriuse que esta molécula é un biomarcador de trastornos psiquiátricos (53, 54). Polimorfismo no DPYSL2 O xene tamén se relacionou co trastorno de uso de alcohol (55). Os informes anteriores e os nosos datos suxiren que a sobreexpresión de GABRB2 e DPYSL2, obxectivos descendentes dos miRNAs reducidos, ten implicacións para a patoxénese de trastornos neuropsiquiátricos, incluíndo o IGD. O receptor de cannabinoides tipo 1 (CNR1) é un heterorreceptor presináptico que modula a liberación dos neurotransmisores e as perturbacións na sinalización cannabinoide están asociadas a varios trastornos neuropsiquiátricos.56). Polimorfismo xenético de CNR1 Se se sabe que o xene está asociado coa dependencia da sustancia nos caucásicos (57). Nun modelo de rata, a activación do hipocampo ventral CNR1 interrompe o comportamento social normal e a cognición (58). Sábese que a alteración xenética na familia NRXN está implicada en diversos trastornos neuropsiquiátricos, incluíndo a adicción (59).
Para examinar a implicación biolóxica dos tres candidatos de miRNA de forma máis directa, exploramos a expresión de proteínas dos seus xenes obxectivo de abaixo. Debido á limitada dispoñibilidade de mostras de plasma, dos candidatos comúns de 140 (previstos como augas abaixo de 2 ou máis miRNAs), examinamos os obxectivos de 5 (GABRB2, DPYSL2, CNR1, DUSP4 e PI15) por western blot e confirmou esa expresión de GABRB2 e DPYSL2 foi significativamente maior no grupo IGD. Os informes anteriores e os nosos datos suxiren que a sobreexpresión de GABRB2 e DPYSL2, obxectivos descendentes dos miRNAs reducidos, pode ter implicacións na patoxénese de trastornos neuropsiquiátricos, incluíndo o IGD. Os resultados do GO e as análises de vías de desenvolvemento neuronal tamén apoian a implicación neurobiolóxica dos marcadores de miARN. Outro achado interesante foi o efecto sinérxico da alteración simultánea dos miARN. As persoas con baixa regulación de todos os miRNA de 3 mostraron un risco 22 veces maior que aqueles sen desregulación e as OR aumentaron de forma dependente da dose. Aínda que o CI para estas tres alteracións foi amplo debido ao tamaño da mostra limitado, a clara correlación positiva (r2 = 0.996) soporta o efecto sinérxico dos tres miARN.
Aínda que descubrimos os marcadores de miRNA asociados ao IGD e os individuos con todas as tres alteracións do miRNA tiñan un risco 22 veces maior que as que non tiñan alteracións do miRNA, neste estudo hai varias limitacións. En primeiro lugar, o pequeno tamaño da mostra aumentou a probabilidade de que faltasen outros marcadores de miRNA significativos. En segundo lugar, xa que os nosos datos non foron suficientes para aclarar se os perfís de miRNA plasmáticos son causa ou efecto, non podemos confirmar o papel biolóxico destes marcadores non invasivos nun contexto clínico. Outros perfís de miRNA e a súa análise de xenes descendente utilizando tecido cerebral humano a partir dun banco de tecidos cerebrais poden dar unha resposta máis directa. Sería útil a análise do tecido cerebral cun modelo animal do trastorno de xogo. En terceiro lugar, debido á limitada dispoñibilidade de mostras de plasma, examinamos só cinco moléculas candidatas descendentes. Será útil explorar máis obxectivos en augas abaixo cun conxunto de mostras máis grande para comprender mellor o mecanismo molecular do DIG.
En resumo, a través do exame de xenoma de perfís de expresión de miARN e validación independente, descubrimos tres miRNAs asociados ao IGD (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p e hsa-miR-652-3p). Segundo informou, moitos dos seus xenes descendentes están implicados en diversos trastornos neuropsiquiátricos, e a validación experimental da expresión alterada destes xenes descendentes soporta a implicación dos miRNAs identificados neste estudo. Descubrimos que os individuos con baixa regulación de todos os tres miARN están en alto risco de IGD. Xunto aos factores de risco e criterios de diagnóstico coñecidos clínicos ou ambientais, os nosos resultados poden facilitar a intervención precoz para axudar ás persoas con maior risco de DGE.
Declaración de ética
Este estudo foi aprobado polo Institutional Review Board do Catholic University Medical College of Korea (MC16SISI0120). Todos os participantes e os seus pais deron consentimento informado por escrito.
Contribucións do autor
ML e HC contribuíron igualmente a este traballo. ML, D-JK e Y-JC deseñaron o estudo. SJ, S-MC, YP, DC e JL realizaron experimentos e xeración de datos. J-WC, S-HP, J-SC e D-JK recolectaron mostras de sangue e información clínica. ML, HC, S-HY e Y-JC analizaron os datos. ML, HC, S-HY e Y-JC describiron o manuscrito. Y-JC supervisou o proxecto.
Declaración de conflitos de intereses
Os autores declaran que a investigación foi realizada en ausencia de relacións comerciais ou financeiras que puidesen interpretarse como un potencial conflito de intereses.
Notas ao pé
Financiamento. Este traballo foi apoiado por unha subvención do Brain Research Programme a través da Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiada polo Ministerio de Ciencia e TIC e Planificación do Futuro (NRF-2015M3C7A1064778).
Material complementario
O material suplementario deste artigo pódese atopar en liña en http://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpsyt.2018.00081/full#supplementary-material.
References
;